基因突变和HIV-1耐药突变位点检测方法及试剂盒

摘要

本发明涉及一种HIV-1耐药突变位点基因检测方法、试剂盒和应用，公开了用于基因突变特别是HIV-1耐药突变位点基因检测的核苷酸引物、探针序列及方法，以及该方法在临床上检测HIV-1耐药突变位点中的应用。本发明的方法具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，适于HIV-1耐药突变位点的快速检测。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及PCR技术、反向杂交技术和单核苷酸延伸标记技术。

背景技术

据中国卫生部统计结果，截至2010年，全国累计报告人获得性免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus，HIV)感染者和艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)病人约75万例，全国每年有大量的艾滋病感染者接受免费高效联合抗逆转录病毒(HighlyActive Antiretroviral Therapy，HAART)治疗，HAART治疗能够有效控制病毒复制，延长患者的生命，大大地降低HIV/AIDS相关疾病的发病率和病死率。但是HIV耐药性的出现却极大地限制了抗病毒治疗的效果。选择一个能最大限度地抑制HIV-1复制的药物治疗方案已成为一个极具挑战性的任务。因此，了解HIV感染者病毒耐药变异情况，有针对性的选择抗病毒药物组合，成为艾滋病治疗工作中的一个重要内容。

HIV-1逆转录酶的不忠实性复制会造成错误碱基的掺入，同时逆转录酶不具备校正功能，所以在病毒复制过程中会产生大量变异。据文献报道，每天艾滋病人体内会产生大约10⁷～10⁸子代病毒，逆转录酶的错配几率约为3.4×10⁵/碱基。HIV基因全长约10kb，因此每天会产生10⁴～10⁵个单点突变。在数量众多的突变中，对抗病毒药物具有抵抗作用的基因突变株在药物选择压力下逐渐成为优势病毒株，会导致病毒学治疗失败，进而发展成免疫学失败，最终导致临床失败。研究证明，根据耐药检测结果选择抗病毒治疗方案可有效地降低病毒载量，升高CD4细胞含量，从而极大地改善HIV-1感染者抗病毒治疗的效果。1999年耐药性协作研究组(Resistance Collaborative Group，RCG)的一项用药方案与病毒耐药基因型表型之间关系的研究结果表明，有针对性的对基因型或表型预测失败者更改用药方案可以使治疗失败率降低30％～50％。因而在抗病毒治疗的过程中对每一个患者进行耐药突变检测是提高治疗效果、延长病人生命、降低发病率和病死率的重要手段。

目前HIV耐药检测方法主要有3种：基因型耐药检测(GART)、表型耐药检测(PART)和虚拟耐药检测(virtual phenotype，vPT)。传统的基因型耐药检测以核酸序列测定为基础，首先通过RT-PCR扩增出HIV的蛋白酶和逆转录酶基因的核酸序列，然后与参比毒株的核酸序列比较了解耐药位点是否发生变异。以RT-PCR扩增产物测序为基础的检测方法准确性高、信息全面，是HIV耐药临床检测金标准。但是测序方法存在如下缺点：检测灵敏度不高，一般要求检测样本病毒拷贝数＞1000cp/ml；分辨率低，不能检出相对含量小于20％的病毒突变株；不能直接提供耐药信息，且无法定量；由于耐药位点变异多且较为分散，需要同时进行多个测试反应。HIV耐药位点表型检测首先需要对HIV感染者进行病毒分离培养，然后再进行药物敏感实验。近年来出现了利用重组病毒进行HIV-1表型耐药检测。该方法主要是将HIV感染者体内的病毒蛋白酶和逆转录酶基因插入载体，同时与骨架质粒共转染细胞包装重组病毒，应用重组病毒进行耐药表型检测。表型检测具有如下优点：可以对病毒耐药情况进行定量分析；对B亚型和非B亚型均可进行分析；可以检测病毒序列中所有突变的作用，结果易于解释。但是表型检测由于受到价格昂贵、周期长、生物安全级别要求高等缺点很难大范围推广使用。虚拟表型检测首先需要建立基因型和表型之间的对应的数据库，通过对比测序结果，在数据库找出与感染者体内病毒序列相同或相似的序列，即可以给出药物敏感的参考意见。虚拟表型分析的可靠性依赖于数据库资料的准确性，要求随时更新耐药位点与表型之间的对应关系。但是虚拟表型检测仍然需要进行序列测定，同样受到基因型检测适用范围的限制。许多研究表明，各种表型耐药检测和基因型耐药检测的结果具有较高的一致性，并提出用基因型代替表型耐药检测。

无论是表型检测还是基因型检测目前只能在有条件的实验室中小范围使用，因此研发一种实验周期短，准确性好，灵敏度高，同时能够进行多位点检测，价格便宜，能够在基层医疗单位使用的耐药检测试剂在艾滋病防治工作中具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以同时检测多个基因突变的方法和一种HIV-1耐药突变位点基因检测试剂盒。此方法整合了基因扩增、反向杂交和单核苷酸延伸标记技术。

本发明的第一方面提供一种可以同时检测多种基因突变的检测方法，该方法通过以下步骤实现：

1)按照突变位点的碱基将突变位点分为A/T/C/G四组；

2)设计探针，探针序列3’末端与突变位点相邻但不包括突变位点，将探针按照检测位点的分组固定在杂交芯片的四个独立分区上；’

3)多重PCR获得含有待检测基因突变位点的核酸片段；

4)将反应3)获得的基因片段按照突变位点的分组分别与含有不同探针的芯片进行杂交；

5)杂交结束后将含有标记物的四种核苷酸分别加入到芯片上，在DNA合成酶的作用下进行单核苷酸延伸；

6)通过检测标记物判断待检测基因中是否含有突变位点。

在一个实施方案中步骤3)中的扩增引物Tm值控制在54-56℃；

在另一个实施方案中步骤2)中的探针Tm值控制在42-45℃；

在另一个实施方案中步骤2)中的探针序列3’末端与突变位点相邻但不包括突变位点，杂交后探针可以作为延伸引物；

在另一个实施方案中，待检测突变位点针对HIV耐药突变位点M184V、M41L、K70R、T215Y、D67N、K103N、Y181C、K65R、I47A、L76V、V32I中的一个或多个(氨基酸位置编号根据GenBank：K03455.1)

在另一个实施方案中常规克隆的方法制备以上耐药突变位点标准品质粒；

本发明所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向书写。

本发明还涉及一种用于检测HIV耐药突变位点的寡核苷酸引物对和探针的组合物。

本发明的另一方面是提供一种HIV耐药突变位点M184V、M41L、K70R、T215Y、D67N、K103N、Y181C、K65R、I47A、L76V、V32I的一个或多个的检测试剂盒，包括扩增引物、杂交芯片、生物素标记的四种核苷酸、杂交体系和延伸体系。

在一个实施方案中，还包括聚合酶及其缓冲液。优选地，所述聚合酶为Taq酶。

本发明的显著特点是：高灵敏度和高分辨率，反向杂交结合标记延伸的方法可以检测出1％的突变基因；同时操作步骤相对简单，可以在一个工作日内完成。

附图说明

图1是HIV耐药突变位点分布情况。黄色部分为延伸dATP区域；绿色部分为延伸dCTP区域；蓝色部分延伸dGTP区域；红色部分为延伸dUTP区域，在检测过程中，四个区域分别加相应的底物，显色后通过显色点的有无判断是否存在某一种突变位点。

图2为检测质粒样品的检测结果。如图所示，杂交膜上的特定位置与某一种突变相互对应，如图2中V32I所显示，在第一排第二列的显色点表明检测样品中含有V32I的突变，而没有其他突变体存在。

具体实施方式

下列实施例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。

实施例1

多重RT-PCR引物设计

根据所选择的12种待检HIV耐药突变附近的基因序列，设计出特异的针对目标基因的扩增引物，扩增引物设计区域在中国主要流行HIV病毒株的相对保守位置。首先根据在HIV基因序列上的位置将待检测的耐药突变位点分为3组，然后分别对3组序列设计扩增引物，使扩增产物包含待检测的突变位点；如果引物序列对应基因序列存在较多基因多态性，则在相应的序列上设计定向简并，以便对中国主要流行株都能高效扩增。同时针对人βactin基因设计一对扩增引物，在引物5’端标记生物素，作为检测方法的内参照。

本发明设计的针对所述12个待检HIV耐药突变位点的扩增引物参见表1，探针序列参见表2。

表1：12个待检HIV耐药突变位点和参照基因的扩增引物。

实施例2

设计捕获探针，制备杂交膜。

所述捕获探针的长度为17-24个碱基，探针序列与HIV扩增产物序列互补，其3’端位于待检测突变位点前一个碱基，即探针延伸的第一个碱基为待检突变碱基；在每条探针序列5′端用氨基进行标记，氨基与探针序列间用多聚碳链连接。探针用NaHCO3稀释后，取5微升用点样仪按照图1所示位置点在杂交膜上。杂交膜购买自Pall公司。

表2：12个待检HIV耐药突变位点和参照基因的识别延伸探针

  探针名称  探针方向  Tm  GC含量％  探针序列  L76V  R  45.9  45.5  TTGACAGGTGTAGGTCCTACTA  T215Y  R  44.9  40  GATGTTTTTTGTCTGGTGTG  M184V  R  45.9  36.4  GATCCTACATACAAATCATCCA  K65R  F  45.1  35  TCCAGTATTTGCCATAAAGA  K70R  F  44.9  29.2  CCATAAAGAAAAAAGACAGTACTA  K103N  F  45.6  38.9  CGCAGGGTTAAAAAAGAA  M41L  F  45.1  33.3  GCATTAGTAGAAATTTGTACAGAG  I47A  R  45.4  56.3  ACCTCCAATTCCCCCT  Y181C  R  44  27.3  ATACAAATCATCCATGTATTGA  D67N  R  44  29.2  CTAATTTTCTCCATTTAGTACTGT  V32I  F  44  42.9  GATACAGGAGCAGATGATACA  βactin  F  43.9  50.0  CAGGAGGAGCAATGATCT

实施例3

扩增病毒基因序列

用于从血浆中提取病毒核酸提取试剂为Qiagen公司(QIAamp MinElute Virus Spin Kit)。

取200微升血浆或血清，用上述试剂盒进行病毒RNA提取。

通过一步法RT-PCR扩增，获得靶序列扩增产物。扩增试剂为Qiagen公司QIAGENOneStep RT-PCR Kit。PCR扩增反应体系参见表3。三组扩增引物每组引物终浓度为0.6微摩尔。

表3：扩增体系

  成分  体积(μL)  终浓度  RNA  5  上游引物  1.5  0.6μmol/L  下游引物  1.5  0.60.6μmol/L  酶  1  5*buffer  5  dNTP  1  10mM each  DEPC水  10  合计  25

PCR反应条件为50℃ 30min；95℃ 15min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，35循环；72℃ 10min 4℃保温。同时，将无菌双蒸水作为阴性对照。将对照样本与待测样本按照相同的反应过程进行反应和测试，以验证检测的有效性。

实施例4

杂交反应及延伸标记

杂交及延伸反应采用凯普公司杂交仪。

将扩增产物95摄氏度变性

25μL的PCR产物95℃5min变性，冰水浴。

放置好杂交膜，1000μL 40℃预热的杂交液温浴2min后泵干。

在500μL 40℃预热的杂交液(2×SSPE 0.1％SDS)中加入变性后的PCR产物，温浴杂交10min，泵干。

用40℃预热的杂交液洗3次，800μL/次。

以下延伸反应中使用的DNA合成酶为宝生物工程(大连)有限公司ExTaq。

用40℃预热的1x PCRBuffer洗2次，500μL/次。

按照表4分别配置4种延伸反应溶液，分别加入到相应的延伸膜上，40℃温浴1h。生物素标记单核苷酸BIOTIN-11-dCTP、BIOTIN-11-dATP、BIOTIN-11-dGTP、BIOTIN-11-dUTP均购自PerKin Elmer公司。40℃延伸1小时。延伸结束后用40℃预热的杂交液洗3次，800μL/次。

25℃500μL封闭液洗(5％BSA 1×PBS)一次，500μL封闭液封闭5min后泵干。

表4：延伸反应体系配置方法

实施例5

酶标、显色、及终止反应

在温度在25℃是，加入500μL的酶标液(AP-labeled Streptavidin，5％ BSA，1×PBS)，温浴5min后泵干。

36℃用洗液(0.5％Tween20，1×PBS)洗膜4次，800μL/次。

加入500μL NBT/BCIP(ROCHE 11681451001)溶液，显色3-5min至显色后泵干。

用溶液1×PBS洗三次，1000μL/次，用蒸馏水漂洗。

实施例6

结果判读

当其他位置出现显色时，参照图1所示，某一位置出现显色点时即可以判断样品中含有这种基因突变。

当参照点显色时，可以判断本次实验结果成立，否则实验失败，需要重新提取核酸进行检测；

如图2所示，杂交膜上的特定位置与某一种突变相互对应，如图2中V32I所显示，在第一排第二列的显色点表明检测样品中含有V32I的突变，而没有其他突变体存在。