用于提高植物和农作物产量的通过植物根系输运活性成分的作为土壤添加剂的合成共生系统

摘要

本申请描述了一种植物生长支持培养基，其改善了土壤特性，并在需要时提高了水或养分的含量。此外，可用微生物接种该培养基以改善土壤特性并提供在植物根、水、养分以及在可适用的情况下，细菌和根分泌物之间的微观环境内的相互作用。这种微环境将活性成分直接输运到植物根。所述培养基包含初级孔径在30微米以上的聚合物材料。所述孔的壁为弹性的，使得孔的尺寸能够膨胀以保持水、溶质或其他生物性可用成分并允许根穿透它们。对壁进行磺化使壁更具亲水性从而将水吸引至孔内并且还增加了壁的弹性。可以提供毛细管以使孔相互连接并允许根穿入培养基。所述孔壁可为颗粒状的，以使水、养分以及在可适用的情况下，细菌代谢物和信使分子在相邻的孔和植物根之间通过。

说明书

技术领域

本发明描述了一种制备用作土壤添加剂的有/无生物活性的纳米结构大孔亲水交联离子聚合物颗粒系统的方法，所述系统允许植物根穿入和穿透该颗粒，由此提高了生物质和农作物的生长速度和产量，特别是在水分和肥料胁迫的条件下。当将所述方法应用于种子或植株的生长时，该方法还通过向生长中的植物提供使其长成的养分来提供适宜的生长条件。

当移栽这些植物时，仍然保持了所述适宜的生长条件，因此使得植物在更不利的新环境中也能够长成。植物生长的促进作用和农作物增产作用被称为农业集约化进程(A-PI)，而为了A-PI的用于促进植物根、水、养分和在可适用的情况下，微生物(如细菌和/或真菌)之间的相互作用的合成培养基被称为合成共生系统(SSS)。所述SSS材料(聚合物)实质上为一种纳米结构大孔(NSMP)弹性/海绵状离子交联亲水性聚合物，其带有或不带有如细菌和真菌的生物活性物种并在微观上使植物根、水、养分和细菌之间发生相互作用。

SSS的有益效果概述如下：

1、在土壤中分散高度吸水的(亲水性的)且溶胀的纳米结构大孔交联离子聚合物颗粒能够更有效地调配水，从而使生物质和农作物增产。与其他吸水性土壤改良剂不同，SSS聚合物停留在土壤里而不容易被冲走或被化学/生物降解掉。

2、在颗粒状SSS聚合物的孔内储存肥料能使养分直接、定向、缓慢地向植物根释放。

3、如果植物根穿入SSS聚合物中，植物受益于已经被所述聚合物(该聚合物由于存在离子部分因此可同时起到离子交换介质的作用)吸附的养分和水的存在。

4、用固氮细菌对所述颗粒状SSS聚合物进行接种和定殖能使根被细菌感染并发生从空气中到豆科植物的共生氮转移，导致农作物的氮、磷以及金属浓度的提高。

5、接种混合微生物(例如，根瘤菌(rhizobium)和有益的土壤真菌，菌根真菌(mycorrhizal))能使氮转移到非豆科植物并使如磷的养分有效转移至植物。

6、在经接种的SSS-聚合物的存在下间作豆科植物和非豆科植物也使得与SSS-聚合物结合的共同根系并在植物间共享氮。

7、通过在罐内在SSS-聚合物上使植物的种子生长然后移栽，存活几率及在新环境中长成植物的几率提高。

基于对模型植物(草和麻风树(其不能固氮)以及豌豆和大豆(其能够固氮))的温室实验，SSS的益处概述如下：

1、弹性/海绵状SSS聚合物允许土壤微生物(细菌或真菌)在其中生长。

2、提高农作物内的金属浓度。

3、在干旱条件下的大幅度增产作用。

4、当肥料被冲走时提高收成的数量。

5、当根系穿过所述生物活性SSS-聚合物培养基时，增加了豆科植物的感染。

6、当根穿过SSS-聚合物培养基生长时，其形态得到改善。

7、由于细菌和根在数十微米内彼此共存，因此对SSS-聚合物接种混合细菌可促进共生。

背景技术

在胁迫条件下农业集约化进程(A-PI)是很重要的，而如果发生全球变暖该胁迫条件将会更加严重。在这种情况下，将会加重农业中水和氮的胁迫状况，而对生物质、食物和肥料的需求增加将会使任何基于生物质的能量/化学制品供给技术不堪重负。本发明公开了如何通过靶向水调配、肥料释放和生物固氮而同时实现植物生长。在本发明中，通过使植物根与SSS-聚合物的缔合来实现水、生物固氮和肥料(包括氮)传输的靶向。本发明与采用土壤改良剂或缓释肥料或间作的其他生物质/农作物增产技术有着本质的区别，这是因为，在本发明中，SSS-聚合物与植物根缔合，因此养分和水的传输以及根感染(导致用于生物固氮的根瘤形成)是直接的并且集中在根毛处。下面的总结概述了可用于植物和农作物增产的技术。

超吸收剂聚合物(Super-absorbent polymer)(SAP)

在土壤保水能力低的农业和园艺应用中或在半干旱地区，聚合物的使用具有很大的潜力。在许多半干旱国家，使用低质量的水来灌溉农作物，因此加重了土壤盐渍度。已经有报道称超吸收剂聚合物和水凝胶即使在压力下也能吸收最高达其重量2400倍的去离子水。已经显示应用水凝胶向生长中的农作物供应水减轻了缺水胁迫的影响并且减少了灌溉需求，降低了植物的死亡率，改善了土壤中肥料的保持力并促进植物的生长(Mohana Raju，K.，Padmanabha Raju，M.and Murali Mohan，Y.(2003).Synthesis ofSuperabsorbent Copolymers as Water Manageable Materials.Polymer Int.52：768-772)。

已经从植物重量、叶片宽度、总干重和在植物开始枯萎前的增加长度几个方面研究了对植物生长的益处。这是通过聚合物或水凝胶对一系列特性(例如，土壤渗透性、密度、结构、质地、压实、透气、侵蚀和微生物活性)的影响并通过影响水的流失、蒸发和渗透率来实现(Abd El-Rehim，H.A.，H.，E.-S.A.and Abd El-Mohdy，H.L.(2004).Radiation Synthesis of Hydrogels to EnhanceSandy Soils Water Retention and Increase Plant Performance.J Appl Polymer SciVol.93：1360-1371)。但是，由于低交联，水凝胶倾向于被容易地降解掉和冲走。

缓释肥料

施用肥料用于出产高产量和高质量的农作物。过量施肥和低的使用效率常常导致发生肥料淋洗作用和流失，这将导致由于湖中的‘藻华’和河口中的‘赤潮’引起的水系的过营养化。据估计约50-70％施用的肥料会流失到环境中。为了帮助提高肥料的使用效率，已经开发了缓释和控制释放系统来以能使肥料被利用的速度向植物释放肥料，从而将通过淋洗作用和流失而损失到环境中的肥料减到最少。

微生物接种

简单地说，接种是将活的对植物有益的微生物(细菌和真菌)施加到载体材料上的方法，所述载体材料可以是有机的、无机的、天然的或合成的。接种物对植物生长的理想效果包括在豆科植物中的固氮、土壤传播疾病的生物防除、增加矿物质的摄取、土壤矿物质的风化和营养性或激素性作用。用根瘤菌(rhizobacteria)接种土壤导致感染适合的植物根以形成有效的根瘤。此外，有益的真菌，例如根真菌，通过根也与植物形成共生关系并促进摄取磷酸盐。可使用多种方法来接种农作物，其中最普遍的方法是用粉末状的接种物将种子包衣，随后，当种子开始发芽时，该接种物可以感染种子。根据土壤类型、宿主植物和细菌，根瘤菌从接种点向根的传播或者取决于细菌的主动活动性或者取决于细菌在水中或在载体上的被动运动。但是，通过观察荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)对豌豆根的定殖以及假单胞菌(Pseudomonas)种菌株对马铃薯根的定殖的研究表明灌溉和水流是将细菌运送到根的最有效的方法。当缺水时，细菌的运送将受限。

许多根瘤菌菌株能够通过促进营养作用、加速矿物化过程或者通过保护植物免受有害土壤微生物的损害来刺激植物的生长而不形成根瘤。但是，在这种情况下，产量反应明显小于固氮的情况。豌豆(Pisum sativum)作物是人类饮食中重要的蛋白质来源并为动物饲料提供草料。豌豆通过通常在欧洲可耕种土壤里发现的豌豆根瘤菌野豌豆变种(Rhizobium leguminosarum biovarviciae)(Rlv)来形成根瘤。所有的根瘤菌均显示出某种程度的宿主特异性，并且Rlv能够使蚕豆(Vicieae)族(包括野豌豆(Vicia)属、山黧豆(Lathyrus)属、豌豆(Pisum)属和兵豆(Lens)属)中的所有品种生成根瘤。通常，在豆科植物-根瘤菌共生现象中，宿主特异性决定了根瘤菌种和短根瘤菌属(Bradyrhizobium)种对豆科植物根的附着，但研究显示，对于根瘤菌-豌豆系统，根瘤菌的生长条件强烈地影响了其对根的附着(Abd El-Rehim，H.A.，H.，E.-S.A.and Abd El-Mohdy，H.L.(2004).Radiation Synthesis of Hydrogels to EnhanceSandy Soils Water Retention and Increase Plant Performance.J Appl Polymer SciVol.93：1360-1371)。这被认为是由于Rlv菌株的低接种效率以及对菌株-栽培品种特异性(strain-cultivar specificity)的研究较少所导致的。

已知豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)附着到豌豆根毛是取决于培育的pH值和生长阶段，其中，在pH值为7.5且用处于生长早期静止期的细菌时产生最佳的附着。通过根瘤菌和豌豆(Pisum sativum L.)共生固定的氮的量为52-77kg N ha^-1(Elkan，G.H.(1992).Biological nitrogen fixation.In：Encyclopedia of Microbiology.Ed：New York，Academic Press Inc.1：285-295)。

混合细菌接种物

协同相互作用的混合接种物(微生物的组合)能够通过可促进其生理的某些有益方面(如固氮)的生理或生化活性来提供养分、除去抑制性产物并相互刺激。混合细菌接种物的一个实例为固氮嗜根菌(Azosipirillum)，其能够与糖-或多糖-降解细菌(PDB)缔合，建立新陈代谢的共生体，其中，糖-降解细菌产生降解和发酵产物，这些产物被固氮嗜根菌作为碳源利用，而固氮嗜根菌反过来又为PDB提供氮。

其他的实例为固氮嗜根菌与降解果胶的杆菌(Bacillus)、固氮嗜根菌和降解纤维素的纤维单胞菌(Cellulomonas)以及固氮嗜根菌与发酵葡萄糖的阴沟肠杆菌(Enterohacter coacae)之间的共生体(Y.Bashan，(1998).Inoculants of plantgrowth-promoting bacteria for use in agriculture，Biotechnology Advances，16：729-770)。此外，固氮嗜根菌被看作是根瘤菌辅助菌，其刺激根瘤形成、根瘤活性和植物新陈代谢，所有这些都刺激植物生长的变量和植物对不利条件的抵抗力。固氮嗜根菌或固氮菌(Azotobacter)与链霉菌(Streptomyces)以及固氮嗜根菌与生防益菌计有瓶霉菌(Phialophora radicola)(防真菌剂)的有益组合均有文献记载。

用固氮细菌和灌木-菌根真菌混合接种产生了协同相互作用，这种协同相互作用可使植物生长明显加速、植物中的磷含量明显提高、增加菌根真菌的感染并增加对如磷、氮、锌、铜和铁的矿物质养分的摄取。

间作

间作利用混养中的天然的一体化技术，其中，一种植物的产出被其他植物利用。在间作中，主要农作物的生产力通过附加农作物的存在而提高。通过间作提高主要农作物生产力的机理是多方面的。间作已经在非机械化农业中被成功地利用。但是，间作在现代机械化农业中并不总是经济的。

然而，如果间作的唯一目的是增加生物质产出并减少施肥，那么间作和机械化农业就可以是可持续的。由于我们的目的是促进从空气中固定氮，因此在SSS的存在的情况下间作豆科植物与非豆科植物是非常成功的。在目前的间作技术中，氮的转移是跨越宏观水平的(在目前的实践中以数米到数厘米为参照)，而SSS技术能够跨越微观水平实现养分的转移，因此增强了间作的效果。

植物根/水/养分/微生物的相互作用

通过灌溉和/或扩散向植物根运送细菌和肥料导致细菌分布在整个土壤中，因此降低了土壤/根界面的局部细菌浓度。最终，细菌和土壤均被冲走而不能到达根系。此外，作为不利土壤环境的结果，细菌的连续分布可导致土壤中菌落的破坏、生物群体信号传导和整体活性的减弱以及最终的细菌耗尽。这些后果导致细菌对根感染的概率降低并造成肥料和水的浪费。因此，与水和养分/肥料类似，也使用不同的策略来代替土壤细菌，包括用细菌肉汤来包衣种子。由于每单位体积的植物根部区域中的根-细菌相互作用面积小，因此即使是在高细菌浓度下，根和细菌之间的相互作用也是随机的。可将每单位体积土壤中的根表面积看作是运送区域密度(Transport Area Density)(TAD)，TAD在可通过提高TAD而增强的生化和化学过程中的许多热和质量转移步骤中都是重要的。此处描述的当前技术使水、肥料以及在可应用的情况下的细菌和植物根集合在SSS-聚合物的孔中，从而缩短了有效扩散路径并提高了TAD。此外，SSS-聚合物的孔起到了微生物的保护性微环境的作用，同时，对于通过其孔生长的植物根，起到了水源和营养源的作用。细菌浓度的提高加强了生物群体信号传导并促进了植物-细菌的共生。

进一步增强在生物或催化化学反应中的质量转移可以通过确保所有催化位点都被利用来实现，这是一个要求在整体式生物-或化学-反应器(monolithicbio-or chemical reactor)中运行的策略，在该生物-或化学-反应器中，通过如在自然界中见到的多级孔(hieratchic pores)的网络(肺、肝脏、肾脏、循环系统等)能够接触到催化/活性位点。在生物(包括组织工程)和化学系统中实现的所谓“基于现象的过程强化”表示在10-1000倍的区域内的强化水平。在生物系统中，当物质或微生物的行为取决于限制它们的环境的尺寸时，强化通过所谓的“局限现象(confinement phenomena)”来实现。因此，对于给定的微生物，通过使用具有特定微结构(孔径、互连尺寸)的支持系统就能够控制生长速度、选择性、生产率。该支持系统的化学/生物特性也影响微生物的行为。因此，基于“局限现象”，就可以强化生物过程。生物过程强化的一个重要要素为使用具有生物活性壁结构的纳米结构微孔材料。

使用纳米结构微孔聚合物和细菌构建物作为土壤添加剂使根穿入聚合物的孔中，细菌得以生长并且通过聚合物快速吸收/缓慢解吸水。植物生长(草、麻风树、大豆和豌豆)和农作物产量(豌豆)数据(均为鲜重和干重产量)清楚地表明该共生系统作为生物反应器运作良好。此外，每次收割后的植物生长强化同样证明当养分因消耗和被水冲洗而从土壤中除去时在土壤内的这些微-(生物)反应器对植物生长的生长贡献。这种增强是由于SSS-聚合物—细菌构建物的下列属性导致的。

由于SSS-聚合物在有水时能够容易地吸收水并在植物需要时能缓慢地释放，因此提高了水和养分(在水里或由通过聚合物吸收的肥料提供)的可用性。由于根在水源的数微米范围内，因此水的转移不再受到扩散作用的限制。在与细菌缔合的情况下，根同样非常靠近细菌源并且在聚合物的孔内保持了高的细菌浓度。

长到聚合物外的根已经被感染并长回到土壤中，在这里其能够利用水和养分而无需形成其他的根瘤。

如下文所述，根据SSS-聚合物的化学/物理结构，可以防止或加强细菌从土壤的渗透。防止不合需要的细菌渗透进入SSS-聚合物细菌构建物部分是因为聚合物构建物外的细菌浓度小并且在土壤中也不存在促进细菌渗透的活性机制(如强制对流)。仅有的机制是通过细菌的活动力和分裂。此外，SSS-聚合物阻止了大的或活力差的细菌进入聚合物构建物中，因此，在孔内存在的细菌得到保护而防止了其他细菌的渗透以及随后的定殖。

SSS-聚合物构建物还起到了突然增加的毒素的储库的作用，所述毒素例如为重金属离子(当被磺化时SSS-聚合物实质上为离子交换树脂)或有机毒素。在此使用的基于交联聚苯乙烯-乙烯基吡啶的SSS-聚合物或磺化交联聚苯乙烯SSS-聚合物为双亲性，即，它们既吸收水也吸收其他溶剂。因此，SSS-聚合物既能吸收金属离子也能吸收有机毒素，随后随着环境中毒素水平的下降或者金属离子或有机毒素通过植物修复或细菌降解而被代谢掉，它们被逐渐释放。

下面详述的新近结果表明即使SSS-聚合物中不包含细菌，对于所有受试植物，总生物质产量均提高。尽管如此，就豆科农作物(例如豌豆和大豆)而言，在SSS-聚合物中存在固氮细菌(根瘤菌)且不存在水和养分胁迫的情况下，总生物质和农作物的增产明显。当存在水和养分胁迫的情况时，与对照相比，非-生物和生物SSS-技术均具有生物质增产的作用。这清楚地表明，与土壤细菌相比，豌豆植物通过SSS-聚合物接受了更多的氮。通过提供植物/细菌交流的显现为植物分泌物的物质的广泛存在，进一步证实了上述研究结果。在仅用土培生长的正常条件下，这些分泌物将会以低浓度存在并会被从根-细菌界面处冲走。有可能是这些信使化学物质增加了植物的氮摄取。已经发现合成共生系统具有许多提高生物质/农作物生长速度和产量的特性。

根据本发明，其提供了一种植物生长支持培养基，该培养基包含具有孔径在30微米以上的初级孔的磺化的聚合物材料，该聚合物材料是弹性的以使所述孔的孔径能够增大，例如所述孔因为水含量或因植物根穿过而增大。

所述聚合物材料的最初孔径优选为30-300微米以使该材料在空隙空间和结构完整性之间获得平衡，并且特别优选50-150微米。

有利的是，磺化度为40-75％，并且特别有利的是，磺化度为60-70％。磺化度太高会使孔壁的强度降低过多，而磺化度太低则不能使孔壁具有足够的弹性和亲水性。

方便的是，通过熔接尺寸范围为10-20纳米的聚合物颗粒，孔壁也为多孔的。该纳米结构导致形成了允许转运水、养分和代谢物的纳米-孔(1-5纳米)。

有利的是，所述聚合物材料选自聚苯乙烯、苯乙烯/丙烯酸乙基己酯共聚物或苯乙烯/乙烯基吡啶共聚物中。特别有利的是，所述苯乙烯/丙烯酸乙基己酯共聚物的组分的重量比为75∶20。进一步特别有利的是，所述苯乙烯/乙烯基吡啶共聚物的组分的重量比为75∶8。

优选地，所述聚合物材料包含毫米尺寸的毛细管以促进植物根生长。

所述初级孔方便地相互连接以使水、养分、细菌和根毛从一个孔生长到另一个孔。

优选地，为了吸收水并运送水、空气、养分和代谢物，所述孔的壁为纳米结构。

方便的是，所述SSS-聚合物中包含的聚合物材料为弹性的以使根穿过其生长。

优选地，所述聚合物材料为高度亲水性的以使水快速吸收但缓慢释放。

有利的是，所述材料为生物相容性的，或者进一步有利的是，所述材料为生物活性的，以帮助促进细菌生长。

在本申请中优先使用的SSS-聚合物为纳米结构微孔交联的离子性和亲水性聚合物，其也被称为PolyHIPE聚合物(PHP)，该聚合物具有70-95％空隙容积。它们或者在被赋予亲水性之前就具有弹性或者一旦吸收水就变成弹性的。尽管这些聚合物可被制成具有0.5-300微米的初级孔径，但是仅有大孔级别是优选的。如果在聚合过程中允许形成聚结孔(其尺寸可为数百微米)，由于聚结孔分散在初级孔内，因此会降低初级孔径。需要注意的是，当磺化的PHP接触水膨胀时，孔径增大。

附图说明

现参照附图描述本发明。在附图中：

图1(a、b)显示了经微波照射而无需冲洗步骤的多种磺化PHP的红外光谱，该光谱示出了磺化作用和碳的形成。

图2(a-f)图示了磺化PHP的微/纳米结构。

图3显示了当将0.5％w/w大约125mm³的海绵状中和PolyHIPE聚合物(SNS-PHP)用在土壤中作为土壤改良剂并每天浇水时，草根的缔合体。

图4(a)为SNS-PHP表面的SEM，其显示了穿过海绵状中和PolyHIPE聚合物结构生长的最初的草根的存在。

图4(b)为SNS-PHP(海绵状聚合物)表面的SEM，其显示了从SSS-聚合物中存在的毛细管中长出的纤细根毛的存在。

图4(c)：与图4(b)相同，在更高的放大倍数下。

图4(d)：穿过SSS-聚合物结构生长的草根。

图4(e)：在海绵状PHP(SNS-PHP)内的草根结构的细节。

图5(a)：弹性的磺化PHP(未中和)在用于土壤中之前的低放大倍数SEM。

图5(b)：弹性的磺化PHP(未中和)的在更高放大倍数下的SEM，其显示了孔和相互连接的结构。

图5(c)：与Fig.5(a)中相同，在更高的放大倍数下显示了壁的结构。

图6(a)：带有草根缔合体的中和弹性PHP(SNS/EHA-PHP)的SEM(横截面)。

图6(b)：带有草根缔合体的磺化-中和弹性PHP(SNS/EHA-PHP)的SEM(横截面)。

图7(a)：施肥对生长21天后的草的鲜重产量的影响(每天浇水；第一次收割)。

图7(b)：施肥对生长21天后的草的干重产量的影响(每天浇水；第一次收割)。

图8(a)：施肥对生长42天后的草的鲜重产量的影响(每天浇水；第二次收割)。

图8(b)：施肥对生长42天后的草的干重产量的影响(第二次收割；每天浇水)。

图9(a)：施肥对生长63天后的草的鲜重产量的影响(第三次收割；每天浇水)。

图9(b)：施肥对生长63天后的草的鲜重产量的影响(第三次收割；每天浇水)。

图10(a、b)：在每天浇水的条件下，海绵状PHP(SNS/EHA-PHP)对生长21天后的草的产量的影响(第一次收割)，(a)鲜重；(b)干重。

图11(a、b)：在每周浇水(40ml)的条件下，海绵状PHP(SNS/EHA-PHP)对生长21天后的草的产量的影响(第一次收割)，(a)鲜重；(b)干重。

图12(a、b)：在每周浇水(20ml)的条件下，海绵状PHP(SNS/EHA-PHP)对生长21天后的草的产量的影响(第一次收割)，(a)鲜重；(b)干重。

图13(a、b)：在使用或不使用海绵状SNS-PHP的情况下，接种处理对41天后豌豆荚产量的影响，(a)鲜重，(b)干重。

图14(a、b)：在使用或不使用海绵状SNS-PHP的情况下，接种处理对41天后豌豆植物的植株生物质产量的影响。

图15(a、b、c)：在用于豌豆栽培前，在不同放大倍数下的接种了豌豆根瘤菌的海绵状PHP(SNS-PHP)。

图16(a、b、c、d、e)：豌豆根与磺化-中和海绵状PHP(SNS-PHP)的缔合体。

图17(a)：与海绵状PHP(以圆片形式紧邻种子的下面使用)缔合的豌豆植物根的照片，其显示了根在穿过SSS-聚合物(SNS-PHP)后形成了根瘤，而未与SSS-聚合物接触的根没有形成根瘤。

图17(b)：在被海绵状PHP(SNS-PHP)内的细菌感染后形成的豌豆根的根瘤的SEM。

图17(c)：在海绵状聚合物(SNS-PHP)内的豌豆根的SEM，其显示了腐质和PHP结构的存在。

图17(d)：豌豆根通过海绵状PHP(SNS-PHP)生长并产生腐质。

图17(e)：因根生长和丝状结构的存在而造成的PHP结构的变形和相互连接。

图17(f)：包含根、细菌和海绵状PHP(SNS-PHP)的微环境的产生。

图17(g)：在豌豆生长过程中在海绵状PHP(SNS-PHP)内的细菌菌落。

图17(h)：在从海绵状PHP(SNS-PHP)被感染后，在根表面生长的细菌。

图17(i)：在豌豆栽培过程中在使用海绵状PHP(SNS-PHP)接种的根瘤菌表面形成的纤维状结构的细节(放大倍数×5000)。

图18(a)：穿过海绵状PHP(SNS-PHP)的纤维状根结构。

图18(b)：当根单独在土壤中生长时，纤维状的根结构。

图19(a、b、c、d)：草和豌豆的根与海绵状PHP(未接种)的缔合体，其显示了在不同的部位以不同的放大倍数下穿过SSS-聚合物(SNS-PHP)的两种不同类型的根的存在。

图20(a、b、c)：草和豌豆的根与用根瘤菌接种的海绵状PHP的缔合体，其显示了细菌和纤维状结构的存在。

图21(a、b、c)以不同的放大倍数显示了在海绵状PHP(SNS-PHP)孔壁上生长的真菌。

图22：当植物由种子开始生长随后被移栽时根生长和根瘤形成的图示。设计这项技术是为了提高植物在不利环境中的成活率。

为了实现上述特性，制备基体SSS-材料并功能化以使其具有亲水性、弹性和肥料存储能力，接着用细菌接种，用于生物固氮和植物生长。这些步骤总结在下文中。

带有相互连接的孔的纳米结构大孔聚合物的通用名为PolyHIPE聚合物(PHP)，该聚合物通过在WO 2004/005355(2004)中披露的高内相乳液(HIPE)聚合路径来制备。在这些实验中使用的PolyHIPE聚合物由90vol％的水相和10vol％的油相构成。

水相由去离子水、聚合反应引发剂(过硫酸钾)和作为纳米构造剂的5％的硫酸构成。水相的体积分数(相体积)为90％。制备三种类型的聚合物，其中，油相组成为：

单体相：苯乙烯＝76-X-Y-Z％，其中X、Y、Z具有下面的含义

2-乙烯基吡啶(2-VP)＝X％

丙烯酸2-乙基己酯(2-EHA)＝Y％

油相可溶性引发剂(月桂基过氧化物)＝Z％

交联剂(二乙烯基苯，DVB)＝10％

非离子表面活性剂(失水山梨糖醇单月桂酸酯，司盘80)＝14％

由于我们可以不使用油相可溶性引发剂(Z＝0)就能获得合意的聚合物。因此，X和Y的变化导致形成3种类型的聚合物。这些聚合物为：

1)交联聚苯乙烯(PS)：X＝Y＝Z＝0

2)交联苯乙烯-丙烯酸乙基己酯共聚物(S-EHA CP)：Y＝20％X＝Z＝0

3)交联苯乙烯-乙烯基吡啶共聚物(S-VP CP)：X＝8％Y＝Z＝0％

将油相在室温下混合在一起。在开始乳化前才将油相放入混合容器(内径12cm)中，然后通过振动泵将水相加入到油相中，同时发生混合。通过交叠成直角的3个扁平的搅拌桨(直径9cm)进行混合。底部的叶轮在使用时尽可能的接近容器的底部而其他叶轮被放置成间隔3cm，这样当加入所有的水相时，顶部的叶轮浸入混合容器中的乳液表面下1cm。

加样时间为t_D并且加样过程中的叶轮速度为Ω_D。加样完成后，通过在Ω_Hrpm的转动叶轮速度下混合t_H的一段时间来均化乳液。这些值根据油相组成和所需的孔径(D)而变化。互连孔径(interconnect hole size)(d)主要由水相体积(Φ)以及油相组成和所用的表面活性剂的类型来决定。油相的体积为25ml并且水相的体积为225ml。

对于给定的油相-水相组分，只要乳液在聚合过程中是稳定的，那么在微孔聚合物中的孔径和互连孔径主要是在乳化阶段实现(即，PHP孔径＝HIPE中分散相液滴的尺寸)。HIPE中液滴的尺寸通过控制乳化温度(T_E)、混合速度(Ω_D和Ω_H)、加样和混合时间(t_D和t_H)以及叶轮的尺寸和类型来确定。如果乳液稳定，那么PHP的孔就被称为初级孔(参见：G.Alcay，S.Dawnes，V.J.Price-Byron，Microcellular polymers as cell growth media and novel polymers，EP 1183328 A2(2002)；US 09,856,182(2002)；G.Akay，MA Bokhari，VJ Byron and M.Dogru，Development of nano-structured materials and their application inbioprocess-chemical process intensification and tissue engineering。同样参见Chemical Engineering Trends and Developments，Ed：MA Galan and E.M.DelValle，Wiley，London，2005.Ch.pp.171-196.(2005))。如果乳液在聚合过程中变得不稳定，那么初级孔就开始聚结，这会使孔增大。这些扩大的聚结孔分散在初级孔内并且其体积分数和尺寸随着不稳定性程度和初级孔尺寸的增加而增大。尽管，对于具有初级孔的PHP，d/D的比值是相对恒定的，但对于聚结孔，d/D的分布却非常宽。根据本发明的目的，已经发现具有＞40微米的初级孔径的聚合物是有效的，具有30-200微米的初级孔径的聚合物是特别有效的，具有50-10微米的初级孔径的聚合物尤其有效。

所述高内相乳液(HIPE)在带封闭盖的聚丙烯圆柱形管(直径2.3cm)中于60℃下聚合8小时。在聚合反应并形成固体聚合物后，可以进行任何所需的官能化。在本申请的聚合物材料中，需要高吸水量和弹性。弹性既可以通过在共聚物链中存在丙烯酸乙基己酯来实现(即，PS-EHA共聚物)也可以通过当交联苯乙烯通过磺化变成高亲水性聚合物时一旦吸水而发生膨胀来获得。当从磺化的PHP中除去水时，聚合物恢复其原来的体积。尽管PS-EHA PHP是弹性的，但其却是疏水的。这样的聚合物可以通过磺化作用而具有亲水性。

在聚合反应后，将PHP样品切成大约4mm的圆片，然后在过量的水中用蒸馏水冲洗2小时，同时每隔30分钟换水。将PHP圆片在磺化前于通风橱内干燥24小时。所述聚合物的磺化和中和通过下述方法中的一种来进行。

方法1：

聚合后，如上所述进行冲洗和风干，将聚合物圆片浸入97％w/w的硫酸中2小时。为了获得能膨胀并吸收大量水的弹性磺化PHP(当使用90％空隙的PHP时，该聚合物通常能吸收其自身重量18倍的水)，优选在吸收浓硫酸和后续的微波照射前冲洗该聚合物。接着，使用松下^TM厨房微波炉(1000W)用微波照射这些含有97％的酸的聚合物样品。可以使用较低浓度的酸但在这种情况下需要延长照射时间。但是，众所周知，微波炉的照射分布并不规律，这通常导致样品中热点的形成。热点会导致聚合物焦化，因此需要质量控制测量，样品以30秒的间隔进行照射，之后让圆片冷却60秒，接着将其倒置并随机分布在微波盘的新位置。每隔30秒停止照射，在微波炉上翻转样品，继续照射直到总照射时间对于14个聚合物圆片通常为150秒。在这些条件下，磺化度为70％。延长暴露于磺化条件下不会提高磺化度但增加了碳元素的形成。因此，发现在上述额定功率下的上述照射时间是最合适的。在微波照射过程中，随着磺化反应的进行，PHP聚合物圆片明显膨胀并且它们开始具有弹性。

已经发现40-75％的磺化度适合本发明。低于40％的值导致壁的弹性和吸水量不足，而高于70％的值不能使壁具有足够的完整性。已经发现60-70％的磺化度是特别优选的。例如，当根穿过时，壁的弹性能使孔的尺寸膨胀。而且，在孔壁上的磺酸基是亲水性的从而吸引或保持水。此外，弹性能使更多的水保持在孔内，因此更多的水被保持在植物生长培养基的聚合物材料中。值得注意的是，初级孔的壁通常具有0.1-1.0纳米的厚度。而且，壁可以具有熔接的颗粒状的性质，确保了水能通过相邻颗粒间的间隙。通过扫描电子显微镜已经发现颗粒的尺寸为10-20纳米。

当以工业化规模进行微波照射时，使用移动的托盘进行照射-无照射的循环，同时进行空气循环。

磺化后，用水彻底清洗聚合物样品以除去过量的酸，接着用5.0N的氢氧化铵溶液中和，随后进行进一步的水洗清洁直到溶液的pH值为5.5。干燥并存储这些聚合物备用。即使在干燥后磺化的PHP圆片的厚度也稍有增加(即，厚度由4mm增加至约5mm)。一些圆片被切成测量为约5×5×5mm的立方体。

方法2：

将浓(97％)硫酸和硝酸的混合物用于磺化。在硝酸中硫酸的体积浓度为90％-10％。这样做的优点是用氢氧化铵中和磺化的PHP以在亲水性聚合物的孔内获得富氮的肥料。

控制磺化的水平以使聚合物具有所需的特性。由于硫酸或磺酸根的存在，聚合物的表面变得更具亲水性，这使水积聚在表面上。当在其中一个孔内出现水的积聚时，孔就被水充满。此外，磺化使壁具有弹性，能使含水孔膨胀至其原始尺寸的7倍。因此，聚合物有效地起到了保持水和水内所含盐的作用。这种固定使聚合物能够保持水并缓慢地释放水，该特性能使聚合物在干旱条件下向植物释放水的过程中具有重大的用处。

通常的磺化水平为40-75％，优选的范围为60-70％。

值得注意的是，对于具有较大孔径的孔，其孔壁的厚度也趋向更大。此外，在一些实施方式中，壁具有颗粒状的性质，其中颗粒的尺寸为10-20nm。所述颗粒并没有堆积在一起形成完全密封的壁，而是在颗粒间留有间隙以使水和溶解的盐从中通过。

为了制备含有细菌分布的生物活性合成共生系统用于磺化PHP的接种，使用了下列方法。

以真空干燥的形式提供豌豆根瘤菌。为防止样品的污染，制备豌豆根瘤菌的所有步骤，从最初开启细菌容器到平板接种均在灭菌的通风橱内进行。为了分散干燥的根瘤菌团粒，向团粒加入5ml的肉汤培养基并静置30分钟使其达到平衡。然后，将无菌环放入细菌分散物中并用其在准备好的琼脂平板上交叉划线以在培养过程中制备孤立的菌落。每个琼脂平板使用一根新的无菌环，琼脂平板在马上开始接种前是密封的并在接种后立即被密封。接着摞起平皿、贴标签并用两条胶带交叉越过这摞平皿的顶部和底部将其密封。将器皿倒置(以防止冷凝液滴落在平板上)在设定为26℃的培养箱内，并使豌豆根瘤菌生长7天直到已经形成了清晰的单个菌落。将选出的单个菌落随后被接种在新鲜的平板上并再次培养以确保任何平皿均未被污染。

从第二套培养平板开始，在无菌环上收集单菌落一并放进5个含100ml经高压灭菌处理的肉汤培养基的不同容器中的一个。这些容器随后被放入振荡器并在26℃的温度下以160rpm旋转72小时。振动后，将肉汤在-18℃下储存于无菌的50ml试管中直至使用，当使用时将它们在室温下解冻5小时。

如上所述干燥并储存磺化的聚合物圆片备用。

一些圆片被切成测量为约5×5×5mm的立方体。这些材料被用在土壤中，它们可以是经细菌接种的或未经细菌接种的。

一些聚合物圆片具有穿过其中的毛细管。利用在(Alcay等人，WO00/34454)中描述的技术，可将这些毛细管制成一维、二维或三维的网络。

在其他情况下，交联的聚苯乙烯被切割成小颗粒(粒径范围为100-2000微米)，冲洗除去残留的单体和表面活性剂，接着进行磺化、中和和干燥。这些材料被用于测试作为土壤改良剂的NSMP聚合物的外形的效果。颗粒形式的磺化PHP的使用增强了聚合物-植物根的相互作用。当制备含有细菌的磺化SSS-聚合物时，使用下列方法。

在本申请中描述的是采用细菌供应商推荐的方法和成分来制备根瘤菌生长肉汤培养基。首先，通过用2mm的筛网收集并过筛80g风干的土壤并将其与0.2g的碳酸钠和200ml的去离子水混合来制备200ml的土壤浸出物。该浸出物随后在121℃下高压灭菌1小时以确保无菌，然后在室温下储存。将生长培养基制备成液体肉汤，并且还加入琼脂制成固体培养基。对于500ml的肉汤培养基，将400ml的去离子水与100ml的土壤浸出物、5g的甘露醇和0.5g的酵母混合。得到的溶液随后被等分入5个不同的100ml容器中并被高压灭菌。为了制备固体琼脂培养基，进行上述步骤，但在高压灭菌前另外加入7.5g的琼脂。在高压灭菌后，在无菌通风橱内将琼脂培养基倒入无菌的皮氏培养皿中，并使其冷却并静置30分钟，然后摞起并储存培养皿同时制备细菌。

在装土罐内的土壤总重量为900g。在这些实验中仅使用5×5×5mm³形式的海绵状PolyHIPE聚合物，并且仅在土壤底部的25mm(即，在种子下面)使用该聚合物，用量为0.5％w/w，等于200g土壤内有1g聚合物。将聚合物浸入25ml的肉汤中直至达到吸收平衡，然后将其充分混合在种子下面的土壤中。

将基于John Innes肥土的混合肥料No.3用作土壤。园艺沙由纽卡斯尔的Moorbank花园提供。使用Superstar品种的多年生黑麦草并从英国的农业、环境和渔业部(Agriculture，Environment and Fisheries Department，UK.)购买种子。肥料：硝酸铵肥料粒(Nitram)由英国Teeside的Terra Nitrogen提供。Nitram含有34.5％的氮，并且将一次使用的量溶解在25ml的水中并在种植阶段加到每个罐中。还使用市售的液体肥料Miracle-GroPour & Feed，由Scotts(英国)有限公司(高达明(Godalming)，萨里(Surrey)，英国)生产。按照制造商的指导使用Miracle-Gro(MG)肥料，在种植阶段每个罐使用25ml未稀释的肥料。在最开始的种植后，硝酸铵肥料粒或Miracle-Gro均不再重复使用。

在这些实验中只使用磺化海绵状PHP(SNS-PHP)的5mm尺寸的立方体，并以0.5％w/w的用量将其施加在土壤中。使用上文所述的方法对聚合物进行微波磺化并将其pH值调节至5.5以与土壤的pH值匹配。将干燥的聚合物混入土壤中，这样当将它们倾倒在土壤上时，这些聚合物可以吸收水和/或肥料。

琼脂、甘露醇、酵母和碳酸钠均从Sigma Aldrich(吉林厄姆(Gillingham)，多西特(Dorset))购得。从Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)(不伦瑞克(Braunschweig)，德国)获得真空干燥形式的细菌(豌豆根瘤菌)。所用的多年生黑麦草为Superstar品种并从英国农业、环境和渔业部购得种子。豌豆(Pisum sativum L.)为Kelvedon Wonder的矮小多用途品种，由Johnsons(纽马克特(Newmarket)，萨克福(Suffolk)，英国)提供。

草和豌豆被用作两种测试植物以检测在此项工作中开发的合成共生系统的效果。

为了种植草，将园艺土壤与25％的园艺沙混合，并将得到的200g土壤混合物放入直径为8cm的罐中。罐中土壤有6cm深并到达罐的下缘，下缘处的直径为7cm，表面积为38.5cm²，并且土壤在罐的上盖下1.5cm。在加入5g的常年生黑麦草种子(其被均匀地播撒在土壤表面)前，将0.5％w/w的聚合物充分混入土壤中。也使用没有聚合物的对照处理。用薄层的土壤覆盖种子直到与罐的下缘平齐，然后给予40ml自来水。罐被随机分布在面积为2×2m²的温室内。其上放置罐的毡垫整天保持潮湿。21天后，在罐的上缘水平处，土壤表面以上1.5cm处割草。随后，立即称重草以确定鲜重，接着将其放入60℃烘箱内72小时并再次称重以确定干重。生长实验要继续进行另外的21天，与第一次收割一样，通过割草并处理产品获得第二次的草收成。第三次(最后一次)的收成在另外的21天后获得，在这21天末，从罐中取出剩余的草和根并在水中仔细地清洗以显示SNS-PHP和根的相互作用。

在温室草生长实验中使用下列类型的PHP和浇水方案。

磺化-中和-海绵状PS-PHP(被称为海绵状PHP并由SNS-PHP表示)

外形：

a)测量为5×5×5mm的立方体

b)粉末(粉末尺寸100-2000微米)

c)具有至少一条连续的毛细管(毛细管尺寸：2mm)的测量为5×5×5mm的立方体

磺化-中和-弹性PS-EHA-PHP(被称为弹性PHP并由SNS/EHA-PHP表示)

测量为5×5×5mm的立方体

磺化-中和-海绵状PS-VP-PHP

由聚苯乙烯-乙烯基吡啶PHP制备接着用氢氧化铵中和并随后冲洗以使pH值为5.5的测量为5×5×5mm的立方体。

为豌豆种植所做的准备

为了准备种植豌豆，形成距罐的下缘7.5cm在罐的上盖下2cm的7.5cm深的土壤混合物。在装土罐内的土壤总重量为900g。在这些实验中使用海绵状PolyHIPE聚合物的5×5×5mm³小块，并且仅用在底部的1英寸的土壤中(即，在种子下面)，其用量为0.5％w/w，等于200g土壤中有1g的聚合物。所述聚合物已经采用如上所述的方法被微波磺化并将pH值调节到5.5以与土壤的pH值匹配。也使用没有聚合物的对照处理。

当使用未接种的豌豆时，向土壤施加干燥的聚合物。对于接种罐，直接向土壤施加25ml的细菌肉汤作为对照，或者对于聚合物处理，将聚合物浸入25ml肉汤中直到达到吸收平衡然后将其充分混入种子下的土壤中。剩余的、未被吸收的肉汤随后被倾倒在要种植种子部位周围的土壤上。将一粒豌豆种子放在每个罐中央1英寸深的土壤中，然后用另外2英寸的土壤覆盖。所有的罐随后浇水50ml并随机分布在温室的2×2m²的区域内。

在实验过程中，通过每日浇水使所有的罐都保持潮湿。42天后，从底部切下植株，接着除去豌豆荚并使其与其余的茎和叶分离。豌豆荚的产量与其余植株生物质(茎和叶)分开测量从而能够在农作物产量和总(即，茎和豆荚)-生物质产量之间进行比较。将来自各罐的豌豆荚和茎贮存在帖有标签、可密封的塑料袋里，然后立即称重以确定鲜重。一旦记录下各样品的鲜重，就将样品放入60℃烘箱内72小时，然后分别再次称重并记录以确定干重。每种处理重复四次实验。

浇水方案

对于草的生长，使用三种不同的浇水方案：1)每日浇水；2)每周浇水(半干旱条件，每周每罐浇水40ml)；3)减少的每周浇水(干旱条件：每周每罐浇水20ml)。对于豌豆、苜蓿和麻风树，仅使用一种浇水方案。

植物产量数据的统计学分析

将各次收获的平均鲜重和干重绘制成直方图。以95％的可信度采用独立假设等方差双样本t-检验比较平均产量，并采用Tukey′s两两比较的单向方差分析确定。所有温室实验重复4次进行。

材料表征

首先通过FT-红外光谱表征SSS-聚合物以测定制备的不同类型聚合物之间的化学差异。在所有的情况下，在进行FT-IR测量前冲洗PHP。在图1(a、b)中显示了聚合和磺化后几个PHP样品的FT-IR光谱。该数据表明在经微波照射的样品中存在元素碳(图1(b))。

使用Beckman Coulter(Palo Alto，CA)SA3100 BET气体吸附表面积分析仪(Gas Adsorption Surface Area Analyser)进行比表面积的测量，从而帮助测定吸水量。在制备的各个阶段采用经冲洗的样品(即，在聚合、磺化和中和后)进行表面积测量。与海绵状PHP相同，弹性PHP在水相中含5％的酸且相体积为90％。使用多种磺化技术制备弹性PHP。

表1：多种磺化-中和PolyHIPE聚合物作为加工条件的函数的吸水特性。

^*在温室实验中使用的PHP

为了降低所需的成本和时间，制备在植物生长实验中使用的弹性聚合物用于以立即吸收酸的方法(即，未经冲洗)来进行磺化，因此该聚合物具有12.5的吸水量。海绵状SSS聚合物(SNS-PHP)与聚苯乙烯-丙烯酸乙基己酯(即使在磺化前也具有弹性且其代码为SNS/EHA-PHP)相比吸水非常迅速。

扫描电子显微镜(SEM)研究

采用低倍放大图像，用配有EDX分析的SEM测量PolyHIPE聚合物的平均孔径和互连尺寸。在SEM下固定并观察两种类型的样品，第一种为在温室实验中使用并因此与种子一起放入土壤中的接种聚合物，而第二种为在磺化后仅被高压灭菌然后与细菌肉汤一起放入培养箱的聚合物。制备后者是为能够检查用于微生物(豌豆根瘤菌或土壤菌根真菌)生长而不会被潜在的天然土壤细菌污染的清洁样品。其通过将聚合物浸入细菌肉汤中并将其置于26℃的培养箱内7天来制备。如上所述，用相同的方法冲洗并固定两种类型的样品。但是，对于根瘤菌，到达静止期的优选生长时间为3天。

在将接种的豌豆根瘤菌固定在聚合物中之前，必须在新容器内用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗样品。将PBS倒在样品上直至其完全浸入。样品在密封容器中保持浸没10分钟，然后排出PBS。一旦样品完成冲洗就开始固定细菌的步骤。接着，将用PBS稀释的含2％戊二醛的溶液倒在样品上直至其被覆盖，立即密封容器并将其置于室温下24小时。24小时后，最后一次在PBS中冲洗样品10分钟以除去任何腐质并完成固定步骤。

样品需要被保藏直至在SEM观察，这通过使用乙醇脱水来实现。通过首先将样品浸入10％的乙醇中10分钟来实现脱水。10分钟后，排出乙醇并将样品浸入25％的乙醇中另外10分钟。然后用50％和75％的乙醇重复上述步骤，然后将样品保存在4℃的100％的乙醇中。在SEM下观察样品之前，样品进行临界点干燥并在真空下采用溅射涂覆设备用导电材料(碳、金或金合金)涂覆。

将样品安装在带有从底部伸出的3mm圆柱杆的圆形盘上，并用导电胶带(通常为基于石墨的碳带)将其固定在合适的位置，或者在样品较小或不平的情况下，使用干燥的银涂料将其与样品台接在一起。必须非常小心不能扰动样品的表面，并且在为样品的剖面的情况下，必须使其产生裂纹以避免由切割步骤造成的损坏。

在进行SEM观察前在真空下用金涂覆样品的断裂表面。通过在SEM显微照片上测量孔的直径来测量孔径并且在考虑断裂表面的无规断裂特性对其进行矫正后记录数均尺寸。

图2(a、b、c、d、e、f)图示了在中和前和中和后磺化PHP(相体积90％)样品的典型微/纳米-构造。图2(a)以低放大倍数显示了被较小的初级孔(尺寸大约为75微米)围绕的大聚结孔(尺寸为250微米)。其还显示了在聚合、磺化和中和的各个阶段后PHP的通常的开放孔结构。孔径不受样品化学改性的影响。图2(b)显示了壁表面和壁内部的细微结构，其分别在图2(c)和图2(e)中得到进一步显示。图2(e)显示了在图2(a)中示出的样品在中和后(SNS-PHP)的初级孔(孔径为70微米)。该SNS-PHP的表面结构显示在图2(f)中，该图图示了与磺化未中和(酸性形式)聚合物相比表面空隙度降低。

带有细菌和植物根的生物活性PHP的扫描电子显微镜观察

一些PHP样品用于培养细菌并随后用在土壤中用于固氮以及土壤改良。在这两种情况下，植物根都穿入磺化的海绵状PHP，并因此在PHP+植物之间或者在PHP+细菌+植物之间发生的相互作用均可以通过观察PHP的断裂表面来进行研究。用弹性PHP观察植物根穿入的情况，该弹性PHP也可潜在地用于培养细菌并因此也在SEM下观察。由于在海绵状和弹性PHP内存在生物成分，因此使用了不同的SEM样品制备技术。当研究包含植物根和/或细菌的样品时，如上所述，首先固定与PHP缔合的生物材料，然后用碳涂覆。

测定海绵状中和PHP和草根的缔合体。磺化的中和海绵状PolyHIPE聚合物(SNS-PHP)自始至终被用作土壤添加剂。以测量约为5mm×5mm×5mm的立方体的形式使用该聚合物。在第63天生长期末，切下草后，冲洗根并拍照。

如图3中所示，根穿入聚合物结构，这样即使用水从根冲走土壤并通过仅握住几根草的茎干而提起整个根网络之后，还会保持有聚合物。观察到根不仅附着在聚合物大块的表面而且实际上通过结构生长，这样其变成了根网络的错综复杂的一部分。这一现象在SEM下被更近距离地观察(图4(a、b、c、d、e))，在图中清晰地显示了不仅根毛而且主根也穿过聚合物生长。

如图3和4所示，SNS-PHP不仅含有能通过互连孔的纤细根毛(直径为约10μm)，还含有与孔径相当的直径为150μm的主根。这表明，当根毛在聚合物内长成主根时，由于聚合物为海绵状的并能够膨胀，主根可以使聚合物变形并为生长中的根腾出空间。在生长实验的最后，所有PolyHIPE块均与根缔合在一起。这种大规模的根缔合清楚地表明根被导向水源(即，SNS-PHP)。

用弹性类型的PolyHIPE(图5(a、b、c))进行的其他试验同样证明植物根与聚合物的缔合(图6(a，b))。

使用Nitram^TM硝酸铵(AN)以及Miracle-Gro(MG)肥料，可以研究基于PolyHIPE聚合物的缓释肥料是否能够通过提高肥料使用效率来提高产量。每个缓释肥料处理组都与没有聚合物或养分的对照组以及有等量的肥料而无聚合物的处理组进行比较。

Nitram^TM含有34.5％的氮，并且在种植阶段将施用的剂量(0.1g)溶解于给每罐浇的25ml水中。也使用由Scotts英国有限公司(高达明，萨里)生产的市售液体肥料Miracle-GroPour&Feed。按照制造商的指导使用Miracle-Gro(MG)肥料，在种植阶段每罐施加25ml未稀释的肥料。在最初的种植后，无论Nitram^TM还是Miracle-Gro均不再重复使用。

21天后，草的鲜重产量(图7(a、b))显示除了0.1g的AN外所有处理组均显著促进了(p＜0.05)了草的生长。在没有肥料的标准聚合物处理组和带有肥料的标准聚合物处理组之间未观察到统计学差异。尽管MG提高了产量，但使用AN肥料的却没有带来益处，这表明在新鲜土壤里的氮是充足的，而MG则在其他养分的提供方面使草获益。使用含有MG的聚合物与单独施用MG相比未能显著提高产量。但是，载有AN的海绵状PHP与单独施用AN相比的确显著地(p＜0.05)提高了产量，因为后者与对照组相比没有效果。

对于第一次收割的干重产量(图7(b))，只有聚合物处理组与对照组相比产生了生长的显著性差异(p＜0.05)。聚合物处理组之间均无显著性差异。同样，载有AN的海绵状PHP与单独施用AN相比的确显著提高了产量。

对于第二次收割，单独施用肥料，包括使用MG，与对照相比不能提高鲜重(图8(a))。25ml MG与海绵状PHP的组合处理组产生了最高的平均产量(6.81g)，该产量与对照组的4.26g产量相比提高了59.9％。但是，25ml MG与海绵状PHP的组合处理组与其他基于海绵状PHP的处理组相比未能产生平均产量的显著差异。

第二次收割的干重(图8(b))与鲜重的趋势相同，但在为干重的情况下，含有MG的海绵状PHP的产量明显高于对照组(施用25ml MG)以及不含肥料的海绵状PHP。上述组合处理组获得的平均产量为0.97g，比对照组的平均产量0.63g提高了54％，比直接施用25ml MG的平均产量0.67g提高了44.8％。该数据证明产量的增加不是因为土壤改良特性或肥料自身，而是由于含有MG的海绵状PHP已经成功地起到了缓释肥料的作用。

对于第三次收割，所有的鲜重产量均大幅度降低，并且肥料处理的作用与对照组和不含肥料的海绵状PHP相比不再具有显著性差异(图9(a))。MG与聚合物的组合处理组与直接施加MG相比能够将鲜重产量从1.71g提高至3.08g(增加了80.1％)并将干重产量从0.35g提高至0.52g(增加了48.6％)。对于使用AN的前面的试验，只有在第三次鲜重收割时，0.1g的AN与对照组相比才开始增加产量；但是在这种情况下，与前面的试验不同的是，这种增加没有显著性差异。在干重产量中观察到了相同的结果(图9(b))，其中，肥料处理组中没有一个显著提高了产量。

表2：黑麦草生长：对于不同的聚合物、肥料和收割与对照相比的平均百分比变化。SNS-PHP：具有150μm孔径的海绵状交联磺化-中和苯乙烯PolyHIPE聚合物；MG：Miracle-Gro肥料；AN：硝酸铵肥料粒(Nitram)肥料。浇水方案：每日浇水；立方体(5³mm³)。

干＝干重产量，鲜＝鲜重产量，NS＝产量无显著性(p＜0.05)改变

SSS-聚合物作为水分保持和缓释载体

草在不同浇水条件(每日、每周和减少的每周浇水)下生长并在21天后收割。测量并记录每种样品的鲜重产量和干重产量。每种处理进行四个平行实验。

每日浇水的生长

第一次收割显示，在每日浇水的条件下，与对照组相比，所有使用的处理均能够显著提高(p＜0.05)草的鲜重产量和干重产量(图10(a、b))。0.5％的5mm³海绵状PHP与对照组相比将平均鲜重由5.35g提高至6.63g(即，增加了23.9％)。对于平均干重，也观察到了相同的趋势，从对照组的0.61g提高至5mm³海绵状聚合物的0.80g，增加了31.1％。

在半干旱条件(每周浇水)下的生长

对于两种处理组，通过每周浇水40ml获得的半干旱条件在生长21天后均产生非常低的鲜重和干重(图11(a、b))。但是，聚合物处理组显著(p＜0.05)提高了记录的产量。粉末化的海绵状PHP将平均鲜重产量从0.18g到0.47g提高了一倍以上，增加了161％。

对平均干重产量观察到了类似的效果，其从对照组的平均干重产量0.05g增加到粉末化海绵状PHP的0.12，增加了140％。

在干旱条件下(减少的每周浇水)的生长

对于干旱条件下的收割，仅有粉末海绵状PHP能够增加草的鲜重产量和干重产量(图12(a、b))。海绵状PHP的粉末形式也能够使鲜重的增加具有统计学显著性(p＜0.05)，其达到0.12g，增加了109％。PHP的5×5×5mm³的形式在干旱条件下对草的鲜重或干重均无影响。对于在干旱条件下的干重产量，粉末化的海绵状PHP与对照组相比能够提高产量。数据概括在表3中，其表明尤其是在半干旱和干旱条件下，粉末化的和颗粒状的海绵状聚合物与不含聚合物的对照组相比对生物质(新鲜的和干的)的增加均产生了非常好的结果。

表3：黑麦草生长：对于不同聚合物、肥料和收割与对照组相比的平均百分比变化。SNS-PHP：具有150μm孔径的海绵状交联磺化-中和苯乙烯PolyHIPE聚合物；MG：Miracle-Gro肥料；AN：硝酸铵肥料粒(Nitram)肥料。不同的浇水方案。SSS聚合物类型：SNS-PHP粉末或(5³mm³)颗粒。

有或无SNS-PHP的情况下细菌对大豆生长的影响

研究了含有细菌(日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiurn japonicum))的SNS-PHP对大豆生长的影响，同样是在正常和水减少的条件下，但是存在土壤养分的减少。土壤养分的减少主要是为了显示生物活性SSS-聚合物从空气中固氮的效果，因为当土壤中存在现成的氮时，豆科植物优选使用从土壤获得的氮。

首先由75％的威尔金森氏土壤(Wilkinsons′soil)和25％的园艺沙制备生长培养基。冲洗该土壤混合物以除去某些养分，这样可以减少土壤中的固氮细菌和养分对植物生长的影响，而SNS-PHP和细菌构建物的作用将会更早地显现出来。以25％w/v的比例，即2250g土壤/9升自来水，在桶中冲洗土壤。通过在整个冲洗阶段测量水的导电率来监控冲洗。自来水的导电率为315μS/cm。24小时后，期间偶尔搅拌，导电率提高到775μS/cm。换水并向经冲洗的土壤加入另外9升的自来水。在另外24小时后，导电率平均为506μS/cm。排出过量的水，然后在托盘中干燥土壤并以500g的等份在高压灭菌器中的耐热压塑料袋中灭菌。测量洗涤前后土壤的氮、磷和钾的含量，实验重复三次。

      冲洗前             冲洗后

氮    0.22w％            0.14w％

磷    8.66μg/ml         5.87μg/ml

钾    203μg/ml          108.5μg/ml

日本慢生根瘤菌肉汤的制备

在含有无氮养分溶液的平板上将日本慢生根瘤菌划线以获得单菌落。在第二个平板上重复该步骤以确保为纯的单菌落。接着将单菌落接种在无菌无氮的养分溶液中来用作起子/并在26℃下以160rpm于振荡器中培养72小时。随后，将1ml的起子接种到含170ml的无氮养分溶液的500ml烧瓶中并在26℃下以160rpm于振荡器中培养72小时。

所述无氮养分溶液由200ml霍格兰(Hoaglands)无氮养分溶液、0.2g碳酸钠、10g甘露醇、1g酵母和800ml去离子水制成。对于无氮琼脂培养基，每升养分溶液中加入7.5g的琼脂。

种植

将大豆(品种为PAN)种植在直径为13cm的罐中，实验重复三次并采用下列8种不同的处理：

1、对照-无聚合物或根瘤菌

2、+(SNS-PHP)聚合物

3、+根瘤菌

4、+聚合物+根瘤菌

5、干旱-无聚合物或根瘤菌

6、干旱+(SNS-PHP)聚合物

7、干旱+根瘤菌

8、干旱+(SNS-PHP)聚合物+根瘤菌

将每个罐中加入500g的土壤(已经用水冲洗除去了过量的养分)混合物。每罐种入一粒大豆种子并用1英寸的土壤混合物覆盖。以0.5％w/w-即2.5g/罐的比例将磺化聚合物(SNS-PHP)加入到种子下面的土壤中。将60ml的根瘤菌肉汤加入到罐的表面，其中仅加入肉汤。对于既有聚合物又有根瘤菌的罐，将2.5g的聚合物浸入60ml的肉汤中3天。将浸泡过的聚合物与土壤混合并在种植后将剩余的肉汤倒在表面上。正常浇水的植物每周两次每罐浇水100ml。干旱的植物每周两次每次浇水50ml。在罐的顶部浇灌植物以更好地模拟天然的给水条件。

结果

生长8周后，测量植株的长度。结果显示在下文中并通过图12c中的图表阐明。

表4：在存在/不存在固氮细菌的情况下SNS-PHP在正常(200ml/周)和干旱(100ml水/周)的条件下对生物质产量的影响。SSS-聚合物类型：SNS-PHP 5³mm³形式

仅加入根瘤菌的植物与对照组相比并没有产生明显的增加，但仅加入聚合物的植物无论是正常浇水(32.6％)还是干旱(28.9％)均产生了明显的增加。对加入用根瘤菌浸泡的聚合物的植物观察到了更大的增加，与对照组相比，正常浇水的植物增加了52.2％而干旱植物增加了37.5％。与单纯高度的增加相比，实际的生物质增加得更多。

对在正常浇水条件(每周每罐浇水两次，每次200ml，共400ml)和在干旱条件(每周每罐浇水两次，每次100ml，共200ml)下的麻风树植物进一步进行了其他试验。每罐有500g的土壤混合物(威尔金森氏多用途堆肥和园艺沙)和2.5g(即，0.05w％)的SNS-PHP。每8周用Miracle-Gro全用途浓缩液体植物养料对罐施肥。在使用前稀释该肥料。推荐的用量为每升水5.5ml且每7-10天给肥一次。以每升水11ml的浓度(即，双倍浓度)给予麻风树50ml的稀释肥料但每8周给肥一次。

24周后的结果以图表的形式显示在图12d中。试验18周后植物的照片显示在图12e-g中。同样，由PHP的存在带来的提高是明显的。

使用根瘤菌接种物的豌豆农作物产量

进行了一系列的试验以比较土壤改良剂和细菌肉汤两者对豌豆植物产量的影响。将豌豆荚的产量与剩余植株生物质(茎和叶)的产量分开单独测量，从而可以进行农作物产量之间以及总(即，茎和豆荚)生物质产量之间的比较。

豌豆荚农作物的总产量

由于在对照组产量中观察到大的差异，因此以95％的可信度的独立假设等方差双样本t-检验显示，与对照组相比，实际上处理组中没有一个能够显著提高鲜重产量(图13(a))。但是，根瘤菌与海绵状PHP的组合处理组的平均产量明显不同于仅施用豌豆根瘤菌(由4.24g提高了55.2％)和仅施用海绵状聚合物(由5.11g提高了28.8％)。

对于豌豆农作物的干重产量(图13(b))，与所有处理组(包括对照组)相比，根瘤菌与聚合物的组合处理能够显著地增加产量。组合处理实际上将平均产量提高至1.15g，与对照组的0.68g相比增加了69.1％而与直接施用根瘤菌的0.75g相比增加了52.7％。因此，尽管对照组中的鲜重产量差异大，但干重产量的数据的确证实，对于豌豆荚的生长，组合处理是最有益的。

虽然根瘤菌和聚合物的组合处理的确显著提高了干重产量，但单独使用肉汤接种体无论对鲜重产量还是对干重产量均无影响。这表明，当直接向土壤施用细菌肉汤时，其为不适合的接种体。其原因可能是因为肉汤内的细菌浓度不够高因此不足以使其有效地定殖至土壤从而确保与根接触。也可能是当细菌在肉汤内时其不能附着到土壤颗粒，因此一浇水就被冲走。海绵状PHP的使用已经克服了这些问题，其起到了支持基质的作用以促进豌豆根瘤菌的生长。聚合物不仅在土壤内提供了水分储备而且起到了细菌支持基质的作用，这使细菌能在更稳定的环境中生长并促进了细菌与植物根系的相互作用。

豌豆植株生物质产量

还测量并记录了植株生物质产量(即，植株和豌豆)。

同样，鲜重产量(图14(a))显示在对照组和其他各处理组的产量之间无显著性差异。但是，根瘤菌和聚合物的组合处理与单纯用根瘤菌的处理相比导致显著性差异的产量增加，从7.77g增加至12.77g(提高了64.4％)。

对于干重产量(图14(b))，有一个处理组的确产生了与对照组相比具有显著性差异的产量，这个处理组就是根瘤菌和聚合物的组合处理组。同样，该组合处理与单纯用根瘤菌的处理相比导致显著性差异的产量增加，从1.29g增加至2.08g(提高了61.2％)。但是，与豌豆荚的产量不同，组合处理组与仅施用聚合物观察到的结果相比无显著性差异，因此不能确定该差异是由与细菌缔合的聚合物造成的还是由土壤改良性能造成的。也可能是PolyHIPE聚合物+根瘤菌构建物在与根系缔合时增加了农作物产量但损失了总生物质。

将概括的结果显示在表5中。从该表中可以看出，只有当将磺化-中和海绵状PHP(SNS-PHP)用作具有根瘤菌的SSS时才能使产量显著性增加。这是因为由于并不存在水和养分的胁迫而增加了细菌感染和根瘤形成。如在下节所示，根的缔合导致根瘤形成。

表5.当使用磺化-中和海绵状PHP(SNS-PHP)时，SSS聚合物(磺化、中和海绵状聚合物，SN-PHP)+根瘤菌构建物对平均农作物和总生物质产量的影响，显示了鲜重产量(F)和干重产量(D)的百分比改变。

干＝干重产量，鲜＝鲜重产量，NS＝产量无显著性(p＜0.05)改变

细菌和根与SNS-PolyHIPE聚合物的缔合

为了确定豌豆根瘤菌是否能在PolyHlPE的孔内生长，使细菌肉汤渗入经高压灭菌的PolyHIPE样品的孔内，然后冲洗并固定以在SEM下观察。样品的横截面分析(图15(a、b、c))显示刚好在7天培养后在贯穿聚合物结构广泛生长的细菌菌落周围存在来自细菌的细胞外基质和来自接种体肉汤的微观腐质。在土壤中，与仅有土壤的环境相比，聚合物提供了相对无胁迫的环境并使细菌生长旺盛并避免因水的移动而移位。

当根通过土壤移动时，PolyHIPE结构同样吸引它们。根实际上穿透了SNS-PolyHIPE聚合物的结构，其变成缠绕在豌豆植物的整个根系内(图16(a、b、c、d))。当使用SNS-PolyHIPE聚合物作为草生长的土壤改良剂时，也观察到了这一现象。当与细菌肉汤一起制备聚合物时，在种子萌发的同时，细菌能够在多孔基质内生长。当根到达并穿透聚合物结构时，它们得以与限制环境内的大量细菌接触，这样的限制环境增加了细菌/根的缔合，从而使根瘤形成并生成根分泌物(图17a、b、c、d、e、f、g、h、i)。正是这种密切关系使SNS-PolyHIPE聚合物增强了根瘤菌和豌豆植物间的共生关系，并因此提高了接种体使用效率并提高产量。

在使用SNS-PolyHIPE聚合物内的根瘤菌栽培豌豆农作物的过程中，如图17(e、i)所示，观察到SNS-PHP结构被根分泌物包覆。

同样观察到，与同SSS-培养基没有任何相互作用的情况下生长的根(如图18(b)所示)相比，通过SSS-培养基(SNS-PHP)生长的豌豆根具有更加凹凸不平的结构(图18(a))。

豌豆农作物和植株的组织分析

如表6中所示，使用接种或未接种根瘤菌的SSS-聚合物与对照组(无聚合物或无附加的细菌)相比同样增加了豌豆农作物的氮和磷含量。当将等量的细菌放入土壤中而不是放入海绵状聚合物中时，其对农作物的氮和磷含量的增加也是明显的。由于氮和磷是蛋白质的重要成分，因此这同样表明当使用聚合物时豌豆农作物的蛋白质含量也增加。

同样地，在大多数情况下观察到豌豆和植株的金属含量与对照组相比也增加。这些增加是由于这样的事实，即，海绵状聚合物起到了离子交换介质的作用并且带正电的离子被聚合物吸收随后被植物摄取。

表6.与对照组(不含SSS-聚合物的土壤，无附加的根瘤菌)相比，养分/金属含量的百分比差异.

  海绵状  海绵状  细菌  细菌  接种过的  接种过的  植株  豌豆  植株  豌豆  植株  豌豆  氮  9.63％  20.11％  -45.85％  7.06％  -11.59％  65.49％  磷  15.01％  16.96％  -41.07％  28.85％  5.61％  90.18％  钾  21.87％  11.80％  -36.44％  19.93％  15.84％  81.15％  镁  26.63％  22.67％  -20.16％  10.81％  25.53％  78.11％  钙  14.37％  24.55％  -21.12％  9.11％  26.95％  88.72％  硫  -17.36％  9.75％  13.51％  28.31％  13.19％  70.37％  锰  44.01％  15.85％  -20.58％  4.66％  -10.95％  7.74％  铜  35.93％  -10.83％  -33.11％  17.95％  10.71％  25.87％  铁  156.23％  81.44％  403.78％  106.05％  34.35％  54.03％

豆科植物和非豆科植物的间作

为了通过细菌和植物的缔合促进固氮并与另一种植物分享氮，我们使用豌豆(豆科植物)和草(非豆科植物)。为增加氮转运的间作的其他可用例子包括如金雀花或苜蓿(豆科植物)的多年生植物与麻风树(非豆科植物)，其作为在水-养分胁迫条件下不施加氮肥产生生物质的能源作物。有几个能够固氮的树种(固氮树，NFT)，其在干旱/半干旱的边际土地是特别重要的林粮间作作物。它们包括，例如，沙漠铁木(Olneya tesota)、假紫荆属树木(蓝花假紫荆(Cercidiummicrophyllum))、牧豆树(Prosopis velutina、Prosopis glandulosa)、金合欢树种(夏威夷寇阿相思树(Acacia koa)、台湾相思树(Acacia confusa)等)、银合欢(中非银合欢(Leucaena leucocephala))等。这些固氮树种中的一些也被认为是杂草而它们可以与如柳树、白杨树、麻风树等的能源作物一起种植，这样就没有食物链的竞争。当来自两种作物的根通过作为分享氮的适合环境的SSS-培养基时将会进一步增强氮从豆科植物向非豆科植物的转运。

为了观察共生-培养基内根-根的相互作用，研究了在SSS-培养基存在下的间作。在这些实验中，将一些草籽和一颗豌豆种子种植在每个罐中。在加入用细菌肉汤接种的5³mm³立方体SNS-PHP颗粒形式的0.5wt％的海绵状PHP前，用0.5g的液体肥料(Miracle Gro)处理土壤。每天浇水，在栽培的42天末，回收SNS-PHP颗粒并在SEM下观察。使用两种类型的SNS-PHP。最初，我们使用没有任何根瘤菌的SNS-PHP。图19(a、b、c、d)显示根通过SNS-PHP生长的两种不同类型的根的状态以及微环境的细节。如图20(b、c)所示，当SNS-PHP含有根瘤菌时，在SNS-PHP内也存在两种植物(草和豌豆)的根，但现在SNS-PHP的微环境含有根分泌物，这与如图17(e、i)所示的当仅种植豌豆植物时产生的微环境类似。

混合细菌接种

有益的土壤真菌在大多数植物的氮和磷利用中起到了非常大的作用。它们还帮助水的摄取并抑制根病原菌。与固氮细菌(根瘤菌)向植物根的传递类似，磺化中和海绵状PolyHIPE聚合物(SNS-PHP)被用作有益土壤真菌的传递系统。菌根真菌由PlanfWorks有限公司(肯特(Kent)，Sittingboume，英国)提供，其商品名为Rootgrow。将5g的Rootgrow混入45ml的Hoaglands无氮养分溶液中然后倒在皮氏培养皿中的磺化中和PolyHIPE聚合物圆片上。然后用箔覆盖培养皿以挡住光线并置于28℃的生长室内14天。14天后，在PBS和戊二醛中冲洗样品，然后在乙醇中脱水，接着被临界点干燥以进行SEM分析。

如图21(a、b、c)所示，SEM分析显示菌根真菌存在于SNS-PHP的表面以及靠近表面的孔内。这是由于真菌的丝状特性。图21(a)在低放大倍数下显示了支持体PolyHIPE聚合物的表面结构，而图21(b、c)为磺化中和海绵状PolyHIPE聚合物和菌根真菌的高放大倍数。如前所述，已经用菌根真菌接种的SSS-聚合物能够进一步用根瘤菌接种。或者，可以将用菌根真菌和根瘤菌接种的两种不同类型的SNS-PHP混合并用作联合-土壤添加剂。已知菌根真菌在不同物种(例如固氮植物(农作物和树木)和非豆科植物)的根之间形成网络并在它们之间传递氮。由于这两种类型植物的根与含有菌根真菌或根瘤菌的土壤添加剂多孔亲水生物活性聚合物缔合，因此通过微生物根缔合体建立了养分转运网络。

作为直接根传递系统的SSS-培养基

SSS-培养基的重要特征为：由于SSS-培养基与根的缔合，水、养分、细菌(通过感染)的传递直接通过植物的根实现。这与其中土壤为主要传递载体的其他传递机制相反。因此，本申请的技术更有效且是环境友好的，尤其是当传递其他有毒的农用化学品(例如杀虫剂、除草剂或真正的细菌)时。还可使用SSS-培养基作为含水、养分和细菌的包装物用于运输种子和幼苗直到它们在土壤中定植，以提高植物的存活率。图22以图表形式显示了这种含有各种类型的SSS-培养基的种子/幼苗包装物，所述SSS-培养基载有水、养分或细菌，并混合在一起从而为种子/幼苗在其新环境中的定植提供载体。该系统也可用于在干旱地区通过从飞机投下含有种子或萌发种子的罐来大规模地种植树木(飞播造林)。