植物开花相关基因LFY/FLO同源片段的快速克隆方法及其专用引物

摘要

本发明是植物开花相关基因LFY/FLO同源片段的快速克隆方法及其专用引物，涉及植物同源基因的快速分离克隆技术领域。该方法的特征是所用的专用引物LYF的核苷酸序列是5′-TAYATIAAYAARCCIAARATG-3′，LYR的核苷酸序列是5′-ARIYKIGTIGGIACRTACCA-3′；其引物浓度为25μM，退火温度是44℃。本发明能克隆获得从苔藓植物到种子植物LFY/FLO基因的同源片段，适用的植物种类广泛；能较好地避免以cDNA作为模板时，可能存在的由于LFY/FLO基因的同源片段未表达或表达量低等原因而导致该基因片段难以扩增的问题；该方法快速、简便、经济和有效。

说明书

技术领域

    本发明涉及植物同源基因的快速分离克隆技术领域，具体涉及从苔藓植物到种子植物的LFY/FLO基因同源片段的快速分离方法及其专用引物。

背景技术

植物的成花过程是外界环境和内部遗传因子共同协调的结果，在成花调控网络当中，LFY基因是GA信号和光周期诱导信号转导的枢纽，是决定花分生组织形成的必需基因，并具有激活花器官基因活性的重要作用。LFY/FLO同源基因在有花和无花的高等植物中都存在。LFY/FLO同源基因作为花分生组织特性基因，是决定从营养生长向生殖生长阶段转变的重要元件，且控制着开花时间，但其并非专一表达于成花相关组织。LFY/FLO同源基因广泛表达于高等植物的营养性和生殖性组织，并且可能只有当其表达量达到一定水平时才能促进成花。LFY基因处于成花调控网络的关键位置，不仅调控开花时间和成花转变，而且在花序和花的发育中也起重要作用。

目前，用于植物基因克隆常用的方法有序列克隆法、功能克隆法、转座子标记法、图位克隆法、消减杂交法和差异表达分析等方法。尽管以上几种方法已得到了一定的应用，但普遍存在着耗时长、成本高等不足。

发明内容

   本发明的目的是建立一种从苔藓植物到种子植物都广泛适用的LFY/FLO基因同源片段简便、快速的克隆方法，并提供其专用引物。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

1、一对植物开花相关基因LFY/FLO同源片段快速克隆的专用引物，所述的专用引物是简并引物LYF和LYR，所述的LYF的核苷酸序列是5′- TAYATIAAYAARCCIAARATG -3′，所述的LYR的核苷酸序列是5′-ARIYKIGTIGGIACRTACCA-3′。

2、一种植物开花相关基因LFY/FLO同源片段的快速克隆方法，包括提取植物样品的基因组DNA，用专用引物进行PCR扩增，扩增产物的回收、克隆和测序等步骤，所述的专用引物是简并引物LYF和LYR，所述的引物LYF的核苷酸序列是5′- TAYATIAAYAARCCIAARATG -3′，所述的引物LYR的核苷酸序列是5′-ARIYKIGTIGGIACRTACCA-3′；所述的PCR扩增的PCR反应体系是：在一个25μl反应体系里，10×Buffer 2.5μl，dNTP Mixture 2μl,（各为2.5mM），25μM LYF 1μl；25μM LYR 1μl，样品DNA 1μl ，5U/μl Taq 酶0.5μl，ddH₂O 17μl； PCR反应条件是：94℃预变性2min；94℃变性30s，44℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环； 72℃延伸10min；预期扩增片段大小为236bp；所述的专用引物中 Y表示t或c, I表示肌苷, R表示g或a， K表示g或t。 

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、通过本发明所设计的专用引物（即简并引物LYF和LYR），PCR反应条件的优化，能克隆获得从苔藓植物到种子植物LFY/FLO基因的同源片段，适用的植物种类广泛。

2、本发明中所用的专用引物是基于第二内含子之后的外显子部分进行引物设计，可直接用于以基因组DNA作为模板的扩增，能较好地避免以cDNA作为模板时，可能存在的由于LFY/FLO基因的同源片段未表达或表达量低等原因而导致该基因片段难以扩增的问题。

3、本发明方法快速、简便、经济和有效。

附图说明

   图1是对PCR反应温度进行优化的结果，图中各标记表示：1. 36℃；2. 39℃；3. 44℃；4. 49℃；5. 55℃；M. DNA Marker。

图2是应用本发明所述的简并引物LYF和LYR对14种植物进行PCR扩增后的电泳检测结果，其中：

M为Marker，

泳道1是罗汉松；泳道2是苔藓; 泳道3是枸骨; 泳道4是叶子花; 泳道5是杜鹃; 泳道6是桂花; 泳道7是美人蕉; 泳道8是绿萝; 泳道9是珙桐; 泳道10是青冈; 泳道11是迎春; 泳道12是日本冬樱; 泳道13是竹子;泳道14是牵牛。

 图3是从14种植物中所克隆的LFY/FLO基因同源片段与已报道的水稻和玉米该基因片段的氨基酸序列的同源性分析结果，图中百分数表示相应两种植物LFY/FLO基因同源片段氨基酸序列的同源性。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述，便于更好地理解本发明，但并不构成对本发明的限制，下例实施例中实验方法均为常规方法，所用试剂、耗材，均能从试剂公司购买到，实施例1用本发明方法对如下14种从苔藓植物到种子植物的不同科属的植物进行了植物开花相关基因LFY/FLO同源片段的快速克隆及其基因同源性分析。

罗汉松（Podocarpus macrophyllus），罗汉松科，罗汉松属；

苔藓（Bryophyta）； 

枸骨（ Ilex cornuta  ），冬青科,冬青属；

叶子花（Bougainvillea spectabilis），紫茉莉科, 叶子花属；

杜鹃（Rhododendron hybrida），杜鹃花科，杜鹃属；

桂花（Osmanthus fragrans），木樨科, 木犀属； 

美人蕉（Canna indica），美人蕉科，美人蕉属；

绿萝（Epipremnum aureum），天南星科，麒麟叶属；

珙桐（Davidia involucrata），珙桐科，珙桐属；

青冈（Cyclobalanopsis glauca），壳斗科，青冈属；

迎春（ Jasminum nudiflorum），木犀科,素馨属；

日本冬樱（Prunus subhirtella(Miq.)Sok.），蔷薇科,李属；

慈竹 （Sinocalmus affinis），禾本科，牡竹属； 

牵牛（Pharbifis nil），旋花科，牵牛属。

实施例1 

（1）专用引物即简并引物LYF和LYR设计与合成

根据已报道的LFY/FLO同源基因序列设计的简并引物LYF和LYR，引物LYF的核苷酸序列是5′- TAYATIAAYAARCCIAARATG -3′（即如SEQ ID NO:1所示），引物LYR的核苷酸序列是5′-ARIYKIGTIGGIACRTACCA-3′（即如SEQ ID NO:2所示），预期扩增的目标产物为236bp。

上述专用引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

（2）用所述的专用引物对上述14种植物LFY/FLO同源片段进行PCR扩增，其步骤如下：

①样品的采集

所述的14种植物样品取自云南省昆明市各公园。

②DNA的提取

 应用快捷型植物基因组DNA试剂盒（购于北京天根公司）从植物组织中提取DNA，操作步骤根据天根公司提供的使用说明操作。

③PCR反应条件的优化

本实验用宝生物工程（大连）有限公司提供的Taq                                                完成PCR反应。 

利用不同的退火温度进行梯度PCR，结果表明，在36℃和39℃以及49℃的条件下，所扩增条带较弱，55℃时没有目的条带扩增，5种不同退火温度中，44℃扩增较好，因此，最终确定44℃ 为本研究的最佳退火温度（图1）。

由于引物LYF和LYR具有较高的简并度，设计了不同的引物使用浓度，发现使用标准浓度（10μM）时无目的条带，当引物浓度提高到25μM时，可获得目的条带。

 ④PCR反应

PCR反应体系：

PCR反应条件

94℃ 2min

72℃ 10min

⑤电泳检测

PCR反应终止后，取5μlPCR产物，1.5%琼脂糖电泳检测扩增结果。能够扩增出236bp左右的片段即为LFY/FLO同源片段，如图2。

⑥克隆和测序

用天根胶回收试剂盒回收纯化PCR扩增产物，pMD18-T载体（购于宝生物工程有限公司）连接，转化及克隆鉴定按常规操作方法进行，并送上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序。

⑦序列比对

利用Cluxtal X将所获得的14种植物LFY/FLO基因同源片段与已报道的水稻和玉米该基因片段进行氨基酸序列比对及同源性分析，并通过NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BALST/)在线比对,均表现出较高的同源性，如图3所示，说明利用本发明方法成功地从14种植物中克隆获得了LFY/FLO基因的同源片段。

序列表

 

<110>  西南林业大学

 

<120>  植物开花相关基因LFY/FLO同源片段的快速克隆方法及其专用引物

 

<130>  -

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223> i表示肌苷

 

<400>  1

tayatiaaya arcciaarat g                                               21

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<223> i表示肌苷

 

<400>  2

ariykigtig giacrtacca                                                 20