一种用于治疗非感染性眼部炎症、抑制角膜新生血管形成和角膜移植后抗排异反应的配方

摘要

本发明公开了一种用于治疗非感染性眼部炎症、抑制角膜新生血管形成和角膜移植后抗排异反应的配方，通过等渗剂、缓冲剂的选择，防腐剂、释微球制剂、重组人白细胞介素-8受体拮抗剂和趋化素样因子1(CKLF1)的添加，增加了重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的活性，延长了其保存时间。解决了现有技术中重组人白细胞介素-1受体拮抗剂对外部环境要求较高，容易失活的问题，并通过添加重组人白细胞介素-8受体拮抗剂和趋化素样因子1与重组人白细胞介素-1受体拮抗剂之间产生协同效应，来减少用量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于治疗眼部疾病的配方，尤其是一种用于治疗非感染性眼部炎症、抑制角膜新生血管形成和角膜移植后抗排异反应的配方。

背景技术

IL-1在机体的炎症反应中起着极为关键的启动作用。人类许多疾病的发生、发展过程中都有IL-1参与，IL-1本身不仅可以趋化体内的炎性反应细胞聚集至炎症发生部位，还可刺激体内的多种炎症介导介质的产生，而使炎症反应进一步加剧。因此，如何消除IL-1的影响将对治愈某些炎症疾病起着重要作用。IL-1ra是体内自然存在的IL-1拮抗剂。它可以特异地与细胞表面的IL-1受体结合而不激活靶细胞，从而阻断IL-1的生物学活性。

自从IL-1ra被发现以来，人们就试图将其开发为可供临床应用的药品，大量基础研究和初步临床研究结果显示IL-1ra对人类的许多炎性疾病确有疗效。此类报道更激起了人们对IL-1ra成为新药的企盼。90年代初期，Arend等成功地克隆出人IL-1ra cDNA，为使用基因重组手段大规模制备IL-1ra成为可能。近十年来，人类在对IL-1ra更为全面深入了解基础上，对IL-1ra的临床应用进行了全面开发。研究结果表明，IL-1ra将有可能用于治疗类风湿性关节炎、移植排异反应、移植物抗宿主反应、哮喘、牛皮癣等疾病，目前在美国IL-1ra治疗类风湿关节炎已完成I、II期临床研究，正进入III期临床研究阶段。

而在我国虽然早在90年代初期就已完成IL-1ra表达载体的构建，但至今尚未产业化。为能使我国的基因工程制药业赶上世界发展的脚步，公司投入大量精力，开始了对IL-1ra开发研究工作。

目前已发现IL-1ra可以特异性地与IL-1受体结合，阻断IL-1的生物学活性，因此在有IL-1参与的炎性疾病的发生，发展过程中，IL-1ra都可能发挥其治疗作用。根据IL-1ra这一生物学特性，结合我国的实际情况，我们选择了外眼部非感染性炎症、角膜移植和抑制角膜新生血管作为适应症。希望我们的研究开发成果能够为广大外眼疾病患者带来福音。

据国家有关部门统计，我国每年约有1460万人患眼表非感染性炎症，占眼科门诊病人的1/3，致盲率为0.34％，约400-500万人；沙眼、角膜病和眼外伤这三类疾病致盲人口达200万人，导致视力下降的人口约300万人以上。有资料表明，近年来角膜疾病致盲率呈逐年上升趋势，主要原因是皮质类激素和抗生素的广泛应用和滥用所致。绝大多数病人都伴有因角膜局部修复过程中，新生血管长入角膜而导致视力下降，如果早期可以应用恰当的药物加以治疗，就可以防止视力下降或致盲。

hIL-1ra是由177个氨基酸组成的蛋白质，其中25个氨基酸为信号肽[5]。成熟的hIL-1ra含有152个氨基酸，利用Western Blot分析单核巨噬细胞的细胞培养上清及细胞裂解物发现，大肠杆菌表达的IL-1ra分子量约为20kDa。

两种结构不同的IL-1ra的变体已经被发现：一种为17kDa的形式，从单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞及其它细胞中分泌出来，称为sIL-1ra；另一种为18kDa的形式，存在于角化细胞、其它上皮细胞、单核细胞及纤维原细胞的细胞质中，称为icIL-1ra。另外一种16kDa的在嗜中性细胞、单核细胞及肝细胞中的IL-1ra最近被发现。前两种主要的异构体都是从同一基因的不同第一外显子转录而来。实验证实，人的IL-1ra能与IL-1的I、II型受体结合，而与I型受体的结合能力强于II型受体。

由于重组人白细胞介素-1受体拮抗剂对外部环境的要求较高，在一般环境下很容易造成活性降低或者失活，为了使重组人白细胞介素-1受体拮抗剂进行 更好、更长时间的保存，本专利对其渗透液、缓冲液的选择做了重点研究，并通过研究重组人白细胞介素-8受体拮抗剂等同重组人白细胞介素-1受体拮抗剂之间的协同效应，可以控制在较小用量的情况下达到较好的效果。

发明内容

为了克服现有技术中重组人白细胞介素-1受体拮抗剂对外部环境要求较高，容易失活的问题，并通过添加重组人白细胞介素-8受体拮抗剂和趋化素样因子1与重组人白细胞介素-1受体拮抗剂之间产生协同效应，来减少用量。

本发明提供了一种用于治疗非感染性眼部炎症、抑制角膜新生血管形成和角膜移植后抗排异反应的配方，每1000毫升溶液主要由以下成分组成：

用无菌水配制为1000毫升，渗透压在250-450mOsm，PH值在5-9范围。

优选方案为甘油为30g。

优选方案为缓冲调节剂为磷酸盐缓冲剂、枸橼酸、枸橼酸钠、组氨酸盐缓冲剂、苹果酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、硼酸钠、琥珀酸盐缓冲剂及乙酸盐缓冲剂，使用时一种或一种以上的混合物；所述的蛋白保护剂为甘氨酸类，组氨酸、谷氨酸和赖氨酸等、及白蛋白、膜联蛋白V、胶原蛋白中的一种或几 种组合；所述的PH调节剂为氢氧化钠、盐酸、硼酸、三乙醇胺、乙酸、柠檬酸、磷酸盐中的一种或几种组合。

优选方案为缓冲剂为枸橼酸钠和枸橼酸组合。

优选方案为枸橼酸钠为80g，枸橼酸为40g。

优选方案为配方中增加有防腐剂。

优选方案为防腐剂为对羟基苯甲酸类、苯甲酸、山梨酸、苯扎溴铵、醋酸氯己定、苯酚、桉叶油、薄荷油、笨扎氯胺、笨扎溴铵、尼泊金中的一种或几种组合。

优选方案为防腐剂的为0-1g。

优选方案为对羟基苯甲酸类对羟基苯甲酸乙酯，用量为0.2g。

优选方案为配方中还包括释微球制剂。

优选方案为释微球制剂为聚乙二醇修饰重组人白细胞介素-1受体拮抗剂或脂质体包裹的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂，含量为20-200mg。

优选方案为聚乙二醇修饰重组人白细胞介素-1受体拮抗剂为60mg，脂质体包裹的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂为100mg。

优选方案为重组人白细胞介素-8受体拮抗剂、趋化素样因子1(CKLF1)中的一种或其组合。

优选方案为重组人白细胞介素-8受体拮抗剂含量为5-50mg，趋化素样因子1(CKLF1)含量为10-100mg。

优选方案为重组人白细胞介素-8受体拮抗剂含量为20mg，趋化素样因子1(CKLF1)含量为50mg。

本发明的配方，能使重组人白细胞介素-1受体拮抗剂提高活性，并能保 持更长时间的活性，使重组人白细胞介素-1受体拮抗剂易于保存，并通过加入重组人白细胞介素-8受体拮抗剂和趋化素样因子1(CKLF1)与重组人白细胞介素-1受体拮抗剂产生协同效应，使较小的用量达到较好的治疗效果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明作进一步详细的说明，但该具体实施方式并不用于限定本发明的保护范围。

实施例1选取等渗剂为甘油与等渗剂为甘露醇的试验结果对比

配方1(现有的采用的配方)：磷酸氢二钠(缓冲剂)40g，磷酸二氢钾(缓冲剂)20g，氯化钾(缓冲剂)30g，甘露醇70g，人血白蛋白2g，重组人白细胞介素-1受体拮抗剂50mg由无菌水配制1000ml溶液。

配方2甘油替代甘露醇，甘油重量为10g。

配方3甘油替代甘露醇，甘油重量为20g。

配方4甘油替代甘露醇，甘油重量为30g。

配方5甘油替代甘露醇，甘油重量为40g。

选取每种配方溶液装到50支瓶子，每支瓶子为10毫升，测试结果取平均值。

由表1中的结果可以看出，采用甘油作为等渗剂比采用甘露醇活性明显提高，并却在0-36个月保存之间内，也能基本上保持高的活性，当甘油量在30mg时，活性效果最好，再增加两，活性基本上不再增加。

实施例2采用枸橼酸钠和枸橼酸组合与磷酸氢二钠和磷酸二氢钾对比的试验结果

表2缓冲剂不同的试验结果对比

配方1(现有的采用的配方)：磷酸氢二钠(缓冲剂)40g，磷酸二氢钾(缓 冲剂)20g，氯化钾(缓冲剂)30g，甘露醇70g，人血白蛋白2g，重组人白细胞介素-1受体拮抗剂50mg由无菌水配制1000ml溶液。

配方2采用缓冲剂为枸橼酸钠和枸橼酸组合，替代磷酸氢二钠和磷酸二氢钾组合，枸橼酸钠和枸橼酸分别为40g、20g。

配方3采用缓冲剂为枸橼酸钠和枸橼酸组合，替代磷酸氢二钠和磷酸二氢钾组合，枸橼酸钠和枸橼酸分别为80g、40g。

选取每种配方，溶液装到50支瓶子，每支瓶子为50毫升，测试结果取平均值。

由表2的试验结果可以得知，采用枸橼酸钠和枸橼酸组合能够更好的保持重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的活性。

实施例3加入防腐剂对比试验

表3加入防腐剂和没加的实验结果对比

配方1(现有的采用的配方)：磷酸氢二钠(缓冲剂)40g，磷酸二氢钾(缓冲剂)20g，氯化钾(缓冲剂)30g，甘露醇70g，人血白蛋白2g，重组人白细胞介素-1受体拮抗剂50mg由无菌水配制1000ml溶液。

配方2在配方1的基础上加入对羟基苯甲酸乙酯0.2g。

选取每种配方，溶液装到50支瓶子，每支瓶子为50毫升，测试结果取平均值。

由表3的试验结果可以得知，加入防腐剂能更好的保持重组人白细胞介素-1受体拮抗剂处在无菌合格的状态，并能更长时间的保持其活性稳定。

实施例4加入释微球制剂药代动力学的研究

采用酶联免疫吸附试验法研究研究一组(配方1)；二组(配方2)及三组(配方3)在大鼠的药代动学研究，以便了解上述三组在体内的生物利用度。

配方1(现有的采用的配方)：磷酸氢二钠(缓冲剂)40g，磷酸二氢钾(缓冲剂)20g，氯化钾(缓冲剂)30g，甘露醇70g，人血白蛋白2g，重组人白细胞介素-1受体拮抗剂50mg由无菌水配制1000ml溶液。

配方2为在配方1的基础上重组人白细胞介素-1受体拮抗剂由脂质体包裹，用量为100mg。

配方3为为在配方1的基础上重组人白细胞介素-1受体拮抗剂由聚乙二醇修饰重组，用量为60mg。

主要设备：450型酶标仪、高压液相色谱(HPLC日本岛津LC-10A型)、离心机等。

实验动物：Wistar大鼠30只，雌雄兼用，体重20±2g，由北京大学医学部 实验动物中心提供，随机分成3组。

给药及采血方法：用微量取样器取一、二、三组的配液，分别对各实验组大鼠双眼结膜囊内滴20μ1。滴眼后每个时间点采集3只动物的血样，离心30分钟，取血清保存-20℃待用双抗体夹心ELISA法检测样品。详见下表4。

表4三组的取样时间和用量

数据处理及药代动力学参数计算：采用重组人白细胞介素-1受体拮抗剂标准品的数据，使用MicroCal Origin软件中的四参数逻辑曲线绘制标准曲线，并求回归方程及相关统计参数；用Microsoft Excel 2003软件将样品数据代入标准曲线的回归方程计算相关值，最后用3P87软件进行曲线拟合并计算药代动力参数，结果如下表5：

表5药代动力学参数计算结果

  Parameter>  一组>  二组>  三组>  Lag time/h>  0.011>  1.758>  2.338>  T_1/2/h>  2.643>  15.620>  12.505>  T_peak/h>  1.482>  21.799>  17.309>  C_max/ng·mL^-1  1654.303>  2834.240>  2611.368>  AUC/ng·h·mL^-1  9861.203>  15731.010>  11077.403>  CL/f(s)(L.h.^-1kg^-1)  0.122>  0.005>  0.012>  v/f(c)(L·kg^-1)  0.448>  0.134>  0.269>

研究一组、二组及三组在大鼠的药代动学研究。大鼠分别双眼结膜囊内给一、二、三组药物后，在不同时间点采血并分离血清。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法测定血清中重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的浓度，用3P87药动学软件进行曲线拟合并计算参数。结果显示，一组，二组与三组的半衰期(T1/2)分别为2.6，15.6和12.5h，后两者半衰期分别为一组的6倍、4.8倍；二组和三组的达峰时间Tpeak分别为一组的14.5倍、11.5倍。通过ELISA法检测比较一组、二组及三组在大鼠体内的药代动力学，表明聚乙二醇修饰重组人白细胞介素-1受体拮抗剂，脂质体包裹的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的技术可以延长重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的半衰期。

实施例5加入重组人白细胞介素-8受体拮抗剂、化素样因子1的实验

配方1(一组)：磷酸氢二钠(缓冲剂)40g，磷酸二氢钾(缓冲剂)20g，氯化钾(缓冲剂)30g，甘露醇70g，人血白蛋白2g，重组人白细胞介素-1受体拮抗剂50mg，由无菌水配制1000ml溶液。

配方2(二组)：在配方1的基础上加入重组人白细胞介素-8受体拮抗剂20mg。

配方3(三组)：在配方1的基础上加入趋化素样因子1(CKLF1)50mg。

(一)生物活性研究

选取每种配方溶液装到50支瓶子，每支瓶子为10毫升，测试结果取平均值，实验结果如表6。

表6三组的实验结果对比

药动力学研究

动物：日本大耳白。合格证06035，体重7W

动物模型建立：用复方氯胺酮10mg/Kg肌肉麻醉，取0.5mol/LNaOH 10ul滴加在直径6mm的滤纸片上，贴于角膜表面，造成兔角膜烧伤。

给药：日本大耳白造模后即刻以50ul药物滴眼，每日三次，其中对照组为生理盐水。

表7碱烧伤后离体角膜平均厚度

注：各组与碱烧伤组比较：P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；

与DMlmg/ml比较：P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；

表8碱烧伤后离体角膜损伤斑平均面积(平方米)

注：各组与碱烧伤组比较：P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；

与DMlmg/ml比较：P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；

以上结果表明如表7、表8：三组在治疗恢复碱烧伤角膜疗效中，三组效果优于二组，二组疗效优于一组。

以上内容是结合本发明的结构和工作过程对其所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。