含分子内二硫键的寡肽分子及在辅助蛋白质氧化复性中的应用

摘要

本发明公开了一种含分子内二硫键的寡肽分子及在辅助蛋白质氧化复性中的应用，能与DTT构成氧化还原对来辅助蛋白质氧化复性的寡肽小分子。所述寡肽包括两条寡肽，具有SEQ ID No.1及SEQ ID No.2氨基酸序列。采用此寡肽小分子辅助蛋白复性，在中性pH下也能够很好地辅助蛋白质的复性，而且可以大大提高蛋白质氧化复性的速度和收率。本发明采用的寡肽小分子可以和变性还原蛋白质所携带的强还原剂DTT耦合形成氧化还原对，从而不需要去除变性蛋白中过量DTT的操作，也不需要在复性液中加入其它还原剂，操作简单，并降低了复性成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够与DTT构成氧化还原对辅助蛋白质氧化复性的含分子内二硫键的寡肽分子，及其在辅助蛋白质氧化复性中的使用方法，属于生物技术中的蛋白质复性技术领域。

背景技术

随着科学技术的发展，基因重组技术成为生产具有医用或工业价值的蛋白质的重要途径。很多具有重要医药和工业价值的蛋白质都含有二硫键，如白细胞介素、人生长激素、人干扰素、肿瘤坏死因子、胰岛素、组织型纤溶酶原激活剂等。应用基因重组方法在大肠杆菌中表达上述蛋白质的时候，往往会形成包含体。包含体的形成虽利于目标蛋白质的分离纯化，但包含体中目标蛋白质因高级结构不正确而没有活性，因此必须通过复性才能获得有生物活性的蛋白质。含有二硫键的蛋白质的折叠过程被称作氧化复性或氧化折叠，在此过程中蛋白质形成正确的三级结构，同时多个半胱氨酸残基准确配对形成正确的二硫键，恢复天然酶活性。

蛋白质二硫键异构酶(PDI)是体内催化蛋白质氧化复性的一个重要的氧化还原酶。它不但能催化二硫键的异构还能够促进二硫键的形成。因此人们设计出了很多模拟该酶功能的小分子巯醇作为还原剂辅助蛋白质复性，如模拟PDI低酸解离常数(pKa)的小分子芳香巯醇、同时模拟其低pKa和分子内二硫键性质的小分子(±)-反-1，2-二(2-乙酰巯基)环己烷(BMC)(Method of folding proteins with synthetic dithiol catalysts，US patent，US591043，1999)以及由半胱氨酸-甘氨酸-半胱氨酸构成的Cys-Gly-Cys三肽巯醇(Small-moleculecatalysts of oxidative protein folding.Current Opinion in Chemical Biology，2008，12，740-745.)。这些模拟PDI功能的小分子巯醇均不含有二硫键，其作为还原剂用于蛋白质的氧化复性中，担负着促进蛋白质二硫键异构化的作用。这些分子能够很好地辅助蛋白质的氧化复性，加快复性的速度和提高复性的收率。但是，变性还原蛋白质样品中过量的还原剂二硫苏糖醇(DTT)需要通过透析或者凝胶过滤色谱的方法去除。DTT的去除操作不仅延长了生产周期、而且会提高人力和设备损耗等生产成本。除此之外，这些小分子巯醇因很易于空气中氧化而失效，故其储存液不易保存。常用的氧化剂(如氧化型谷胱甘肽)和DTT形成氧化还原对辅助蛋白质氧化复性时，又存在不能够在接近中性pH条件下复性，以及复性收率相对较低的问题。所以针对实际生产，有必要开发能够和变性还原蛋白质所携带的DTT构成氧化还原对的小分子氧化剂来辅助蛋白质的氧化复性。

发明内容

本发明的目的在于提供含分子内二硫键的寡肽分子作为氧化剂在碱性及中性pH值条件下耦合DTT辅助含有二硫键蛋白质的高效氧化复性的技术方法。本方法通过直接应用所设计的寡肽作为氧化剂与残留的还原剂DTT耦合形成氧化还原对在中性或碱性pH条件下实现蛋白质的高效复性，无需对变性蛋白质进行还原剂DTT去除的操作。

本发明是通过下述技术方案加以实现的：

本发明的含分子内二硫键的寡肽分子，寡肽分子中的分子内二硫键形成于两个半胱氨酸残基之间，且其能够作为氧化剂和DTT耦合形成氧化还原对，在碱性或及中性pH值条件下辅助含有二硫键蛋白质的氧化复性。

所述的寡肽分子为：氧化型三肽或氧化型五肽。氧化型三肽具有SEQ ID No.1氨基酸序列：Cys-Gly-Cys，其中分子内二硫键形成于两个Cys之间，且羧基端酰胺化。氧化型五肽，具有SEQ ID No.2氨基酸序列：Arg-Lys-Cys-Gly-Cys，其中分子内二硫键形成于两个Cys之间，且羧基端酰胺化。

本发明的含分子内二硫键的寡肽分子在辅助蛋白质氧化复性中的应用，步骤如下：

(1)将含分子内二硫键的寡肽小分子加入含20-100mmol/L三羟甲基氨基甲烷、0-3mmol/L乙二胺四乙酸四钠、0-2mol/L尿素或0-1mol/L盐酸胍的溶液中组成复性液；

(2)蛋白质或包含体用含有DTT的8mol/L尿素变性液还原变性；

(3)经含DTT的变性液还原变性的蛋白质或包含体溶液，直接稀释于或经不含DTT的变性液稀释5-25倍后再稀释于pH7.0-9.0的复性液中，且稀释后蛋白溶液中含分子内二硫键的寡肽浓度为DTT摩尔浓度的2-3.3倍。

本发明涉及的辅助蛋白质复性的方法应用于变性还原蛋白质复性中，变性失活并且含有二硫键被断开的蛋白质样品使用本发明的方法进行复性可以保证较高的复性收率。

本发明的关键技术有四点：首先，CGC和RKCGC寡肽的结构，它们均具有分子内二硫键，这样就可以保证在复性的过程中它们不会和蛋白质分子的巯醇之间形成相对稳定的混合二硫键，而这种混合二硫键的长时间存在会抑制蛋白质的进一步复性；其次是当CGC和RKCGC寡肽被DTT还原后，分子中有一个半胱氨酸上巯醇pK_a值比常用的氧化还原剂低，从而使得其在中性的pH条件下也能够形成巯基阴离子，由于只有巯基阴离子是发生巯醇二硫键交换反应的活性状态，所以CGC和RKCGC寡肽小分子能够加快巯醇二硫键交换反应，促进蛋白质二硫键形成，从而加快复性并提高复性收率；关键之三需要根据复性体系中含有的DTT的摩尔量来调节加入寡肽分子的摩尔量，主要是控制变性还原的蛋白质分子中二硫键形成的速度，使得二硫键形成和异构之间达到较好的平衡，从而促进正确二硫键的形成；最后是变性蛋白质溶液中残留的DTT的处理，应用其它的小分子氧化剂辅助复性时需要将其中的DTT通过凝胶过滤色谱或24h透析的方法除去，而本发明的复性方法不需要进行此操作，直接将DTT作为还原剂来辅助复性。

本发明所介绍的含二硫键的寡肽作为氧化剂辅助蛋白质氧化复性的方法与目前常用的氧化剂辅助蛋白质氧化复性方法相比有如下优点：第一，本发明所采用氧化剂可以和DTT耦合辅助蛋白质氧化复性，所以可以省去将强还原剂DTT从还原变性的蛋白质溶液中除去的操作步骤，从而节省复性时间和成本；第二，本发明所采用的寡肽小分子可以大大提高蛋白质氧化复性的速度和收率，复性速度和收率都高于同条件下氧化型谷胱甘肽的效果；第三，本发明介绍的寡肽小分子，在中性pH下也能够很好地辅助蛋白质的复性，而常用的氧化剂一般只在碱性条件下才能较好地辅助蛋白质氧化复性；第四，本发明采用的寡肽小分子可以和变性还原蛋白质所携带的强还原剂DTT耦合形成氧化还原对，从而不需要在复性液中加入还原剂，操作简单，并降低了复性成本。

附图说明

图1：实施例1中1.4mmol/L CGC和GSSG在中性pH值条件下辅助还原变性溶菌酶复性的活性收率随时间变化图。

图2：实施例2中0.84mmol/L RKCGC和GSSG在中性pH条件下辅助还原变性溶菌酶复性的活性收率随时间变化图。

图3：实施例3中1.4mmol/LRKCGC和GSSG在中性pH条件下辅助还原变性的溶菌酶复性的活性收率随时间变化图。

图4：实施例4中1.2mmol/L CGC和GSSG在中性pH条件下辅助还原变性溶菌酶复性的活性收率随时间变化图。

图5：实施例5中0.84mmol/L CGC和GSSG在碱性pH条件下辅助还原变性溶菌酶复性的活性收率比较图。

图6：实施例6中0.84mmol/L RKCGC和GSSG在碱性pH条件下辅助还原变性溶菌酶复性的活性收率随时间变化图。

图7：实施例7中的1.0mmol/L RKCGC和GSSG在碱性pH条件下辅助还原变性的核糖核酸酶A复性的活性收率比较图。

具体实施方式

下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。作为氧化剂能够和DTT耦合形成氧化还原对并在pH 7.0及以上很好地辅助蛋白质氧化复性的含分子内二硫键的寡肽分子，分子内二硫键形成于两个半胱氨酸残基之间。

作为氧化剂的含分子内二硫键的寡肽分子为一种三肽分子，具有SEQ ID No：1氨基酸序列：Cys-Gly-Cys，分子内二硫键形成于两个Cys之间，且羧基端酰胺化；

作为氧化剂的含分子内二硫键的寡肽分子为一种五肽分子，具有SEQ ID No：2氨基酸序列：Arg-Lys-Cys-Gly-Cys，分子内二硫键形成于两个Cys之间，且羧基端酰胺化；

用上述任一项含分子内二硫键的寡肽辅助蛋白质氧化复性的方法，经含DTT的变性液还原变性的蛋白质或包含体溶液，直接稀释于或经不含DTT的变性液稀释5-25倍后再稀释于pH7.0-9.0的复性液中，复性液由20-100mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0-3mmol/L乙二胺四乙酸四钠(EDTA)、0-2mol/L尿素或0-1mol/L盐酸胍及含分子内二硫键的寡肽小分子组成，稀释后蛋白溶液中寡肽浓度为DTT摩尔浓度的2-3.3倍。

实施例1：1.4mmol/L CGC寡肽在中性pH条件下应用于辅助还原变性溶菌酶的复性

14.3mg溶菌酶溶于1.0mL含有8mol/L尿素，100mmol/L DTT，100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)和1mmol/L EDTA，pH 8.5的变性缓冲溶液中，混合均匀并于40℃还原变性3小时；变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为84mmol/L；对得到的变性溶菌酶用不含DTT的变性缓冲液进行20倍稀释得到变性蛋白质样品。复性缓冲液由20mmol/L Tris-HCl、1.0mol/L尿素、1mmol/L EDTA和1.4mmol/L CGC寡肽或氧化型谷胱甘肽(GSSG)组成，溶液pH为7.0。不对变性蛋白质样品进行去除DTT的操作，而直接用复性液将变性蛋白质样品稀释10倍，稀释后溶液中溶菌酶的浓度为5μmol/L，DTT为0.42mmol/L。稀释后的溶液置于28℃的恒温水浴中开始复性。溶菌酶的活性检测以微球菌为底物，1.30mL 0.25mg/mL底物的pH 6.2的磷酸盐缓冲液与0.10mL稀释后的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性测定温度：28℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。在复性不同时间取样测定蛋白质的活性。其它复性条件相同，不同小分子氧化剂辅助复性效果对比如图1所示。通过单指数拟合，可以得到在CGC寡肽辅助下，还原变性的溶菌酶复性的速率常数是0.0345min^-1而在氧化型谷胱甘肽(GSSG)辅助的条件下其复性的速率常数是0.0255min^-1，可见与GSSG相比，CGC作为氧化剂可以提高还原变性的溶菌酶复性的速度。由图可知，在中性pH条件下，以CGC寡肽作为氧化剂时还原变性的溶菌酶的复性速度和最终收率都高于以GSSG作为氧化剂的复性。

实施例2：0.84mmol/LRKCGC寡肽在中性pH条件下应用于辅助还原变性溶菌酶的复性

14.3mg溶菌酶溶于1.0mL含有8mol/L尿素，100mmol/L DTT，100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)和1mmol/L EDTA，pH 8.5的变性缓冲溶液中，混合均匀并于40℃还原变性3小时；变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为84mmol/L；对得到的变性溶菌酶用不含DTT的变性缓冲液进行5倍稀释得到变性蛋白质样品。复性缓冲液由100mmol/L Tris-HCl、2mol/L尿素、3mmol/L EDTA和0.84mmol/LRKCGC寡肽或氧化型谷胱甘肽(GSSG)组成，溶液pH为7.0。不对变性蛋白质样品进行去除DTT的操作，直接用复性液将变性蛋白质样品稀释40倍，稀释后溶液中溶菌酶的浓度为5μmol/L，DTT为0.42mmol/L。稀释后的溶液置于28℃的恒温水浴中开始复性。溶菌酶的活性检测以微球菌为底物，1.30mL 0.25mg/mL底物的pH 6.2的磷酸盐缓冲液与0.10mL稀释后的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性测定温度：28℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。在复性不同时间取样测定蛋白质的活性。其它复性条件相同，RKCGC寡肽和氧化型谷胱甘肽辅助复性效果对比如图2所示。由图可知，在RKCGC的辅助下还原变性溶菌酶的复性收率和速度都高于氧化型胱甘肽(GSSG)辅助下的复性。

实施例3：1.4mmol/L RKCGC寡肽应用于辅助还原变性溶菌酶的复性

14.3mg溶菌酶溶于1.0mL含有8mol/L尿素，100mmol/L DTT，100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)和1mmol/L EDTA，pH 8.5的变性缓冲溶液中，混合均匀并于40℃还原变性3小时；变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为84mmol/L；对得到的变性溶菌酶用不含DTT的变性缓冲液进行25倍稀释得到变性蛋白质样品。复性缓冲液由50mmol/L Tris-HCl、0.5mol/L盐酸胍、1mmol/L EDTA和1.4mmol/L RKCGC寡肽或氧化型谷胱甘肽(GSSG)组成，溶液pH为7.0。用复性液将变性蛋白质样品稀释8倍，稀释后溶液中溶菌酶的浓度为5μmol/L，DTT为0.42mmol/L。稀释后的溶液置于28℃的恒温水浴中开始复性。溶菌酶的活性检测以微球菌为底物，1.30mL0.25mg/mL底物的pH 6.2的磷酸盐缓冲液与0.10mL稀释后的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性测定温度：28℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。在复性不同时间取样测定蛋白质的活性。其它复性条件相同，RKCGC寡肽和氧化型谷胱甘肽辅助复性效果对比如图3所示。由图可知，在RKCGC的辅助下还原变性溶菌酶的复性收率和速度都远高于氧化型胱甘肽GSSG辅助下的复性，RKCGC辅助下，2小时后收率可以达到90％，而同样条件下，GSSG即使在复性4小时后仍然只能使收率达到60％。

实施例4：1.2mmol/L CGC寡肽应用于辅助还原变性溶菌酶的复性

14.3mg溶菌酶溶于1.0mL含有8mol/L尿素，100mmol/L DTT，100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)和1mmol/L EDTA，pH 8.5的变性缓冲溶液中，混合均匀并于40℃还原变性3小时；变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为84mmol/L；对得到的变性溶菌酶用不含DTT的变性缓冲液进行5倍稀释得到变性蛋白质样品。复性缓冲液由50mmol/L Tris-HCl、1.0mol/L盐酸胍和1.2mmol/L CGC寡肽或氧化型谷胱甘肽(GSSG)组成，溶液pH为7.0。用复性液将变性蛋白质样品稀释40倍，稀释后溶液中溶菌酶的浓度为5μmol/L，DTT为0.42mmol/L。稀释后的溶液置于28℃的恒温水浴中开始复性。溶菌酶的活性检测以微球菌为底物，1.30mL 0.25mg/mL底物的pH 6.2的磷酸盐缓冲液与0.10mL稀释后的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性测定温度：28℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。在复性不同时间取样测定蛋白质的活性。其它复性条件相同，不同小分子氧化剂辅助复性效果对比如图4所示。由图可知，在中性pH条件下，以变性还原蛋白质中携带的DTT作为还原剂，以1.2mmol/L CGC寡肽作为氧化剂时变性还原溶菌酶的复性速度和最终收率都高于以1.2mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)作为氧化剂时的复性。

实施例5：0.84mmol/L CGC在碱性条件下辅助还原变性溶菌酶的复性

14.3mg溶菌酶溶于1.0mL含有8mol/L尿素，100mmol/L DTT，100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)和1mmol/L EDTA，pH 8.5的变性缓冲溶液中，混合均匀并于40℃还原变性3小时；变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为84mmol/L；对得到的变性溶菌酶用不含DTT的变性缓冲液进行20倍稀释得到变性蛋白质样品。复性缓冲液由20mmol/L Tris-HCl、1.0mol/L尿素、1mmol/L EDTA和0.84mmol/L CGC寡肽或氧化型谷胱甘肽(GSSG)组成，溶液pH为8.5。用复性液将变性蛋白质样品稀释10倍，稀释后溶液中溶菌酶的浓度为5μmol/L，DTT为0.42mmol/L。稀释后的溶液置于28℃的恒温水浴中开始复性。溶菌酶的活性检测以微球菌为底物，1.30mL0.25mg/mL底物的pH 6.2的磷酸盐缓冲液与0.10mL稀释后的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性测定温度：28℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。在复性90min时取样测定蛋白质的活性。其它复性条件相同，不同小分子氧化剂辅助复性效果对比如图5所示。由图可知，在pH＝8.5的条件下，以CGC寡肽作为氧化剂时溶菌酶的复性收率高于以氧化型谷胱甘肽(GSSG)作为氧化剂时的复性。

实施例6：0.84mmol/L RKCGC在碱性条件下辅助还原变性溶菌酶的复性

14.3mg溶菌酶溶于1.0mL含有8mol/L尿素，100mmol/L DTT，100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)和1mmol/L EDTA，pH 8.5的变性缓冲溶液中，混合均匀并于40℃还原变性3小时；变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为84mmol/L；对得到的变性溶菌酶用不含DTT的变性缓冲液进行20倍稀释得到变性蛋白质样品。复性缓冲液由20mmol/L Tris-HCl、1.0mol/L尿素、1mmol/L EDTA和1.4mmol/L RKCGC寡肽或氧化型谷胱甘肽(GSSG)组成，溶液pH为9.0。不对变性蛋白质样品进行去除DTT的操作，而直接用复性液将变性蛋白质样品稀释10倍，稀释后溶液中溶菌酶的浓度为5μmol/L，DTT为0.42mmol/L。稀释后的溶液置于28℃的恒温水浴中开始复性。溶菌酶的活性检测以微球菌为底物，1.30mL 0.25mg/mL底物的pH 6.2的磷酸盐缓冲液与0.10mL稀释后的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性测定温度：28℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。在复性不同时间取样测定蛋白质的活性。其它复性条件相同，不同小分子氧化剂辅助复性效果对比如图6所示。由图可知，在碱性pH条件下，以RKCGC寡肽作为氧化剂时还原变性溶菌酶的复性速度和最终收率都高于以氧化型谷胱甘肽作为氧化剂的蛋白质复性。

实施例7：1.0mmol/L RKCGC在碱性条件下辅助还原变性的核糖核酸酶A样品复性

7.0mg核糖核酸酶A溶于1.0mL含有8mol/L尿素，50mmol/L DTT，100mmol/LTris-HCl和1mmol/L EDTA，pH 8.5的变性缓冲溶液中于40℃还原变性1小时。变性完成后通过C18反相色谱测定得到其中残留的DTT含量为47mmol/L。复性缓冲液由100mmol/L Tris-HCl、1.0mmol/L RKCGC或氧化型谷胱甘肽(GSSG)和1mmol/L EDTA组成，溶液pH为8.0。用复性液将变性蛋白质样品稀释100倍，稀释后溶液中核糖核酸酶A的浓度为5μmol/L，DTT为0.47mmol/L。稀释后的溶液置于25℃的恒温水浴中开始复性。核糖核酸酶A的活性检测以胞苷-2′，3′-环磷酸(cCMP)为底物，1.00mL 0.25mg/mL底物的pH 6.0的100mmol/L Tris-HCl缓冲液与0.10mL蛋白质复性样品充分混合，测定反应液在284nm下的吸光度变化。活性测定温度：25℃。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算活性收率。采用本专利所述方法复性，不除掉变性还原蛋白质中的DTT，而直接稀释复性。在复性5小时后取样测定蛋白质的活性。其它复性条件相同，RKCGC寡肽和氧化型谷胱甘肽(GSSG)辅助还原变性核糖核酸酶A复性效果对比如图7所示。由图可知，同样的复性条件下，RKCGC寡肽为氧化剂时核糖核酸酶A复性的收率高于GSSG为氧化剂时的复性收率。

本发明提出的耦合DTT辅助蛋白质有效复性的寡肽，并将其用于变性蛋白质样品的复性，已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。