透射电子显微镜样品支撑膜和透射电子显微镜样品的制作方法

摘要

本发明涉及透射电子显微镜样品支撑膜及透射电子显微镜样品的制作方法。所述透射电子显微镜样品支撑膜由多孔微栅支持膜基底和覆于基底上的单层氧化石墨烯薄膜组成，单层氧化石墨烯薄膜的覆盖密度为0.7×10-6～14×10-6mg/mm2多孔微栅，优选为0.7×10-6～3.5×10-6mg/mm2。该种单层氧化石墨烯薄膜可作为透射电子显微镜样品搭载膜来制作透射电子显微镜样品。本发明的有益效果是，设计和制备了一种新的透射电子显微镜样品支撑膜，具有比传统的碳支持膜更薄的厚度、更强的机械强度和更好的材料分散效果；用它来搭载材料进行材料的透射电子显微镜观察，可以获得更高的分辨率和清晰度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种透射电子显微镜样品支撑膜和透射电子显微镜样品的制作方法。

背景技术

透射电子显微镜技术已在纳米科学和纳米技术领域获得了广泛的应用。若想获得一张完美的透射电子显微镜照片，除了要求有一台功能及状态良好的透射电子显微镜仪器以外，制备一个优质的透射电子显微镜样品至关重要。透射电子显微镜的样品，一般是将待观察的材料搭载在标准的“透射电子显微镜样品支撑膜”上制备而成的。目前市场上提供的透射电子显微镜样品支撑膜有很多种，需要根据材料的不同而做不同的选择。一般而言，支撑膜的厚度、表面亲疏水性质、是否会和待测材料发生反应或产生信号干扰、以及在高压电子束下的稳定性等，这些都是选择样品支撑膜时需要考虑的因素。

目前研究中大家经常使用的透射电子显微镜样品支撑膜是“碳支持膜”。“碳支持膜”的制备方法，是将一层厚度约为15纳米的无定形碳，铺展在金属网格的表面，干燥以后制备而成的(图1a-b)。它的优点在于碳膜的厚度比较厚，因此在高能电子束下稳定性较好，不容易破；缺点在于，如此厚的碳膜会对电子束产生明显的散射，令搭载在碳膜上的待观察材料的散射信号受到干扰，最终影响材料的观察效果，尤其当材料的尺寸与碳膜厚度相当、甚至小于碳膜厚度的时候，这种干扰更加明显。因此“碳支持膜”主要适合于尺寸较大的样品的搭载。

为了提高样品的观察衬度，另一种透射电子显微镜样品支撑膜-多孔微栅-出现了。它是在厚度约为15～20纳米厚的普通碳膜上打了许多的孔，每个孔的尺寸约为0.5～2.5微米(图1c)。制备透射电子显微镜样品的时候，只需要将待观察材料搭在这些微孔的边缘，这样在透射电子显微镜下观察时便可以得到不受背底干扰的“干净”的样品信号。然而，只有管状或者棒状的材料才能够成功的、稳定的搭载在微孔的边缘，而其它大部分材料，像纳米颗粒或生物分子，则很难实现这种搭载，它们需要铺在一种“连续”的支撑膜上才行。

目前，大家解决这一问题的方法是使用“超薄碳膜”。“超薄碳膜”是在孔径约为1～2微米的普通多孔微栅的表面铺一层厚度仅为3～5纳米的、连续的无定形碳膜。由于这一层碳膜的厚度很薄，它对电子束的散射效果很小，大大降低了背底对材料信号的干扰，提高了材料观察的敏感性。然而，对于尺寸仅为几个纳米的材料而言，这种散射仍然不可忽视。同时，由于这一层无定形碳膜的厚度只有3～5纳米，它的机械强度较差，在高能电子束下很容易破掉，影响实验进行。另外，无定形碳膜的生产制备过程很可能带来多种碳基杂质，影响材料的观察。

为了解决上文提到的这些难题，目前为止，人们进行了各种各样的尝试。例如，有人利用碳纳米管来搭载材料、进行材料的透射电子显微镜观察。在实验中，他们采用“封装”或者“化学键结合”的方法，将待测材料(包括分子)固定在碳纳米管上。由于碳纳米管自身特有的单晶的管状结构，它具有极好的机械强度性和极小的电子散射干扰，采用这种“碳纳米管搭载”，可以获得清晰的透射电子显微镜观察效果。然而，不论是“封装”还是“化学键结合”，都需要较高的操作技术和实验条件，同时由于碳管内部空间有限，可能封装进去的材料尺寸必须很小，这些因素都大大限制了这一方法的使用范围。

另一种方法是利用单层剥离的石墨片来搭载材料。单层剥离的石墨片厚度只有几个埃，对样品信号的干扰很小。缺点是单层石墨片的剥离很难实现，目前已有的方法都不适合于材料的大规模生产和实现。

此外，以上提到的各种样品支撑膜，它们有一个共同的特点是它们都具有疏水的表面性质，对于水溶性的纳米材料而言(例如水溶性纳米颗粒或生物分子)，很难获得良好的材料分散效果。曾有人用“表面等离子体共振”处理的方法将支撑膜的疏水表面亲水化，然而采用这种方法很难选择合适的处理功率和时间、确保既不破坏脆弱的碳膜又获得良好的亲水转化的效果。另外，亲水处理后的支撑膜需要保存在水中并于一小时之内使用，否则支撑膜的表面将恢复原有的疏水性质。这些因素在一定程度上制约了支撑膜的使用。

总之，选择一种良好的透射电子显微镜样品支撑膜是目前纳米材料的透射电子显微镜观察研究中亟待解决的问题，这种支撑膜需要具有连续的表面、可用于搭载纳米颗粒或生物分子，要具有超薄的厚度、能够不对材料的观察造成明显的背底干扰，要有较强的机械强度、能够在高能电子束下长时间的稳定存在，并且最好能够具有亲水的表面性质、能够对水溶性材料有良好的分散效果。同时，这种支撑膜应该制备方法简单、成本低廉，适于产品的大规模工业生产。

发明内容

本发明提供一种透射电子显微镜样品支撑膜，这种支撑膜需要具有连续的表面、可用于搭载纳米颗粒或生物分子，要具有超薄的厚度、能够不对材料的观察造成明显的背底干扰，要有较强的机械强度、能够在高能电子束下长时间的稳定存在，并且最好能够具有亲水的表面性质、能够对水溶性材料有良好的分散效果；同时，这种支撑膜应该制备方法简单、成本低廉，适于产品的大规模工业生产。

本发明还提供透射电子显微镜样品的制作方法，以上述透射电子显微镜样品支撑膜作为样品支撑膜。

所述透射电子显微镜样品支撑膜，由多孔微栅支持膜基底和覆于基底上的单层氧化石墨烯薄膜组成，单层氧化石墨烯薄膜的覆盖密度为0.7×10^-6～14×10^-6mg/mm²多孔微栅，优选为0.7×10^-6～3.5×10^-6mg/mm²。

所述透射电子显微镜样品支撑膜的制备方法为：以氧化石墨烯纳米片的水溶液为原料，以多孔微栅支持膜为基底，用溶液浇铸法制备得到单层氧化石墨烯薄膜，作为透射电子显微镜样品支撑膜，在氧化石墨烯纳米片的水溶液中，氧化石墨烯以完全分离的单层纳米片的形式存在，浓度为1～20mg/L，优选为1～5mg/L。

所述氧化石墨烯水溶液的制备方法优选为：取1～6g石墨粉，与2～10g硝酸钠混合，在搅拌状态下，缓慢倒入100～300ml浓硫酸，持续搅拌1～3小时令试剂混合均匀，在冰浴条件下，2～6小时内分批次缓慢加入10～30g高锰酸钾，之后保持在冰浴中继续搅拌5～15小时；然后撤走冰浴装置，在25～45℃水浴条件下恒温搅拌5～15小时至反应完全；缓慢加入温水200～500ml，使体系的温度不高于50℃，然后搅拌5～15小时；继续加入25～45℃的温水，定容至600～1200ml，再缓慢滴入双氧水反应掉剩余的高锰酸钾，至溶液不再变色为止，溶液最终变成亮黄褐色，即获得氧化石墨溶液；将反应生成的氧化石墨溶液清洗、除杂后配制成氧化石墨浓度为0.5～3.0mg/ml的溶液，超声处理10～60分钟令氧化石墨片完全分散成单层，最后加水稀释得到氧化石墨烯溶液。优选氧化过程(从加入高锰酸钾开始至“然后撤走冰浴装置，在25～45℃水浴条件下恒温搅拌5～15小时至反应完全”)被限制在1天的时间范围内。所述石墨粉优选为50～500目的粉末。

本发明利用改进的Hummers的方法，将石墨粉末氧化成氧化石墨，充分清洗后配制成0.5～3.0mg/ml的溶液，超声处理10～60分钟令氧化石墨片完全分散成单层的氧化石墨烯纳米片。将氧化石墨烯纳米片溶液稀释后作为薄膜制备的母液使用。

采用溶液浇铸法制备单层氧化石墨烯薄膜。抽取一定体积的母液，滴到多孔微栅的表面，置于容器中令溶剂缓慢挥发。随着溶剂的挥发，氧化石墨烯纳米片将部分的覆盖住微栅的孔，形成单层的薄膜。

利用低倍透射电子显微镜观察所获得的单层氧化石墨烯薄膜的形貌。多孔微栅中孔被单层氧化石墨烯薄膜覆盖的比率(以下简称孔的覆盖率)为40～80％，单层氧化石墨烯薄膜中的纳米片以单层或边缘部位搭载交叠的形式存在。单层氧化石墨烯薄膜的覆盖密度(即“纳米片的数量”)会影响支撑膜的质量，太少了孔的覆盖率太低，太多了又会造成纳米片的叠合、单层区域变少，制备透射电子显微镜样品后，这两种情况都不容易寻找到合适的、足够的观察区域。

利用目前普遍使用的“超薄碳膜样品支撑膜”作为对比参照，来观察该种单层氧化石墨烯薄膜作为透射电子显微镜样品搭载膜的应用效果。所述样品优选为水溶性纳米颗粒。将纳米颗粒分别铺展在两种支撑膜的表面，置于透射电子显微镜下观察。与传统的超薄碳膜相比，单层氧化石墨烯薄膜由于其具有亲水的表面性质，而获得了更好的样品分散效果。

利用目前普遍使用的“超薄碳膜样品支撑膜”作为对比参照，来观察该种单层氧化石墨烯薄膜作为透射电子显微镜样品搭载膜的应用效果。所述样品优选为单壁碳纳米管。将单壁碳纳米管分别铺展在两种支撑膜的表面，置于透射电子显微镜下观察。与传统的超薄碳膜相比，单层氧化石墨烯薄膜由于其特有的石墨烯单晶骨架，因而具有更好的稳定性，能够在高能电子束下稳定的存在。

利用目前普遍使用的“超薄碳膜样品支撑膜”作为对比参照，来观察该种单层氧化石墨烯薄膜作为透射电子显微镜样品搭载膜的应用效果。所述样品优选为单壁碳纳米管。将单壁碳纳米管分别铺展在两种支撑膜的表面，置于透射电子显微镜下观察，引入“衬度率”的概念来定量的比较两种支撑膜对样品观察的干扰程度。与传统的超薄碳膜相比，单层氧化石墨烯薄膜由于其超薄的厚度，将对样品的观察带来更小的背底干扰，因而在获得的材料的透射电子显微镜照片中，可以获得更好的对比度和衬度效果。

本发明的有益效果是，设计和制备了一种新的单层氧化石墨烯透射电子显微镜样品支撑膜，它具有比传统的碳支持膜更薄的厚度、更强的机械强度和更好的材料分散效果；用它作为支撑膜来搭载材料进行材料的透射电子显微镜观察，可以获得更高的分辨率和清晰度，得到更好的观察效果；并且它的制备方法简单，成本低廉，具有极强的实际应用价值。

附图说明

图1是目前常用的几种透射电子显微镜样品支持膜的结构示意图：(a)金属网格、(b)碳支持膜和(c)多孔微栅。

图2单层氧化石墨烯透射电子显微镜样品支撑膜示意图。

图3是石墨与氧化石墨的X射线粉末衍射图谱。

图4是分散在硅基底上的单层氧化石墨烯纳米片的原子力显微镜扫描图。

图5是氧化石墨烯样品支撑膜的低倍透射电子显微镜照片，图中的(A)、(B)、(C)三类区域分别代表着多孔微栅的孔被氧化石墨烯纳米片“完全覆盖”、“未覆盖”、及“部分覆盖”的情况。

图6是以单层氧化石墨烯样品支撑膜作为搭载制备的、(a)纳米颗粒及(b)碳纳米管两种样品的透射电子显微镜照片，两张照片皆取于多孔微栅中孔的边缘位置。

图7是分别以(a)超薄碳膜及(b)单层氧化石墨烯样品支撑膜两种薄膜作为搭载、采用相同的样品制备方法制备的纳米颗粒样品、在相同放大倍数下的透射电子显微镜照片。

图8是分别以(a)超薄碳膜及(b)单层氧化石墨烯样品支撑膜两种薄膜为搭载制备的、纳米颗粒样品的高分辨透射电子显微镜照片。相比较于照片(a)而言，从照片(b)中可以得到更多的纳米颗粒晶格结构信息；图中可分辨的晶格周期约为0.24纳米。

图9中(a)与(b)分别是以“超薄碳膜”及“单层氧化石墨烯样品支撑膜”两种薄膜为搭载制备的、单壁碳纳米管样品的透射电子显微镜照片，两张照片皆取于搭载膜的边缘位置；照片中分布于碳管上的深色斑点是金属铁颗粒，它们在碳管合成过程中起到催化作用。(c)和(d)分别是照片(a)和(b)中、以矩形标出的两个区域的强度积分后再平均的强度分布图。其中，x轴代表的方向与碳管方向垂直；积分方向与碳管方向平行；积分范围即为(a)、(b)中的矩形标注区域。在图(c)和(d)中，左边起伏的峰值、谷值分别代表了单壁碳纳米管的管壁和空腔的强度，右边的平台代表了背底(孔或支撑膜)的强度；相邻两个峰值之间的距离可以认为是单壁碳管的直径，约为0.7纳米，在图中以箭头标注。其中，(A)为悬于孔上的碳纳米管；(B)为超薄碳膜上的碳纳米管；(C)为悬于孔上的碳纳米管；(D)为氧化石墨烯支撑膜上的碳纳米管。

具体实施方式

1.单层氧化石墨烯样品支撑膜的制备

1.1氧化石墨烯的合成

1.1.1石墨的氧化

石墨的氧化采用改进的Hummers方法，为了保证所获得的氧化石墨烯保持一定的电导性，氧化过程被限制在两天以内。作为原料的石墨是325目的粉末，纯度为99.9995％，购于Alfa Aesar公司，高锰酸钾、硝酸钠、浓硫酸、盐酸、双氧水等化学试剂购于南京化学试剂公司。

取2g石墨粉，与3.75g硝酸钠混合后置于大烧杯中；安装电动搅拌器，在之后的整个氧化过程中保持搅拌器持续工作。缓慢倒入170mL浓硫酸，持续搅拌2小时令试剂混合均匀。

将烧杯置于冰浴中，分批次缓慢加入高锰酸钾，共22g，整个过程持续时间为4小时，之后保持在冰浴中继续搅拌8小时；撤走冰浴装置，将烧杯置于水浴中35℃下恒温搅拌12小时，至氧化反应完全进行，此时体系变为褐色粘稠混合物。

缓慢加入25～45℃的温水345mL，这是一个剧烈的放热过程，因此要缓慢和小心的进行，以保证体系的温度始终不高于50℃。搅拌12小时，待体系稳定后继续加入温水，定容至800ml。最后缓慢滴入双氧水反应掉剩余的高锰酸钾，至溶液不再变色为止(约10ml)，溶液最终变成亮黄褐色，即获得氧化石墨溶液。

1.1.2氧化石墨的清洗

将反应生成的氧化石墨溶液用10％的盐酸和超纯水依次清洗，重复5遍以上。之后置于8k～14k的透析袋中透析3天以上，去掉溶液中的杂质离子，可获得较干净的氧化石墨。

1.1.3氧化石墨烯的获得

测定制得的氧化石墨溶液的质量分数，在此基础上，配置2.0mg/ml的溶液，超声处理20分钟令石墨片完全分散成单层。将溶液稀释至3.15mg/L，作为母液用于氧化石墨烯薄膜的制备。

1.2单层氧化石墨烯薄膜的制备

作为基底的多孔微栅购于北京新兴百瑞公司，直径3mm。用微升进样器量取5μl母液，滴到多孔微栅支持膜的表面，将其置于室温环境下5小时以上令溶剂完全挥发，氧化石墨烯纳米片将部分的覆盖住微栅的孔，获得单层氧化石墨烯薄膜。

2.单层氧化石墨烯薄膜的形貌表征

2.1表征手段

氧化石墨烯的单层结构是利用X射线粉末衍射和原子力显微镜判定的，所用仪器分别为德国Bruker公司D8Advance X射线衍射仪和NanoScope IIIa-D3000原子力显微镜。

氧化石墨烯的电导率是利用四电极法测得的。

单层氧化石墨烯薄膜的形貌是利用JEOL JEM2010透射电子显微镜观察的，工作电压为200kV。

分别以“超薄碳膜”和“单层氧化石墨烯样品支撑膜”两种薄膜为搭载进行的、纳米材料的透射电子显微镜观察对照实验，是在JEOL JEM2010透射电子显微镜上完成的；所选用的纳米材料为：直径约3纳米的水溶性碲化镉纳米颗粒和单壁碳纳米管。

2.2表征结果及分析

2.2.1氧化石墨烯的单层结构表征

为了证明氧化石墨的成分，我们进行了X射线粉末衍射实验。图3是氧化前后石墨的X射线粉末衍射曲线。原始的石墨晶体在～26°尖锐的衍射峰对应着Z方向层状结构的周期为氧化以后，这一特征峰完全消失，同时在～12°出现了一个较宽的峰，对应周期约为这与文献中关于氧化石墨的报导是一致的，意味着石墨层间修饰的氧化功能团的出现。图4是AFM下对分散到硅片表面的氧化石墨片的厚度的测量，约为0.71nm，这与X射线粉末衍射中氧化石墨层状结构的周期是一致的，可见氧化石墨片获得了完全的分离。

2.2.2氧化石墨烯的电导率

我们在硅片上制备了厚度约2μm的氧化石墨薄膜，利用四电极法测得薄膜的电导率约为1.2Ωm。

氧化石墨烯之所以能够保持一定的电导性，是因为其制备过程中受到时间制约的氧化过程。这一氧化过程既保证了在每一层石墨片上都能修饰上氧化功能团、使获得的氧化石墨能够在水溶液中分散为完全分离的单层纳米片；又保证了氧化石墨烯纳米片上所修饰的氧化功能团的数密度、使其能够保持一定的电导性。

2.2.3单层氧化石墨烯薄膜的形貌

图5是低倍透射电子显微镜下观察到的单层氧化石墨烯薄膜的形貌，图中的圆形轮廓是多孔微栅的孔。根据亮度和对比度的不同，这些孔可以分为(A)、(B)、(C)三种区域，分别代表了多孔微栅表面被氧化石墨烯纳米片“完全覆盖”、“未覆盖”和“部分覆盖”的孔。统计不同区域，孔的覆盖率为40％～80％，平均达到了60％左右。

图6是以单层氧化石墨烯样品支撑膜为搭载制备的、纳米颗粒和碳纳米管两种材料的透射电子显微镜样品。虽然单片氧化石墨烯纳米片的尺寸只有几百个纳米，但相邻纳米片之间的互搭、交叠保证了它们可以盖在这些微米尺寸的孔上。

3.功能检测及应用实例

3.1传统“超薄碳膜”与“单层氧化石墨烯样品支撑膜”的对照实验

图7中(a)和(b)分别是以传统的“超薄碳膜”与我们的“单层氧化石墨烯样品支撑膜”为搭载制备的、水溶性碲化镉纳米颗粒样品的透射电子显微镜照片。从图中明显可以看出，与照片(a)相比，照片(b)中的颗粒分散效果更好。这是由于氧化石墨烯具有亲水的表面性质，对于水溶性的材料(包括生物分子等)，能获得比疏水的超薄碳膜更好的样品分散效果。

图8中(a)和(b)是两种样品的高分辨透射电子显微镜照片。在相同的观察条件和放大倍数下，以单层氧化石墨烯薄膜为搭载制备的透射电子显微镜样品，可以清晰地分辨出周期约为0.24纳米的碲化镉颗粒的晶格结构；与之相比，以超薄碳膜为搭载制备的样品，只能勉强分辨出颗粒的存在。

在整个实验观察过程中，氧化石墨烯薄膜能够在透射电子显微镜的高能电子束照射下稳定的存在；而与之相比，超薄碳膜的稳定性则差的多，同一区域持续照射约10秒钟左右即会发生破损和卷曲，影响样品的实验观察。氧化石墨烯薄膜在高能电子束照射下的稳定性，一方面是源于其结构中石墨单晶骨架良好的机械强度，另一方面是由于它保持了一定的电导性，而这些性质，以无定形碳为原料制备而成的超薄碳膜是不具备的。

3.2单层氧化石墨烯样品支撑膜对透射电镜照片衬度改进的量化统计

为了定量的统计我们以“单层氧化石墨烯薄膜”作为纳米材料的透射电镜样品支撑膜、比传统超薄碳膜的改进程度，我们进入了“衬度率”这一概念。我们分别以这两种薄膜为搭载，制备了单壁碳纳米管的透射电镜样品，在相同的条件下观察比较。

由于图片皆有其自身的对比度，我们不能把两张图片的亮度或者信噪比直接拿来比较。一张图片的“衬度率”定义为，它是一张图片内两种衬度的比值，一种是“搭载在支撑膜上的样品”与“支撑膜”之间的衬度，另一种是“悬空”的样品与“真空”区域之间的衬度。这意味着“衬度率”仅反映了“支撑膜”对“样品”信号的干扰程度，而与图片自身的亮度等参数无关。

图9中(a)和(b)分别是制备在超薄碳膜和单层氧化石墨烯支撑膜上的碳纳米管样品在透射电镜下的照片，照片取于膜的边缘位置；(c)和(d)分别是(a)和(b)的强度积分(之后再做平均)的分布图，用于之后的“衬度率”的计算。其中，x轴代表的方向与碳管方向垂直；积分方向与碳管方向平行；积分范围即为(a)、(b)中的矩形标注区域。在图(c)和(d)中，左边起伏的峰值、谷值分别代表了单壁碳纳米管的管壁和空腔的强度，右边的平台代表了背底(孔或支撑膜)的强度；相邻两个峰值之间的距离可以认为是单壁碳管的直径，约为0.7纳米，在图中以箭头标注。

图(a)衬度率的计算，是根据(c)中的强度值进行的。(支撑膜上碳管壁的强度值-支撑膜的强度值)/(悬空的碳管壁的强度值-真空的强度值)，结果即为超薄碳膜表面碳管的衬度率，约为0.66。

相同的方法可以算出图(b)的衬度率，得到单层氧化石墨烯样品支撑膜表面碳管的衬度率，约为0.87，比超薄碳膜高的多。可见，单层氧化石墨烯样品支撑膜在纳米材料的透射电镜观察中造成的背底干扰，比传统的超薄碳膜低得多，这是由于单层氧化石墨烯纳米片的厚度仅有0.7纳米，比超薄碳膜(3～5纳米)薄得多。