表达大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒mazF-cassette及其构建法和用途

摘要

本发明公开了表达大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒mazF-cassette，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。本发明还公开了该表达盒mazF-cassette的构建方法，包括以下步骤：1)扩增大肠杆菌毒素蛋白mazF基因；2)扩增木糖诱导的启动子PxylA基因；3)扩增抗性基因zeocin；4)将上述三个PCR片段融合成重组PCR片段；5)将重组PCR片段，用限制性内切酶Sal I/Xba I进行酶切，与同样酶切的整合载体pSG1729相连，转化枯草芽孢杆菌1A751，所得转化子为含有该表达盒的宿主菌。该表达盒mazF-cassette能用于构建枯草杆菌通用无标记同源重组系统。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种定点突变、删除和引入外源基因的方法。 

背景技术

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是一类好氧型杆状细菌，在极端条件下，还可以诱导产生抗逆性很强的内源孢子，广泛存在于土壤、湖泊、海洋等，自身没有致病性，只具有单层细胞外膜，能将许多蛋白质直接分泌到培养基中。枯草芽孢杆菌为芽孢杆菌中的第一个基因工程表达菌，广泛用于工业酶的生产，因此B.subtilis作为表达菌株受到越来越多的关注。 

枯草芽孢杆菌表达系统的载体主要有自主复制质粒、整合质粒和噬菌体三种。根据复制方式不同，质粒载体可分为两大类，滚环型复制和θ型复制。来源于金色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的质粒进行滚环复制，复制时产生大量单链DNA(ssDNA)，使质粒容易产生丢失。而利用θ型复制的质粒，一般分子量比较大，在宿主菌的拷贝数比较低(通常是1-10拷贝/每个染色体)，因此能够相对稳定地中遗传。避免芽孢杆菌质粒不稳定的有效途径之一是使用整合型载体。 

迄今为止，枯草杆菌168基因组全序列中仍有超过30％的基因功能未知，后基因组学的研究发展急需一些方便简捷而高效的分子生物学工具来研究和明确这些基因的功能。目前用于基因功能研究的常用方法是反向失活法，即通常同源重组敲除失活某个特定基因或基因簇来研究它们的功能。同源重组整合载体是敲除基因中最常用的载体，它可以通过与宿主菌染色体DNA之前发生单交换或双交换同源重组而完成染色体上特定基因的插入失活和定点突变等目标，也可实现外源基因的插入和染色体大片段的删除等遗传操作。而通常情况下，抗生素抗性基因常作为正筛选标记，即菌株获得抗生素抗性。然而，修饰过的菌株中标记基因的存在给菌株的后续研究带来了许多不便，存在以下缺点：一、目前可以作为枯草芽孢杆菌筛选基因进行遗传操作的标记基因非常有限，当某一菌株已存在某一选择标记基因时，该标记基因在随后的遗传操作中就不能再作为选择标记，必需使该抗生 素基因缺失或更换其它抗性基因；二、在一个菌株中引入过多抗生素抗生基因往往会对菌株的一些生理状态产生不利影响，如影响邻近基因的表达等。此外，对于转基因微生物食品安全性的评价研究，抗生素标记基因的存在增加了转基因微生物及饲料添加剂对人类健康的潜在危险，使之安全性评价的研究更为复杂。因此，对芽孢杆菌进行无标记的遗传操作，对芽孢杆菌基因功能研究的进一步发展和转基因芽孢杆菌安全具有重大意义。 

目前，获得无标记基因的遗传操作方法主要是剔除策略，主要包括基于位点特异重组法和基于特定基因的反向筛选法。 

位点特异重组法是将标记基因置于特定重组位点之间，通过相应的特异识别该位点的重组酶催化，产生特异重组或特异切除，利用此特性可将标记基因剔除。目前微生物主要有五类位点特异重组系统，即细菌噬菌体P1的Cre-loxP系统、酵母质粒FLP-FRT系统、Zygosaccharomyces rouxli的R/RS系统、Mu噬菌体的Gin-gix重组酶系统以及λ噬菌体aatB-P系统。利用Cre-loxP或酵母质粒FLP-FRT系统切除标记基因已有大量报道(Datsenko et al.2000；Yan et al.2008；崔文涛et al.2008；Fontaine et al.2010；胡海红et al.2010；Bryan et al.2011)。此外，有学者利用了I-Sce I核酸内切酶识别特定的18bp的序列而实现标记基因的剔除(Kolisnychenko et al.2002；Posfai et al.2006)。然而，采用上述方法的缺点是，在重组位点均会残留特定的外源非天然的小序列。 

基于特定基因的反向筛选法，是将可控诱导表达一般会抑制宿主菌的生长或产生毒性，因此在添加诱导物的选择性平板上，只有那些发生了第二次单交换将抗生素基因和反向筛选标记基因删除的菌株才可以生长并形成菌落从而被筛选出来。目前最常用的反向筛选标记基因有SacB、upp、blaI和araR基因等(Fabret et al.2002；Brans et al.2004；Hashimoto et al.2005；Liu et al.2008)。 

然而，上述方法有两个共同的缺陷，即必需使用染色体上某个特定基因突变的菌株作为宿主菌株，这是一个较大的限制因素：若将该方法用于其它菌株，就必需事先准备一个特定基因突变的突变型菌株；另外，要准备特定基因缺陷菌株，该菌株的遗传背景必需清楚，如已完成基因组测序的枯草杆菌168或衍生菌株。这种方法对于遗传背景不清楚的菌株则是无效的。 

张晓舟等报道了以大肠杆菌毒素蛋白基因mazF作为枯草芽孢杆菌新反向筛选标记基因，实现了枯草杆菌染色体上特定基因的删除或插入失活，外源目的基因在染色体插入和不改变特定阅读框的内部序列删除操作(Zhang et al.2006)。但该系统也存在一些不足，如它需要限制性内切酶酶切处理和连接过程，同时周期较长，构建一个重组子需要2周左右； mazF基因在Pspac诱导启动子调控之下，会发生泄漏表达，导致自然突变而产生抗mazF菌株；近期不同学者对该系统进行了改进(Morimoto et al.2009；Yang et al.2009)，结合了PCR或更严谨调控的启动子PxylA，使得遗传操作的周期和毒素蛋白泄漏得以改进，但仍然存在很大的问题，基因的删除或插入失活需要至少3600bp的重组PCR片段，且仍需要限制性内切酶处理和连接过程，长片段的PCR产物势必影响到PCR的扩增效率和准确性。 

参考文献如下： 

1、Brans，A.，Filee P.，Chevigne A.，Claessens A.and Joris B.(2004).New integrative method to generate Bacillus subtilis recombinant strains free of selection markers.Appl Environ Microbiol70，7241-50(Brans，A.，Filee P.，Chevigne A.，Claessens A. and Joris B.(2004).新整合方法一种构建无筛选标记重组枯草芽孢杆菌的新整合方法.Appl Environ Microbiol(应用环境微生物)70，7241-50)。 

2、Bryan，A.，Harada K.and Swanson M.S.(2011).Efficient Generation of Unmarked Deletions in Legionella pneumophila.Appl Environ Microbiol 77，2545-8(Bryan，A.，Harada K.and Swanson M.S.(2011).在肺球菌中的高效无标记删除.Appl Environ Microbiol(应用环境微生物)77，2545-8)。 

3、Cutting，S.M.and Vander-Horn P.B.(1990).Genetic analysis.In Molecular Biological Methods for Bacillus ed.Harwood C R and Cutting S M.pp.27-75.Chichester：Wiley press(Cutting，S.M.and Vander-Horn P.B.(1990).遗传分析.芽孢杆菌分子生物学.Harwood C R and Cutting S M.pp.27-75.Chichester：Wiley press(奇切斯特：Wiley出版社).)。 

4、Datsenko，K.A.and Wanner B.L.(2000).One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA 97，6640-5(Datsenko，K.A.and Wanner B.L.(2000).利用PCR产物一步法失活大肠杆菌染色体基因.Proc Natl Acad Sci USA(美国科学院院刊)97，6640-5)。 

5、Fabret，C.，Ehrlich S.D.and Noirot P.(2002).A new mutation delivery system for genome-scale approaches in Bacillus subtilis.Mol Microbiol 46，25-36(Fabret，C.，Ehrlich S.D.and Noirot P.(2002).一种用于枯草芽孢杆菌基因组操作的新突变传递系统.Mol Microbiol(分子微生物)46，25-36)。 

6、Fontaine，L.，Dandoy D.，Boutry C.，Delplace B.，de Frahan M.H.，Fremaux C.，Horvath P.，Boyaval P.and Hols P.(2010).Development of a versatile procedure based on natural transformation for marker-free targeted genetic modification in Streptococcus thermophilus. Appl Environ Microbiol 76，7870-7.(Fontaine，L.，Dandoy D.，Boutry C.，Delplace B.，de Frahan M.H.，Fremaux C.，Horvath P.，Boyaval P.and Hols P.(2010).一种基于链球菌自然转化无标记靶向遗传操作方法的开发.Appl Environ Microbiol(应用环境微生物)76，7870-7)。 

7、Hashimoto，M.，Ichimura T.，Mizoguchi H.，Tanaka K.，Fujimitsu K.，Keyamura K.，Ote T.，Yamakawa T.，Yamazaki Y.，Mori H.，Katayama T.and Kato J.(2005).Cell size and nucleoid organization of engineered Escherichia coli cells with a reduced genome.Mol Microbiol 55，137-49(Hashimoto，M.，Ichimura T.，Mizoguchi H.，Tanaka K.，Fujimitsu K.，Keyamura K.，Ote T.，Yamakawa T.，Yamazaki Y.，Mori H.，Katayama T.and Kato J.(2005).基因组减小的基因工程大肠杆菌的细胞大小和核质.Mol Microbiol(分子微生物)55，137-49)。 

8、Kolisnychenko，V.，Plunkett G.，3rd，Herring C.D.，Feher T.，Posfai J.，Blattner F.R.and Posfai G.(2002).Engineering a reduced Escherichia coli genome.Genome Res 12，640-7 

(Kolisnychenko，V.，Plunkett G.，3rd，Herring C.D.，Feher T.，Posfai J.，Blattner F.R.and Posfai G.(2002).基因组减小大肠杆菌的改造.Genome Res(基因组研究)12，640-7.)。 

9、Liu，S.，Endo K.，Ara K.，Ozaki K.and Ogasawara N.(2008).Introduction of marker-free deletions in Bacillus subtilis using the AraR repressor and the ara promoter.Microbiology 154，2562-70(Liu，S.，Endo K.，Ara K.，Ozaki K.and Ogasawara N.(2008).利用AraR阻遏蛋白和ara启动子在枯草芽孢杆菌中引入无标记删除.Microbiology(微生物)154，2562-70.)。 

10、Morimoto，T.，Ara K.，Ozaki K.and Ogasawara N.(2009).A new simple method to introduce marker-free deletions in the Bacillus subtilis genome.Genes Genet Syst 84，315-8 

(Morimoto，T.，Ara K.，Ozaki K.and Ogasawara N.(2009).一种新的简易的在枯草芽孢杆菌基因中引进无标记的方法.Genes Genet Syst(基因和遗传系统)84，315-8)。 

11、Posfai，G.，Plunkett G.，3rd，Feher T.，Frisch D.，Keil G.M.，Umenhoffer K.，Kolisnychenko V.，Stahl B.，Sharma S.S.，de Arruda M.，Burland V.，Harcum S.W.and Blattner F.R.(2006).、Emergent properties of reduced-genome Escherichia coli.Science 312，1044-6(Posfai，G.，Plunkett G.，3rd，Feher T.，Frisch D.，Keil G.M.，Umenhoffer K.，Kolisnychenko V.，Stahl B.，Sharma S.S.，de Arruda M.，Burland V.，Harcum S.W.and Blattner F.R.(2006).基因组减少的大肠杆菌K12的聚现特性.Science(科学)312，1044-6)。 

12、Yan，X.，Yu H.J.，Hong Q.and Li S.P.(2008).Cre/lox system and PCR-based genome engineering in Bacillus subtilis.Appl Environ Microbiol 74，5556-62(Yan，X.，Yu H.J.，Hong Q.and Li S.P.(2008).枯草芽孢杆菌Cre/lox系统及基于PCR的基因组改造.Appl Environ  Nicrobiol(应用环境微生物)7A，5556-62.)。 

13、Yang，J.，Jiang W.and Yang S.(2009).mazF as a counter-selectable marker for unmarked genetic modification of Pichia pastoris.FENS Yeast Res 9，600-9(Yang，J.，Jiang W.and Yang S.(2009).mazF作为反向筛选标记用于无标记遗传修饰的毕氏酵母.FENS Yeast Res(FEMS酵母研究)9，600-9.)。 

14、Zhang，X.Z.，Yan X.，Cui Z.L.，Hong Q.and Li S.P.(2006).mazF，a novel counter-selectable marker for unmarked chromosomal manipulation in Bacillus subtilis.Nucleic Acids Res 34，e71(Zhang，X.Z.，Yan X.，Cui Z.L.，Hong Q.and Li S.P.(2006).mazF作为一种枯草芽孢杆菌新的反向筛选标记而进行无标记的染色体操作.Nucleic Acids Res(核酸研究)34，e71)。 

15、胡海红，石爱琴，胡艳华，李敏，丁明和赵辅昆(2010).枯草芽孢杆菌整合载体的构建及基因组的改造.浙江理工大学学报，134-139。 

16、崔文涛，任立明，侯健，张颖，陈永福和安晓荣(2008).一种利用Cre/loxP系统进行标记基因删除与靶基因置换的细胞模型研究.生物化学与生物物理进展35，650-660。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种表达大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒mazF-cassette及其构建法，使芽孢杆菌等无标记重组基因缺失或外源基因的整合表达更为方便。 

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种表达大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒mazF-cassette，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。 

作为本发明的表达大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒mazF-cassette的改进：该表达盒包含了抗性基因zeocin、木糖诱导的启动子PxylA和mazF基因，该表达盒DNA片段为936bp。 

本发明还同时提供了上述表达大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒mazF-cassette的构建方法，依次包括以下步骤： 

1)、扩增大肠杆菌毒素蛋白mazF基因； 

2)、扩增木糖诱导的启动子PxylA基因； 

3)、扩增抗性基因zeocm； 

4)、将上述三个PCR片段，通过重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)的方法，融合成一个重组PCR片段(见图1)； 

5)、将所述重组PCR片段，用限制性内切酶Sal I/Xba I进行酶切，与同样酶切的整合载体pSG1729相连，转化枯草芽孢杆菌1A751，所得到转化子为含有该表达盒的宿主菌。 

本发明还同时提供了表达大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒mazF-cassette的用途，其特征是：用于构建枯草杆菌通用无标记同源重组系统。优点为：片段小、操作方便和周期短且效率高。 

作为本发明的表达大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒mazF-cassette的用途的改进：首先构建二侧含有枯草芽孢杆菌淀粉酶基因(amyE)基因的删除重组PCR片段的表达盒，然后将该表达盒转入枯草芽孢杆菌1A751中，从而实现无标记的枯草芽孢杆菌淀粉酶基因(amyE)基因的删除。 

作为本发明的表达大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒mazF-cassette的用途的改进：首先构建枯草芽孢杆菌淀粉酶基因(amyE)基因位点引入绿色荧光蛋白表达盒的重组PCR片段，然后将该重组表达盒转入枯草芽孢杆菌1A751中，从而实现绿色荧光蛋白表达盒的引入，而未留下其它抗生素基因。 

作为本发明的表达大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒mazF-cassette的用途的改进：首先构建含有Skin基因簇((spoIVCB-spoIIIC)+Δpro7(yrkM-yraK))的删除重组PCR片段的表达盒；然后将该表达盒转入枯草芽孢杆菌1A751中，从而实现一个长达97kb的Skin基因簇的删除，而未留下其它抗生素基因。 

作为本发明的表达大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒mazF-cassette的用途的改进：该表达盒可适用于含有阻遏蛋白XylR的原核微生物，适合于其它构建芽孢杆菌属或其它原核微生物的通用无标记同源重组系统。如：B.megaterium，B.amyloliquefaciens，B.pumilus，B.cereus，B.licheniformis，B.halodurans，B.coagulans，B.anthracis等，其它原核微生物包括Staphylococcus xylosus，Tetragenococcus halophila和Lactobacillus pentosus。 

为了克服现有的无标记遗传操作系统中需要限制性内切酶酶切和连接过程、遗传操作周期长、毒素蛋白泄漏和长片段PCR方法等不足，本发明提供了一种且周期短和能够重复遗传操作的无标记同源重组系统。遗传操作缩短到4天，对基因的删除或插入失活仅需要2000bp左右的重组PCR片段。 

本发明提供了两种策略构建用于基因的删除或插入失活。(1)对单个基因的删除或插入失活时，分别扩增目标基因的两个同源DNA片段(每个片段约为500bp左右)，其中一个片段含有来源于另一同源片段30bp同向重复序列(direct-repeats sequence，DR)，通过重 叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)的方法，将两个同源DNA片段与上述的表达盒(mazF-cassette)融合(记为mazF)，即表达盒位于两个同源DNA片段中间，构建成一个重组PCR片段(见图3)。(2)对多个基因或是基因簇的删除或插入失活时，分别扩增该多个基因或是基因簇两侧的两个同源DNA片段(每个片段约为500bp左右，记为A和B)，通过重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)的方法，融合成A-B；同时，扩增该多个基因或基因簇中间的一个同源DNA片段(片段约为500bp左右，记为C)，通过重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)的方法，将上述4个片段融合成A-B-mazF-C，即构建成一个重组PCR片段(见图4)。 

本发明提供了一种策略将外源靶基因(记为D)整合到宿主染色体，而未留下其他基因或核苷酸片段，可以插入到任何非必需基因或特定基因附近，即分别扩增该插入位点附近基因两侧的两个同源DNA片段(每个片段约为500bp左右，记为A和B)，通过上述类似的方法，将上述4个片段融合成A-D-mazF-B，即构建成一个重组PCR片段(见图5)。 

本发明提供了一种将受体菌的靶基因进行无标记删除的策略，而未留下其他基因或核苷酸片段，将上述构建的同源重组PCR片段，转化至枯草芽孢杆菌或其它受体菌中，用抗生素zeocin进行筛选，在抗生素zeocin选择压力下，同源重组PCR片段在宿主体内，发生同源重组，筛选得到阳性转化子，再将阳性转化子涂布于LB+1％(w/v)木糖的固体培养基中，由于诱导物的存在，诱导毒性蛋白的表达，会迫使阳性转化子在另外两个同源区域发生第二次同源重组，将mazF-cassett等剔除，次日检测转化子，进行PCR和抗性敏感性再次验证，得到最终重组菌株，其过程如图6。 

为了实现上述目的，首先构建了枯草芽孢杆菌淀粉酶基因(amyE)基因的删除重组PCR片段，枯草芽孢杆菌淀粉酶基因(amyE)位点引入绿色荧光蛋白表达盒的重组PCR片段，和Skin基因簇((spoIVCB-spoIIIC)+Δpro7(yrkM-yraK))的删除重组PCR片段。将上述三个重组PCR片段转入枯草芽孢杆菌1A751中，分别实现了无标记的枯草芽孢杆菌淀粉酶基因(amyE)的删除、绿色荧光蛋白表达盒的引入和一个长达97kb的Skin基因簇的删除。 

本发明提供了建立了通用型无标记同源重组体系，优化了以往类似技术体系所不同的策略，打破了以前无标记同源重组体系的局限，不仅适用于枯草芽孢杆菌，还可以适用于巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌等。 

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 

图1是实施例1构建的大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒(mazF-cassette)。 

图2是实施例2大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒(mazF-cassette)功能的验证： 

A枯草芽孢杆菌ZPM6涂布于LB固体培养基， 

B枯草芽孢杆菌ZPM6涂布于LB+1％(w/v)木糖固体培养基， 

C枯草芽孢杆菌ZPM6和1A751点种于LB+1％(w/v)淀粉固体培养基， 

D枯草芽孢杆菌ZPM6和1A751点种于LB+1％(w/v)淀粉固体培养基，经碘液复染，透明图显示淀粉酶活性。 

图3是实施例3构建的删除淀粉酶基因(amyE)重组PCR片段。 

图4是实施例4构建引入绿色荧光蛋白质报告基因的重组PCR片段。 

图5是实施例5构建的删除基因簇Skin的重组PCR片段。 

图6是构建无抗性标记的菌株过程与原理示意图： 

A是单个基因删除的示意图； 

B是某一个基因簇删除的示意图； 

C是是重组枯草芽孢杆菌ZPMGS部分基因组结构示意图，含P43GFP报告基因。 

图7是本发明电泳验证图： 

图中：泳道1：DL5000.泳道15：1kb DNA ladder. 

(A)引物对扩增mazF表达盒.泳道2：ZPM6(阳性对照)，泳道3：1A751(阴性对照)，泳道4：ZPM61，泳道5：ZPM61S；(B)引物对扩增gfp基因.泳道6：P43GFP(阳性对照)，泳道7：ZPM61S，泳道8：ZPMGS；(C)引物对扩增amyE基因.泳道9：ZPM61S，泳道10：ZPMGS；(D)引物对扩增mazF表达盒和yqcI基因.泳道11：ZPM62，泳道12：ZPM62S，泳道13：ZPM62，泳道14：ZPM62S。 

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范畴。 

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 

实施例中所使用的载体、菌株、试剂及其来源： 

枯草芽孢杆菌(Bacillus sublitis)1A751，载体pSG1729，载体pDGCZ、P43GFP购自美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心(BGSC，http://www.bgsc.org)；大肠杆菌JM109(属于公知材料)可购自浙江大学；引物合成和序列测定由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成；PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4DNA连接酶、内切酶均购自TaKaRa公司； 抗生素zeocin购自英潍捷基(上海)贸易有限公司。酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。 

实施例1大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒的构建 

(1)引物： 

5ZeoRF：ggcGTCGACGGATCCGAATTCAAGCTTCAGTCCTGCTCCTCGGCCAC 

3ZeoRR：TTCATGAAAGACTTGATATGGCTTTTTATATGTG 

5PxylF：CATATCAAGTCTTTCATGAAAAACTAAAAAAAATATT 

3PxylR：ACCAGATCCTCCTTTAGATGCATTTTATGTCATATTGTA 

5SOEmazF；CATCTAAAGGAGGATCTGGTAATGGTAAGCCGATA 

3SOEmazR：ggcTCTAGACTACCCAATCAGTACGTTAAT 

(2)基因的扩增 

以质粒pDGCZ为模板，5ZeoRF/3ZeoRR为引物PCR扩增zeocin抗性基因；以质粒pSG1729为模板，5PxylF/3PxylR为引物PCR扩增木糖启动子基因；以大肠杆菌JM109基因组为模板，5SOEmazF/3SOEmazR为引物PCR扩增mazF基因； 

反应体系均分别为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板DNA 2μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水31.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸反应10min。 

PCR扩增结束后，将三个PCR产物进行琼脂糖凝胶回收后，待做重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)反应。 

(3)SOE反应 

反应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上述3个PCR产物各取5μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水20.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸50s，11个循环；最后72℃延伸反应10min。 

PCR扩增结束后，以该PCR产物为模板，5ZeoRF/3SOEmazR为引物PCR扩增大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒(mazF-cassette)(图1)； 

反应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板DNA 5μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水28.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退 火10s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸反应10min。 

(4)酶切与连接 

PCR扩增结束后，将步骤3)所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶回收后，用限制性内切酶Sal I/Xba I进行酶切，与同样酶切的整合载体pSG1729进行连接，连接条件为10×Ligase Buffer 2μl、PCR片段8μl、载体pSG1729 8μl，T4 DNA连接酶2μl。16℃连接12h。 

(5)转化 

采用二步法的化学法制备B.subtilis感受态细胞(Cutting et al.1990)，将步骤4)所得的连接产物转入枯草芽孢枯草菌B.subtilis 1A751中，并在LB+zeocin(20μg/ml)平板上筛选转化子，将能在LB+zeocin(20μg/ml)平板的筛选长出来的克隆子时，即得到转化子即为含有该表达盒的宿主菌。 

(6)PCR验证 

以转化子基因组为模板，以5ZeoRF/3SOEmazR为引物PCR扩增大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒(mazF-cassette)，应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板DNA(即步骤5)转化所得的含有该表达盒的宿主菌的DNA)1μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水32.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸反应10min。 

用引物对5ZeoRF/3SOEmazR进行转化子的PCR扩增，将能扩增到大约900bp条带的转化子，即为含有该表达盒的重组子(图7，泳道2和泳道3)。 

上述扩增产物经英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，得SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列，为936bp。即，大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒(mazF-cassette)核苷酸序列为SEQ ID NO：1。 

实施例2大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒功能的验证 

(1)淀粉酶活性验证 

将PCR验证为阳性转化子的菌株，命名为ZPM6(Zeocin-PxylA-MazF)和对照菌株1A751分别点种在LB+1％淀粉的固体平板上，第二天用碘液复染，以检测其淀粉酶活性(图2C和D)；结果显示，ZPM6菌株不能在淀粉培养上形成透明图，丧失的淀粉酶分解功菌，说明mazF-cassette插入到淀粉酶基因(amyE)位置；而对照菌株1A751由于存在完整的淀粉酶基因(amyE)，能在淀粉培养基上形成透明图。 

(2)反向筛选功能的验证 

将上述ZPM6(Zeocin-PxylA-MazF)和对照菌株1A751分别划线于LB+1％(w/v)木糖的固体平板上，第二天观察其生长情况。结果显示，ZPM6菌株在LB+1％(w/v)木糖的固体平板上，诱导物木糖诱导毒性蛋白基因mazF的表达，对细菌产生毒性而不能生长，因此ZPM6菌株在LB+1％(w/v)木糖的固体平板上表现为不能生长；而对照菌株，由于不存在毒性蛋白基因mazF的表达，则能正常生长(图2 A和B)。上述结果说明，所构建的mazF-cassette能起到正向筛选的作用，在诱导物诱导的条件下，也能起到反向筛选的作用，所构建的表达盒功能是可行的。 

实施例3枯草芽孢杆菌淀粉酶基因(amyE)无抗性标记的删除 

(1)引物 

5maZF(Box)：AATCAATAATGGACCAGACGACAGTCCTGCTCCTCGGCCAC 

3SOEmazR：GGCTCTAGACTACCCAATCAGTACGTTAAT 

5fPamyE：AGTCTTCAAAAAATCAAATAAGGAGT 

3fPamyE：TCGTCTGGTCCATTATTGATTTGATAAACGCTTAACCTCATTGGAAATCGCG 

5bPamyE：TGATTGGGTAGTCTAGAGCCCAGATGCGAATACAACAAAAGC 

3bPamyE：GTAAGTCCCGTCTAGCCTTGCCCTC 

注：下划线为与3’端同源片段正向重复(Direct-repeat)的30bp。 

(2)基因的扩增 

以枯草芽孢杆菌ZPM6基因组为模板，5maZF(Box)/3SOEmazR为引物PCR扩增mazF-cassette基因；以枯草芽孢杆1A751基因组为模板，5fPamyE/3fPamyE为引物PCR扩增5’端同源片段；以枯草芽孢杆1A751基因组为模板，5bPamyE/3bPamyE为引物PCR扩增3’端同源片段；反应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板DNA 2μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水31.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸反应10min。 

PCR扩增结束后，将三个PCR产物进行琼脂糖凝胶回收后，待做重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)反应。 

(3)SOE反应 

反应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上述3个PCR产物各取5μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水20.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延 伸2min，11个循环；最后72℃延伸反应10min。 

PCR扩增结束后，以该PCR产物为模板，5fPamyE/3bPamyE为引物PCR扩增重组DNA片段(图3)，反应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板DNA 5μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水28.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸反应10min。 

(4)转化 

采用二步法的化学法制备B.subtilis感受态细胞(Cutting and Vander-Horn 1990)，将上述步骤3)所得的PCR产物直接转入枯草芽孢枯草菌B.subtilis 1A751中，并在LB+zeocin(20μg/ml)平板上筛选转化子，将能在LB+zeocin(20μg/ml)平板的筛选长出来的克隆子时，即得到转化子，待进一步验证。 

(5)PCR验证 

以转化子基因组为模板，以5ZeoRF/3SOEmazR为引物PCR扩增大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒(mazF-cassette)，应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板DNA 1μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水32.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸反应10min。有扩增到目的条带的转化子(图7泳道4)，即为含有该表达盒(即实施例1所述)的宿主菌，记为ZPM61。 

(6)mazF-cassette的剔除 

将上述所得到的转化子ZPM61，涂布于LB+1％(w/v)木糖的固体平板上培养过夜，第二天检测转化子。将能在LB+1％(w/v)木糖的固体平板上来的克隆子，随机挑取并将转化子点种于LB+1％淀粉的固体平板上，第二天用碘液复染，以检测其淀粉酶活性；将无淀粉酶活性的转化子PCR扩增mazF-cassette，以5ZeoRF/3 SOEmazR为引物PCR扩增大肠杆菌毒素蛋白，将没有扩到的转化子命名为ZPM61S(图7泳道5)，即将淀粉酶基因amyE失活并无残留外源核苷酸片段。结果表明：由于诱导物的存在，会迫使ZPM61在两个DR区域发生第二次同源重组，将mazF-cassette的剔除。 

实施例4枯草芽孢杆菌中绿色荧光蛋白质报告基因无抗性标记的引入 

(1)引物 

5maZF(Box)：AATCAATAATGGACCAGACGACAGTCCTGCTCCTCGGCCAC 

3SOEmazR：ggcTCTAGACTACCCAATCAGTACGTTAAT 

5fPamyE：AGTCTTCAAAAAATCAAATAAGGAGT 

3famyEgfp：TACCACCTATCTTAACCTCATTGGAAATCGCG 

5SOEgfp：ATGAGGTTAAGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTG 

3SOEgfp： 

TCGTCTGGTCCATTATTGATTTGATAAACGTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC 

5bPamyE：TGATTGGGTAGTCTAGAGCCCAGATGCGAATACAACAAAAGC 

3bPamyE：GTAAGTCCCGTCTAGCCTTGCCCTC 

5gfp： 

3gfp： 

注：下划线为与3’端同源片段正向重复(Direct-repeat)的30bp。 

(2)基因的扩增 

以枯草芽孢杆菌ZPM6基因组为模板，5maZF(Box)/3SOEmazR为引物PCR扩增mazF-cassette基因；以枯草芽孢杆1A751基因组为模板，5fPamyE/3famyEgfp为引物PCR扩增5’端同源片段；以枯草芽孢杆1A751基因组为模板，5bPamyE/3bPamyE为引物PCR扩增3’端同源片段；以质粒p43GFP为模板，5SOEgfp/3SOEgfp为引物PCR扩增P43GFP基因； 

反应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板DNA 2μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水31.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸反应10min。 

PCR扩增结束后，将四个PCR产物进行琼脂糖凝胶回收后，待做重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)反应。 

(3)SOE反应 

反应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上述4个PCR产物各取5μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水15.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸3min，11个循环；最后72℃延伸反应10min。 

PCR扩增结束后，以该PCR产物为模板，5fPamyE/3bPamyE为引物PCR扩增重组DNA 片段(图4)，反应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板DNA 5μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水28.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸3min，30个循环；最后72℃延伸反应10min。 

(4)转化 

采用二步法的化学法制备B.subtilis感受态细胞(Cutting and Vander-Horn 1990)，将上述PCR产物直接转入枯草芽孢枯草菌B.subtilis 1A751中，并在LB+zeocin(20μg/ml)平板上筛选转化子，将能在LB+zeocin(20μg/ml)平板的筛选长出来的克隆子时，即得到转化子，得到转化子进一步验证。 

(5)PCR验证 

以上述步骤4)所得的转化子基因组为模板，以5gfp/3gfp为引物PCR扩增绿色荧光蛋白基因gfp，应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板DNA 1μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水32.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸反应10min。有扩增到大约750bp目的条带的转化子(图7B，泳道8)，即为含有该表达盒的宿主菌，记为ZPMG。 

(6)mazF-cassette的剔除 

将上述所得到的转化子ZPMG，涂布于LB+1％(w/v)木糖的固体平板上培养过夜，第二天检测转化子。挑取菌落有微偏绿的转化子点种于LB+1％淀粉的固体平板上，第二天用碘液复染，以检测其淀粉酶活性；将无淀粉酶活性的转化子PCR扩增mazF-cassette，将没有扩到的转化子命名为ZPMGS，即将淀粉酶基因amyE失活。结果表明：由于诱导物的存在，会迫使ZPMGS在两个DR区域发生第二次同源重组，将mazF-cassette的剔除，同时留下绿色荧光表达盒。 

实施例5、枯草芽孢杆菌大片段基因簇(97kb)的无抗性标记的删除 

(1)引物 

5Skin：ATCAGCCCCTGCACCGCCTTCCTCG 

3Skin：GAATTGCTCGACACCTGTCACCATCGTCACC 

5yraKF：TGACAGGTGTCGAGCAATTCATGGAAGACCTTA 

3yraKR：TCGTCTGGTCCATTATTGATTCATCTCACATTGCGTTCTCGT 

5maZF(Box)：AATCAATAATGGACCAGACGACAGTCCTGCTCCTCGGCCAC 

3SOEmazR：ggcTCTAGACTACCCAATCAGTACGTTAAT 

5yqcI：TGATTGGGTAGTCTAGAGCCGAGCAATTCATGGAAGACCTTA 

3yqcI：TTGCGTTCTCGTTAGTGAAAAGT 

(2)基因的扩增 

以枯草芽孢杆菌ZPM6基因组为模板，5maZF(Box)/3SOEmazR为引物PCR扩增mazF-cassette基因；以枯草芽孢杆1A751基因组为模板，5Skin/3Skin为引物PCR扩增spoIVCB的5’端同源片段；以枯草芽孢杆1A751基因组为模板，5yraKF/3yraKR为引物PCR扩增yraK 3’端同源片段；以枯草芽孢杆1A751基因组为模板，5yqcI/3yqcI为引物PCR扩增yqcI3’端同源片段；反应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板DNA 2μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水31.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸反应10min。 

PCR扩增结束后，将四个PCR产物进行琼脂糖凝胶回收后，待做重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)反应。 

(3)SOE反应 

反应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上述4个PCR产物各取5μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水15.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸3min，11个循环；最后72℃延伸反应10min。 

PCR扩增结束后，以该PCR产物为模板，5Skin/3yqcI为引物PCR扩增重组DNA片段(图5)； 

反应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板DNA 5μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水28.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸3min，30个循环；最后72℃延伸反应10min。 

(4)转化 

采用二步法的化学法制备B.subtilis感受态细胞(Cutting and Vander-Horn 1990)，将上述PCR产物直接转入枯草芽孢枯草菌B.subtilis 1A751中，并在LB+zeocin(20μg/ml)平板上筛选转化子，将能在LB+zeocin(20μg/ml)平板的筛选长出来的克隆子时，即得到 转化子，得到转化子进一步验证。 

(5)PCR验证 

以转化子基因组为模板，以5ZeoRF/3SOEmazR为引物PCR扩增大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒(mazF-cassette)，应体系为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺)10μl、dNTP Mixture(各2.5mM)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板DNA 1μl、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、灭菌蒸馏水32.5μl。反应程序为：98℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸反应10min。有扩增到大约900bp目的条带的转化子(图7D，泳道11)，即为含有该表达盒的宿主菌，记为ZPM62。 

(6)mazF-cassette的剔除 

将上述所得到的转化子ZPM62，涂布于LB+1％(w/v)木糖的固体平板上培养过夜，第二天检测转化子。挑取转化子点种于LB+1％淀粉的固体平板上，第二天用碘液复染，以检测其淀粉酶活性；将无淀粉酶活性的转化子PCR扩增mazF-cassette，将没有扩到的转化子命名为ZPM62S(图7D，泳道12)，并以5 yqcI/3 yqcI为引物PCR扩增进验证，检测是否能扩增到大约500bp的条带(图7 D，泳道13和泳道14)，即将淀粉酶基因amyE失活。结果表明：由于诱导物的存在，会迫使ZPM62在两个yraK区域发生第二次同源重组，将mazF-cassette的剔除，而无任何抗性标记留下。 

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。