大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA双价RNAi表达载体及应用

摘要

本发明公开了一种大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA双价RNAi表达载体，它是从大豆籽粒中克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA基因，用绿色荧光蛋白GFP作为中间片段，构建了大茎环结构的KTi和SBA双价RNAi表达载体，以植物表达载体pCAMBIA3301为基础，用大豆种子特异性启动子7αP，并插入大茎环结构的KTi和SBA双干扰元件，获得了重组表达载体pCAMBIA3301-7αP-SBAF-KTiF-GFP-KTiZ-SBAZ，通过遗传转化，获得的转基因大豆品种的胰蛋白酶抑制剂活力平均降低了83％，凝集素活性也有大幅度降低，从而降低了饲料加工成本，期望为畜牧业增加更大的经济效益。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，确切地是大豆品质改良表达载体的构建及应用。

背景技术

胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor)和凝集素(agglutinin)是大豆(Glycine max)主要营养抑制因子(nutritional inhibitors)，极大地影响着大豆制品的质量和新产品的开发。

胰蛋白酶抑制剂是大豆蛋白质中最重要的一类抗营养因子。大豆胰蛋白酶抑制剂(Soybean Trypsin Inhibitors，STI)主要存在于大豆籽实中，占大豆籽实蛋白质总量的6％～8％。STI主要分为Kunitz类抑制剂(KTI)和Bowman-Birk类抑制剂(BBI)两类。其中KTi型大豆胰蛋白酶抑制剂起主要的抗营养作用，含量为1.4％左右，表达形式为21.5kDa的蛋白质，对胰蛋白酶有专一的抑制性；BBi含量为0.6％左右，分子量为8kD(单子叶植物或双子叶植物)或16kD(单子叶植物)，同时对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在独立的反应部位产生抑制。KTi家族由多基因编码，在大豆的基因组中至少存在10个不同的KTi基因，其中KTi1、KTi2、KTi3为主要基因，在胚形成时期和成熟植株中表达，这三种基因在大豆生活周期中是差异表达的，其中，KTi3编码大豆种子主要的胰蛋白酶抑制剂，在幼胚及种子中高水平的表达。

生大豆抗营养作用的40％是由胰蛋白酶抑制剂引起的。目前，大豆胰蛋白酶抑制剂抗营养作用主要表现在抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性、降低蛋白质消化吸收和造成胰腺肿大两个方面。主要是胰蛋白酶抑制因子与小肠液中胰蛋白酶、糜蛋白酶结合，生成无活性复合物，消耗和降解胰蛋白酶，导致肠道对蛋白质消化、吸收及利用能力下降。同时，胰蛋白酶抑制剂与肠内胰蛋白酶结合后随粪便排出体外，使肠内胰蛋白酶数量减少。小肠中的胰蛋白酶、糜蛋白酶的浓度和活性都降低，负反馈性引起促胰液素-胆囊收缩素(CCK)分泌增加，刺激胰腺泡细胞分泌功能加强，分泌更多的酶进入肠道，以抵消胰蛋白酶抑制剂对消化酶的失活作用，结果造成胰腺细胞肥大和增生。

大豆凝集素(Soybean Agglutinin，SBA)也是大豆的主要抗营养因子之一。SBA是指大豆中能与N-乙酰基-葡萄糖胺或半乳糖特异性结合的糖蛋白，具有典型的豆类凝集素四级结构，由等量的两种略有不同的四个亚基组成，每个亚基分子量约30KDa，故而大豆凝集素的分子量约120kDa。1974年，Lotan等测定了大豆凝集素的氨基酸组成，发现大豆凝集素中富含酸性和羟基氨基酸，大豆凝集素亚基完整的基因序列已经被测出(其基因库查询号码为AY342213)。SBA在成熟的种子中其含量高达蛋白质总量的10％左右，属于热敏感性抗营养因子，但在加热处理后，其残存量仍然很大，在大豆粕(饼)、带(去)皮大豆和大豆油等饲料原料中仍含有一定量的大豆凝集素。

大豆凝集素抗营养作用的关键在于它能与动物的小肠特异性结合，这种结合导致：①小肠正常的结构被破坏，营养物质的吸收利用下降，动物生长受到抑制，并出现病理性腹泻，同时导致肠细胞的生长和分化受到抑制；②SBA进入循环系统，继而破坏消化器官(胰腺)的正常结构，引发全身性的反应。SBA能破坏肠道上皮微绒毛即刷状缘正常结构，并促进腺窝细胞分裂。刷状缘酶在粘膜消化过程中起着至关重要作用，它包括蔗糖酶、氨肽酶、碱性磷酸酶等重要酶类，这些酶是在肠细胞分化过程中合成，并能影响肠细胞生长和分化，对营养物质消化吸收和转运有着非常重要作用。然而，SBA引起刷状缘正常结构破坏，直接导致刷状缘活性降低，从而导致动物对营养物质吸收利用率下降，出现病理性腹泻。

SBA能进入循环系统，是因为其与小肠上皮细胞结合继而被内吞入上皮细胞后没有被溶酶体酶彻底降解，最后经胞吐作用经吸收性细胞基底膜释放进入循环系统。SBA进入循环系统后，可导致血浆胰岛素水平迅速降低，使脂肪降解增加、合成减少，肌肉蛋白质合成减少。此外，SBA可直接刺激小肠黏膜的神经内分泌细胞分泌CCK(胆囊收缩素)，而血浆CCK水平的升高可导致动物采食下降、内分泌紊乱、生产性能降低等。

降低胰蛋白酶抑制剂和凝集素活性的方法包括物理失活，化学失活和作物育种失活，这些方法也可以降低其活性，但增加了能源消耗，同时降低了大豆品质及营养价值。所以，运用RNA干扰技术培育低胰蛋白酶抑制剂和凝集素含量的大豆品种，可有效提高大豆的加工品质和营养价值，是解决这一问题的一种简洁、有效的方法。以往在大豆的品质改良及抗营养抑制因子的研究中，多采用杂交、回交等方法，但由于受到遗传基础窄、育种时间长的限制，改良作用有限。

常规育种方法是首先利用高速而低耗的检测手段对大量种质资源进行筛选，筛选出大豆胰蛋白酶抑制因子低含量水平或者缺失的自然缺失体品种；或采用诱变技术产生所需的变异类型，再利用普遍回交或改良回交法等传统方法培育出大豆胰蛋白酶抑制因子低含量水平或者缺失的品种。研究人员依据对KTi基因及其遗传规律的研究与认识，已经通过上述手段获得了低含量水平或者缺失大豆胰蛋白酶抑制因子的品种。80年代，研究人员将这些基因转育到一些栽培品种中，如William82，Amsoy71等，这些品种产量与普通大豆相当，而胰蛋白酶抑制剂活性降低了50％。1990年美国已有了个以“库尼兹”命名的titi型商用大豆品种，同时日本岩手大学等也进行了大豆titi基因的转育。目前，国内还选育出了KTi和脂肪氧化酶双缺失的大豆新品种中黄16，但是它们的血缘均源自美国缺失KTi的大豆品种。因此，迄今为止，我国还没有自己独立创制的不含胰蛋白酶抑制因子的大豆品种。近年来，国外直接利用不含凝集素和Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的大豆粉饲喂畜禽(牛、鸡)收到了良好效果。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由内源性或外源性双链RNA引起的序列特异性基因沉默，主要是通过siRNA介导的靶mRNA降解，调节或关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动，是由dsRNA分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程，是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(PTGS)。RNAi现象普遍存在于植物、动物和人类中，现在RNA干扰已发展成为一种强大的“基因沉默”技术，并且广泛应用于各种生物的基因功能鉴定和功能基因表达调控领域。植物中利用RNAi技术的关键因素在于需要构建可转录为hpRNA或dsRNA的植物表达载体。研究表明：在强启动子下游插入反向重复片段的重组载体是导致RNA沉默的基本结构。该结构中，在间隔序列(spacer)的两端是目标基因的cDNA片段的克隆，这些片段的头头相连或尾尾相连导致该转基因产生自我互补的hpRNA(分子内dsRNA)结构，同时启动子的强弱、目的片段的大小和内含子的有无等也会影响RNA沉默的效率。人们用不同的启动子分别构建了两种植物表达载体，结果用CaMV35S启动子所构建的载体获得转基因植株的效率比采用NOS启动子所构建的载体的效率高得多，这说明启动子功能的强弱对于RNAi干扰效果的影响较为明显。研究还发现较短的目的片段效率较低，较长的发夹结构在寄主细菌中容易重组。

因此我们分离胰蛋白酶抑制剂KTi基因和凝集素SBA基因的两个核心保守片段，构建双价RNAi表达载体，通过RNA干扰的定向表达，抑制KTi和SBA基因，降低他们的含量，为大豆胰蛋白酶抑制剂和凝集素的同时改良提供简洁的新技术。

目前，国内外还没有对胰蛋白酶抑制剂或凝集素的同时进行抑制的研究。运用RNAi技术，进行两种抗营养因子的同时抑制，能够改良大豆种质，生产出更加利于吸收和畜牧业利用的大豆新种质，获得更大的社会价值和经济效益。

发明内容

本发明目的是提供一种大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA双价RNAi表达载体。

一种大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA双价RNAi表达载体是在pCAMBIA3301的EcoR I和Xba I中，插入大豆种子特异性启动子7αP，在Xba I和Pst I酶切位点中，插入了大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA反义连接片段SBAF-KTiF，在Pst I和Bgl II酶切位点中，插入了绿色荧光蛋白GFP基因片段，在Bgl II和BstE II中插入了大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA正义连接片段KTiZ-SBAZ；

所述的KTi、SBA、7αP和GFP其核苷酸序列依次分别如：SEQ ID No.1、2、3和4所示，所述的连接片段SBAF-KTiF或KTiZ-SBAZ在KTi和SBA之间引入了酶切位点SalI；

所述的7αP、KTi、SBA基因片段均来自于吉农17。

一种大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA双价RNAi表达载体制备方法，该方法包括：

1)提取大豆吉农17总RNA，反转录成cDNA；以反转录成的cDNA为模板，用引物：

P1：5′TTT CTG CAG AAGTCAGACATAACAGCAT 3′(Pst I)

P2：5′TTT GTC GAC TTCATCATCAGAAACTC   3′(Sal I)

扩增大豆胰蛋白酶抑制剂基因KTi基因片段；

用引物：

P1：5′TTT GTC GAC ATCCACATTTGGGACAGC   3′(Sal I)

P2：5′GGG TCT AGA TGGCAAATTGGAAGAAAA   3′(Xba I)

扩增大豆凝集素SBA基因片段；

提取大豆吉农17的基因组DNA，以其为模板，用引物：

P1：5′GGG GAA TTC TGCTTGGATTTGGACCAGAC  3′；(EcoR I)

P2：5′GGG TCT AGA TAGGATATTGAACTAGTTCT  3′；(Xba I)

扩增大豆种子特异性启动子7αP；

提取AHLG的质粒DNA，以其为模板，用引物：

P1：5′TTT CTG CAG ATG GTG AGC AAG GGC GA  3′；(Pst I)

P2：5′GGG AGA TCT TTACTTGTACAGCTCGTC      3′；(Bgl II)

进行GFP基因的PCR扩增；

将上述各基因分别插入克隆载体pMD18-T中；

2)克隆质粒pMD-T-7αP和表达质粒pCAMBIA3301分别用EcoR I、Xba I进行双酶切，电泳分离酶切片段，分别回收目的基因片段和载体大片段，16℃连接过夜，得到种子特异性表达载体p3301-7αP；

3)将重组质粒p3301-7αP经Pst I、Bgl II酶切，分离载体大片段；克隆质粒pMD18-T-GFP经Pst I和Bgl II酶切，分离目的基因片段，用T₄DNA连接酶连接到重组质粒p3301-7αP上，得中间表达载体p3301-7αP-GFP；

4)同时用Pst I和Sal I、Sal I和Xba I分别双酶切克隆载体pMD18-T-KTi和pMD18-T-SBA，反应结束后，进行电泳，回收，连接，对KTi和SBA做T₄连接，以连接产物为模板，用引物：

P1：5′GGG AGA TCT GTC AGA CAT AAC AGC AT 3′(Bgl II)

P2：5′TTG GGT TACC TGGCAAATTGGAAGAAAA 3′(BstE II)

进行扩增，得到的片段连入pMD18-T载体，得到重组克隆载体pMD18-T-KTiZ-SBAZ；

5)同时用Bgl II和BstE II分别双酶切克隆载体pMD18-T-KTiZ-SBAZ和过渡载体p3301-7αP-GFP，将切下的片段连入p3301-7αP-GFP，构建成正义表达载体pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ；

6)同时用Xba I和Pst I分别双酶切表达质粒pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ和克隆质粒pMD18-KTiZ-SBAZ，经电泳回收连接，得到双价RNAi表达载体pCAMBIA3301-7αP-SBAF-KTiF-GFP-KTiZ-SBAZ，统称：pCAMBIA3301-KTi-SBA。

一种根癌农杆菌，它是转染了pCAMBIA3301-KTi-SBA的根癌农杆菌。

本发明的另一个目的是一种大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA双价RNAi表达载体，在改良大豆中胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA含量的应用

本发明的大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA双价RNAi表达载体是从大豆籽粒中克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA基因，用绿色荧光蛋白GFP为中间片段，构建了大茎环KTi和SBA双价RNAi表达载体；以植物表达载体pCAMBIA3301为基础，用大豆种子特异性启动子7αP，并插入大茎环KTi和SBA双干扰体，获得了重组表达载体pCAMBIA3301-7αP-SBAF-KTiF-GFP-KTiZ-SBAZ，通过遗传转化，获得的转基因大豆品种的胰蛋白酶抑制剂活力平均降低了83％，凝集素活性也有大幅度降低，从而降低了饲料加工成本，期望为畜牧业增加更大的经济效益。

附图说明

图1为双价RNAi表达载体pKTi-SBA-RNAi构建流程图。

图2为双价RNAi表达载体pCAMBIA3301-KTi-SBA构建流程图。

图3为双价RNAi表达载体pKTi-SBA-RNAi酶切电泳检测结果图

图4为双价RNAi表达载体pCAMBIA3301-KTi-SBA酶切电泳检测结果图

实施例1提取大豆总RNA提取与cDNA的合成

RNA的提取：使用TRIzoL试剂盒(TaKaRa公司)从处于成熟中后期的大豆品种“吉农17”籽粒提取总RNA，然后将其反转录成cDNA。

反转录反应体系：反应体系为20μL，其中5×缓冲液4.0μL，dNTP(10mM)2.0μL，通用引物2.0μL，反转录酶1μL，RNA酶抑制剂0.5μL，模板4μL，ddH₂O 6.5μL。上述试剂均购于TaKaRa公司。

实施例2大豆胰蛋白酶抑制剂基因KTi基因片段的克隆、筛选及鉴定

根据GenBank已发表的KTi3基因序列(S45092)的保守序列设计引物，选取324bp的片段作为干扰KTi类型胰蛋白酶抑制剂基因的mRNA，为了便于重组植物表达载体构建，在上、下游引物的5’端分别引入Pst I和Sal I位点，引物序列如下(画线部分为加入的酶切位点)：

Primer1：5′TTT CTG CAG AAGTCAGACATAACAGCAT 3′(Pst I)

Primer2：5′TTT GTC GAC TTCATCATCAGAAACTC   3′(Sal I)

以实施例1合成的大豆cDNA为模板；

PCR反应体系：反应体系为25μL，其中(NH₁)₂SO₄ Buffer 2.5μl，MgCl₂ 2.5μl，dNTPMixture(10mM)0.5μl，引物各1μl(由北京三博远志生物技术有限责任公司合成)，模板cDNA1μl，Taq酶0.1μl，ddH₂O17.4μL(上述试剂均购于MBI公司)；

PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性55s，48℃复性45s，72℃延伸55s，30个循环，最后72℃延伸8min；

进行PCR反应；

PCR反应结束后，将反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，分别得到约324bp和517bp的片段，特异性强，单一的扩增带。电泳后，采用北京V-gene生物公司的DNA GeLExtraction Kit回收目的片段；

回收的PCR产物与克隆载体pMD18-T连接；

连接反应体系：在10μl反应体系中，Solution I 5μl，PCR回收产物4μl，pMD18-T Vector1μl。混匀后16℃反应16h。(pMD18-T-vector购于TaKaRa公司)。

重组载体的转化：按Maniatis的方法制备感受态细胞，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，冰浴30min，同时做对照管。然后42℃热激90s，冰上放置2min。每管加入800μL LB液体培养基，37℃温育45min，140rpm/min。涂在含氨苄青霉素(100μg/mL)、×-gal(北京鼎国生物技术有限责任公司)、IPTG(北京鼎国生物技术有限责任公司)的LB培养基平板上选择培养过夜(37℃)。挑取白斑用碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶酶切鉴定，得到重组克隆pMD18-T-KTi；

送北京三博远志有限公司测序，核苷酸序列分析用DNAMAN软件，其核苷酸序列如：SEQID No.1所示。

实施例3SBA基因片段PCR克隆、筛选及鉴定

依据GeneBanK中已知大豆凝集素基因序列(AY342213)设计人工寡核苷酸扩增，为了便于重组植物表达载体构建，在上、下游引物的5′端分别引入Sal I和Xba I位点，引物如下(画线部分为加入的酶切位点)：

Primer1：5′TTT GTC GAC ATCCACATTTGGGACAGC  3′(Sal I)

Primer2：5′GGG TCT AGA TGGCAAATTGGAAGAAAA  3′(Xba I)

以实施例1合成的大豆cDNA为模板；

PCR反应体系：反应体系为25μL，其中(NH₄)₂SO₄ Buffer 2.5μl，MgCl₂ 2.5μl，dNTP Mixture(各10mM)0.5μl，引物各0.5μl，模板0.3μl，Taq酶0.3μl(MBI公司)，ddH₂O18.4μL；上述试剂均购于MBI公司；

PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，52.8℃复性55s，72℃延伸55s，35个循环，最后72℃延伸10min；

进行PCR反应；

PCR反应结束后，将反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，分别得到约324bp和517bp的片段，特异性强，单一的扩增带。电泳后，采用北京V-gene生物公司的DNA GeLExtraction Kit回收目的片段；

回收的PCR产物分别与克隆载体pMD18-T连接；

连接反应体系：在10μl反应体系中，Solution I 5μl，PCR回收产物4μl，pMD18-T Vector1μl。混匀后16℃反应16h。(pMD18-T-vector购于TaKaRa公司)。

重组载体的转化：按Maniatis的方法制备感受态细胞，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，冰浴30min，同时做对照管。然后42℃热激90s，冰上放置2min。每管加入800μL LB液体培养基，37℃温育45min，140rpm/min。涂在含氨苄青霉素(100μg/mL)、×-gal(北京鼎国生物技术有限责任公司)、IPTG(北京鼎国生物技术有限责任公司)的LB培养基平板上选择培养过夜(37℃)。挑取白斑用碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶酶切鉴定，得到重组克隆pMD18-T-SBA；

送北京三博远志有限公司测序，核苷酸序列分析用DNAMAN软件，其核苷酸序列如：SEQID No.2所示。

实施例4大豆种子特异性启动子7αP的克隆

利用CTAB法提取得到大豆品种“吉农17”的基因组DNA，以其为模板，利用大豆7S蛋白α亚基基因启动子序列的特异性引物PCR扩增大豆种子特异性启动子7αP；

为了便于重组植物表达载体构建，在上、下游引物的5′端分别引入EcoR I和Xba I位点，引物序列如下(画线部分为加入的酶切位点)：

Primer1：5′GGG GAA TTC TGCTTGGATTTGGACCAGAC  3′；(EcoR I)

Primer2：5′GGG TCT AGA TAGGATATTGAACTAGTTCT  3′；(Xba I)

PCR反应体系：反应体系为50μL，其中(NH₄)₂SO₄ Buffer 5μl，MgCl₂ 5μl，dNTP Mixture(10mM)1μl，引物各1μl(由北京三博远志生物技术有限责任公司合成)，模板DNA 1μl，Taq酶0.3μl，ddH₂O 34.7μL(上述试剂均购于MBI公司)；

PCR扩增条件：94℃预变性8min，94℃变性1min，68℃复性2min30s，32个循环，最后72℃延伸30min；

回收的PCR产物大豆种子特异性启动子7αP与克隆载体pMD18-T连接；获pMD18-T-7αP，统称：p-7αP经测序，核苷酸序列分析用DNAMAN软件，大豆种子特异性启动子7αP的核苷酸序列如：SEQ ID No.3所示。

实施例5绿色荧光蛋白GFP基因片段的扩增

参照植物表达载体AHLG上GFP基因序列，设计一对特异性引物。提取AHLG的质粒DNA，以其为模板进行GFP基因的PCR扩增。

PCR反应体系：反应体系为50μL，其中(NH₄)₂SO₄ Buffer 5μl，MgCl₂ 5μl，dNTP Mixture(10mM)1μl，引物各1μl(由北京三博远志生物技术有限责任公司合成)，模板质粒DNA 1μl，Taq酶0.3μl，ddH₂O 34.7μL(上述试剂均购于MBI公司)；

PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性50s，56℃复性50s，72℃延伸55s，28个循环，最后72℃延伸30min；

PCR扩增反应结束后，产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，电泳后回收目的片段。

为了便于重组植物表达载体构建，在上、下游引物的5′端分别引入Pst I和Bgl II位点，引物序列如下(画线部分为加入的酶切位点)：

Primer1：5′TTT CTG CAG ATG GTG AGC AAG GGC GA  3′；(Pst I)

Primer2：5′GGG AGA TCT TTACTTGTACAGCTCGTC      3′；(Bgl II)

回收的PCR产物GFP与克隆载体pMD18-T连接，获p-GFP。GFP的核苷酸序列如：SEQID No.4所示

实施例6KTi基因RNAi表达载体p7αP-KTiZ-GFP-KTiF完整的ihpRNA构件(pMD18-T-KTiRNAi)的克隆(参见附图1)

1)种子特异性表达载体p1301-7αP的构建

将克隆质粒p-7αP和表达质粒pCAMBIA1301分别用EcoR I、Xba I进行双酶切，电泳分离酶切片段，分别回收目的基因片段和载体大片段，然后以3∶1的比例，加连接液4.0μL混匀，16℃反应过夜，得到重组质粒(p1301-7αP)；该pCAMBIA1301质粒由本实验室保存；

2)中间表达载体p1301-7αP-GFP的构建

将上述重组质粒p1301-7αP经Pst I、Bgl II酶切，分离载体大片段；克隆质粒(p-GFP)经Pst I和Bgl II酶切，分离目的基因片段，用T₄DNA连接酶连接到重组质粒(p1301-7αP)上，得中间表达载体p1301-7αP-GFP。

3)重组表达载体p1301-7αP-KTiZ-GFP的构建

以重组质粒pMD18-T-KTi为模板，利用KTi基因的正向引物PCR扩增KTiZ，电泳后回收目的片段，然后利用Xba I和Pst I分别双酶切KTiZ的PCR回收产物和p1301-7αP-GFP质粒，37℃酶切3h，反应结束后，进行电泳，回收，连接，将胰蛋白酶抑制剂KTi正向插入中间表达载体p1301-7αP-GFP，得到p1301-7αP-KTiZ-GFP。扩增KTiZ的引物序列如下：

P1：5’TTG GAA TTCAAGT CAG ACA TAA CAG CAT 3’(Xba I)

P2：5’GGG CTG CAGTTC ATC ATC AGA AAC TC 3’(Pst I)

4)ihpRNA种子特异性表达载体p1301-7αP-KTiZ-GFP-KTiF的构建

以重组质粒pMD18-T-KTi为模板，利用KTi基因的反向引物PCR扩增KTiF，电泳后回收目的片段，然后利用Bgl II和BstE II分别双酶切KTiF的PCR回收产物和重组质粒p1301-7αP-KTiZ-GFP，37℃酶切3h，反应结束后，进行电泳，回收，连接，得到p1301-7αP-KTiZ-GFP-KTiF。扩增KTiF的引物序列如下：

P1：5’GGG AGA TCT TTC ATC ATC AGA AAC TC 3’(Bgl II)

P2：5’TTG GGT TACCAAGT CAG ACA TAA CAG CAT 3’(BstE II)

实施例7KTi基因RNAi表达载体p1301-7αP-KTiZ-GFP-KTiF完整的ihpRNA构件的克隆

以p1301-7αP-KTiZ-GFP-KTiF质粒DNA为模板，利用种子特异性启动子7αP的上游引物PBX和NOS终止子的下游引物NOSX PCR扩增p1301-7αP-KTiZ-GFP-KTiF完整的ihpRNA构件。PCR反应结束后，进行电泳，回收，连接，将测序正确的命名为pMD18-T-KTiRNAi。引物序列如下：

PBX：5’GGGCTCGAGTGC TTG GAT TTG GAC CAG AC 3’(Xho I)

NOSX：5’TTG CTCGAG GAT CTA GTA ACA TAG ATG ACA CCG 3’(Xho I)

实施例8SBA基因ihpRNA种子特异性表达载体p1301-7αP-SBAZ-GFP-SBAF的构建

1)重组表达载体p7αP-SBAZ-GFP的构建

以克隆质粒pMD18-T-SBA为模板，利用SBA基因的正向引物PCR扩增SBAZ，电泳后回收目的片段，用Xba I和Pst I分别双酶切SBAZ和重组质粒p1301-7αP-GFP，37℃酶切3h，反应结束后，进行电泳，回收，连接，将SBA插入种子特异性表达载体p1301-7αP-GFP中，得到p7αP-SBAZ-GFP；扩增SBAZ的引物序列如下：

P1：5′TTT GAA TTC ATCCACATTTGGGACAGC    3′(Xba I)

P2：5′GGG CTG CAG TGGCAAATTGGAAGAAAA    3′(Pst I)

2).ihpRNA种子特异性表达载体p1301-7αP-SBAZ-GFP-SBAF的构建

以克隆质粒pMD18-T-SBA为模板，利用SBA基因的反向引物PCR扩增SBAF，电泳后回收目的片段，用Bgl II和BstE II分别双酶切SBAF的PCR回收产物和重组质粒p7αP-SBAZ-GFP，37℃酶切3h，反应结束后，进行电泳，回收，连接，得到p1301-7αP-SBAZ-GFP-SBAF。扩增SBAF的引物序列如下

P1：5′GGG AGA TCT TGGCAAATTGGAAGAAAA  3′(Bgl II)

P2：5′TTT GGT TACC ATCCACATTTGGGACAGC 3′(BstE II)

实施例9双价RNAi表达载体pKTi-SBA-RNAi的构建及转化

1)大豆胰蛋白酶抑制剂KTi基因和凝集素SBA基因双价RNAi表达载体的构建

以pMD18-T-KTiRNAi的质粒DNA为模板，利用种子特异性启动子7αP的上游引物和NOS终止子的下游引物PCR扩增p1301-7αP-KTiZ-GFP-KTiF完整的ihpRNA构件，然后电泳，回收，利用Xho I单酶切PCR扩增产物p1301-7αP-KTiZ-GFP-KTiF和SBA基因RNAi表达载体p1301-7αP-SBAZ-GFP-SBAF，37℃酶切1h，然后在微量离心管中分别依次加入2μl10×buffer和1μl CIAP将p1301-7αP-SBAZ-GFP-SBAF载体去磷酸化，反应30分钟后65℃加热8min。反应结束后，进行电泳，回收，连接，成功地构建了双价RNAi表达载体pKTi-SBA-RNAi。

2)大豆胰蛋白酶抑制剂KTi基因和凝集素SBA基因双价RNAi表达载体的转化

将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选出4个重组克隆。通过限制性内切酶XbaI和PstI酶切鉴定，得到两条约517bp和324bp的特异带，电泳图谱(附图3)表明大豆胰蛋白酶抑制剂基因和凝集素基因确实插入到植物表达载体pCAMBIA1301的种子特异启动子下游，成功地构建了双价RNAi表达载体pKTi-SBA-RNAi。

实施例10双价RNAi载体pCAMBIA3301-KTi-SBA的构建及转化(参见附图2)

1)种子特异性表达载体p3301-7αP的构建

将实施例4制得的克隆质粒pMD-T-7αP和表达质粒pCAMBIA3301分别用EcoR I、Xba I进行双酶切，电泳分离酶切片段，分别回收目的基因片段和载体大片段，16℃连接过夜，得到重组质粒(p3301-7αP)；

2)中间表达载体p3301-7αP-GFP的构建

将重组质粒p3301-7αP经Pst I、Bgl II酶切，分离载体大片段；克隆质粒(p-GFP)经Pst I和Bgl II酶切，分离目的基因片段，用T₄DNA连接酶连接到重组质粒(p3301-7αP)上，得中间表达载体p3301-7αP-GFP；

3)KTi与SBA连接成双片段KTi-SBA

同时用Pst I和Sal I、Sal I和Xba I分别双酶切克隆载体pMD-T-KTi和pMD-T-SBA，反应结束后，进行电泳，回收，连接，对KTi和SBA做T₄连接，以连接产物为模板，利用KTi的上游引物2ks-dj和SBA的下游引物2las-dj对其进行扩增得到的片段连入pMD18-T载体，得到重组克隆载体pMD18-T-KTiZ-SBAZ。

2ks-dj：5′GGG AGA TCT GTC AGA CAT AAC AGC AT 3′(Bgl II)

2las-dj：5′TTG GGT TACC TGGCAAATTGGAAGAAAA 3′(BstE II)

4)正义表达载体pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ的构建

同时用Bgl II和BstE II分别双酶切克隆载体pMD18-T-KTiZ-SBAZ和过渡载体p3301-7αP-GFP，将切下的片段连入p3301-7αP-GFP，构建成正义表达载体pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ。

5)双价RNAi载体pCAMBIA3301-KTi-SBA的构建

同时用Xba I和Pst I分别双酶切表达质粒pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ和克隆质粒pMD18-KTiZ-SBAZ，然后经电泳回收连接，得到双价RNAi表达载体pCAMBIA3301-7αP-SBAF-KTiF-GFP-KTiZ-SBAZ，统称：pCAMBIA3301-KTi-SBA；成功构建了siRNA表达载体。

6)表达载体的转化

将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选出7个重组克隆。通过限制性内切酶Pst I和Sal I、Sal I和Xba I酶切鉴定，得到两条约324bp和517bp的特异带，电泳图谱(附图4)表明大豆胰蛋白酶抑制剂基因和凝集素基因确实插入到植物表达载体pCAMBIA3301的种子特异启动子下游，成功地构建了siRNA的表达载体pCAMBIA3301-KTi-SBA。

实施例11双价RNAi表达载体pKTi-SBA-RNAi和pCAMBIA3301-KTi-SBA的遗传转化

采用RNAi技术沉默大豆胰蛋白酶抑制剂基因和凝集素基因，对转基因植株进行分子鉴定、内源大豆胰蛋白酶抑制剂和凝集素活性的测定和农艺性状的观察，研究RNAi技术对大豆胰蛋白酶抑制剂和凝集素在种子特定部位的表达调控效果以及对其他品质性状的影响，培育出大豆新品种。此外，还对两种RNAi表达载体(一个大茎环结构和两个小茎环结构)转入大豆后的效果进行了比较，得出一个大茎环结构要比两个小茎环结构RNA抑制效果显著的结论。

1、花粉管通道法转化

1)表达质粒(pCAMBIA3301-KTi-SBA和pKTi-SBA-RNAi)的提取

采用改良的“碱裂解法”(大量)提取表达质粒(pCAMBIA3301-KTi-SBA和pKTi-SBA-RNAi)。

置于冰箱中待用。

2)受体大豆品种“吉农28”，“吉农18”，“吉农27”的种植

将受体大豆品种“吉农28”，“吉农18”，“吉农27”的种子播种于试验田内，按照一般方法管理，培育成株至开花，在盛花期进行目的基因的导入。

3)受体植株的选择和目的基因的导入

时间选择在下午3:00～5:00时进行目的基因的导入。方法为：用镊子将多余花去除，然后将即将要导入花的萼片与翼瓣去除，用小剪刀将显露出的柱头小心剪去一小部分，然后用微量进样器在切口处滴注5～10μL制备好的质粒DNA液(pCAMBIA3301-KTi-SBA和pKTi-SBA-RNAi)，挂上标牌，记载导入时间，质粒DNA名称和受体品种。待15～20min后，复滴一次。

4)后期管理和收获

转化的植株在3～10d内进行去杂，待大豆成熟时，将导入外源DNA的大豆荚分别收获，晒干，脱粒。

2、农杆菌介导的转化

1)农杆菌工程菌液的制备

利用质粒提取试剂盒分别提取pCAMBIA3301-KTi-SBA和pKTi-SBA-RNAi的质粒DNA，通过冻融法分别转入根癌农杆菌感受态细胞EHA105中，将经过菌落PCR鉴定的农杆菌单菌落分别接种于含有100μg/ml Kan的5ml YEP液体培养基中，于28℃，210rpm振荡培养过夜。次日，将其转入50ml YEP液体培养基中，于28℃，210rpm振荡培养至OD₆₀₀值在0.5～1.0时，收集菌体，用MS液体培养基悬浮，待用。

2)大豆子叶节的培养和处理

A.挑选饱满、无破损和无病的大豆种子进行表面消毒：将大豆种子盛于一个大培养皿中，取15mL NaClO、浓5mL HCl于玻璃培养皿中混合，使产生氯气，迅速盖好玻璃培养皿的上盖，熏蒸消毒过夜。将消毒后的大豆种子置于萌发培养基上培养3～5d。

B.取萌动的种子制备子叶节外植体：用镊子剥去大豆种皮，然后用解剖刀沿种子中线纵向切开，使两片子叶分开，切去子叶的1/3，再去掉下胚轴及顶芽。每皿约18个子叶，26℃预培养3d。

3)农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化

A.将预培养3d后的大豆子叶节外植体，用解剖刀在子叶与胚轴交接处浅划几刀制造创伤后，放入用MB液体培养基重悬后的菌液中浸泡30min，期间每隔5min摇动一次。

B.倒掉菌液，将子叶节取出放在无菌的滤纸上稍微吸干，然后将其近轴面向下置于MB共体培养基中，26℃暗培养3d。

C.待共培养3d后的外植体，周围出现菌斑后，将其转入含有相应浓度的Cef、Carb和Hyg的MB筛选培养基上，26℃，光照16h/d，光照强度2000LX培养，同时将未转化的组织同样处理作为对照，每隔15d更换一次培养基。

D.待抗性芽长至1～2cm左右时，将其切下转到伸长培养基中长茎，当茎长至3～5cm时，移入含有相应潮霉素浓度的MB生根培养基中。

E.待根系发育好后，先炼苗3d，然后移入盛有无菌土的花盆中，用塑料薄膜保湿3d后，室温常规管理。

3、转化后代的筛选和鉴定

(1)转基因植株的Southern杂交检测

(2)转基因植株的胰蛋白酶活性的检测

1)试样的制备

称取0.2g～1g试样，将试样材料磨碎，过筛(筛盘为100目～200目)。在室温条件下先用戍烷∶己烷(1∶1)脱脂。脱脂方法如下：将试样浸泡于20mL戍烷∶己烷(1∶1)中，低档速电磁搅拌30min，过滤。残渣用约50mL戍烷∶己烷(1∶1)淋洗俩次，收集残渣。然后加入50mL 0.01mol/L氢氧化钠溶液进行浸提，低档速电磁搅拌下浸提3h，过滤。浸出液用于测定，必要时，可进行稀释。

2)测定管和对照管的制备

取两组平行的试管，按表5-2在每组中一次加入试样浸出液、水和胰蛋白酶溶液，于37℃水浴中混合后，再加入5.0mL预热至37℃的BAPA底物溶液，从第一管加入起计时，于37℃水浴中摇动混匀，并准确反应10min，最后加入1.0mL反应终止液。

在制备测定管的同时，应制备试剂对照管和试样对照管，即取2mL水或试样浸出液，然后按顺序加入2mL胰蛋白酶溶液、1mL反应终止液和5mLBAPA底物溶液，混匀后过滤。

表4-2反应体系

Table 4-2 reaction system

3)测定

以试剂对照管调节吸光度值为0，在410nm波长下测定各测定管和对照管的吸光度值，以平行试管的算术平均值表示。

4)结果表示

A.酶活性的表示方法。

a.胰蛋白酶活性单位(TU)：在规定实验条件下，每10mL反应液在410nm波长下每分钟升高0.01吸光度值即为一个TU。

b.胰蛋白酶抑制率：在规定实验条件下，与非抑制管相比，测定管吸光度值降低的比率。

c.胰蛋白酶抑制单位(TIU)：在规定实验条件下，与非抑制管相比，每10mL反应混合液在410nm波长下每分钟降低0.01吸光度值即为一个TIU。

B.计算

a.各测定管的胰蛋白酶抑制率按如下公式计算：

式中：

TIR-胰蛋白酶抑制率％；

A_N-非抑管吸光度值；

A_T-测定管吸光度值；

A_T0-试样对照管吸光度值。

b.只有胰蛋白酶抑制率在20％～70％范围内时，测定管吸光度值可用于胰蛋白酶抑制剂活性计算，各测定管胰蛋白酶抑制剂活性按如下公式计算：

$\mathrm{TI}=\frac{A_N-A_T-A_{T0}}{T\times 0.01}$

式中：

TI-胰蛋白酶抑制剂活性，单位为胰蛋白酶抑制剂单位(TIU)；

t-反应时间，单位为分钟(min)。

c.单位体积试样浸出液中胰蛋白酶抑制剂活性

以测定用试样浸出液体积(单位为mL)为横坐标，TI为纵坐标作图，拟和直线回归方程，计算斜率，斜率值即是单位体积试样浸出液中胰蛋白酶抑制剂活性(单位为TIU/mL)。当测定用试样浸出液体积和TI不是一条直线关系时，单位体积试样浸出液中胰蛋白酶抑制剂活性用各各测定管单位体积胰蛋白酶抑制剂活性的算术平均值表示。

试样值胰蛋白酶抑制剂活性按如下公式计算：

$\mathrm{TIM}=\frac{\mathrm{TIV}\times V\times F}{m}$

式中：

TIM-试样中胰蛋白酶抑制剂活性，单位为胰蛋白酶抑制剂单位每克(TIU/g)；

TIV-单位体积试样浸出液中胰蛋白酶抑制剂活性，单位为胰蛋白酶抑制剂单位每毫升(TIU/mL)；

V-试样浸出液总体积，单位为毫升(mL)；

F-稀释倍数；

m-试样质量，单位为克(g)。

结果显示，转基因大豆种子的胰蛋白酶抑制剂活力与对照(100％)相比有明显的下降，其中转一个大茎环结构ihpRNA种子特异性表达载体的转基因种子平均降低了83％，转两个小茎环结构ihpRNA种子特异性表达载体的转基因种子平均降低了13.4％。以上结果说明ihpRNA种子特异性表达载体的RNAi表达构件在种子特异性启动子的控制下有效的表达了siRNA，从而抑制了内源性胰蛋白酶抑制剂mRNA的翻译，使胰蛋白酶抑制剂明显降低，并且转一个大茎环结构RNAi载体的抑制效果更好。

(3)转基因植株的凝集素活性的检测

1)大豆凝集素的提取

取适量转基因大豆和非转基因大豆(吉农18)样品，用研钵间歇性粉碎后，过4O目筛，称取1g过筛粉碎样品与2倍体积的石油醚(沸程60～90℃)混合脱脂，搅拌12h后抽滤，脱脂的大豆粗粉静置过夜至完全干燥，用2倍体积的0.15mol/L浓度的NaCl混合浸提，溶液透析过夜，透析液在4℃下15000rpm离心30min，取上清液，得大豆凝集素粗品，用于检测。

2)红细胞悬液的制备

兔心脏采血后，血液注入装有玻璃珠的椎形瓶中快速摇动10min，以脱去纤维。取脱纤维血液5mL，加入10～15mL生理盐水混匀，常温离心(3000r/min^-1，5min)，倒去上部液体，反复几次直至上部液体澄清。取1mL洗过血液用血球缓冲液(0.02mol/L PBS，pH7.2)配制成2.5％浓度的红细胞悬液，置于4℃备用，可保存一周。

3)大豆凝集素的检测

(1)在“V”型血凝板中每孔加入15μL血球缓冲液(0.02mol/L PBS，pH7.2)。

(2)取待测凝集素样品15μL，加入第一孔，混匀后取出15μL，加入第二孔，混匀后取出15μL加入第三孔。依此类推，作倍比稀释。

(3)“V”型血凝板的最后一排加入反应缓冲液做空白对照。

(4)待测样品倍比稀释完成后，随即每孔加入15μL 2.5％的血球悬浮液，加完血球后将血凝板置于微型震荡器上振动(60rpm，1min)，室温放置，观察凝集效果。结果显示转基因植株凝集素活性均有大幅度减低。