核酸存在比测定装置、核酸存在比测定方法、判断方法及核酸存在比测定试剂盒

摘要

提供能够简易地测定核酸存在比的核酸存在比测定装置、核酸存在比测定方法、判断方法以及核酸存在比测定试剂盒。一种核酸存在比测定装置，其包括：检测单元，在不同的温度范围内检测具有1个以上熔解温度的核酸混合物的熔解曲线的检测信号；存在比计算单元，基于从由上述检测单元检测出的检测信号中得出的特征量之比和标准信息，计算核酸存在比。

说明书

技术领域

本发明涉及核酸存在比测定装置、核酸存在比测定方法、 判断方法及核酸存在比测定试剂盒。

背景技术

以往，提出了一种熔解曲线分析方法及熔解曲线分析装置， 其根据以微分熔解曲线表示的熔解曲线判断不同的两个峰的有 无以及其温度范围，从而辨别基因多态性的类型；其中，微分 熔解曲线表示的是：对表示各温度下样品的信号值的熔解曲线 的信号值进行微分而得的信号微分值与温度的关系(例如，参 照专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2009/081965号小册子

发明内容

发明要解决的问题

然而，在专利文献1的技术中，存在以下问题：即使能够自 动地辨别基因多态性的类型，也无法得到该基因的变异的比例。

本发明是为了解决上述问题而完成的，其目的在于提供通 过简易地计算核酸存在比即可测定核酸存在比的核酸存在比测 定装置、核酸存在比测定方法、核酸存在比测定程序、判断方 法以及核酸存在比测定试剂盒。

用于解决问题的方案

为了达成上述目的，本发明的核酸存在比测定装置包括以 下结构：检测单元，在不同的温度范围内检测具有1个以上熔解 温度的核酸混合物的熔解曲线的检测信号；存在比计算单元， 基于从由上述检测单元检测出的检测信号中得出的特征量之比 和标准信息，计算核酸存在比。标准信息是指表示特征量之比 与核酸存在比的关系的信息，例如，有表示特征量之比与核酸 存在比的关系的标准曲线、表、计算式等。

根据本发明的核酸存在比测定装置，检测单元，在不同的 温度范围内检测具有1个以上熔解温度的核酸混合物的熔解曲 线的检测信号。而且，存在比计算单元，基于从由检测单元检 测出的检测信号中得出的特征量之比和标准信息，计算核酸存 在比，从而测定待测物(测定对象核酸混合物)中的核酸存在 比。

此外，本发明的核酸存在比测定装置的其他形态可以包括 以下结构：存储单元，存储表示特征量之比与存在比的关系的 标准信息；或输入单元，用于输入上述标准信息；其中，所述 特征量是基于从具有各不相同的熔解温度的核酸的存在比各不 相同的多个核酸混合物各自得出的表示温度与检测信号的关系 的熔解曲线、从包含上述熔解温度的多个温度范围内的上述熔 解曲线的检测信号中得出的。

根据这样的形态，存储单元，存储表示特征量之比与存在 比的关系的标准信息，其中，所述特征量是基于从具有各不相 同的熔解温度的核酸的存在比各不相同的多个核酸混合物各自 得出的表示温度与检测信号的关系的熔解曲线、从包含各不相 同的熔解温度的多个温度范围内的熔解曲线的检测信号中得出 的。此外，该标准信息可由输入单元输入。而且，基于测定对 象核酸混合物的熔解曲线的与多个温度范围分别对应的温度范 围内的熔解曲线的检测信号，计算特征量之比，并基于所计算 出的特征量之比和标准信息，计算核酸存在比，从而测定待测 物中的核酸存在比。

这样，基于表示多个核酸存在比与各核酸的从包含熔解温 度的多个温度范围内的熔解曲线的检测信号中得出的特征量之 比的关系的标准信息，和从测定对象核酸混合物的与多个温度 范围分别对应的温度范围内的熔解曲线的检测信号中得出的特 征量之比，简易地计算核酸存在比，从而可测定待测物中的核 酸存在比。

此外，本发明的核酸存在比测定装置的其他形态中，上述 特征量之比可以为：从一个熔解温度附近(大致相当于熔解温 度)的检测信号水平减去背景水平所得的值与从其他熔解温度 附近的检测信号水平减去背景水平所得的值之比；从一个熔解 温度附近的检测信号的微分值减去背景水平所得的值与从其他 熔解温度附近的检测信号的微分值减去背景水平所得的值之 比；一个温度范围内的检测信号的微分值之和与其他温度范围 内的检测信号的微分值之和之比；或者从一个温度范围内的检 测信号的微分值之和减去背景水平之和所得的值与从其他温度 范围内的检测信号的微分值之和减去背景水平之和所得的值之 比。

熔解温度附近的检测信号，原本理想的是使用熔解温度的 检测信号，但考虑到因试剂条件(待测物的状态)、循环数而产 生的熔解温度的偏移、因测定装置的检测灵敏度(例如，以1℃ 为单位进行测定)而产生的误差，熔解温度附近的检测信号意 味着使用熔解温度附近的检测信号。另外，熔解温度附近的检 测信号包含熔解温度的检测信号。

此外，本发明的核酸存在比测定装置的其他形态中，上述 特征量之比可以为：在表示温度与检测信号的微分值的关系的 熔解曲线中，由通过一个温度范围的下限值所对应的点和上述 一个温度范围的上限值所对应的点所作的直线与熔解曲线所围 成的部分的面积，与由通过其他温度范围的下限值所对应的点 和上述其他温度范围的上限值所对应的点所作的直线与熔解曲 线所围成的部分的面积之比。

此外，本发明的核酸存在比测定装置的其他形态中，上述 温度范围的上限值或下限值可以为：在表示温度和检测信号的 微分值的关系的熔解曲线中的两个峰间检测信号的微分值为最 小时的温度；在表示温度和检测信号的微分值的关系的熔解曲 线中峰的峰脚所对应的温度；或在表示温度和检测信号的微分 值的关系的熔解曲线中距离峰±15℃以内的温度。

此外，本发明的核酸存在比测定装置的其他形态中，上述 温度范围的上限值或下限值可以为在表示温度和检测信号的微 分值的关系的熔解曲线中距离峰±10℃以内的温度。

此外，本发明的核酸存在比测定装置的其他形态中，上述 温度范围的上限值或下限值可以为在表示温度和检测信号的微 分值的关系的熔解曲线中距离峰±7℃以内的温度。

此外，本发明的核酸存在比测定装置的其他形态中，上述 一个温度范围的上限值与含有高于上述一个温度范围的温度范 围的下限值可以为不同的值。

此外，本发明的核酸存在比测定装置的其他形态中，从上 述一个温度范围的下限值到上限值的宽度与从上述其他温度范 围的下限值到上限值的宽度可以为同一宽度。

此外，本发明的核酸存在比测定装置的其他形态中，从上 述一个温度范围的下限值到上限值的宽度与从上述其他温度范 围的下限值到上限值的宽度可以为不同的宽度。

此外，本发明的核酸存在比测定装置的其他形态可以进一 步含有以下结构：温度控制单元，控制上述核酸混合物的温度 变化；测量单元，测量吸光度、荧光强度或相对荧光强度作为 上述检测信号。通过该结构，使用从待测物测量出的检测信号， 能够测定待测物中的核酸存在比。

此外，本发明的核酸存在比测定方法可以为包括以下工序 的方法：检测工序，在不同的温度范围内检测具有1个以上熔解 温度的核酸混合物的熔解曲线的检测信号；存在比计算工序， 基于从上述检测工序中检测出的检测信号中得出的特征量之比 和标准信息，计算核酸存在比。

根据本发明的核酸存在比测定方法，在检测工序中，在不 同的温度范围内检测具有1个以上熔解温度的核酸混合物的熔 解曲线的检测信号。而且，在存在比计算工序中，基于从上述 检测工序中检测出的检测信号中得出的特征量之比和标准信 息，计算核酸存在比，从而测定待测物中的核酸存在比。

此外，本发明的核酸存在比测定方法的其他形态可以为包 括以下工序的方法：标准信息制作工序，制作表示特征量之比 与存在比的关系的标准信息，所述特征量是基于从具有各不相 同的熔解温度的核酸的存在比各不相同的多个核酸混合物各自 得出的表示温度与检测信号的关系的熔解曲线、从包含上述熔 解温度的多个温度范围内的上述熔解曲线的检测信号中得出 的；特征量之比计算工序，基于测定对象核酸混合物的熔解曲 线的与上述多个温度范围分别对应的温度范围内的熔解曲线的 检测信号，计算特征量之比；存在比计算工序，基于上述特征 量之比计算工序中计算出的特征量之比和上述标准信息制作工 序中制作出的标准信息，计算核酸存在比。经由这些工序计算 核算存在比，从而能够测定核酸存在比。

此外，本发明的核酸存在比测定程序可以为用于使计算机 作为存在比计算单元发挥作用从而使计算机测定待测物中的核 酸存在比的程序；存在比计算单元，读取在不同的温度范围内 检测出的检测信号，并基于从读取的检测信号中得出的特征量 之比和标准信息，计算核酸存在比，其中，所述检测信号为具 有1个以上熔解温度的核酸混合物的熔解曲线的检测信号。

此外，本发明的核酸存在比测定程序的其他形态可用于使 计算机作为获取标准信息的获取单元、特征量之比计算单元、 及存在比计算单元发挥作用。获取单元，从存储有表示特征量 之比与存在比的关系的标准信息的存储单元获取该标准信息， 或者获取由输入单元输入的上述标准信息；其中，所述特征量 是基于从具有各不相同的熔解温度的核酸的存在比各不相同的 多个核酸混合物各自得出的表示温度与检测信号的关系的熔解 曲线、从包含上述熔解温度的多个温度范围内的上述熔解曲线 的检测信号中得出的；特征量之比计算单元，基于测定对象核 酸混合物的熔解曲线的与上述多个温度范围分别对应的温度范 围内的熔解曲线的检测信号，计算特征量之比；以及存在比计 算单元，基于由上述特征量之比计算单元计算出的特征量之比 和由上述获取单元获取的标准信息，计算核酸存在比。由此， 能够使计算机测定待测物中的核酸存在比。此外，作为本发明 的核酸存在比测定程序的其他形态，可以使上述计算机作为控 制单元发挥作用，控制单元用于使其他计算机执行上述检测信 号、一部分的计算。

此外，本发明的判断方法为以下方法：基于使用上述核酸 存在比测定装置、上述核酸存在比测定方法或上述核酸存在比 测定程序而得到的核酸存在比和预先确定的核酸存在比与患者 的状态的关系，判断患者的状态。

此外，本发明的判断方法为以下方法：基于使用上述核酸 存在比测定装置、上述核酸存在比测定方法或上述核酸存在比 测定程序而得到的核酸存在比和预先确定的核酸存在比与体质 及相适于体质的药剂处方量中至少一者的关系，判断体质及相 适于体质的药剂处方量中至少一者。

此外，本发明的核酸存在比测定试剂盒为以下核酸存在比 测定试剂盒：其被使用在上述核酸存在比测定装置、上述核酸 存在比测定方法或上述核酸存在比测定程序中测定上述核酸存 在比之际，该试剂盒含有：能够杂交到上述核酸混合物中的核 酸中可能存在的包含靶变异的核酸序列区域的探针；能够扩增 上述核酸混合物中的核酸中可能存在的包含靶变异的核酸序列 的引物对。此外，也可基于预先确定的核酸存在比与体质及相 适于体质的药剂处方量中至少一者的关系，将本发明的核酸存 在比测定试剂盒用于判断体质及相适于体质的药剂处方量中至 少一者。

此外，本发明的核酸存在比测定装置可以包括以下结构：

存储单元，存储表示特征量之比与存在比的关系的标准信 息；其中，所述特征量是基于从多个核酸存在比各不相同的多 个核酸混合物各自的表示温度与检测信号的关系的熔解曲线、 从包含大小各不相同的熔解温度的多个温度范围内的熔解曲线 的检测信号中得出的；特征量之比计算单元，基于测定对象核 酸混合物的熔解曲线的与上述多个温度范围分别对应的温度范 围内的熔解曲线的检测信号，计算特征量之比；存在比计算单 元，基于由上述特征量之比计算单元计算出的特征量之比和上 述存储单元中存储的标准信息，计算核酸存在比。

发明的效果

如以上说明的那样，根据本发明的核酸存在比测定装置、 核酸存在比测定方法以及核酸存在比测定程序，基于从具有不 同的熔解温度的核酸混合物的熔解曲线的检测信号中得出的特 征量之比和标准信息，能够得到以下效果：通过简易地计算核 酸存在比即可测定待测物中的核酸存在比。

此外，根据本发明的判断方法和判断试剂盒，能够得到以 下效果：使用通过本发明的核酸存在比测定装置、核酸存在比 测定方法或核酸存在比测定程序而得到的核酸存在比，能够判 断患者的状态。

附图说明

图1为表示本实施方式的核酸存在比测定装置的结构的框 图。

图2中，(A)为表示核酸混合物的熔解曲线的一个例子、(B) 为表示微分熔解曲线的一个例子的图。

图3为表示微分熔解曲线的其他例子的图。

图4为表示标准曲线的一个例子的图。

图5为表示本实施方式的核酸存在比测定装置中核酸存在 比测定处理例程的内容的流程图。

图6为表示实施例中的核酸混合物的各样品的微分熔解曲 线的图。

图7为表示实施例中的测定对象核酸混合物的熔解曲线的 图。

图8为表示实施例中的测定对象核酸混合物的微分熔解曲 线的图。

图9为表示核酸混合物的(A)熔解曲线及(B)微分熔解 曲线的其他例子的图。

图10为用于对特征量之比的其他例子进行说明的图。

图11为表示微分熔解曲线中两个温度范围分离的例子的 图。

图12为表示微分熔解曲线中基值偏移的例子的图。

附图标记说明

10核酸存在比测定装置

12操作部

14显示部

16计算机

20CPU

22ROM

24RAM

26存储器

具体实施方式

以下，参照附图详细说明本发明的核酸存在比测定装置的 实施方式。

如图1所示，本实施方式的核酸存在比测定装置10具备：操 作部12，由键盘、鼠标、触摸面板、条形码读取器等读取装置 构成且用于通过操作而输入各种信息；显示部14，用于显示核 酸存在比的测定结果；以及计算机16，实行核酸存在比的测定 处理。

计算机16含有以下结构：CPU20，控制核酸存在比测定装 置10总体；ROM22，作为存储后述核酸存在比测定处理等的各 种程序的存储介质；RAM24，作为工作区暂时存储数据；存储 器26，作为存储有各种信息的存储单元；输入输出端口(I/O端 口)28；网络接口(网络I/F)30；以及连接这些构件的总线。 I/O端口28上连接着操作部12及显示部14。另外，还可设置HDD。

此外，存储器26，存储有标准曲线，所述标准曲线表示从 包含大小各不相同的熔解温度的两个温度范围内的熔解曲线的 检测信号的微分值之和减去背景水平之和所得的值之比与两种 核酸的存在比的关系；其中，所述从包含大小各不相同的熔解 温度的两个温度范围内的熔解曲线的检测信号的微分值之和减 去背景水平之和所得的值是基于从两种核酸存在比各不相同的 多个核酸混合物各自的熔解曲线。另外，标准曲线也可预先存 储在ROM22或HDD。此外，本实施方式中，虽然对于在计算前 事先读取预先存储的标准曲线的情况进行说明，但也可以用条 形码读取器读取包含标准曲线的信息的条码，或者用各种读取 装置读取记录在IC芯片、RFID中的标准曲线的信息等从操作部 12输入标准曲线的信息，还可以从介由I/O端口28、网络I/F30 连接的外部装置接收标准曲线的信息。

这里，对标准曲线的制作方法进行说明。

首先，例如，制作使野生型核酸Wt和突变型核酸Mt这两种 核酸的存在比各不相同的多个核酸混合物，对于多个核酸混合 物的每一个，使用熔解曲线分析装置而得到熔解曲线。

图2中，(A)表示某一个核酸混合物的由温度与吸光度或 荧光强度等检测信号的关系所表示的熔解曲线，(B)表示由温 度与检测信号的微分值的关系所表示的熔解曲线(也称作微分 熔解曲线)。通过从该微分熔解曲线检测峰，从而检测核酸Wt 的熔解温度Tm_W及核酸Mt的熔解温度Tm_M，设定分别包含Tm_W及Tm_M的温度范围。作为包含Tm_W的温度范围ΔT_W，例如，可以 设定成以Tm_W与Tm_M之间检测信号的微分值最小时的温度为下 限、以检测信号的峰的峰脚所对应的温度为上限的温度范围。 此外，作为包含Tm_M的温度范围ΔT_M，例如，可以设定成以Tm_W与Tm_M之间检测信号的微分值最小时的温度为上限、以检测信 号的峰的峰脚所对应的温度为下限的温度范围。另外，温度范 围ΔT_W及温度范围ΔT_M可以如图2的(B)所示那样设定成同一 宽度(例如10℃)，或者，如图3所示那样设定成不同的宽度(例 如，温度范围ΔT_W为7℃，温度范围ΔT_M为16℃)。此外，温度范 围ΔT_W及温度范围ΔT_M可以设定成从各自的熔解温度Tm加上 X℃、减去X℃的宽度(X℃为例如15℃以内，优选10℃以内， 更优选7℃以内)。自动地进行这样的温度范围的设定是容易的。

接着，对于各个温度范围ΔT_W及温度范围ΔT_M，求出由通过 微分熔解曲线的温度范围的下限所对应的点和上限所对应的点 所作的直线与微分熔解曲线所围成的面积(图2的(B)的斜线 部分)。作为面积的求法的一个例子，具体可按以下方式求得。 设温度T下的检测信号的微分值为f(T)，设温度T下的基值为B (T)，根据下述式(1)求得。

面积S＝{f(T_s+1)-B(T_s+1)}+{f(T_s+2)-B(T_s+2)}

+…+{f(T_e-1)-B(T_e-1)}…(1)

其中，Ts为各温度范围的下限值，Te为上限值。此外，各 温度T的基值B(T)为根据下述式(2)求得的值，表示检测信 号中所包含的背景水平。通过从检测信号的微分值减去该基值， 从而能够更适当地去除检测信号中所包含的背景的影响。

B(T)＝a×(T-T_s)+f(T_s)…(2)

其中，a＝{f(T_e)-f(T_s)}/(T_e-T_s)。

根据上述式(1)及式(2)，对各核酸混合物，求出温度范 围ΔT_W下的面积S_W及温度范围ΔT_M下的面积S_M，制作表示面积 比与各核酸混合物的存在比的关系的标准曲线。图4表示横轴采 用存在比(核酸Mt相对于核酸混合物的总量的比例)、纵轴采用 面积比(S_M/S_W)的标准曲线的一个例子。将这样制作的标准曲 线预先存储在存储器26中。另外，面积比可以设定为S_W/S_M。

接着，参照图5，对于本实施方式的核酸存在比测定装置10 中所实行的对测定对象核酸混合物的核酸存在比测定处理例程 进行说明。

在步骤100中，读取存储在存储器26中的标准曲线。

接着，在步骤102中，获取两种核酸存在比未知的待测物(测 定对象核酸混合物)的熔解曲线的数据。熔解曲线的数据，可 以从介由网络I/F30连接的熔解曲线分析装置等的外部装置获 取，或者通过读取记录在记录介质的数据来获取。

接着，在步骤104中，将上述步骤102中获取的熔解曲线的 检测信号对温度进行微分，从而计算表示温度与检测信号的微 分值的关系的微分熔解曲线。

接着，在步骤106中，对上述步骤104中计算的微分熔解曲 线，设定与在制作上述步骤100中读取的标准曲线时设定的各个 温度范围ΔT_W及ΔT_M对应的温度范围ΔT’_W及ΔT’_M。另外，温度 范围ΔT’_W及ΔT’_M可以设定成与制作标准曲线时设定的温度范 围ΔT_W及ΔT_M相同的温度范围，也可设定成与温度范围ΔT_W及 ΔT_M近似的温度范围。

而且，对于各个温度范围ΔT’_W及温度范围ΔT’_M，求出由通 过微分熔解曲线的温度范围的下限所对应的点和上限所对应的 点所作的直线与微分熔解曲线所围成的面积。具体而言，根据 式(1)及式(2)，采用与制作标准曲线时计算各温度范围的面 积所用相同的方法，计算温度范围ΔT’_W下的面积S’_W及温度范围 ΔT’_M下的面积S’_M。

接着，在步骤108中，使用上述步骤106中计算的面积S’_W及S’_M，计算面积比S’_M/S’_W。

接着，在步骤110中，基于上述步骤108中计算出的面积比 S’_M/S’_W和上述步骤100中读取的标准曲线，计算与面积比 S’_M/S’_W对应的核酸存在比，从而测定待测物的核酸存在比。即， 测定待测物的变异的比例。

接着，在步骤112中，按照显示部14中显示上述步骤110中 的测定结果的方式，输出测定结果，从而结束处理。

另外，上述例程中，步骤102中，在读取熔解曲线之前，事 前读取标准曲线(步骤100)，只要在步骤110中的基于面积比及 标准曲线测定核酸存在比(变异的比例)之前，则可以在任一 阶段进行标准曲线的读取。

如以上说明的那样，根据本实施方式的核酸存在比测定装 置，基于表示两种核酸存在比与各核酸的从包含熔解温度的两 个温度范围内的微分熔解曲线得出的面积比的关系的标准曲 线，和从存在比未知的测定对象核酸混合物的微分熔解曲线的 与两个温度范围分别对应的温度范围内的微分熔解曲线得出的 面积比，简易地计算待测物的核酸存在比，从而简易地测定待 测物的核酸存在比。即，可简易地测定待测物的变异的比例。

[实施例1]

以下，使用c-kit基因的部分序列作为测定对象核酸，对本 发明的一个实施例进行说明。

作为样品使用表3所示的核酸混合物的样品(10³拷贝/反应 液)，使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科 来株式会社制)进行PCR及Tm分析。PCR反应液组成如表1所示， PCR及Tm分析的条件如表4所示。

[表1]

[表2]

  名称   序列   mer   F引物   5′-tgtattcacagagacttggca-3′   21   R引物   5′-gagaatgggtactcacgtttc-3′   21   探针   5′-gatgtctctggctagacc-(BODIPY FL)-3′   18

[表3]

另外、此处，对于Wt质粒为100％的情况及Mt质粒为 100％的情况也按照核酸混合物的方式进行处理。

质粒使用在pT7Blue T-vector(宝生物工程株式会社)中插 入下述所示序列(Wt序列：序列号4，Mt序列：序列号5)，用 EcoRI使其线性化而成的质粒。Wt序列与Mt序列中，大写字母 所示的碱基不同。以插入有Wt序列的质粒为Wt质粒，以插入有 Mt序列的质粒为Mt质粒。

Wt序列：

cactatagtattaaaaagttagttttcactctttacaagttaaaatgaatttaaatggttttcttttct

cctccaacctaatagtgtattcacagagacttggcagccagaaatatcctccttactcatggtc

ggatcacaaagatttgtgattttggtctagccagagAcatcaagaatgattctaattatgtggt

taaaggaaacgtgagtacccattctctgcttgacagtcctgcaaaggatttttagtttcaacttt

cgataaaaattgtttcctgtgactttcataatgtaaat

Mt序列：

cactatagtattaaaaagttagttttcactctttacaagttaaaatgaatttaaatggttttcttttct

cctccaacctaatagtgtattcacagagacttggcagccagaaatatcctccttactcatggtc

ggatcacaaagatttgtgattttggtctagccagagTcatcaagaatgattctaattatgtggtt

aaaggaaacgtgagtacccattctctgcttgacagtcctgcaaaggatttttagtttcaactttc

gataaaaattgtttcctgtgactttcataatgtaaat

[表4]

图6表示由上述条件测定的各样品的微分熔解曲线。本实施 例中，得到荧光强度作为检测信号。从图6的微分熔解曲线检测 峰，从而求得各核酸的熔解温度Tm_W及Tm_M，设定包含求得的 熔解温度的温度范围ΔT_W(58℃～66℃)、温度范围ΔT_M(50℃～ 58℃)。然后，对于各样品，按照上述式(1)及式(2)，求得 温度范围ΔT_W下的面积S_W及温度范围ΔT_W下的面积S_M，并求得 面积比S_M/S_W。表5表示各样品的面积S_M及S_W以及面积比S_M/S_W。

[表5]

  样品名   S_M  S_W  S_M/S_W  Wt 100％   0   879   0.0％   Mt 10％   0   924   0.0％   Mt 20％   39.6   800.5   4.9％   Mt 30％   121.9   652   18.7％   Mt 40％   147.8   619   23.9％   Mt 50％   238.5   509   46.9％   Mt 60％   333.5   433.5   76.9％   Mt 70％   375   346   108.4％   Mt 80％   471   192   245.3％   Mt 90％   618.5   43.5   1421.8％   Mt 100％   632.5   0   -

基于表5所示的各值，制作横轴采用Mt在样品总量中的比 例、纵轴采用面积比S_M/S_W的标准曲线。这里制作的标准曲线与 图4作为一个例子所示出的标准曲线相同。

接着，使用该标准曲线，测定Wt和Mt的存在比未知的测定 对象核酸混合物的核酸存在比。

首次，获取图7中示出的表示测定对象核酸混合物的温度与 荧光强度的关系的熔解曲线的数据(步骤102)，如图8所示那样， 通过将熔解曲线的荧光强度进行微分，从而计算表示温度与荧 光强度的微分值的关系的微分熔解曲线(步骤104)。

接着，对于计算出的微分熔解曲线，设定与制作图4的标准 曲线时设定的温度范围ΔT_W(58℃～66℃)、温度范围ΔT_M(50℃～58℃)相同的温度范围ΔT’_W及温度范围ΔT’_M，根据式 (1)及式(2)，计算温度范围ΔT’_W下的面积S’_W及温度范围ΔT’_M下的面积S’_M(步骤106)。此处，算得S’_W＝730，面积S’_M＝241.5。

接着，使用计算出的面积S’_W及S’_M，计算面积比S’_M/S’_W(步 骤108)。此处，算得S’_M/S’_W＝0.331(33.1％)。

接着，在图4的标准曲线中，通过计算面积比S’_M/S’_W(＝ 33.1％)所对应的Mt的比例即变异的比例，从而测得变异的比 例(步骤110)。此处，Mt的比例为40～50％之间。

另外，在上述实施例中，作为表示熔解状态的检测信号， 对于使用采用发出荧光的探针并利用与荧光物质相应的激发光 而放射的荧光强度的情况进行了说明，但并不限定于此。例如， 可以采用由于双链核酸熔解而增加的、260nm下的吸光度。此 外，上述实施例中，对于使用双链形成(非熔解)时发生猝灭 的探针的情况进行了说明，但也可使用双链形成时发出荧光的 探针。此种情况下，可以得到如图9的(A)所示的表示温度与 荧光强度的关系的熔解曲线，由此可以得到如图9的(B)所示 的微分熔解曲线。

作为荧光物质的具体例，可列举出诸如溴化乙锭、SYBR (注册商标)Green之类的嵌入剂。这些嵌入剂通常通过双链的 形成而发出荧光，并通过双链的熔解而使荧光的产生受到抑制。 此外，荧光物质例如可以与构成双链核酸的至少一个单链核酸 结合。作为荧光物质所结合的单链核酸，例如可列举出像本实 施例中使用的作为鸟嘌呤猝灭探针而已知的QProbe(注册商标) 那样的所谓荧光猝灭探针。荧光猝灭探针通常通过双链的形成 而猝灭荧光，并通过双链的熔解而产生荧光。

此外，表示本发明的核酸混合物的熔解状态的检测信号， 如上述那样，例如，可以是通过样品的非熔解而产生、并通过 样品的熔解而使得产生受到抑制的检测信号，相反地，也可以 是通过样品的非熔解而使得产生受到抑制、并通过样品的熔解 而产生的检测信号。此外，检测信号的微分值，例如，可以通 过使检测信号对温度进行微分而以“dF/dT”来表示，也可以 “-dF/dT”来表示。dF为检测信号的变化量，dT为温度的变化量。 在通过样品的熔解而使得检测信号的产生受到抑制的情况下， 在以“dF/dT”表示检测信号的微分值的微分熔解曲线中，峰呈谷 形；在以“-dF/dT”表示检测信号的微分值的微分熔解曲线中， 峰呈山形。此外，在通过样品的熔解而产生检测信号的情况下， 在以“dF/dT”表示检测信号的微分值的微分熔解曲线中，峰呈山 形，在以“-dF/dT”表示检测信号的微分值的微分熔解曲线中， 峰呈谷形。在任一情况下，均能求出由规定的温度范围下的微 分熔解曲线与表示基值的直线所围成的部分的面积。此外，检 测信号的微分值并不限于使检测信号对温度进行微分而得到的 微分值，也可以采用使检测信号对时间进行微分而得到的微分 值。

此外，在上述实施方式及实施例中，对于使用上述面积比 作为从熔解曲线的检测信号中得出的特征量之比的情况进行了 说明，但并不限定于此。作为特征量之比，如图10的(A)所 示，可以采用熔解温度Tm_W下的检测信号水平F_W与熔解温度 Tm_M下的检测信号水平F_M之比(F_M/F_W)。此外，也可以采用温 度范围ΔT_W的下限值下的检测信号水平与上限值下的检测信号 水平之差ΔF_W，与温度范围ΔT_M的下限值下的检测信号水平与上 限值下的检测信号水平之差ΔF_M之比(ΔF_M/ΔF_W)。此外，还可 以采用从熔解温度Tm_W下的检测信号水平减去背景水平所得的 值(F-B)_W与从熔解温度Tm_M下检测信号水平减去背景水平所 得的值(F-B)_M之比((F-B)_M/(F-B)_W)。

此外，如图10的(B)所示，可以采用熔解温度Tm_W下的检 测信号的微分值f_W与熔解温度Tm_M下的检测信号的微分值f_M之 比(f_M/f_W)。此外，也可以采用温度范围ΔT_W的检测信号的微分 值之和∑f_W(相当于图10的(B)中向右下倾斜的斜线部的面积) 与温度范围ΔT_M的检测信号的微分值之和∑f_M(相当于该图中向 右上倾斜的斜线部的面积)之比(∑f_M/∑f_W)。此外，还可以采 用从熔解温度Tm_W下的检测信号的微分值减去背景水平所得的 值(f-B)_W与从熔解温度Tm_M下的检测信号的微分值减去背景 水平所得的值(f-B)_M之比((f-B)_M/(f-B)_W)。(f-B)_W可以 通过从f_W减去通过温度范围ΔT_W的下限值所对应的点和上限值 所对应的点所作的直线上的与熔解温度Tm_W所对应的值来求 得。对于(f-B)_M而言，也同样可以通过从f_M减去通过温度范 围ΔT_M的下限值所对应的点和上限值所对应的点所作的直线上 的与熔解温度Tm_M所对应的值来求得。

此外，上述实施例中，虽然测定了仅1个碱基不同的核酸存 在比，但只要是作为目标的各个核酸的熔解温度不同，则同源 性没有特别的限制，也可以全无同源性。例如，对于熔解温度 不同且无同源性的基因A和基因B的核酸混合物，也可以测定基 因A和基因B的存在比。

此外，上述实施例中，虽然对于各个核酸使用相同的探针 进行了检测，但也可以使用不同的探针。

此外，上述实施方式及实施例中，虽然对于核酸的各个包 含熔解温度的温度范围(ΔT_W及ΔT_M)连续的情况进行了说明， 但是，如图11所示，在熔解温度分离的情况等中，还可以将温 度范围设定在不连续的范围内。

此外，上述实施方式及实施例中，对于将用于减去背景水 平的基值设为通过微分熔解曲线中的温度范围的下限值所对应 的点和上限值所对应的点所作的直线上的值的情况进行了说 明，例如，基值可以在温度范围的上限值或下限值所对应的检 测信号的微分值中为恒定。但是，如图12所示，在温度范围的 下限值所对应的检测信号的微分值与上限值所对应的检测信号 的微分值之差大的情况下(基值发生规定量以上的偏移的情 况)，如上述实施方式及实施例那样，以通过温度范围的下限值 所对应的点和上限值所对应的点所作的直线上的值为基值时， 能够高精度地去除背景的影响。此外，基值也可以不以直线而 以曲线来确定。

此外，上述实施方式及实施例中，虽然对于对两种核酸的 存在比不同的核酸混合物计算核酸存在比的情况进行了说明， 但是对于三种以上的核酸存在比不同的核酸混合物也可以同样 地适用本发明。

此外，上述实施方式及实施例中，虽然对于使用图4所示的 标准曲线作为标准信息的情况进行了说明，但是也可以采用以 表形式表示特征量之比与核酸存在比的关系的标准信息、以计 算式表示特征量之比与核酸存在比的关系的标准信息。

此外，上述实施方式中，虽然对于显示部14显示测定结果 的情况进行了说明，但是，也可以设置打印装置而在纸等介质 上打印输出测定结果，也可以记录在便携式记录介质上，还可 以将测定结果输出到介由I/O端口28、网络I/F30连接的外部装 置。

此外，本实施方式的核酸存在比测定装置可以进一步设置 以下结构：判断部，基于预先确定的核酸存在比与病情的进展 状况的关系和计算出的核酸存在比，判断病情的进展状况。测 定变异基因与正常基因的存在比，该存在比可以用作用于观察 患者状态的参数。例如，预先制作规定了血中游离核酸中的变 异基因(例如，与癌症相关的基因)和正常基因的比例与病情 的进展状况的关系的表。然后，测定变异基因和正常基因的存 在比，通过与预先制作的表进行比较，可以判断病情的进展状 况。这样，使用所测定的核酸存在比，能够监测患者的状态， 例如病情的进展状况等。

此外，本实施方式的核酸存在比测定装置可以进一步设置 以下结构：判断部，基于预先确定的核酸存在比与体质及相适 于体质的药剂处方量中至少一者的关系和计算出的核酸存在 比，判断体质及相适于体质的药剂处方量中至少一者。体质是 指被测定者的对特定疾病的患病难易度、对特定的药剂给药的 药效。例如，预先制作确立某个基因(具有拷贝数多态性(copy  number variant)的基因)与拷贝数已知的对象基因的比例，与 患上特定疾病的难易度、有无患上特定疾病、病况、药效、药 剂处方量等的关系的表。然后，测定上述拷贝数多态性已知的 基因与对象基因的存在比，通过与预先制作的表进比较，能够 判断患上特定疾病的难易度、药效等的体质，有无患病、病况、 药剂处方量等。这样，使用所测定的核酸存在比，能够判断被 测定者的体质、药剂处方量等。例如已知在CCL3L的拷贝数多 的情况下，为难以患上HIV的体质；已知在FCGR3B的拷贝数少 的情况下，为容易患上如全身性红斑狼疮等之类的自身免疫疾 病的体质。此外，已知在与自闭症、精神分裂症、突发性学习 障害等相关的基因中也表现出此种基因的拷贝数多态性。

此外，本发明的核酸存在比测定试剂盒含有：能够杂交到 包含靶变异的核酸序列的区域的探针；能够扩增包含靶变异的 核酸序列的引物对。通过使用含有这些试剂的测定试剂盒，具 有能够更简便地测定作为目标的基因变异，从而能够测定存在 比等优点。

构成本发明的核酸存在比测定试剂盒的探针及引物的序 列，只要作为目标的基因的序列、以及作为目标的基因变异的 序列是已知的，则本领域技术人员即可基于这些序列进行适当 设计。对于用于有效实施检查所需的探针的长度、引物对的退 火位置等，本领域技术人员也可进行适当调整。

此外，从检测的有效性的观点出发，上述探针优选为带有 标记的标记探针。作为标记探针中的标记物质的具体例，例如 可列举出荧光色素及荧光团。作为标记探针的具体例，例如优 选的是被荧光色素标记、单独时显示荧光且通过形成杂交体而 减少荧光(例如猝灭)的探针。

利用这样的荧光猝灭现象(Quenching phenomenon)的探 针通常被称作荧光猝灭探针。其中，作为上述探针，优选寡核 苷酸的3’区域(例如3’末端)或5’区域(例如5’末端)的碱基被 荧光色素标记的探针，被标记的碱基优选为胞嘧啶(C)。此时， 在上述标记探针杂交的检测目标序列中，优选的是将上述标记 探针的碱基序列设计成与上述标记探针的末端碱基C成对的碱 基或距离上述成对的碱基1～3个碱基位置的碱基为鸟嘌呤 (G)。这样的探针通常被称作鸟嘌呤猝灭探针，已知有大家常 说的Q Probe。这种鸟嘌呤猝灭探针杂交到检测目标序列时，通 过使被荧光色素标记的末端的C与上述检测目标序列中的G接 近，从而显示出上述荧光色素的发光变弱(荧光强度减少)的 现象。只要使用这种探针，根据信号的变动即可容易地确认杂 交与解离。此外，上述标记物质例如通常可以结合到核苷酸的 磷酸基上。

本发明的核酸存在比测定试剂盒中所含的各试剂，可以被 包含在不同的容器中，也可以被包含在同一容器中。另外，本 说明书中的“不同的容器”，只要是可使各试剂分开而能够维持 非接触状态，未必一定为可独立地进行处理的单个容器。

此外，本发明的核酸存在比测定试剂盒中，除了上述各试 剂以外，还可以含有扩增所需的聚合酶等试剂或缓冲液、用于 杂交所需的试剂或缓冲液、用于稀释待测物试样的稀释剂等。 进而，在本发明的核酸存在比测定试剂盒中优选含有记载本发 明的核酸存在比测定方法的说明书、与在试剂盒中可含有或可 追加含有的各种试剂相关的说明书等。

此外，在上述实施方式中，虽然对于通过从熔解曲线分析 装置等外部装置获取熔解曲线的数据或者通过读取记录在记录 介质的数据而获得熔解曲线的数据的情况进行了说明，但是， 也可以一体地构成熔解曲线分析装置和本实施方式的核酸存在 比测定装置。具体而言，除了上述实施方式的构成以外，还可 以设置控制核酸混合物的温度变化的温度控制部和测量吸光 度、荧光强度、相对荧光强度等检测信号的测量部。而且，利 用测量部测量利用温度控制部使作为待测物的核酸混合物发生 温度变化时的检测信号，从而得到熔解曲线的数据。而后，与 上述实施方式同样可以使用熔解曲线测定待测物的核酸存在 比。

另外，也可将规定了上述的核酸存在比测定处理例程的程 序记录在记录介质中而进行提供。