用于检测稗草对二氯喹啉酸抗药性的基因片段以及引物

摘要

本发明提供一种新的检测稗草对二氯喹啉酸抗药性的基因片段以及引物以及利用这些基因片段和引物进行检测的方法。利用这些方法能够准确检测出稗草是否对二氯喹啉酸具有抗药性。

说明书

技术领域

本发明属于利用基因片段或序列进行杂草抗药性检测领域，特别地，属于利用稗草对 二氯喹啉酸抗药性的基因片段以及引物来检测稗草对二氯喹啉酸抗药性以及利用这些基因 检测抗药性的方法。

背景技术

截止2011年5月全球已有197种杂草(115种双子叶，82种单子叶)的358个生物型 对19类化学除草剂产生了抗药性，几乎涵盖各类重要的除草剂。抗药性杂草已成为杂草治 理和农业生产的严重威胁，由其引发的严重经济和安全问题倍受全球关注。

稗草(Echinochloa crusgalli)是世界性的稻田恶性杂草，是我国农田15种严重危害杂 草之首。而1988年德国巴斯夫公司开发的二氯喹啉酸(Quincloric)是防除稗草等禾草的特 效药，自1990在我国推广使用以来，防效显著，但是，由于十多年连续使用，在我国南北 稻区逐渐出现抗药性稗草，而且日趋严重。抗药性稗草的漫延和猖獗带来了许多负面效应， 如降低生物多样性、增加农药的投入，污染作物的产地环境，降低水稻的产量和品质等。

GH3(Gretchen Hagen 3)基因最早是从大豆中克隆出的植物生长素早期响应基因 (Primary-response genes)，后来在拟南芥(有19个GH3家族成员)、水稻(有13个GH3的 类似基因)，烟草(至少1个GH3基因)，辣椒(1个GH3基因))，印度芥菜(有2个GH3 的类似基因)及苔藓植物P.patens(有3个GH3家族成员)中发现许多GH3基因或其类 似基因，有的GH3以基因家族的形式存在，例如在拟南芥基因组中，在第5条染色体上有 5个GH3基因，而且这些基因方向一致地串联排列在一起。生长素能够诱导GH3基因家族 中的大部分基因快速、瞬时地表达。这种快速应答是调节植物体内生长素动态平衡的机制 之一。植物GH3蛋白具有IAA等植物生长素氨基酸化合成酶和腺苷化合成酶活性。

快速、准确、高通量的杂草抗药性检测方法，是抗药性杂草防治的一个关键环节。目 前杂草抗药性检测方法主要有(1)、温室整株植物鉴定法。它是国际杂草抗药性管理组织 推荐的一种主要技术，优点是简便易行，重复性好。缺点是温室空间大，试验周期长、不 能对当季杂草作鉴定。(2)、组织或器官的形态结构比较鉴定法，包括种子或幼苗检测法、 分蘖检测法、花粉粒萌发法、叶圆片浸渍技术测定等，其优点是简便易行，缺点是不准确。 (3)、细胞或细胞器水平测定，包括叶片内叶绿素荧光测定法、离体叶绿体测定技术、光 合速率测定法，优点是准确，缺点是复杂、对技术和设备要求高。(4)、生理生化鉴定法， 主要是酶活性测定法，缺点是：只适合靶标酶已知的杂草。(5)、DNA分析技术鉴定法， 主要是靶标基因序列的突变位点比较。缺点是，只适合靶基因突变的杂草。(6)、蛋白质水 平的鉴定法，主要是ELISA法对抗性杂草的特异蛋白质的检测。缺点是，只适合已知特异 蛋白质的抗药性杂草。

标志基因法检测杂草抗药性优势明显，首先它可实现大规模、高能通量的样品量检测， 因而可迅速掌握大面积农田的杂草抗药性水平和范围。其次对当季稻田发生的杂草草实现 检测，掌握其抗药性水平。第三是检测周期短、出结果快，只需要几天便可得结果。其缺 点是对仪器要求较高，荧光定量PCR仪是较贵。

发明内容

一个标志基因只能检测一种或一类农药的杂草抗药性。所以挖掘农药的标志基因是发 展和完善标志基因法的必由之路。农药的标志基因应该具备：在不同抗药性水平的杂草植 株中，标志基因在转录水平的表达量存在差异，这种差异是区分杂草抗药性的定量指标， 而且其表达量和抗药性水平存在较好的线性关系。为了进一步验证结果的准确性。标志基 因还应该有其它的特征，比如在对应农药处理杂草后，在不同抗药性水平的杂草植株中， 标志基因有不同的表达特征。

本发明小组人员提出了通过检测标志基因在转录水平的表达量是一种新的杂草抗药性 检测方法。GH3基因是植物生长素储存代谢基因，在维持细胞内正常生长素浓度方面起重 要作用。本发明小组从抗二氯喹啉酸稗草克隆了GH3基因的同源基因并命名为ec-GH31。 ecGH31基因名称中，按国际命名习惯EC是稗草拉丁文Echinochloa crusgalli的首字母缩 写。GH3是来自稗草的与GH3基因同源的基因，1指稗草的GH3基因家族中克隆的第一 个基因。

它在抗、感二氯喹啉酸稗草植株体内的表达量明显不同，用二氯喹啉酸处理防治适期 的抗、感稗植株后，具有明显不同的表达曲线。以上特征使GH3基因成为检测稗草抗二氯 喹啉酸水平的标志基因，为建立一种杂草抗药性检测新方法提供了可能。

采用RACE法，从来自浙江的抗二氯喹啉酸稗草中，克隆了生长素IAA代谢相关基因并 命名为ec-GH31。该基因阅读框长度为1839bp，编码612个氨基酸。基于Real-time PCR实验结 果发现，该基因在不同水平的抗二氯喹啉酸稗草中表达量存在明显特征性差异，故提出稗 草对二氯喹啉酸抗药性的检测方法。

一方面，本发明提供用于检测稗草属于对二氯喹啉酸抗性的基因序列。一种用来检测稗 草对二氯喹啉酸抗药性的基因序列，其中该序列为SED IN NO：29。

优选的，所述的基因序列，其中，该基因序列包括依所述的续列设计的引物。优选的， 其中所述的引物序列为IN NO：31和SED IN NO：32；或SED IN NO：33和SED IN NO：34。 优选的，所述的检测为检测该基因序列在转录水平的表达量。优选的，其中检测的方法为 Real-Time PCR方法。

优选的，所述的检测包括以下步骤：在待检测的稗草和对照稗草上取样产生样本；在待 检测的稗草和对照稗草上用二氯喹啉酸处理后在不同时间取样产生样本；检测稗草样本的 GH3基因在转录水平的表达量；把GH3基因的表达量与对照处理的GH3基因的表达量进 行比较；比较的结果来进行待检测的稗草对二氯喹啉酸的抗药性评价。优选的，检测对照 稗草所使用的引物为序列SED INNO：33和SED INNO：34。更优选的，其中，检测待检测 的稗草所使用的引物为序列SED IN NO：31和SED IN NO：32。

另一方面，本发明提供一种检测稗草对二氯喹啉酸抗药性的方法，包括：在待检测的稗 草和对照稗草上取样产生样本；在待检测的稗草和对照稗草上用二氯喹啉酸处理后在不同 时间取样产生样本；检测稗草样本的GH3基因在转录水平的表达量；把GH3基因的表达 量与对照处理的GH3基因的表达量进行比较；比较的结果来进行待检测的稗草对二氯喹啉 酸的抗药性评价。

优选的，以稗草actin为对照，待检测的稗草GH3基因在转录水平的相对表达量大于 100的为抗二氯喹啉酸类型。更优选的，其中，当使用常规用量的二氯喹啉酸在用药窗口 期处理稗草后，在1小时内待检测的稗草体内GH3的表达量升高幅度小于1.5倍，在2小 时至5天内其体内GH3的表达量升高幅度为0.2～1倍；在第6天其体内的GH3的表达量 升高幅度为2～3倍的为抗二氯喹啉酸类型。

优选的，其中，以稗草actin为对照，待检测的稗草GH3基因在转录水平的相对表达 量小于50的为感二氯喹啉酸品种。优选的，其中，使用常规用量的二氯喹啉酸在用药窗口 期处理稗草后，在1小时内待检测的稗草体内GH3的表达量升高幅度大于4.5倍，在2小 时至3天内其体内GH3的表达量升高幅度为0.3～1.5倍；在第4和第6天其体内GH3的 表达量升高幅度在2～3倍，在第5天其体内二氯喹啉酸的表达量升高幅度大于16倍的为 感二氯喹啉酸类型。

优选的，其中，以稗草actin为对照，待检测的稗草GH3基因在转录水平的相对表达 量介于50～100为二氯喹啉酸敏感和抗性的中间类型。优选的，其中，使用常规用量的二 氯喹啉酸在用药窗口期处理稗草后，在1小时内待检测的稗草体内GH3的表达量升高幅度 介于于1.5～4.5倍的为二氯喹啉酸敏感和抗性的中间类型。

在以上所有的实施方式中，所述的稗草的GH3为SED IN NO：29，以及依此序列设计 的引物。优选的，其中，检测所述待检测稗草GH3基因表达的方法为Real-Time PCR，引 物为序列SED IN NO：31和SED IN NO：32。更优选的，其中，检测所述对照稗草GH3基 因表达的方法为Real-Time PCR，引物为序列SED IN NO：33和SED IN NO：34。 另外，该方法还包括以下特征：

(一)、具有如下特征的稗草属于对二氯喹啉酸有抗药性的稗草：(1)以稗草actin(Ct) 为内参，稗草ecGH31基因在转录水平的相对表达量大于100。(2)使用常规用量的二氯 喹啉酸在用药窗口期处理稗草后，在1小时内其体内ecGH31的表达量升高幅度小于1.5 倍，在2小时至5天内其体内ecGH31的表达量升高幅度为0.2～1倍。在第6天其体内的 ecGH31的表达量升高幅度为2～3倍。

或，(二)、具有如下特征的稗草属于对二氯喹啉酸敏感的稗草：(a)以稗草actin(Ct)为 内参，稗草ecGH31基因在转录水平的相对表达量小于50。(b)使用常规用量的二氯喹啉 酸在用药窗口期处理稗草后，在1小时内其体内ecGH31的表达量升高幅度大于4.5倍，在 2小时至3天内其体内ecGH31的表达量升高幅度为0.3～1.5倍。在第4和第6天其体内 ecGH31的表达量升高幅度在2～3倍，在第5天其体内二氯喹啉酸的表达量升高幅度大于 16倍。

或，(三)、具有如下特征的稗草属于对二氯喹啉酸敏感和抗性的中间类型：(1)以稗草actin (Ct)为内参，稗草ecGH31基因在转录水平的相对表达量介于50～100。(2)使用常规 用量的二氯喹啉酸在用药窗口期处理稗草后，在1小时内其体内ecGH31的表达量升高幅 度介于于1.5～4.5倍。

或者，以上三个方面的组合或同时满足以上三个条件的检测方法。

附图说明

图1为本发明的一个实施方式中稗草总RNA电泳验证图；

图2为本发明的一个实施方式中稗草中间片断RT-PCR电泳验证图；

图3为本发明的一个实施方式中ecGH35RACE-PCR产物(约1800bp)电泳图；

图4为本发明的一个实施方式中ecGH35RACE菌落PCR电泳结果图；

图5为本发明的一个实施方式中ecGH313RACE-PCR产物(约1100bp)电泳图；

图6为本发明的一个实施方式中ecGH313RACE菌落PCR电泳结果图；

图7为本发明的一个实施方式中三个片段位置关系及其引物位置示意；

图8为本发明的一个实施方式中验证ecGH31全长的三个内nest PCR电泳结果图；

图9为本发明的一个实施方式中ecGH31与拟南芥的GH3家族成员的亲缘关系图；

图10为本发明的一个实施方式中ec-GH3-R基因扩增曲线分析图；

图11为本发明的一个实施方式中ec-GH3-R基因熔点曲线分析(Tm＝80.5℃)图；

图12为本发明的一个实施方式中ec-GH3-S基因扩增曲线分析图；

图13为本发明的一个实施方式中ec-GH3-S基因熔点曲线分析(Tm＝80.5℃)图；

图14为本发明的一个实施方式中ec-GH3基因扩增效率分析图；

图15为本发明的一个实施方式中ec-actin-R基因扩增曲线分析图；

图16为本发明的一个实施方式中ec-actin-R基因熔点曲线分析(Tm＝84℃)图；

图17为本发明的一个实施方式中ec-actin-S基因扩增曲线分析图；

图18为本发明的一个实施方式中ec-actin-S基因熔点曲线分析(Tm＝84℃)图；

图19为本发明的一个实施方式中ec-actin基因扩增效率分析图。

实施例

为了进一步对本发明进行详细的说明，现在以具体实施例子进行说明，这些说明仅仅是本 发明的具体方式的有限的列绝，并不对本发明做任何的限制。

实施例1：ecGH31基因的克隆

材料准备

选取经过温室整株植物鉴定法(参见：Moss，S.R.(1995)Techniques for determining herbicide  resistance.Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference-Weeds，547-556.)鉴定的 抗二氯喹啉酸稗草种子，25℃下置于湿润滤纸上催芽3-5天，选取发芽整齐的稗草幼苗移 栽于人工土壤中，培养至3-5叶期，备用。

用50％杀稗王(江苏新沂中凯农用化工有限公司)配成0.5g/L浓度(有效成分)，均 匀喷雾，0.5小时摘取叶片迅速浸入液氮保存。

实施例1.1中间片断的克隆

简并引物设计与合成：

在NCBI中找出拟南芥、水稻、玉米、烟草、葡萄的GH3的同源基因DNA序列，在 DDBJ网站在线比对，设计简并引物并合成(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)： 简并引物序列为：SED IN NO：1和SED IN NO：2。

组织总RNA提取：

按TransZOL总RNA提取试剂盒说明进行(北京全式金生物技术有限公司)。用DEPC 处理水溶解RNA，并进行浓度和纯度的测定，用12g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.稗草总RNA的提取

提取、纯化的稗草叶片总RNA，用12g/L琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果见图1。可看到 28S rRNA和18S rRNA两条带，二者含量比值大约为2∶1，说明所提的RNA完整，无降解 (图1)。RNA的含量和纯度可满足下一步试验要求。

逆转录合成cDNA第一条链：

按cDNA第一条链合成试剂试剂盒(TransScript II First-Strand cDNA Synthesis  SuperMix)(北京全式金生物技术有限公司，产品批号：#D11030)说明进行反转录合成 cDNA第一条链，其中以Anchored Olig(dT)₂₀Primer(引物序列为：SED IN NO：39)为引物。 PCR扩增中间片断：

以逆转录合成cDNA的第一条链作模板和设计的简并引物(SED IN NO：1和SED IN  NO：2)进行RT-PCR(primerSTAR HS(premix)，Takara)，PCR条件为35个循环，条件为：98 ℃，10sec；57℃，5sec；72℃，48sec。结果进行1％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒EasyPure  Quick Gel Extraction Kit(北京全式金生物技术有限公司；产品批号：#E20205)回收600bp 大小片断。

连接与转化与蓝白斑筛选：

用含pEASY-Blunt Cloning Vector的试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)把目的片 断(经过RT-PCR扩增后的600bp大小)连接并转化Trans-T1(DH5α)感受态细胞(北京 全式金生物技术有限公司，产品批号：#E200331)，通过蓝白斑(蓝白斑筛选的主要内容 是pEASY-Blunt Cloning Vector的试剂盒中的载体和Trans-T1(DH5α)感受态细胞)筛选 转化子。

测序：

通用引物M13F，M13R(SED IN NO：3SED IN NO：4)进行测序(上海生工生物工 程技术服务有限公司合成)

结果1

(一)ecGH31基因的克隆

2.稗草中间片断的获取。经RT-PCR扩增获得大小为600bp的目的片段(图2)。

3.稗草中间片断DNA序列：经过蓝白斑筛选和测序得到ecGH31基因的中间片段序列(SED  IN NO：5)

(1)RACE(Rapid Amplification ofcDNAEnds，快速扩增cDNA末端法)法5′和3′ 片断克隆

5′RACE和3′RACE模板采用GeneRacer Kit(维特金(Invitrogen)，产品批号： L1500-01)进行合成。试剂盒所提供接头引物引物序分别为：

5′维特金外部引物(GeneRacer outer primer)：SED IN NO：35

3′维特金外部引物(GeneRacer Outer Primer)：SED IN NO：36

5′维特金内部引物(GeneRacer Innerprimer)：SED IN NO：37

3′维特金内部引物(GeneRacer Inner Primer)：SED IN NO：38

根据中间片断DNA(600bp)序列用Primer5软件设计基因特异引物(SED IN NO：6，SED  IN NO：7；SED IN NO：9，SED IN NO：10)

5′RACE引物为SED IN NO：6，SED IN NO：7。

5′RACE PCR的条件：

第一轮

94℃2min

5cycles：98℃ 10sec 72℃ 1min

5cycles：98℃ 10sec  70℃ 1min

25cycles：98℃ 10sec  66℃ 30sec  68℃ 1min

第二轮

94℃ 2min

25cycles：98℃ 10sec 66℃ 30sec 68℃ 1min

电泳验证后，PCR产物经加尾，连接pUCm-T载体(上海生物工程有限公司)，然后转化 感受态细胞JM109(上海生物工程有限公司)，采用M13F和M13R进行菌落PCR扩增， 选择大小约1800bp左右的菌落进行测序(英潍捷基(上海)贸易有限公司)

结果2

4.ecGH31基因的5′RACE序列

ecGH31基因5′RACE扩增产物的电泳结果表明，获得一条1800bp的cDNA片段(图3)。 PCR产物经加polyA尾，连接pUCm-T载体，然后转化感受态细胞JM109(上海生物工程 有限公司)，采用M13F和M13R进行菌落PCR扩增，电泳结果如图4。

选择大小约1800bp左右的菌落进行测序，结果见SED IN NO：8：

3′RACE引物：SED IN NO：9，SED IN NO：10

3′RACE PCR条件：

第一轮

94℃2min

5cycles：98℃ 10sec 72℃ 1min

5cycles：98℃ 10sec 70℃ 1min

25cycles：98℃ 10sec 66℃ 30sec 68℃ 1min

第二轮

94℃ 2min

25cycles：98℃ 10sec 66℃ 30sec 68℃ 1min

PCR产物经加尾，连接pUCm-T载体(上海生物工程有限公司)，然后转化感受态细胞JM109 (上海生物工程有限公司)，采用M13F和M13R进行菌落PCR扩增，选择大小约1100bp 左右的菌落进行测序(英潍捷基(上海)贸易有限公司)。

结果3

ecGH31基因的3′RACE序列

ecGH31基因3′RACE扩增产物的电泳结果表明，获得一条大小约1100bp的cDNA片段 (图5)。

PCR产物经加polyA尾，连接pUCm-T载体，然后转化感受态细胞JM109，采用M13F和 M13R进行菌落PCR扩增，电泳结果如图6。选择大小约1100bp左右的菌落进行测序，结 果如下(SED IN NO：11)。

6.ecGH31基因的全长序列

理论拼接后完整序列见(SED IN NO：24)：序列全长：2574bp，编码区：668-2143＝1475bp 理论拼接的DNA序列所推导的氨基酸序列见(SED IN NO：25)，491aa。

(2)ecGH31全长片断的验证

(1)三段法验证全长ecGH31基因策略，见图7

用DANStar软件把5端RACE片断、中间片断和3端RACE片断进行拼接成全长的理 论片断(SED IN NO：24)，以此理论片断为模板，分成三段，分别用Primer primer5软件， 设计三对巢式(nest)引物，进行PCR，把内PCR产物连接到pUCm-T载体上(上海生物 工程有限公司)，经过蓝白斑筛选，用M13F和M13R引物(SED IN NO：3SED IN NO：4) 进行测序(上海生工)。

验证所用的引物：

第一部分验证所用的引物：

SED IN NO：12(143-164)；

SED IN NO：13(1034-1057)

第一轮大小：915bp

SED IN NO：14′(166-189)

SED IN NO：15(862-886)

第二轮大小：721bp

第二部分验证所用的引物：

SED IN NO：16(665-689)

SED IN NO：17(1410-1433)

第一轮大小：759bp

SED IN NO：18(747-767)

SED IN NO：19(1384-1409)

第二轮大小：663bp

第三部分验证所用的引物：

SED IN NO：201317-1341)

SED IN NO：21(2209-2237)

第一轮大小：921bp

SED IN NO：22(1381-1401)

SED IN NO：23(2006-2031)

第二轮大小：651bp

PCR反应条件如下(两轮PCR的反应条件是一样的。不同的是反应物和产物，但是条件是 一样的。第一轮反应结果是扩增的三个较大的外部片断，第二轮扩增的是以第一轮产物为 模板扩增的较小的内部片断)：

第一轮PCR反应

反应条件：94℃ 2min；35cycles：94℃ 30sec  65℃ 1min

第二轮PCR反应

反应条件：94℃ 2min；35cycles：94℃ 30sec  65℃ 1.0min

(二)ecGH31基因的验证

(1)ecGH31ORF区的三个nest内引物PCR结果

理论拼接的ecGH31全长cDNA，分成5端，中间和3端三个部分。三个片断各自经过两个 轮PCR，经过电泳得到预期大小的片断，其中5端片断1的大小约为720bp大小，中间片断 2的大小约为660bp，3端片断3的大小约为650bp(图8)。

(3)ecGH31ORF区的三个片段测序结果：

第一部分测序结果(5端)(SED IN NO：26)：

第二部分测序结果(中间)(SED IN NO：27)：

第三部分测序结果(3端)(SED IN NO：28)：

(3)ecGH31验证后的全长

拼接后完整序列如下(SED IN NO：29)：序列全长：2532bp，编码区：263-2101＝1839bp

验证后的DNA所推导的氨基酸序列如下(SED IN NO：30)：612aa

ClusterW分析发现与拟南芥的GH3家族成员atGH31的亲缘关系较近(见图9)

Real-time PCR

(1)总RNA提取方法

1.试剂：总RNA提取试剂盒(杭州浩基生物科技有限公司)

2.仪器：移液器(Eppendorf)，高速冷冻离心机(Sigma公司)，振荡器，紫外分光光 度计(Eppendorf公司)

(2)逆转录实验

1.试剂：SuperScript^TM II RTase(Invitrogen)

2.仪器：PCR基因扩增仪(Bio-Rad)

(3)基因表达水平差异检测(Real-Time PCR)

1.试剂：Premix Ex Taq^TM(Perfect Real Time)(TaKaRa公司)(Catalog No. DRR041A)

2.仪器：iQ^TM5多重实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)

3.采用Primer Premier 6.0和Beacon designer软件进行荧光引物的设计，然后由上海生 物工程有限公司负责合成，引物序列如下：

表：Real-Time PCR Primers(RT-PCR)和条件

(4)Real-Time PCR扩增反应条件

反应条件

95℃，1min；

45个循环：95℃，10sec；60-65℃，25sec(收集荧光)

熔点曲线分析55℃ to 95℃

(5)Real-Time PCR基因表达差异的数据统计

每个样品重复三次，各个基因的相对表达水平以2^{(Ct内参基因-Ct目的基因)}进行统计分析。

结果

(二)基于Real-time PCR的ecGH31基因转录水平表达特点

1：各对荧光引物扩增特异性分析

通过熔点曲线分析，表明这些基因引物扩增具有较强的特异性

2：抗、感稗草的ec-GH31基因转录水平的相对表达特点

抗二氯喹啉酸稗草植株体内ec-GH3基因的相对表达量为105.89，二氯喹啉酸处理后， 在1小时内表达量迅速升高，但不超过1.5倍。药后2小时至5天其体内GH3基因的相对 表达量均小于施药前，在0.5倍左右浮动，第6天，升高至2.57倍(见表1)。

表1：抗二氯喹啉酸稗草植株ec-GH3基因相对表达量分析

对二氯喹啉酸敏感稗草植株体内ec-GH3基因的相对表达量为47.43，二氯喹啉酸处理 后，在1小时内表达量迅速升高，且大于4.5倍。药后2小时至5天其体内GH3基因的相 对表达量在1倍左右浮动，第5天升高至16.8倍，第6天，升高至2.11倍(见表2)。

表2：对二氯喹啉酸敏感稗草植株ec-GH3基因相对表达量分析