截短CD20蛋白质,DeltaCD20

摘要

本发明特别涉及一种源于编码CD20的基因的选择性剪接的蛋白质、编码如本发明所述蛋白质的核酸、CD20基因的突变形式，以及使用如本发明所述的蛋白质和核酸序列的药物、诊断工具、诊断方法和治疗方法。

说明书

技术领域

本发明特别涉及一种源于编码CD20的基因的选择性剪接的蛋白质、编码如本 发明所述蛋白质的核酸、CD20基因的突变形式，以及使用如本发明所述的蛋白质 和核酸序列的药物、诊断工具、诊断方法和治疗方法。

背景技术

编码在B淋巴细胞上表达的CD20蛋白质的基因属于定位于11号染色体q12 区域的家族。此区域确定了命名为MS4A(跨膜结构域4亚家族(Membrane Spanning  4 domain Subfamily A))的基因簇，具有称为MS4A1到MS4A12的12个亚类。此 基因簇有600kb。整个CD20基因有41.17kb，分散为被7个内含子隔开的8个外 显子。

CD20的前体mRNA具有14.95KB大小，有416bp的不翻译的5’序列(5’UTR)。 3’UTR区域具有跟随polyA延伸的2291bp，似乎与调控序列对应。该序列潜在地 编码具有297个氨基酸(AA)的蛋白质，预测分子量为33.0KDa。在5’UTR区域 中，更具体地在外显子1中，各种剪接位点已经被识别，产生大小变化为2.8、2.6 和3.4kb的三种形式的转录物。

各种转录物形式编码具有33KD分子量的CD20蛋白质；尽管如此，通过蛋白 质印记(Western blot)和免疫沉淀，已证明33、34.5和36KD三种异形体的存在， 与剪接的变异体不对应但与转录后修饰，磷酸化对应。此蛋白质由极疏水区、4个 跨膜片段(AA68至84)组成，确定细胞外区域(被外显子VI编码的AA)和细 胞内区域(被外显子III、V、VII和VIII编码的AA)。

虽然被广泛用作外周血B淋巴细胞的标记，用于淋巴细胞群鉴定技术或用于 疾病或B血液病(B haemopathy)的诊断，CD20蛋白质的功能至今未被阐明。 尽管如此，人类或小鼠的CD20分子的蛋白质结构类似于其它蛋白质，诸如视 紫质、间隙连接蛋白或某些肾上腺素受体，全部涉及信号传导，暗示该蛋白质 的类似作用。此蛋白质的细胞内部分包含许多磷酸化的序列并且与Src家族酪 氨酸激酶(Fyn，Lyn，Lck)关联。

关于CD20的体外和敲除(KO)小鼠模型功能研究已显示该蛋白质参与膜间 Ca++转运。随着酪氨酸激酶激活引起B细胞粘附，抗CD20抗体与此分子的结合 也诱导c-Myc和B-Myb癌基因的增加，细胞内蛋白质磷酸化的增加，CD18、CD58 和II类MHC分子的增加。这些功能归功于CD20蛋白质仍存争议，因为在关于 CD20的KO小鼠模型中，B细胞的发育和功能未被报导为正常，并且没展现出特 殊的表现异常。

进一步的功能被归功于CD20蛋白质，即在B淋巴细胞(BL)分化和其激活/ 成熟为浆细胞的中的细胞周期调控。在B淋巴细胞个体发育中，在编码Ig重链的 基因重排之后，伴随持续的膜表达至成熟晚期B阶段，CD20在前B细胞表面(祖 B细胞上不存在)被大量地表达。CD20在造血干细胞上、在祖B细胞和浆细胞上 不表达，除了在某些病理情况中，在可能与浆母细胞有关的一小团细胞上。最后， 注意CD20配体未知，致使其功能的确定困难。

在B淋巴细胞表面的表达使通过流式细胞术或采用免疫磁纯化技术鉴定此群 体成为可能。CD20分子在大多数B细胞上的表达参与到恶性疾病，由于一些原因 使其成为治疗靶点的选择：

——标记存在于BL上并且在干细胞和浆细胞上不存在

——它在细胞表面被大量地表达

——它在蛋白水解之后不被分泌或释放进循环

——在抗CD20固定之后，CD20/Ab复合体不被内化

利妥昔单抗(Rx，商品名：Mabthera^TM)是针对CD20抗原的人化小鼠嵌 合抗体。它对提呈CD20抗原的恶性细胞是有活性的，即在III-IV阶段的滤泡 性淋巴瘤和侵袭性扩散大B细胞非霍奇金淋巴瘤，CD20阳性。它也被使用， 选择地与化疗结合，并且更多的是实验性地在其他情况下，举例如某些自身免 疫病，诸如狼疮或类风湿性关节炎。

已按其固定补体和诱导ADCC(抗体依赖细胞介导的(Antibody-Dependent  Cell-Mediated))细胞毒性作用的能力选择人类IgH的Fc部分。影响其功效 的因素是多种多样的：CD20表面表达密度，抗体扩散，治疗性抗CD20抗体 捕获，抗体/靶点结合，FcgR3受体多态性。

发明内容

本发明基于编码CD20的基因的选择性剪接造成CD20截短形式的表达的 发现。此多肽(即，deltaCD20或ΔCD20)缺失了天然的CD20(或wtCD20) 的全部或部分跨膜部分，致使deltaCD20不在B淋巴细胞膜上固定。

这样，在第一个具体实施方式中，本发明涉及多肽，其特征在于，它包 含与SEQ ID NO：2大体相同的氨基酸序列。

在本发明的范围中，术语“大体相同”指具有超过90％，优选95％，更 优选99％和最优选100％的同源性的两段序列。

在本发明的范围中，术语“多肽”指可选择地包含翻译后修饰的氨基酸。 优选地，如本发明所述的多肽可通过合成或基因工程的方法获得。在后一种 情况下，使用术语重组蛋白质。

优选地，如本发明所述的多肽具有与SEQ ID NO：2大体相同的氨基酸序 列；并且更优选地，它是具有序列SEQ ID NO：2的多肽。

为了清楚的目的，详细说明，如本发明所述的多肽与wtCD20(wtCD20 的氨基酸序列通过SEQ ID NO：4表示)特别不同的地方在于它不能与细胞膜 关联。这样，鉴定如本发明所述的多肽也是可能的，它不包含至少二十个连 续的氨基酸序列，该二十个连续的氨基酸序列来自在SEQ ID NO：4中的43 位氨基酸和209位氨基酸之间(即wtCD20的跨膜部分)发现的二十个连续的 氨基酸序列。

本发明还涉及核酸序列，其特征在于，它编码如本发明所述的多肽。如 一个优选的具体实施方式所述，如本发明所述的核酸序列包含与SEQ ID NO： 1相同的核酸序列。如一个更优选的具体实施方式所述，如本发明所述的核酸 序列与SEQ ID NO：1相同。

在本发明的范围中，术语“核酸序列”特别指天然的或合成的DNA或 RNA序列。优选地，如本发明所述的核酸序列通过基因工程的方法获得或合 成。如进一步优选的具体实施方式所述，它由完全或部分纯化的核酸序列组 成。

本发明还涉及包含如本发明所述的核酸序列的重组载体，置于一个或复 数个在宿主细胞中表达其所需的元件的控制之下。重组载体为本领域技术人 员所熟知，他们特别使重组蛋白质的产生和/或核酸序列的扩增成为可能。在 现有技术中许多重组载体是可用的，特别列举质粒和病毒载体。这样，如一 个优选的具体实施方式所述，从包含质粒和病毒载体的群组中选择如本发明 所述的重组载体。

如第一个具体实施方式所述，如本发明所述的重组载体是病毒载体。病 毒载体为本领域技术人员所熟知并且已经被用于人类的临床实践(例如， MVA，腺病毒，反转录病毒)。它们一般由包含全部或部分病毒基因组的载 体组成，病毒基因组被修饰以并入外源序列。如一个优选的具体实施方式所 述，从包含腺病毒载体、反转录病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒衍生载体、 衍生自与腺病毒关联的病毒的载体和甲病毒衍生载体的群组中选择如本发明 所述的病毒载体。本发明还涉及包含如本发明所述的重组载体的病毒颗粒。

优选地，如本发明所述的重组载体与一种或复数种便利其导入到宿主细胞的化 合物相关联。便利载体导入到宿主细胞的化合物为本领域技术人员所熟知并且某些 是商业上可利用的，术语转染剂(transfection agent)也被使用。在一个特别优选 的具体实施方式中，从包含阳离子类脂、钙盐、阳离子聚合物和多肽的群组中选择 便利如本发明所述的重组载体导入到宿主细胞的化合物。

在本申请的范围中，术语“在宿主细胞中表达所需的元件”指用于核酸序列的 翻译和转导(transduction)的核酸序列和用于增加所述转导和翻译的核酸序列。如 一个优选的具体实施方式所述，从包含内含子、多腺苷酸化位点和启动子的群组 中选择在宿主细胞中表达所需的元件。

在本发明的范围中，术语宿主细胞特别指原核和真核细胞。在这些细胞中， 列举细菌、酵母菌、昆虫细胞(例如sf9)和动物细胞(例如CHO，293，PERC6)。 本发明还涉及包含如本发明所述的重组载体的宿主细胞。

申请人还揭示了deltaCD20的表达与某些疾病的存在相关。更进一步，还披露 了deltaCD20的表达水平与这些疾病的发展相关。这点更加具体地适用于与B淋巴 细胞功能障碍(还作为B血液病被知道)有关联的疾病，B淋巴细胞功能障碍代 表85至90％的淋巴血液病。这些特别地由滤泡型淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞白 血病(CLL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、套细胞淋巴瘤(ML)、B细 胞淋巴瘤、骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏病(Disease，WD)组成。

这样，本发明还涉及采用来自病人的生物样品的体外诊断方法，其特征在于， 它包含如本发明所述的多肽的表达水平的测量和/或编码如本发明所述的多肽的 mRNA的表达水平的测量。

术语“生物样品”指任何含有病人的B淋巴细胞的流体或组织。优选地，该 生物样品是病人的血液或骨髓。

如本发明所述的方法可用未处理的生物样品(即没有经过任何改变的取样)实 施，但在通过本领域技术人员视为必要的任何方法处理生物样品之后，也能实施。 这些处理包括红细胞裂解、单核细胞分离(例如在Ficoll上分离)和/或用于保护 生物样品的分子的添加(例如抗蛋白酶)。诸如红细胞裂解和单核细胞分离的技术 特别地使B淋巴细胞与存在于生物样品中的其他细胞相比的比率的增加成为可能。 这样，如一个优选的具体实施方式所述，如本发明所述的诊断方法进一步包含用于 增加B淋巴细胞与存在于生物样品中的其他细胞相比的比率的步骤。

在翻译后修饰之前或之后，多肽可由蛋白质组成，完整的或裂解的。方法涉及 多肽的全部或部分的检测，并且因此它可能只检测mRNA或多肽的部分，因为此 部分的表达水平代表整个分子的表达水平。

在本申请中，术语“表达水平”指细胞表达的deltaCD20的数量。表达水平能 被定量地或半定量地测量。实际上，不必要知道细胞所表达的deltaCD20的确切数 量，但仅确定此数量是否显著地大于某具体值。用一组健康对象并且测量deltaCD20 在这些对象的细胞中的表达水平，这能被本领域技术人员容易地确定。如果如本发 明所述的方法揭示，在病人的细胞中deltaCD20的表达水平大于正常表达，所述病 人将容易患B淋巴细胞功能障碍。

如一个优选的具体实施方式所述，如本发明所述的多肽的表达水平的测量是编 码所述多肽的mRNA的表达水平的测量。用于测量具体编码分子的mRNA数量的 技术为本领域技术人员所熟知。这些技术包括定量RT-PCR，半定量RT-PCR，RNA 印迹(Northern Blot)和微阵列技术。实施这些技术所需的探针和寡核苷酸的设计 和产生在本领域技术人员的范围之内。这些寡核苷酸特别地包括SEQ ID NO：14至 SEQ ID NO：17所描述的那些，这也是本发明的主题。这样，如一个更优选的具体 实施方式所述，通过定量RT-PCR，半定量RT-PCR，实时RT-PCR，RNA印迹或 通过微阵列技术，测量编码如本发明所述的多肽的mRNA的表达水平。

如一个进一步优选的具体实施方式所述，如本发明所述的多肽的表达水平和/ 或编码如本发明所述的多肽的mRNA的表达水平的所述测量，是在B淋巴细胞里 面的如本发明所述的多肽的表达水平和/或编码如本发明所述的多肽的mRNA的表 达水平的测量。

如一个优选的具体实施方式所述，如本发明所述的多肽的表达水平的所述测量 通过免疫学方法实施。在本申请的范围中，术语“免疫学方法”指利用针对所述蛋 白质的特定抗体的蛋白质检测技术。在本申请的范围中，术语“抗体”指包含至少 一互补位的多肽。抗体包括T细胞受体、免疫球蛋白、嵌合抗体、人类抗体、单 克隆抗体、人源化抗体(humanised antibodies)、重组抗体和抗体片段。抗体片段 包括Fab，Fab′，F(ab)2，F(ab′)2，Fv和scFv。

这样，如一个更为优选的具体实施方式所述，如本发明所述的诊断方法进一步 包含一个步骤，在所述步骤中如本发明所述的多肽被置于与针对所述多肽的特定抗 体接触。

用于测量细胞内蛋白质的表达水平的技术为本领域技术人员所熟知。它们特别 地包括，ELISA、流式细胞术、蛋白质印迹。这样，如一个更为优选的具体实施方 式所述，免疫学方法选自包括ELISA、流式细胞术、蛋白质印迹的群组。

免疫学方法能特别地用在细胞裂解产物上或用在膜被渗透致使细胞里面的抗 体的能通行的细胞上。

如一个优选的具体实施方式所述，如本发明所述的诊断方法是用于诊断与一种 或复数种的病人的B淋巴细胞的功能障碍相关联的疾病的方法。如一个优选的具 体实施方式所述，在包含滤泡型淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B 细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、套细胞淋巴瘤(ML)、B细胞淋巴瘤、骨髓瘤、 瓦尔登斯特伦氏病(WD)的群组中，选择与一种或复数种的B淋巴细胞的功能障碍 相关联的疾病。

在实体器官移植中，包括肾移植，同种异基因移植(allogenic graft)缺失仍旧 是主要问题。在超急性排斥反应中捐献者的同种异型抗体(allo-antibody)机理的 作用，与T细胞相关的早期和延迟性排斥反应的作用，是被熟知的，并且部分地 被控制。尽管如此，在长期移植存活方面，影响T淋巴细胞区室的治疗具有被减 少的影响，表明其它靶点效应机理。

被鉴定的CD20基因的剪接产生缺失的转录物，其序列仍旧在阅读框内。mRNA 的剪接形式的转录或翻译成蛋白质，能干扰正常的CD20蛋白质的表达并且削弱其 表面表达，这能调控利妥昔单抗治疗的功效。这点最近在文献中报导了，其中，在 淋巴瘤细胞系中对抗CD20抗体(利妥昔单抗)的耐受性的获得，与转录前和转录 后调控现象或表观遗传(epigenetic)现象相关联。这样，deltaCD20蛋白质因此代 表用于改进利妥昔单抗治疗功效的新的治疗靶点并且阻止逃逸和复发。

在肾移植中，在患有急性排斥反应的病人上的高通量转录组的研究使确定B 淋巴细胞群的特征基因簇、某些类型的急性排斥反应的特征成为可能，这在光学显 微镜中通常不可区分。用免疫组织化学技术进行的补充研究，已证实渗透移植物的 CD20+B淋巴细胞的强烈存在。最终，用利妥昔单抗进行治疗后，渗透移植肾脏的 CD20+细胞的持续存在被证明，而循环的B淋巴细胞池被移除。

跟随此研发，团队已经描述了研究，该研究报导用肾上腺皮质激素、ATG 和血浆去除术进行针对肾脏或心脏移植的抗CD20抗体(利妥昔单抗)治疗， 结果是鼓舞人心的，为在2年时85％的移植物的存活率。

作为一般规则，在实质器官移植中，在参与同种异型抗体产生的B淋巴细胞 区室方面存在增长的价值。在将此B淋巴细胞群作为靶点的试剂中，利妥昔单抗 自然证明其在抑制B应答(B response)方面的价值，对预防的(移植前)和延期 的治疗(将记忆性B细胞作为靶点)都是。采用如本发明所述的诊断方法(例如 在活检片段或无创伤性尿样中)和我们的将ΔCD20蛋白质作为靶点的免疫治疗策 略，在预测急性排斥反应和改善利妥昔单抗治疗方面是有用的。

这样，如一个优选的具体实施方式所述，与一种或复数种的B淋巴细胞的功 能障碍相关联的疾病是急性移植排斥反应。

这样，如一个进一步优选的具体实施方式所述，如本发明所述的诊断方法是用 于评估包含抗CD20抗体的使用的治疗的功效的方法。如一个优选的具体实施方式 所述，所述抗CD20抗体是利妥昔单抗。

本申请还涉及用于实施如本发明所述的诊断方法的试剂盒。这样，本发明还涉 及包含至少一种针对如本发明所述的多肽的特定抗体的诊断试剂盒。在deltaCD20 中，至少一个与野生形式CD20有关的新表位的存在使得针对deltaCD20的特定抗 体的产生成为可能。本领域的技术人员完全有能力通过现有技术中可利用的多种方 法来产生所述抗体。这些特别包括表达scFv的噬菌体库的筛选。这样，本发明还 涉及一种针对如本发明所述的多肽的特定抗体。如一个优选的具体实施方式所述， 如本发明所述的抗体针对野生形式的CD20，并且更具体地，针对具有如SEQ ID NO： 4所确定的序列的多肽，不是特异的。

如一个进一步的具体实施方式所述，如本发明所述的诊断试剂盒包含至少一种 针对mRNA的特定寡核苷酸探针，该mRNA编码如本发明所述的多肽。如一个进 一步的具体实施方式所述，所述寡核苷酸探针包含与SEQ ID NO：14或SEQ ID  NO：17相同的序列。如一个特别优选的具体实施方式所述，所述寡核苷酸探针具 有与SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：17相同的序列。

本发明还涉及如本发明所述的诊断试剂盒的用途，用于检测与一种或复数种的 B淋巴细胞的功能障碍相关联的疾病。如一个优选的具体实施方式所述，在包含滤 泡型淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞急性淋巴细胞白血病 (ALL)、套细胞淋巴瘤(ML)、B细胞淋巴瘤、骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏病(WD) 的群组中选择所述的与一种或复数种的B淋巴细胞的功能障碍相关联的疾病。如 一个进一步优选的具体实施方式所述，所述的与一种或复数种的B淋巴细胞的功 能障碍相关联的疾病是急性移植排斥反应。

本发明还涉及如本发明所述的诊断试剂盒的用途，用于评估包含抗CD20抗体 的使用的治疗的功效。如一个优选的具体实施方式所述，所述抗CD20抗体是利妥 昔单抗。

如本发明所述的多肽对免疫治疗策略(疫苗接种)是理想的靶点。更具体地， 对于与使用抗CD20抗体(例如利妥昔单抗)的治疗相关联的疾病，此免疫治疗策 略对于阻止耐受性和改善治疗是有用的。实际上，发明人用蛋白质印迹证明了，在 体外诱导利妥昔单抗耐受性(具有利妥昔单抗选择压力的B系)的情况下，由截 短蛋白质(truncated protein)所产生的信号的增长，与以定量RT-PCR获得的信号 的增长相关，定量RT-PCR采用来自于同样的群体的mRNA。这意味着表达多数 deltaCD20的细胞逃逸并且耐受标准利妥昔单抗治疗。对于细胞毒性T细胞应答， 截短蛋白质，deltaCD20，是潜在的蛋白质靶点。类似地，同样被描述，用反义寡 核苷酸技术或用RNA沉默途径(SiRNA)，剪接的mRNA是有价值的一个靶位。这 两种途径的目的是使这种选择性剪接能在体内消失。这样，本发明还涉及一种用于 改善治疗的方法，治疗包含抗CD20抗体的使用，包含反义寡核苷酸和/或siRNA 的使用，通过病人的细胞能够完全地或部分地抑制如本发明所述的多肽的表达。

肽接种(peptide vaccination)或免疫治疗是当前在癌症预防或治疗方面具有主 要价值的主题治疗途径。其原理基于用多肽进行免疫，再产生被细胞毒性T淋巴 细胞(CTLs)识别的肿瘤抗原的T表位，对于在其表面表达这些抗体的肿瘤细胞 的消除扮演重要角色。

CTLs不识别整个蛋白质抗原，但识别其肽段，由在各种细胞表面表达的主要 组织相容性复合体(MHC)分子提呈。这些肽段形成T表位。

这些肽的提呈是一个复杂过程的结果，被称为“抗原制备”，牵涉3个主要步 骤：1/通过被称为蛋白酶体的多酶复合物降解胞质抗原；2/在内质网中，通过TAP 转运蛋白转运从所述降解获得的肽；3/这些肽与MHC相关联以形成稳定的肽/MHC 复合体，输出至细胞表面。

由主要组织相容性复合体I(MHC I)提呈的表位一般有8至11个氨基酸， 并且被CD8+T细胞识别，代表细胞毒素应答的主要成分。

对于这些表位，特别是(考虑到CD8+应答在细胞毒作用中的本质性的作用) 那些由MHC I提呈的，其鉴定因此代表关于抗肿瘤免疫治疗发展的本质性的步骤。

目前已知多种肿瘤抗原能够诱导CTL应答。这些抗原的T表位中的某些已经 被鉴定，再产生这些T表位的基于肽的(peptide-based)疫苗的功效在多种情况下 被证明。

跟随人类CD20基因(deltaCD20)新的选择性剪接的发现和由所述的截短 mRNA编码的蛋白质的发现，申请人发现了这样的靶点在抗肿瘤免疫治疗方面的 影响。实际上，所获得的结果证明此靶点蛋白质(不在健康捐献者的B淋巴细胞 表达)在肿瘤形成方面的作用和其在抗CD20抗体(利妥昔单抗)治疗耐受性方面 的作用。

除了与B淋巴细胞功能障碍或急性移植排斥反应相关联的疾病的标准治疗(抗 CD20抗体(利妥昔单抗))之外，Delta20蛋白质和针对与剪接结合带(splicing  junction zone)重叠的多肽的T细胞毒性应答诱导的发现，使实施疫苗接种免疫治 疗成为可能。此疫苗接种可直接用肽施行，或用编码所述肽的重组载体施行。

这样，本发明还涉及如本发明所述的多肽的全部或部分的用于制备药物的用 途，或如本发明所述的重组载体的全部或部分的用于制备药物的用途。如一个优选 的具体实施方式所述，所述多肽包含至少一种选自包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO： 7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO： 12和SEQ ID NO：13的群组的序列。如一个更优选的具体实施方式所述，所述多 肽由具有选自包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO： 9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的群组 的序列的多肽组成。

本发明还涉及编码多肽的核酸序列的用于制备药物的用途，所述多肽包含至少 一种选自包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ  ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的群组的序列。 如一个优选的具体实施方式所述，编码多肽的核酸序列的用于制备药物的用途，所 述多肽具有由选自包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO： 9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的群组的 序列组成的序列。

如一个更优选的所述的用于制备药物的用途的具体实施方式所述，所述多肽包 含至少一种诸如SEQ ID No：9的序列。如一个特别优选的具体实施方式所述，如 本发明所述的用途的特征在于，所述多肽由具有诸如SEQ ID No：9的序列的多肽 组成。

如一个优选的具体实施方式所述，所述医药产品用于改善治疗功效，所述治疗 包含抗CD20抗体的使用。如一个更优选的具体实施方式所述，所述抗CD20抗体 是利妥昔单抗。

如一个优选的具体实施方式所述，所述药物用于治疗或阻止B血液病、滤泡 型淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、 套细胞淋巴瘤(ML)、B细胞淋巴瘤、骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏病(WD)。

本发明还涉及多肽，多肽具有选自包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ  ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和 SEQ ID NO：13的群组的序列。

进一步的途径可以是基因转移，编码如本发明所述的抗体，因此针对这种 蛋白质重定T淋巴细胞靶点。针对这种蛋白质的单克隆抗体的发展，将使并行 鉴定编码轻和重Ig链的高可变区(CDR3)的序列成为可能。所鉴定的序列因 此可通过基因转移用T细胞转染。协同自杀基因可使控制抗ΔCD20T应答成 为可能，虽然它将被限制于表达这种形式的蛋白质的激活的肿瘤T细胞。这样， 本发明还涉及如本发明所述的抗体的用于制备药物的用途，或编码所述抗体的 核酸的用于制备药物的用途，或包含所述核酸序列的载体的用于制备药物的用 途，并且优选地用于制备用于治疗来自列表的疾病的药物，与在本申请中所描 述的B淋巴细胞功能障碍相关联。

CD20同时是膜标记，因它在B细胞表面被表达，但也是“易感”基因，因在 某些血液病中编码抗CD20抗体治疗(利妥昔单抗)的靶点分子。为了在体外(例 如通过反转录病毒)或体内修饰T细胞(不正常表达CD20)，这两种属性能用于 基因治疗。这对调控和控制由T淋巴细胞(TLs)引起的骨髓同种异基因移植后的 并发症特别有用。这样，在基因修饰之后，在CD20表达(不被TLs正常表达)的 基础上，细胞可被选择(例如通过免疫磁性系统手段)，并且如果存在并发症(移 植物抗宿主病，GvHD)，可在体内作为抗CD20抗体(利妥昔单抗)的靶点。

虽然在基因修饰规则中，作为选择标记并且作为易感基因，CD20基因的使用 是有价值的，用反转录病毒LTR启动子，用其作为易感基因的各种研究已经证明 此基因表达的不稳定性。CD20基因的选择性剪接的产生可能是表达调控 (modulation)的根源。而且，在用携带“全部长度”CD20cDNA的载体转染的 反转录病毒包装系中，我们证明了选择性转录的存在。这个系(line)因此将产生 ΔCD20反转录病毒颗粒，可感染靶细胞，但无表面CD20表达，这会限制反转录 病毒转导的功效。更进一步，被转导的靶细胞表达CD20转录物的剪接形式，可削 弱其对利妥昔单抗的敏感性。

这样，选择性剪接的发现，和用于此剪接的供体和受体位点的发现，使产生核 酸序列成为可能，所述核酸序列编码天然CD20，并且在所述供体和/或受体位点上 包含修饰以阻止所述选择性剪接。这样，本发明涉及编码CD20的核酸序列，其特 征在于，它不包含选择性剪接位点。如一个优选的具体实施方式所述，所述序列包 含诸如SEQ ID NO：5的序列，并且特别优选地，所述序列由诸如SEQ ID NO：5 的序列组成。本发明还涉及如前面定义的重组载体，重组载体包含所述核酸序列。 本发明还涉及病毒颗粒，病毒颗粒包含所述重组载体，所述重组载体与一种或复数 种便利其导入宿主细胞的化合物相关联，如上面定义，并且宿主细胞(如上面定义) 包含所述重组载体。本发明还涉及所述核酸序列或所述重组载体的用于制备药物的 用途并且优先地用于制备用于改善包含抗CD20抗体的使用的治疗的功效的药物， 并且更优先地，所述抗CD20抗体是利妥昔单抗。

本发明还涉及包含如本发明所述的多肽、核酸序列、抗体和/或寡核苷酸和药 学可接受缓冲液的药物组合物。

具体实施方式

实验

1.编码CD20的基因的选择性剪接的证明

为了关闭在反转录病毒的质粒骨架中的编码CD20的cDNA，我们通过 RT-PCR，使用自DAUDI B系提取的RNA，扩增与CD20蛋白质整个编码部 分(CDS)对应的节段，使用2个分别覆盖“起始”和“终止”密码子的引物。

PCR产物的电泳揭示了2个有区别的带，一个具有所期待的894bp的大小而 另一个具有小于393bp的大小及相同的长度。

NCBI基因库的测序和比对揭示了与编码CD20基因的片段对应的序列，在其 中间部分501bp缺失，保留“起始”和“终止”密码子。在蛋白质上的缺失分析证 明，跨膜部分实际上完全缺失，这不利于此蛋白在细胞膜表面的固定。

截短蛋白质具有131个氨基酸的序列，预测分子量为15kD，并且截短蛋白质 包括胞质内C-端结构域、第一跨膜结构域的一个小的部分和胞质内N端结构域末 端。如通过共聚焦显微镜图像所证明的那样，通过用表达wtCD20/GFP或 ΔCD20/GFP融合蛋白的载体进行细胞系转染，由于缺乏4个跨膜节段的表达，潜 在的截短蛋白质不被固定在膜上。在用pcDNA3.1CT拓扑表达载体(inVitrogen) 转染之后，wtCD20Δ/GFP或CD20/GFP蛋白质在293T真核细胞中表达。因GFP 蛋白质在CD20序列(Δ或WT)的阅读范围被克隆。GFP蛋白质通过直接激发被检 测(绿色)并且wtCD20蛋白质通过与TIRTC偶联的抗CD20抗体被检测(红颜 色)。这样，在用截短形式CD20感染的细胞中，示踪的是胞质，而观察到与GFP 和wtCD20对应的绿色和红色标记基本上共同定位于膜。这证实了ΔCD20被限制 于胞质。

用剪接位点、剪接供体位点和受体位点预测软件((NNSPLICE v0.9软件- http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.htm)对编码CD20基因(WRCD20)的野生 序列的分析，证明供体位点(DS)和隐蔽的受体位点(AS)的存在，与编码缺失 CD20基因(ΔCD20)序列精确对应。更深入的研究，用其它软件系列(Netgene 2 -http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2)检测出分支位点，位于受体位点的某二 十个碱基对上。

1.ΔCD20蛋白质的表达

a.蛋白质印迹检测

为了剪接转录物所编码的截短蛋白质(不带跨膜部分，因此是胞质的)的存在， 我们用B细胞系，通过蛋白质印迹的手段，用识别蛋白质C端部分的抗CD20的 可利用的抗体(Thermo Fischer，#RB9013)进行试验。这样，我们证明了，除了所 期望的与野生CD20蛋白质对应的带之外，还有与ΔCD20对应的所期望大小 (～17KD)的带的存在。此蛋白质在T系中不被表达。

2.ΔCD20：对B血液病或肾脏同种异基因移植后并发症(急性排斥反应，淋巴瘤)的诊断和/或预后分子生物标记

a.选择性ΔCD20转录物和B血液病

用定性PCR试验，扩增编码序列(flCD20 PCR)的整体，我们筛选衍生自各 种类型的B血液病的其它系(Burkitt、前B急性淋巴细胞性白血病、转化的 B-EBV)并且证明短小形式的CD20转录物存在于所有B系和不存在于T系。然 后我们开发了敏感并且特异的PCR工具(ΔCD20 PCR)，通过设计覆盖剪接结合 位点(splicing junction site)的引物。这种新工具只能检测短小形式的mRNA并且 因此避免了与高敏感性矛盾的PCR竞争现象。

使用这种更有效的PCR工具，我们在PBMCs上试验短小形式的CD20，或为 了更加敏感，在来自5个健康捐献者的CD19+或CD20+B细胞上试验短小形式 的CD20，未检测出相同的。使用我们的敏感的PCR工具，对截短转录物 (truncated transcript)的特定筛选显示在细胞系上的阳性信号和在PBMCs上 的阴性信号，表明在EBV转化细胞中，在恶性细胞中，此剪接机制存在并且 在正常B细胞中不存在。此截短形式的CD20RNA因此是与其恶性表现型 (phenotype)相关联的B细胞活化状态的识别标志。

b.在各种类型的B血液病中的ΔCD20的诊断定量

为了阐明在某些血液病诊断中使用ΔCD20转录物定量的可能性，我们将我 们的QRTPCR化验应用于各种类型的B血液病。两种形式(完全长度和截短的) 的定量以一系列稀释度范围进行实施，稀释度范围为已知数量的，包含wt或Δ 形式的CD20的标准质粒的。计算比率R＝[ΔCD20/(wtCD20+ΔCD20)]x100使 表达关于野生形式的CD20转录物相对定量成为可能。因此我们证明在各种B 血液病中这些选择性转录物的差异表达。在体外转化的B-EBV系中(2.9± 4.51％，n＝6)，在纯化的CD19+扁桃体摘除术(tonsillectomy)细胞(9±2.2％，n＝7) 和体外产生的B幼稚细胞(blasts)(14±7.8％，n＝5)中，我们量化了ΔCD20的 剪接形式[以ΔCD20的％形式表示：R＝(ΔCD20/wtCD20+ΔCD20)x100]。以 有利的方式，我们量化了ΔCD20，在B急性淋巴细胞性白血病(n＝27)中为3.6 ±5.1％，在滤泡型淋巴瘤(n＝5)中为3.9±5.3％；在套细胞淋巴瘤(n＝6)中为2.9 ±4.5％；在高级别淋巴瘤(n＝5)中为3.2±2.2％；并且在B-CLL(n＝8)中为0.1± 0.2％。

c.ΔCD20：残留病标记(RDM)

一个进一步的可能还将是，使用我们的实时PCR定量化验以监控治疗功效(例 如可选择地与利妥昔单抗-Rx-相关联的化疗)。此试验对不具有特征分子或表现型 标记的血液病是非常合适的。ΔCD20定量动力学与标准分子标记的表达进行比 较，标准分子标记诸如BCR/ABL(p190)转录物和分别用于急性淋巴细胞白血 病-B型(ALL-B)和套细胞淋巴瘤的细胞周期蛋白D1。我们证明了通常的标 记(细胞周期蛋白D1和BCR/Abl p190)和ΔCD20之间的相关性。

3.ΔCD20蛋白质，潜在的治疗靶点

a.对于抗CD20抗体(利妥昔单抗)的耐受性

在体外我们用B系，通过使它们暴露在不同的剂量和时间，确立了Rx的耐受 性。在体外敏感性试验证实了耐受性的获得。

以很有利的方式，通过蛋白质印迹的手段，我们证明截短形式的CD20蛋白质 的信号根据群体的Rx耐受性获得而增强。更具体地，在患滤泡型淋巴瘤(n＝3) 或套细胞淋巴瘤(n＝3)的病人的细胞中，我们量化了编码ΔCD20的mRNA。我 们观察到利妥昔单抗耐受性获得是，在每个案例中，与编码ΔCD20的mRNA的量 的增加相关(均值x3.38)。

b.ΔCD20-特定寡肽的构建

这样，利用ΔCD20mRNA序列的翻译，我们使用SYFPEITHI库 (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)来设计与选择性剪接结合带重叠的肽 (AA30至AA39)，该肽因此对ΔCD20形式是特异的。使用预测的蛋白酶体裂解 工具(http://paproc.de)，有价值的两个潜在免疫源性的肽(No.4-RMS和No. 7-SLE)被检测到，因它们潜在地由蛋白酶体酶(proteoasome enzyme)制备并 且因HLA-A*0201受限制。

与这些序列对应的肽通过MILLEGEN(LABEGE，法国)合成并且溶解在20％ 的DMSO中和贮存在-80℃。

在体外，证实了仍未解决的鉴定为针对MHC分子的肽的结合的亲和性，和肽 /MHC I分子复合物的稳定性(未示出数据)。

c.肽疫苗接种后的T细胞毒性应答诱导

对于H-2I级和II级，通过在HLA-A2/DR1和敲除(KO)转基因小鼠上产生 CTL评估ΔCD20a肽的免疫原性。

用2或3种肽使小鼠(每组4个)免疫(在尾巴根部2次注射，间隔8天)： 每种肽50μg，辅助肽100μg(来自CMV-特异性pp65的20mers肽)，全部用弗 氏不完全佐剂(incomplete Freud adjuvant)一起乳化。

在第二次免疫之后七天，小鼠的脾脏被移除并且在体外分别用4μg/ml的每种 肽再刺激脾细胞。在培养的第五天，测试应答的群体，以确定特定的细胞毒素。在 体外，以一个星期的间期时间，再刺激具有最终细胞毒性的细胞，以获得特定的 CTLs。

RMAS-HHD细胞用作靶点以研究细胞毒素。用10μg/ml的受验的肽，或不相 关的对照肽填充这些靶点细胞，37℃，90分钟，并且用100μCi的51Cr标记90 分钟，并且清洗三次。脾细胞被分到96孔V底板(3x10 3个细胞/孔，在100μl 的RPMI 1640+10％胎牛血清中)。然后，将100μl的效应细胞(效应细胞/ 靶点细胞比例＝30∶1；10∶1；3∶1和1∶1)加入孔中并且在37℃下将培养板孵育 4小时。在孵育之后，收集50μl的上清液，转移到特定的板(Lumaplate)中 并且在γ计数器中测定放射性。用公式计算特定的裂解百分数：[(实验的51Cr 释放-自发的51Cr释放)/(最大的51Cr释放-自发的51Cr释放)]x100。

来自免疫组A的4个小鼠中的三个针对肽No.4生成T细胞毒性应答并且 对第三方肽BMLF1无应答，这对EBV是特异的，因此表明应答的特异性。

这些结果证明，用RMS肽的免疫产生杀死装有所述肽的RMAS-HHD靶点 的CTLs，而不是装有不相关肽的细胞。

这些研究清楚地证明我们能够获得抗ΔCD20 CTL应答，能用于改善抗 CD20抗体治疗和阻止或消除CD20+肿瘤B淋巴细胞(表达ΔCD20蛋白质) 的持续存在。

4.编码CD20的序列的定向诱变的产生，不合适于选择性剪接

因此我们试图使人类CD20基因的野生序列突变，以限制这些选择性转录 物的形成。受体位点的突变以修饰核苷酸序列并维持阅读框架，因此氨基酸序 列——维持以CAG或CAA密码子编码的AA Gln。在核苷酸612处实施突变 (坐标基于ATG——起始密码子的第一个碱基)：-nt612G＞A.。在定向诱变之 后，我们通过测序证实在受体位点上的单个碱基对的突变。最终，我们证明突 变的CD20基因序列(mutCD20)不进一步产生选择性转录物。CD20表达的流 式细胞术分析证明表达被维持，并且蛋白质实际上在膜上表达。