串联抗菌肽Alloferon-1的制备方法及rAlloferon-1-K的应用

摘要

本发明涉及一种抗菌肽的制备方法及其应用。目的是提供一种步骤简捷、表达效率高而又保持其体外抗肿瘤活性的抗菌肽Alloferon-1的制备方法以及rAlloferon-1-K的应用。技术方案是：串联抗菌肽Alloferon-1的制备方法，包含以下步骤：1）设计一对末端单链DNA；2）PCR体系中生成串联体；3）电泳筛选14拷贝Alloferon-1串联体；4）构建原核重组表达系统E.coliBL21DE3pET42a-14×Alloferon-1-K；5）重组蛋白14rAlloferon-1-K表达提纯；6）胰蛋白酶酶切14rAlloferon-1-K，提纯获得rAlloferon-1-K。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肽的串联原核表达方法的建立、重组串联肽的酶切、纯化及应用， 具体是抗菌肽Alloferon-1的串联原核表达方法，用胰蛋白酶酶切得到重组肽单体rAlloferon- 1-K，对rAlloferon-1-K进行抗肿肿瘤活性检测。

背景技术

抗菌肽是广泛存在于多种生物体内的无抗原性短肽，对各种微生物和原虫均有广谱 高效的抑制或杀灭活性，一些抗菌肽还有抗肿瘤作用且不损伤正常细胞。因此，抗菌肽是目 前抗感染及抗肿瘤新药的研究热点。

Alloferon-1首先在红头丽蝇血液中发现，是由13个氨基酸组成的、分子量为1481.53 的新型抗菌肽。但其较低的天然表达产量难以满足产业化要求。有文献报道，采用高效的原 核表达可便利地获得大量Magainin-II等抗菌肽，并证实其生物学活性与天然产物相似。因 此，研究Alloferon-1重组串联高效表达技术上可行。动物实验证实该抗菌肽Alloferon-1有 较强的抗肿瘤、抗病毒活性，因此，研究Alloferon-1重组串联高效表达产物的抗肿瘤应用 研究有现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种步骤简捷、表达效率高而又保持其体外抗肿瘤活性的抗菌 肽Alloferon-1制备方法。

本发明的另一目的是上述表达产物rAlloferon-1-K的应用。

本发明提供的技术方案是：串联抗菌肽Alloferon-1的制备方法，具体包含以下步 骤：

1)设计一对非镜像对称含互补粘性末端单链DNA；正链序列：5’-磷酸化- CATGGCGTGAGCGGCCATGGCCAGCATGGCGTGCATGGCAAA-3’，负链序列：5’-磷酸 化-GCCATGGCCGCTCACGCCATGTTTGCCATGCACGCCATGCTG-3’；

2)在PCR反应体系中，通过退火，获得单拷贝双链DNA，利用互补粘性末端在PCR体系 中随机串联，生成不同拷贝的串联体；

3)T-A克隆产物琼脂糖电泳筛选14拷贝Alloferon-1串联体，测序鉴定；

4)用测序鉴定正确的T-A克隆14拷贝Alloferon-1串联体构建原核重组表达系统E.coli BL21DE3^{pET42a-14×Alloferon-1-K}；

5)IPTG诱导目的重组蛋白14rAlloferon-1-K表达，Ni-NTA亲和层析提纯并收集目的重组蛋 白；

6)胰蛋白酶酶切14rAlloferon-1-K，Sephadex G-50层析法提纯获得rAlloferon-1-K，浓缩 后检测rAlloferon-1-K浓度。

所述的抗菌肽Alloferon-1的串联原核表达14拷贝Alloferon-1后的重组蛋白 rAlloferon-1-K，具有序列表3所示的核苷酸序列和氨基酸序列。

串联抗菌肽Alloferon-1的制备方法获得的重组蛋白rAlloferon-1-K应用于抗肿瘤。

本发明的有益效果是：经肿瘤体外抗肿试验显示，本发明提供的制备方法获得的重 组蛋白rAlloferon-1-K，具有明显抑制KB、SGC和HL-60细胞生长及增殖的效果。上述研 究结果表明，我们成功建立了抗菌肽Alloferon-1串联原核制备方法，其制备产物rAlloferon- 1-K可望成为多肽类抗肿瘤新药。此外，本发明采用酶切效率更高的胰蛋白酶代替肠激酶酶 切可降低制备成本，有利于推广应用。

具体实施方式

序列表说明

序列表1是红头丽蝇血液中发现的的一种新型抗菌肽Alloferon-1的氨基酸序列。

序列表2是抗菌肽Alloferon-1的氨基酸序列及人工合成的对应核苷酸序列(带胰蛋 白酶切位点赖氨酸)，上一行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列。

序列表3是rAlloferon-1-K串联序列；14拷贝的rAlloferon-1-K串联序列，每排上一 行为核苷酸序列，下一行为氨基酸序列，有方框区为14拷贝的Alloferon-1序列，□内氨基 酸与核苷酸序列为胰蛋白酶酶切位点赖氨酸及其密码。)

据文献报道，Alloferon-1氨基酸序列为HGVSGHGQHGVHG有抗病毒、抗肿瘤活性， Alloferon-2的氨基酸序列则为GVSGHGQHGVHG无活性的，两者序列差异仅体现在N 端，故N端极可能是Alloferon-1活性关键部位所在。我们通过Alloferon-1的C端加胰蛋白 酶酶切位点赖氨酸密码子串联表达不易影响其生物学活性，串联表达产物通过胰蛋白酶酶切 K位点可获得多个单一rAlloferon-1-K(HGVSGHGQHGVHGDDDDK)，提高产量的同时可 保持Alloferon-1的活性。为了获得更高的目的重组表达产量，我们构建并筛选获得含14个 重复串联式表达14rAlloferon-1-K的原核重组表达系统E.coli BL21DE3^{pET42a-14×Alloferon-1-K}，采 用Ni-NTA和Sephadex G-50层析法，快速提纯目的串联表达产物。T-A克隆后测序结果表 明，我们克隆的Alloferon-1-K序列完全正确。采用连接引物PCR和T-A克隆技术，我们获 得了与预期序列相同的人工融合基因片段及其克隆。

构建的原核重组表达系统pET42a-14Alloferon-1-K-E.coliBLDE3在IPTG诱导下，可 高效地表达串联式目的重组蛋白14rAlloferon-1-K，其产量约为细菌总蛋白的30％，经Ni- NTA柱提纯后在聚丙烯酰胺凝胶中呈现为单一的蛋白条带。14rAlloferon-1-K经胰蛋白酶酶 切后，用Sephadex G-50柱提纯rAlloferon-1-K，这为进一步研究rAlloferon-1-K体内外抗肿 瘤、抗病毒等活性提供了良好的基础。

用直接化学合成的Alloferon-1(cAlloferon-1)及含有胰蛋白酶酶切位点的Alloferon- 1(cAlloferon-1-K)作为对照检测了rAlloferon-1-K体外抑制KB、SGC和HL-60肿瘤细胞 生长及增殖的效果。结果显示rAlloferon-1-K有明显抑制KB、SGC和HL-60细胞生长及增 殖的效果，且与cAlloferon-1和cAlloferon-1-K抑制作用无明显差异。

实施例

串联抗菌肽Alloferon-1的制备方法是：

1)从GenBank获得红头丽蝇天然Alloferon-1的氨基酸序列：N-His Gly Val Ser Gly His Gly  Gln His Gly Val His Gly-C(Alloferon-1序列不含精氨酸和赖氨酸)；

2)设计一对非镜像对称含互补粘性末端单链DNA；根据报道的Alloferon-1氨基酸序列及大 肠杆菌偏爱密码子，同时考虑串联表达的Alloferon-1分离，正链序列：5’-磷酸化- CATGGCGTGAGCGGCCATGGCCAGCATGGCGTGCATGGCAAA-3’，在正链DNA Alloferon-1基因3’端设胰蛋白酶酶切位点赖氨酸密码子，负链序列：5’-磷酸化- GCCATGGCCGCTCACGCCATGTTTGCCATGCACGCCATGCTG-3’。负链DNA与正链交错 互补；委托Invitrogen公司合成。

3)目的肽核苷酸序列双链的形成；在1×T4DNA连接酶缓冲液(TaKaRa)中将225 pmol正链与等量负链DNA混合，PCR仪中95℃3min，关闭电源使反应物自然冷却30 min，55℃10min后加入T4DNA连接酶(TaKaRa)，16℃连接过夜，以修复DNA双链中缺 口。采用Ex-Taq PCR试剂盒(TaKaRa)将串联的Alloferon-1-K双链DNA两端单链补齐并 连上3’-A，反应参数：94℃5min、55℃10min、72℃30min。

4)T-A克隆：采用T-A克隆试剂盒(TaKaRa)将DNA片段与pMD19-T(外购)连 接，转化入E.coli DH101B中扩增，用质粒提取试剂盒(Simgen)提取重组质粒，核酸内切 酶BamH I与Hind III(TaKaRa)双酶切初步鉴定后，委托上海Invitrogen公司测序。

5)目的肽串联重组表达载体的构建及鉴定：根据测序结果选取序列正确的14× Alloferon-1-K质粒DNA为模板，采用循环降温PCR扩增目的片段，根据合成Alloferon-1 核苷酸序列的设计含内切酶Nde I和Xho I位点、启始密码ATG和终止密码TAA和胰蛋白 酶酶切位点的上、下游引物，PCR扩增，反应参数：94℃ 5min；94℃ 30s、68℃ 30s、 72℃ 1min，5个循环；94℃ 30s、66℃ 30s、72℃ 1min，5个循环；94℃ 30s、64℃  30s、72℃ 1min，5个循环；94℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 1min，15个循环；72℃ 10 min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，按上法将回收的目的片段与pMD19-T连接形 成重组质粒pMD19-T^{14×Alloferon-1-K}。原核表达载体pET42a(Novagen)与pMD19-T^{14×Alloferon-1-K}分别用Nde I和Xho I 37℃双酶切过夜，琼脂糖凝胶电泳后回收的14×Alloferon-1-K与线 性化pET42a用T4DNA连接酶16℃连接16h，连接产物转化入E.coli BL21DE3 (Novagen)中形成表达系统E.coli BL21DE3^{pET42a-14×Alloferon-1-K}，提取pET42a^{14×Alloferon-1-K}委 托上海Invitrogen公司测序。

6)目的重组产物表达、酶切及提纯：E.coli BL21DE3^{pET42a-14×Alloferon-1-K}在含0.5 mmol/L IPTG(Sigma)LB培养液30℃诱导目的重组蛋白14×rAlloferon-1-K表达，SDS- PAGE与Bio-Rad凝胶图象系统检查表达情况及产量。采用Ni-NTA亲和层析柱提纯14× rAlloferon-1-K，溶于pH8.0、0.01mol/L磷酸(PB)缓冲液中，每10mg 14×rAlloferon-1-K 加入0.1mg胰蛋白酶，37℃酶切2h后过Sephadex G-50柱，收集含rAlloferon-1-K单体的 第三洗脱峰，洗脱液为上述PB，紫外分光光度法测定蛋白浓度。rAlloferon-1提纯及浓度检 测方法同上。

7)目的肽的合成：委托Invitrogen公司直接合成Alloferon-1短肽 HGVSGHGQHGVHG(cAlloferon-1)及含胰蛋白酶酶切位点的短肽HGVSGHGQHGVHGK (cAlloferon-1-K)。

rAlloferon-1-K的应用：分别以人口腔鳞状上皮癌细胞KB、人胃腺癌细胞SGC和髓 系白血病细胞HL-60为靶细胞，检测不同Alloferon-1体外对肿瘤细胞的生长抑制作用。96 孔培养板每孔1×10⁴KB、2×10⁴SGC、1×10⁵K562细胞中分别加入1×10⁵、1×10⁵、1× 10⁶BALB/c小鼠脾细胞，然后加入不同浓度rAlloferon-1-K，在5％CO₂和37℃条件下，KB 和K562细胞培养24h、SGC细胞培养72h，加入CCK-8试剂显色1h后测定OD₄₅₀值并 计算肿瘤细胞杀伤率。实验中同时设置cAlloferon-1和cAlloferon-1-K阳性对照及不加任何 药物的正常对照。

为鉴定抗菌肽Alloferon-1的串联原核表达技术的可行性和降低rAlloferon-1制备成 本，我们在设置酶切位点时用活性更高价格更低廉的胰蛋白酶代替肠激酶，即在设计正链 DNA时紧跟Alloferon-1基因的3’端含胰蛋白酶(K)密码子。抗肿瘤活性试验结果表明， 基因工程技术获得rAlloferon 1-K、rAlloferon 1-EK与人工化学合成的crAlloferon 1、 cAlloferon 1-K抗肿瘤活性无显著性差异。说明建立的抗菌肽Alloferon-1的串联原核表达技 术的可行并可用胰蛋白酶代替肠激酶降低制备成本。

具体的试验见以下各表：

1.cAlloferon-1和cAlloferon-1-K直接抗肿瘤作用

在0.1-1000ng/mL范围内，cAlloferon-1和cAlloferon-1-K均无抑制KB、SGC和K562肿瘤 细胞生长及增殖的活性(P＞0.05)(表1)。

表1 cAlloferon-1和cAlloferon-1-K直接抗肿瘤效果

2.cAlloferon-1和cAlloferon-1-K间接抗肿瘤作用

在0.1-10ng/mL范围内及小鼠脾细胞存在下，cAlloferon-1和cAlloferon-1-K分别作用KB和 K562肿瘤细胞24h、作用于SGC肿瘤细胞72h时均显示了明显的抑制肿瘤细胞生长及增 殖的活性(P＜0.01)，上述cAlloferon-1和cAlloferon-1-K体外抗肿瘤细胞活性无明显差异 (P＞0.05)(表2)。

表2 cAlloferon-1和cAlloferon-1-K间接抗肿瘤效果

*和^#：与脾细胞+肿瘤细胞比较P＜0.01

3.rAlloferon-1-K间接抗肿瘤作用

在0.1-10ng/mL范围内及小鼠脾细胞存在下，rAlloferon-1-K分别作用KB和K562肿瘤细 胞24h、作用于SGC肿瘤细胞72h时均显示了明显的抑制肿瘤细胞生长及增殖的活性 (P＜0.01)，该抗肿瘤活性与cAlloferon-1和cAlloferon-1-K无明显差异(P＞0.05)(表3)。

表3 rAlloferon-1-K间接抗肿瘤效果

*和^#：与脾细胞+肿瘤细胞比较P＜0.01

结论：

1.CCK-8法检测结果：在0.1ng/mL～10ng/mL浓度范围内，cAlloferon-1、cAlloferon-1-K、 rAlloferon-1-K具有明显提高小鼠脾细胞杀伤K562、KB和SGC肿瘤细胞生长及增殖的生物 学活性(P＜0.01)，作用效果与药物浓度无关，rAlloferon-1-K抗肿瘤活性与cAlloferon-1及 cAlloferon-1-K比较无显著性差异(P＞0.05)。提示各Alloferon-1可能通过激活小鼠脾细胞而 显示抗肿瘤作用，rAlloferon-1-K分子C端加上赖氨酸(Lys，K)不影响其抗肿瘤活性。

2.CCK-8法检测原理：CCK-8试剂中所含的WST-8为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4- 硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，可在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯 (1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物 (Formazan)，生成的甲臜物量与活细胞数量有良好的线性正相关。

3.肿瘤细胞选择：KB、SGC和K562细胞分别是鳞状上皮癌、人胃腺癌和白血病细 胞，可分别代表三种不同类型的肿瘤细胞。

4.CCK-8法检测对象：化学法直接合成的cAlloferon-1、cAlloferon-1-K及重组表达后 提纯的rAlloferon-1-K对上述三种不同类型肿瘤细胞生长及繁殖的抑制作用。

序列表

<110>严杰