人体血浆中洛伐他汀酸及HMG-CoA还原酶抑制剂的定量分析方法

摘要

本发明公开了一种通过测定HMG-CoA还原酶活性定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂的方法。经过方法适用性实验验证，用本方法在测定人血浆中洛伐他汀酸和其他HMG-CoA还原酶抑制剂的抑制活性可满足方法学要求，可以被生物研究接受。所有数据符合试验设计的验收标准。

说明书

发明领域

本发明涉及一种人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂的定量分析方法，特别涉及一种通过测定HMG-CoA还原酶活性定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂的方法。 

背景技术

HMG-CoA还原酶是胆固醇合成的关键酶，抑制HMG-CoA还原酶可以限制胆固醇的合成，达到调节血脂的目的。目前HMG-CoA还原酶抑制剂主要有洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀等。文献报道的技术方法均为针对单个他汀的定量分析方法，由于他汀类的血浆代谢产物他汀酸类亦具有一定的HMG-CoA还原酶抑制活性，所以定量分析血浆中他汀类药物的含量并不能真实的反应此他汀对HMG-CoA还原酶的抑制活性。本方法通过HMG-CoA还原酶抑制剂的定量分析，可以从总体上评价洛伐他汀对HMG-CoA还原酶的抑制活性，而不单是洛伐他汀本身，尚包含其他洛伐他汀代谢物等活性成分对HMG-CoA还原酶的抑制作用。目前尚未见定量分析HMG-CoA还原酶抑制剂的方法学报道。 

发明内容

本发明目的在于公开一种通过测定HMG-CoA还原酶活性定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂的方法。 

本发明目的是通过如下方案实现的： 

本发明定量分析方法具体包括如下步骤： 

A.试剂溶液的配制 

(1)200mM磷酸二氢钾缓冲液(pH7.4，PBS)的配制 

称取10.6g K₃PO₄·3H₂O于烧杯中，加180mL水溶解，用H₃PO₄调节pH至7.4，再加入纯水至200mL，摇匀； 

(2)200mM EDTA(乙二胺四乙酸)(在200mM pH7.4的PBS中)的配制 

向200mL pH7.4，200mM的PBS中加入162mg K₂EDTA·2H₂O(乙二胺四乙酸二钾)，摇匀； 

(3)10mM DTT(二硫苏糖醇)(在2mM EDTA和200mM PBS(PH7.4)中)的配制取15.4mg DTT至10mL容量瓶中，以2mM EDTA定容至刻度； 

(4)12mM NADPH(还原型辅酶II)的配制 

取20mg NADPH·Na₄至5mL塑料管中，加入2mL纯水，溶解混匀，于-20℃保存，备用； 

(5)0.4mM HMG-CoA的配制 

将10mg HMG-CoA加至25mL容量瓶中，纯水稀释至刻度并混合均匀，每3mLHMG-CoA分装至一只5mL PP试管中，于-20℃冷冻保存； 

(6)3.3mg/mL大鼠肝脏微粒体(在2mM NADPH中)的配制 

以10mM DTT将20mg/mL的大鼠肝脏微粒体稀释至4mg/mL，将该溶液以5∶1的比例与12mM NADPH混合； 

(7)5N HCl的配制 

将5mL HCl倒至玻璃容器中，以7mL水溶解，摇匀； 

(8)0.1N HCl的配制 

取9.0mL HCl至1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀； 

(9)15％甲醇的配制 

加入75mL甲醇至425mL水中，摇匀； 

(10)0.2％氨水的配制 

取8.0mL 25％氨水至1000mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，摇匀； 

(11)10mM甲酸铵(pH＝8.0)的配制 

在1000mL烧瓶中，将630g甲酸铵用800mL水溶解，以0.2％氨水调至pH 8.0，转移至1000mL容量瓶中并用纯水定容至刻度，摇匀； 

(12)流动相的配制 

700mL 10mM，pH＝8.0的甲酸铵与300mL乙腈混合均匀； 

(13)稀释液：0.1％甲酸甲醇溶液的配制 

移取100μL甲酸至100mL甲醇中，摇匀； 

(14)0.5％甲酸甲醇溶液的配制 

移取500μL甲酸至100mL甲醇中，摇匀； 

(15)羟基洛伐他汀酸标准储备液的配制 

羟基洛伐他汀酸标准储备液(LSS，1mg/mL)：精密称取10mg羟基洛伐他汀酸钠至10mL容量瓶中，以稀释液溶解并定容至刻度，于-20℃下冷冻保存； 

羟基洛伐他汀酸标准储备液1(LSS1，10μg/mL)的配制：取100μL LSS至10mL容量瓶中并以稀释液定容至刻度，于-20℃下冷冻保存； 

(16)羟基洛伐他汀酸标准加样溶液(STD)的配制 

以表1的方法配制标准加样溶液，于-20℃下冷冻保存； 

表1羟基洛伐他汀酸标准加样溶液的配制 

(17)羟基洛伐他汀酸(QC)储备液的配制 

羟基洛伐他汀酸QC储备液(LQS，1mg/mL)的配制：精密称取10mg羟基洛伐他汀酸钠至10mL容量瓶中，以稀释液溶解并定容至刻度，于-20℃下冷冻保存； 

羟基洛伐他汀酸QC储备液1(LQS1，10μg/mL)的配制：取100μL LQS至10mL容量瓶中并以稀释液定容至刻度，于-20℃下冷冻保存； 

(18)羟基洛伐他汀酸(QC)标准加样溶液的配制 

以表2的方法配制标准加样溶液，于-20℃下冷冻保存； 

表2羟基洛伐他汀酸(QC)标准加样溶液的配制 

(19)羟基洛伐他汀酸(QC)样品溶液的配制 

以表3的方法配制样品溶液，于-20℃下冷冻保存； 

表3羟基洛伐他汀酸(QC)样品溶液的配制 

(20)甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准储备液的配制 

甲瓦龙酸内酯标准储备液(MSS，2mg/mL)：精密称取20mg甲瓦龙酸内酯至10mL容量瓶中，乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，4℃保存； 

甲瓦龙酸内酯标准储备液1(MSS1，5μg/mL)：取50μL MSS至20mL容量瓶中并以水定容至刻度，摇匀，4℃保存； 

(21)甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准加样溶液的配制 

以表4的方法配制标准加样溶液，于-20℃下冷冻保存； 

表4甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准加样溶液的配制 

(22)内标物溶液的制备 

内标物储备液(ISS，500μg/mL)：移取10mg甲瓦龙酸内酯-d7(MVAL-d7，内标物)于20mL容量瓶中，乙腈溶解并稀释至刻度；4℃保存； 

内标物储备液1(ISS1，100μg/mL)的制备：取1000μL ISS至5mL容量瓶中，纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，MVAL-d7的准确加入量应根据ISS的储备浓度计算；4℃保存； 

内标物储备液2(ISS2，10μg/mL)的制备：取200μL ISS至10mL容量瓶中，纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，MVAL-d7的准确加入量应根据ISS的储备浓度计算；4℃保存； 

内标物溶液(200ng/mL)的制备：取200μL ISS2至10mL容量瓶中，纯水溶解并稀释至刻度；4℃保存； 

B.试验前预处理 

(1)羟基洛伐他汀酸工作标准溶液的制备 

在2mL塑料管中以表5的方法配制工作标准溶液： 

表5羟基洛伐他汀酸工作标准溶液的制备 

(2)取100μL血浆(双空白溶液**，空白溶液***，工作曲线溶液，QC样品溶液)至1.2mL 96深孔板中；加入400μL 0.5％甲酸(Formic Acid，FA)，盖板并充分振荡；3750rpm离心10min，取上清液300μL加至1.2mL可拆装的96孔板中，30℃氮气吹干，得提取物于-20℃下保存； 

STD 0*：0ng/mL样品溶液(阴性对照)； 

双空白溶液**：含有肝脏微粒体和NADPH，而不含有HMG-CoA和内标物的血浆样品； 

空白溶液***：含有肝脏微粒体、NADPH以及内标物，而不含有HMG-CoA的血浆样品； 

C.HMG-CoA酶反应 

将上述可拆装的96孔板中的1.2mL小管重新装配至96孔板上，向各小管中分别加入20μL水，涡流振荡混匀；冰浴下，用排枪向各管中加入3.3mg/mL的大鼠肝脏微粒体溶液120μL，涡流振荡混匀；37℃水浴预孵育，同时振摇15min；再用排枪加入0.4mM的HMG-CoA溶液20μL，涡流振荡混匀，其中双空白和空白样品溶液中均加入20mL纯水代替HMG-CoA；37℃水浴孵育，同时振摇30min；用排枪向各孔加入5N的HCl 20μL，涡流振荡混匀；再次37℃水浴孵育，同时振摇15min以终止反应，得反应溶液，备用； 

D.MVAL含量测定前处理 

分别取150μL MVAL标准加样溶液或反应溶液(双空白溶液、空白溶液、羟基洛伐他汀酸工作溶液、QC样品溶液和待测样品溶液)至玻璃试管中；除双空白溶液外，向其余各试管分别加入100μL内标物加样溶液；再加入900μL 0.1N的HCl和1mL水，涡流振荡混匀，静置30min使MVA转化为MVAL；采用1mL甲醇和1mL 0.1N的HCl次序活化ENV-SPE小柱；将样品上ENV-SPE小柱后，以1mL 0.1N的HCl，1mL纯水和1mL 15％甲醇依次洗脱，抽干小柱；再以0.5mL甲醇洗脱ENV-SPE小柱3次，富集流份；洗脱液在40℃下，氮气吹干；干燥物以200μL 0.2％氨水重溶，涡流振荡混匀，静置30min使MVAL转化为MVA；接着进样LC/MS/MS系统，30μL/针； 

E.仪器设置 

(1)HPLC条件： 

HPLC色谱柱：          Venusil ABS C18柱(5μm，4.6×150mm) 

流动相：              10mM甲酸铵(pH＝8.0)和乙腈(70/30，v/v) 

流速：                0.8mL/min(不分流) 

进样针清洗液：        50∶50甲醇/水 

进样体积：            30μL 

数据采集时间：        3min 

柱温：                室温 

自动进样温度：        室温； 

(2)转换阀条件： 

具体转换时间和数据采集时间根据色谱柱条件改变，T1为1.2min，该设置在第一个色谱峰出峰前0.5min，数据采集时间应设置在最后一个色谱峰出峰至少0.5min后；T2为2.5min。 

(3)MS/MS条件 

MVA：极性为负离子模式，母离子和子离子荷质比分别为147.0和59.1，延滞时间为200msec，停顿时间为5msec，保留时间为～1.8min； 

MVA-d7(MVA的内标物)：极性为负离子模式，母离子和子离子荷质比分别为154.0和59.1，延滞时间为200msec，停顿时间为5msec，保留时间为～1.8min； 

F.数据计算 

(1)MVAL定量分析 

色谱峰保留时间和峰面积由分析软件(1.4.1)确定；以峰面积比率和浓度得曲线，计算出MVAL的浓度；采用线性回归根据以下等式计算出MVAL的浓度： 

y＝ax+b 

其中：y＝被测物与内标物的峰面积比率 

b＝标准曲线的截距 

a＝标准曲线的斜率 

x＝被测物浓度(ng/mL) 

(采用加权最小二乘法进行回归运算) 

(2)HMG-CoA还原酶抑制剂定量分析 

①计算HMG-CoA还原酶(HMGR)的抑制率： 

首先，计算标准品和样品(QC)： 

y＝HMGR的活性抑制率 

注：标准曲线测定在QC样品测定前后至少重复两次，测得的MVAL含量的平均数值用于计算抑制率；用空白血浆制备的阴性对照液需要重复制备并测定四次，测得阴性对 照液中MVAL的平均含量用于上式计算； 

其次，计算血浆样品： 

y＝HMGR的活性抑制率 

注：不同个体可能有不同的阴性对照值(基线值)，如果没有对于每个个体都合适的阴性对照值，则取给药前的(0h)MVAL血浆浓度作个体阴性对照浓度。 

②作HMGR的抑制率与羟基洛伐他汀酸浓度的相关曲线； 

③以人血浆中羟基洛伐他汀酸的含量定量HMG-CoA还原酶抑制剂的含量： 

血浆中羟基洛伐他汀酸和其它HMG-CoA还原酶抑制剂(统称羟基洛伐他汀酸类似物)的浓度由HMGR的抑制率与洛伐他汀酸浓度的相关曲线计算得来；浓度计算采用药理/化学软件Origin 7.5中的对数剂量响应法； 

y＝A₂+(A₁-A₂)/[1+(X/X₀)^P] 

其中：X＝羟基洛伐他汀酸浓度(ng/mL) 

(无加权处理) 

-5≤A₁＜A₂≤115 

A₁，A₂，X₀和P来自软件中的原始参数；交互作用过程中，简化的卡方检验并没有降低； 

(3)准确度和精密度的检测 

①羟基洛伐他汀酸 

准确度： 

羟基洛伐他汀酸计算浓度是由HMGR的抑制率与洛伐他汀酸浓度的相关曲线回溯计算得来； 

精密度： 

所有计算数据和统计数据在软件中都不进行舍入处理，只有在出具报告数据时进行舍入处理； 

②MVAL 

准确度： 

MVAL计算浓度是由MVAL的峰面积比率与MVAL浓度的相关曲线回溯计算而来的； 

精密度： 

所有计算数据和统计数据在软件中都不进行舍入处理，只有在最终出具报告数据时进行舍入处理。 

附图说明

图1：洛伐他汀酸双空白的代表色谱图； 

图2：洛伐他汀酸空白的代表色谱图； 

图3：MVAL低限校正标准溶液的代表色谱图； 

图4：洛伐他汀酸低限校正标准溶液的代表色谱图； 

图5：洛伐他汀酸最高浓度标准溶液的代表色谱图； 

图6：MVAL代表标准曲线； 

图7：洛伐他汀酸代表标准曲线； 

图8：HMG-CoA转化为MVA示意图； 

图9：MVA与MVAL的相互转化示意图。 

本发明公开了一种通过测定HMG-CoA还原酶活性定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂的方法。经过方法适用性实验验证，用本方法在测定人血浆中洛伐他汀酸和其他HMG-CoA还原酶抑制剂的抑制活性可满足方法学要求，可以被生物研究接受。所有数据符合试验设计的验收标准。 

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。 

下述实验例1-8为按照本发明实施例1所述方法定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂，下述实验例1-8是对该方法的验证以评估该方法的适用性，以测定人血浆中洛伐他汀酸和其他HMG-CoA还原酶抑制剂的抑制活性。研究结果表明，本发明定量分析方法可满足方法学要求，可以被生物研究接受。所有数据符合试验设计的验收标准。 

实验例1本发明定量分析方法的选择性实验 

对照组血浆采集自6个不同的个体，分析不含内标物和HMG-CoA的双空白对照血浆、 含有内标物但不含HMG-CoA的空白对照血浆、含有内标物(n＝1)的洛伐他汀酸的定量上限(ULOQ，MVAL的较低浓度)的样品，如表6所示，对照样品没有干扰峰。洛伐他汀酸的双空白色谱图、空白色谱图，MVAL的定量下限色谱图，洛伐他汀酸的定量下限和定量上限色谱图分别见附图1，2，3，4，5。 

表6洛伐他汀选择性研究 

注：从每天的结果中收集选择性研究数据。 

双空白：内标和HMG-CoA都没加的空白对照血浆 

空白：没加HMG-CoA，加内标的空白对照血浆 

定量上限：加内标的洛伐他汀酸样品的定量上限(洛伐他汀酸是25ng/mL，MVAL浓度的定量下限)。 

实验例2本发明定量分析方法的灵敏度实验 

按照本发明实施例2所述的方法定量分析人体血浆中洛伐他汀酸及其它HMG-CoA还原酶抑制剂，将洛伐他汀酸的定量下限(LLOQ)设计为0.5ng/mL。为了评估方法的灵敏度，在该浓度检测了至少8个样品。由5个不同批次的血浆制备，检测结果由标准曲线回溯计算得到，结果见表7。该结果不符合设计要求(所有洛伐他汀酸LLOQ的测定结果的准确度应为真实值的100±30％，LLOQ的测定结果的RSD应≤25％)。将标准曲线上的次低浓度点1ng/mL设置为定量最低限则满足设计要求。数据(见表12)说明，该方法在洛伐他汀酸浓度为1ng/mL时具有足够的灵敏度。 

表7洛伐他汀酸定量下限样品结果 

实验例3本发明定量分析方法中标准曲线的实验 

表8和表9分别显示了洛伐他汀酸和MVAL的校正曲线上标准品的回溯计算浓度，结果表明符合设计要求(洛伐他汀酸的LLOQ的回溯计算值未超出其真实值的100±30％，其余各点的回溯计算值未超出其真实值的100±25％；MVLA的LLOQ的回溯计算值未超出其真实值的100±20％，其余各点的回溯计算值未超出其真实值的100±15％；包括定量下限(LLOQ)和定量上限(ULOQ)在内的至少75％非零标准品符合上述验收标准)。 

表8本发明分析过程：洛伐他汀酸校正标准溶液的实测浓度 

表9本发明分析过程：MVAL校正标准溶液的实测浓度 

实验例4本发明定量分析方法中曲线拟合算法的实验 

在10-2000ng/mL的MVAL标准浓度范围内评估该方法的线性。线性回归(加权最小二乘法)表明血浆中MVAL浓度/检测器响应关系的最佳拟合曲线。MVAL的校正曲线参数见表10，曲线上各点相关系数R大于0.99。MVAL的代表性线性点见附图6。 

洛伐他汀酸的校正曲线由一份双空白样品、一份空白样品、一份0ng/mL样品和至少6个非零标准品浓度点(在线性1～25ng/mL浓度范围内)，其中包括定量上限和定量下限。采用对数回归拟合法绘出血浆中洛伐他汀酸的浓度抑制曲线。洛伐他汀的校正曲线参数见表11。曲线上各点相关系数R大于0.99。洛伐他汀酸的代表性线性点见附图7。 

表10本发明分析过程：MVAL的校正曲线参数 

表11本发明分析过程：洛伐他汀酸的校正曲线参数 

实验例5本发明定量分析方法日内和日间的准确度和精密度实验 

在三个不同浓度水平(1ng/mL，10ng/mL和20ng/mL洛伐他汀酸)评估本发明定量分析方法的日内和日间的准确度和精密度。洛伐他汀酸的样品(QC)的统计结果见表12。 

结果显示，该方法的日内和日间的准确度和精密度均符合本研究要求(％Nom在[100±25]％范围内，％RSD不大于20％)。 

表12洛伐他汀酸日内和日间的准确度和精密度 

注：*异常值，不计入统计分析 

实验例6本发明定量分析方法回收率实验 

分别在两个QC浓度(1.5ng/mL和36ng/mL)测定洛伐他汀和洛伐他汀酸的回收率。每个浓度水平制备3个平行样品，采用3个结果的平均值进行比较。表13显示的是不同浓度水平的洛伐他汀的回收率，分别是86.1％和85.5％。表14显示的是不同浓度水平的洛伐他汀酸的回收率，分别是83.3％和81.8％。 

在3个浓度水平(20ng/mL，100ng/mL和2000ng/mL)测定MVAL的回收率，结果见表15，分别是82.2％(低)、72.3％(中)、72.3％(高)。在浓度200ng/mL测定MVAL-d7(内标物)的回收率，结果为72.4％，见表16。 

表13洛伐他汀的回收率 

表14洛伐他汀酸的回收率 

表15MVAL的回收率 

表16MVAL-d7(内标)的回收率 

实验例7本发明定量分析方法稀释完整性实验 

为了验证高浓度的样品稀释后仍在可分析的范围内，并为检测限所接受，在人血浆中加入加倍的洛伐他汀酸，达到500ng/mL。QC样品的稀释液至少准备6份平行样，加入空白血浆稀释50倍至洛伐他汀酸的浓度为10ng/mL。稀释后的样品采用标准校正曲线分析。实测浓度乘以稀释倍数(50)即可得到准确浓度。计算得到的浓度乘以稀释因子(50)得到准确的样品浓度。稀释完整性评估表明符合生物分析研究要求(％准确度在100±25％范围内，％RSD在20％范围内)。结果见表17，洛伐他汀酸的稀释完整性符合试 验要求。 

表17洛伐他汀酸的稀释完整性研究结果(稀释因子＝50) 

注：*异常值，不计入统计分析 

实验例8本发明定量分析方法稳定性实验 

(1)提取物的稳定性 

在评估经处理样品的完整性时，在预实验之后准备两个浓度水平的QC样品(含洛伐他汀酸1ng/mL(LQC)和20ng/mL(HQC))，置-20℃冷冻保存120h。采用实验例3和4的方法重新求得一条MVAL校正标准曲线和两条洛伐他汀酸标准曲线，并用它们定量分析上述样品。每个浓度水平的QC样品至少准备6个平行样品进行分析测定。结果见表18，均满足方案设计的验收标准(如果在-20℃提取物的测定浓度平均值在真实值的100±25％内，则认为提取物是稳定的)。 

表18-20℃条件下放置120小时后提取物样品中洛伐他汀酸的稳定性结果 

(2)短期稳定性 

为了评价血浆中洛伐他汀酸的短期稳定性，将两个浓度水平的QC样品(含洛伐他汀酸1ng/mL(LQC)和20ng/mL(HQC))在冰水浴中放置6h，采用实验例3和4的方法重新求得一条MVAL校正标准曲线和两条洛伐他汀酸标准曲线，并用它们定量分析以上样品。 每个浓度水平的QC样品至少准备6个平行样品进行分析。结果见表19，说明血浆中洛伐他汀酸在冰水浴条件下6h是稳定的。 

表19冰水条件下放置6小时后洛伐他汀酸的稳定性结果 

(3)自动进样器内的样品稳定性 

为了评估人血浆中洛伐他汀酸在处理样品时的稳定性，将处理样品置于自动进样器中，于15℃放置44h。采用实验例3和4的方法重新求得一条MVAL校正标准曲线和两条洛伐他汀酸标准曲线，并用它们定量分析自动进样器中的样品。结果见表20，符合试验方案的验收标准(测定结果的平均值在真实浓度的[100±25]％内)，表明洛伐他汀酸在自动进样器中于15℃放置44h是稳定的。 

表20室温(15℃)条件下在自动进样器中放置44小时后洛伐他汀酸的稳定性结果 

注：*异常值，不计入统计分析 

(4)冻溶稳定性 

采用两个浓度的样品(含洛伐他汀酸1ng/mL和20ng/mL)，每个浓度水平至少准备6个平行样品，以评估血浆中洛伐他汀酸的冻溶稳定性。经过冻溶循环的样品浓度与真实浓度进行比较，结果见表21，符合方案的验收标准(测定结果平均值在真实浓度的[100±25]％内)，说明洛伐他汀酸在冻溶循环中是稳定的。 

表21洛伐他汀酸的冻融稳定性研究结果 

(5)标准加样样品稳定性 

为了评估冷藏条件下标准加样样品的稳定性，将MVAL和MVAL-d7(IS)的标准加样样品在4℃放置22天。结果分别与新配制的MVAL和MVAL-d7的标准加样样品进行比较。结果见表22和23，表明MVAL和MVAL-d7的标准加样溶液在4℃放置22天是稳定的。 

表22MVAL加样溶液在冷藏(4℃)条件下放置22天后的稳定性结果 

表23MVAL-d7(内标)加样溶液在冷藏(4℃)条件下放置22天后的稳定性结果 

(6)储备液稳定性 

为了评估冷藏条件下储备液的稳定性，将MVAL和MVAL-d7(IS)的储备液在4℃分别放置62天和82天。结果分别与新配制的MVAL和MVAL-d7的标准加样样品进行比较。结 果见表24和25，表明MVAL和MVAL-d7的标准加样溶液在4℃分别放置62天和82天是稳定的。 

表24MVAL储备液在冷藏(4℃)条件下放置62天后的稳定性结果 

表25MVAL-d7(内标)储备液在冷冻(-20℃)条件下放置82天后的稳定性结果 

下述实施例均能实现上述实验例所述效果。 

具体实施方式

实施例1：本发明定量分析方法 

A.试剂溶液的配制 

(1)200mM磷酸二氢钾缓冲液(pH7.4，PBS)的配制 

称取10.6g K₃PO₄·3H₂O于烧杯中，加180mL水溶解，用H₃PO₄调节pH至7.4，再加入纯水至200mL，摇匀； 

(2)200mM EDTA(乙二胺四乙酸)(在200mM pH7.4的PBS中)的配制 

向200mL pH7.4，200mM的PBS中加入162mg K₂EDTA·2H₂O(乙二胺四乙酸二钾)，摇匀； 

(3)10mM DTT(二硫苏糖醇)(在2mM EDTA和200mM PBS(PH7.4)中)的配制取15.4mg DTT至10mL容量瓶中，以2mM EDTA定容至刻度； 

(4)12mM NADPH(还原型辅酶II)的配制 

取20mg NADPH·Na₄至5mL塑料管中，加入2mL纯水，溶解混匀，于-20℃保存，备用； 

(5)0.4mM HMG-CoA的配制 

将10mg HMG-CoA加至25mL容量瓶中，纯水稀释至刻度并混合均匀，每3mLHMG-CoA分装至一只5mL PP试管中，于-20℃冷冻保存； 

(6)3.3mg/mL大鼠肝脏微粒体(在2mM NADPH中)的配制 

以10mM DTT将20mg/mL的大鼠肝脏微粒体稀释至4mg/mL，将该溶液以5∶1的比例与12mM NADPH混合； 

(7)5N HCl的配制 

将5mL HCl倒至玻璃容器中，以7mL水溶解，摇匀； 

(8)0.1N HCl的配制 

取9.0mL HCl至1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀； 

(9)15％甲醇的配制 

加入75mL甲醇至425mL水中，摇匀； 

(10)0.2％氨水的配制 

取8.0mL 25％氨水至1000mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，摇匀； 

(11)10mM甲酸铵(pH＝8.0)的配制 

在1000mL烧瓶中，将630g甲酸铵用800mL水溶解，以0.2％氨水调至pH 8.0，转移至1000mL容量瓶中并用纯水定容至刻度，摇匀； 

(12)流动相的配制 

700mL 10mM，pH＝8.0的甲酸铵与300mL乙腈混合均匀； 

(13)稀释液：0.1％甲酸甲醇溶液的配制 

移取100μL甲酸至100mL甲醇中，摇匀； 

(14)0.5％甲酸甲醇溶液的配制 

移取500μL甲酸至100mL甲醇中，摇匀； 

(15)羟基洛伐他汀酸标准储备液的配制 

羟基洛伐他汀酸标准储备液(LSS，1mg/mL)：精密称取10mg羟基洛伐他汀酸钠至10mL容量瓶中，以稀释液溶解并定容至刻度，于-20℃下冷冻保存； 

羟基洛伐他汀酸标准储备液1(LSS1，10μg/mL)的配制：取100μL LSS至10mL容量瓶中并以稀释液定容至刻度，于-20℃下冷冻保存； 

(16)羟基洛伐他汀酸标准加样溶液(STD)的配制 

以表1的方法配制标准加样溶液，于-20℃下冷冻保存； 

表1羟基洛伐他汀酸标准加样溶液的配制 

(17)羟基洛伐他汀酸(QC)储备液的配制 

羟基洛伐他汀酸QC储备液(LQS，1mg/mL)的配制：精密称取10mg羟基洛伐他汀酸钠至10mL容量瓶中，以稀释液溶解并定容至刻度，于-20℃下冷冻保存； 

羟基洛伐他汀酸QC储备液1(LQS1，10μg/mL)的配制：取100μL LQS至10mL容量瓶中并以稀释液定容至刻度，于-20℃下冷冻保存； 

(18)羟基洛伐他汀酸(QC)标准加样溶液的配制 

以表2的方法配制标准加样溶液，于-20℃下冷冻保存； 

表2羟基洛伐他汀酸(QC)标准加样溶液的配制 

(19)羟基洛伐他汀酸(QC)样品溶液的配制 

以表3的方法配制样品溶液，于-20℃下冷冻保存； 

表3羟基洛伐他汀酸(QC)样品溶液的配制 

(20)甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准储备液的配制 

甲瓦龙酸内酯标准储备液(MSS，2mg/mL)：精密称取20mg甲瓦龙酸内酯至10mL容量瓶中，乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，4℃保存； 

甲瓦龙酸内酯标准储备液1(MSS1，5μg/mL)：取50μL MSS至20mL容量瓶中并以水定容至刻度，摇匀，4℃保存； 

(22)甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准加样溶液的配制 

以表4的方法配制标准加样溶液，于-20℃下冷冻保存； 

表4甲瓦龙酸内酯(MVAL)标准加样溶液的配制 

(22)内标物溶液的制备 

内标物储备液(ISS，500μg/mL)：移取10mg甲瓦龙酸内酯-d7(MVAL-d7，内标物)于20mL容量瓶中，乙腈溶解并稀释至刻度；4℃保存； 

内标物储备液1(ISS1，100μg/mL)的制备：取1000μL ISS至5mL容量瓶中，纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，MVAL-d7的准确加入量应根据ISS的储备浓度计算；4℃保存； 

内标物储备液2(ISS2，10μg/mL)的制备：取200μL ISS至10mL容量瓶中，纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，MVAL-d7的准确加入量应根据ISS的储备浓度计算；4℃保存； 

内标物溶液(200ng/mL)的制备：取200μL ISS2至10mL容量瓶中，纯水溶解并稀释至刻度；4℃保存； 

B.试验前预处理 

(1)羟基洛伐他汀酸工作标准溶液的制备 

在2mL塑料管中以表5的方法配制工作标准溶液： 

表5羟基洛伐他汀酸工作标准溶液的制备 

(2)取100μL血浆(双空白溶液**，空白溶液***，工作曲线溶液，QC样品溶液)至1.2mL 96深孔板中；加入400μL 0.5％甲酸(Formic Acid，FA)，盖板并充分振荡；3750rpm离心10min，取上清液300μL加至1.2mL可拆装的96孔板中，30℃氮气吹干，得提取物于-20℃下保存； 

STD 0*：0ng/mL样品溶液(阴性对照)； 

双空白溶液**：含有肝脏微粒体和NADPH，而不含有HMG-CoA和内标物的血浆样品； 

空白溶液***：含有肝脏微粒体、NADPH以及内标物，而不含有HMG-CoA的血浆样品； 

C.HMG-CoA酶反应 

将上述可拆装的96孔板中的1.2mL小管重新装配至96孔板上，向各小管中分别加入20μL水，涡流振荡混匀；冰浴下，用排枪向各管中加入3.3mg/mL的大鼠肝脏微粒体溶液120μL，涡流振荡混匀；37℃水浴预孵育，同时振摇15min；再用排枪加入0.4mM的HMG-CoA溶液20μL，涡流振荡混匀，其中双空白和空白样品溶液中均加入20mL纯水代替HMG-CoA；37℃水浴孵育，同时振摇30min；用排枪向各孔加入5N的HCl 20μL，涡流振荡混匀；再次37℃水浴孵育，同时振摇15min以终止反应，得反应溶液，备用；HMG-CoA转化为MVA的示意图见附图8。 

D.MVAL含量测定前处理 

分别取150μL MVAL标准加样溶液或反应溶液(双空白溶液、空白溶液、羟基洛伐他汀酸工作溶液、QC样品溶液和待测样品溶液)至玻璃试管中；除双空白溶液外，向其余各试管分别加入100μL内标物加样溶液；再加入900μL 0.1N的HCl和1mL水，涡流振荡混匀，静置30min使MVA转化为MVAL；采用1mL甲醇和1mL 0.1N的HCl次序活化ENV-SPE小柱；将样品上ENV-SPE小柱后，以1mL 0.1N的HCl，1mL纯水和1mL 15％甲醇依次洗脱，抽干小柱；再以0.5mL甲醇洗脱ENV-SPE小柱3次，富集流份；洗脱液在40℃下，氮气吹干；干燥物以200μL 0.2％氨水重溶，涡流振荡混匀，静置30min使MVAL转化为MVA；接着进样LC/MS/MS系统，30μL/针；MVA与MVAL的相互转化的示意图详见附图9。 

E.仪器设置 

(1)HPLC条件： 

HPLC色谱柱：        Venusil ABS C18柱(5μm，4.6×150mm) 

流动相：            10mM甲酸铵(pH＝8.0)和乙腈(70/30，v/v) 

流速：              0.8mL/min(不分流) 

进样针清洗液：      50∶50甲醇/水 

进样体积：            30μL 

数据采集时间：        3min 

柱温：                室温 

自动进样温度：        室温； 

(2)转换阀条件： 

具体转换时间和数据采集时间根据色谱柱条件改变，T1为1.2min，该设置在第一个色谱峰出峰前0.5min，数据采集时间应设置在最后一个色谱峰出峰至少0.5min后；T2为2.5min。 

(3)MS/MS条件 

MVA：极性为负离子模式，母离子和子离子荷质比分别为147.0和59.1，延滞时间为200msec，停顿时间为5msec，保留时间为～1.8min； 

MVA-d7(MVA的内标物)：极性为负离子模式，母离子和子离子荷质比分别为154.0和59.1，延滞时间为200msec，停顿时间为5msec，保留时间为～1.8min； 

F.数据计算 

(1)MVAL定量分析 

色谱峰保留时间和峰面积由分析软件(1.4.1)确定；以峰面积比率和浓度得曲线，计算出MVAL的浓度；采用线性回归根据以下等式计算出MVAL的浓度： 

y＝ax+b 

其中：y＝被测物与内标物的峰面积比率 

b＝标准曲线的截距 

a＝标准曲线的斜率 

x＝被测物浓度(ng/mL) 

(采用加权最小二乘法进行回归运算) 

(2)HMG-CoA还原酶抑制剂定量分析 

①计算HMG-CoA还原酶(HMGR)的抑制率： 

首先，计算标准品和样品(QC)： 

y＝HMGR的活性抑制率 

注：标准曲线测定在QC样品测定前后至少重复两次，测得的MVAL含量的平均数值用于计算抑制率；用空白血浆制备的阴性对照液需要重复制备并测定四次，测得阴性对 照液中MVAL的平均含量用于上式计算； 

其次，计算血浆样品： 

y＝HMGR的活性抑制率 

注：不同个体可能有不同的阴性对照值(基线值)，如果没有阴性对照值对于每个个体都是合适的，则取给药前的(0h)MVAL血浆浓度作个体阴性对照浓度。 

②作HMGR的抑制率与羟基洛伐他汀酸浓度的相关曲线； 

③以人血浆中羟基洛伐他汀酸的含量定量HMG-CoA还原酶抑制剂的含量： 

血浆中羟基洛伐他汀酸和其它HMG-CoA还原酶抑制剂(统称羟基洛伐他汀酸类似物)的浓度由HMGR的抑制率与洛伐他汀酸浓度的相关曲线计算得来；浓度计算采用药理/化学软件Origin 7.5中的对数剂量响应法； 

y＝A₂+(A₁-A₂)/[1+(X/X₀)^P] 

其中：X＝羟基洛伐他汀酸浓度(ng/mL) 

(无加权处理) 

-5≤A₁＜A₂≤115 

A₁，A₂，X₀和P来自软件中的原始参数；交互作用过程中，简化的卡方检验并没有降低； 

(3)准确度和精密度 

①羟基洛伐他汀酸 

准确度： 

羟基洛伐他汀酸计算浓度是由HMGR的抑制率与洛伐他汀酸浓度的相关曲线回溯计算得来； 

精密度： 

所有计算数据和统计数据在软件中都不进行舍入处理，只有在出具报告数据时进行舍入处理； 

②MVAL 

准确度： 

MVAL计算浓度是由MVAL的峰面积比率与MVAL浓度的相关曲线回溯计算而来的； 

精密度： 

所有计算数据和统计数据在软件中都不进行舍入处理，只有在最终出具报告数据时进行舍入处理； 

G.验收标准 

1、标准品验收标准 

(1)羟基洛伐他汀酸： 

羟基洛伐他汀酸的校正曲线应至少包含1～25ng/mL范围内六个浓度样品。这些样品准备相应的平行样，在样品测定之前和之后，进样检测。采用MVAL的平均浓度计算抑制率。为更好的曲线拟合，亦将0.25ng/mL、0.5ng/mL和30ng/mL作为浓度测定点，但并不进行报告和评估。其余校正曲线样品的理论计算浓度将予以报告。 

验收标准： 

1)标准品的定量低限(LLOQ)的回溯计算值不应超出其真实值的(100±30)％、所有其他标准品的(100±25)％。 

2)舍弃不符合验收标准的标准品值，但不改变已经建立的标准。 

3)包括定量低限(LLOQ)和定量高限(ULOQ)在内的所有标准曲线中各浓度的回溯计算值应至少有75％符合验收标准，并且校正曲线中应至少包含六个符合标准的数据，回归系数≥0.99。 

4)如果LLOQ或ULOQ不满足验收标准，可适当调节方法的浓度范围并予以记录。 

(2)MVAL 

MVAL的校正曲线至少包含10～2000ng/mL六个浓度的样品。在每一个样品进样之前，这些样品均进行相应的检测。校正曲线中样品的理论计算浓度将予以报告。 

验收标准 

1)标准品的定量低限(LLOQ)的回溯计算值不应超出其真实值的(100±20)％、所有其他标准品的(100±15)％。 

2)舍弃不符合验收标准的标准品值，但不改变已经建立的标准。 

3)包括定量低限(LLOQ)和定量高限(ULOQ)在内的所有标准曲线中各浓度的回溯计算值应至少有75％符合验收标准，并且校正曲线应该由至少6个可以接受的标准品所构成。 

4)如果LLOQ或ULOQ不满足验收标准，可适当调节方法的浓度范围并予以记录。 

2、验收标准 

1)LQC样品(1ng/mL)计算值(测量值)的准确度应在标识值(真实值)的70％～130％，其余样品(10ng/mL和20ng/mL)测量值的准确度应在真实值的75％～125％。 

2)至少2/3样品的计算值(测量值)必须在各自的标识值(真实值)范围内，每个浓度水平必须有一个样品在标识值(真实值)范围内。