一种用于制备抗肿瘤药物的大戟科大戟属植物提取物的制备方法

摘要

本发明涉及一种从大戟科大戟属植物中提取用于制备抗肿瘤药物的大戟科大戟属植物提取物的方法。它依次包括如下工艺步骤：原料粉碎→回流提取→减压浓缩→萃取→反萃取→碱水解→调节pH至7→减压浓缩→硅胶柱层析→石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱→浓缩→结晶→干燥。本方法采用工业易得的分离材料和试剂，生产可达产业化规模，产品质量高。含量可达99.9％以上，进入国际市场竞争力强。

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药提取方法，具体涉及一种用于制备抗肿瘤药物的大戟科大戟属植物提取物的制备方法，特别是一种高纯度大戟二萜醇的制备方法。

背景技术

肿瘤(tumor，neoplasm)是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致克隆性异常增生而形成新的生物。自20世纪70年代以来，我国的恶性肿瘤发病率及死亡率一直呈上升的趋势。但近年来，国外的一些主要肿瘤的发病率和死亡率开始出现下降趋势，这主要归功于医学的不断研究和进展。

澳大利亚的Peplin Biotech Ltd和Queensland Institute of Medical Research联合从大戟科大戟属植物(Euphorbia peplus)中分离筛选出的天然化合物ingenol-3-angelate有显著抗肿瘤活性，作用机制是促进蛋白激酶(PKC)的活性，其II期临床对皮肤癌的治愈率大于90％，2010年3月，丹麦LEO Pharma公布的III期临床的结果也显示取得预期良好效果。

国内天然产物的同仁也从事大戟科大戟属植物提取物，尤其是大戟二萜醇衍生物的抗肿瘤活性。大戟二萜醇(ingenol)，它的结构新奇复杂，属四环二萜。以ingenol为母核的系列衍生物具有显著抗癌、抗病毒的活性。国内外医药工作者对其系列衍生物做过大量深入的工作，并取得不少成就。

2003年沈阳药科大学姚新生等从甘遂(Euphorbia kansui)的根中分离了4个ingenol衍生物，活性试验表明它们均具显著抗肿瘤活性。2008年中国科学院上海药物研究所果德安等人从乳浆大戟(euphorbia esula)的全草中分得16个ingenol衍生物都具抗肿瘤活性。

自ingenol衍生物的显著活性被发现以来，以ingenol及其作为母核的系列化合物持续受到世界医药研究人员的高度重视。他们围绕这类化合物做过大量而深入的研究，在国际著名期刊上发表论文120多篇。现在虽然已经有ingneol通过化学方法合成的报道，但是由于其新奇复杂的结构，其全合成的成本一直无法降低，使得ingenol一直是价格高昂的化合物，严重影响到其衍生物的研究和应用。

千金子是大戟科Euphorbiaceae大戟属Euphorbia植物续随子(Euphorbia lathyris)的成熟种子，是一种毒性中药，收载于《中国药典》中。千金子富含40-50％的脂肪油，国内一直作为能源植物在研究。在ingenol未能全合成以前，为了满足合成其衍生物的需要，千金子一直被用作制备ingenol的原料。虽然Giovanni Appendino等于1999年报道过ingenol的制备工艺(J.Nat.Prod.1999.62，76-79)，但是由于其用到价格昂贵的环己烷以及剧毒化学品氰化钾，这样严重限制了其应用推广。

发明内容

本发明是在ingenol全合成的工艺尚不成熟、成本居高不下的前提下进行的，本发明的目的在于克服现有技术中的不足而提供一种节约成本，降低药品价格，提高收率的从大戟科大戟属植物中提取大戟二萜醇的工艺。

本发明的目的是这样来实现的，它的工艺步骤如下：

a)原料粉碎：取大戟科大戟属植物，粉碎成颗粒状；

b)回流提取：取上述粉碎后的原料1重量份，用按体积比80％-100％的溶剂进行回流提取，所述溶剂为甲醇、乙醇或其混合物；

c)减压浓缩：将提取液合并后抽入浓缩罐中进行减压浓缩成浸膏，冷却；

d)萃取：在浸膏中加入石油醚进行萃取，将上层石油醚，从下层的水及不溶性固体中分离；

e)反萃取：收集石油醚液，置于萃取罐中，加入乙腈后，搅拌5分钟静置分层，放出下层乙腈萃取液，然后按照相同操作，再反萃取2次，将3次萃取的乙腈合并；

f)减压浓缩：将乙腈萃取液减压回收至稠膏；

g)碱水解：将上述稠膏溶解于甲醇中获得样品溶液，加入碱水解0-48小时；

h)中和：在上述碱水解液加入盐酸调节PH至7；

i)减压浓缩：将中和后的溶液减压回收至浸膏状；

j)硅胶层析：将上述浸膏跟硅胶重量比1∶1拌样，烘干后进行硅胶柱层析，用石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1洗脱除杂后，用乙酸乙酯洗脱得乙酸乙酯洗脱部位；

k)结晶纯化：将上述乙酸乙酯洗脱部位减压浓缩后，放置于冰箱-20-5℃条件下0-48小时，析出结晶得所述大戟科大戟属植物提取物。

其中，

步骤a)中的大戟科大戟属植物优选为千金子、甘遂；

步骤b)中回流提取的溶剂优选为甲醇或95％乙醇，回流提取的次数为3次，第一次加入5重量份的溶剂回流提取2小时，第二次加入4重量份的溶剂回流提取1.5小时，第三次加入4重量份的溶剂回流提取1.5小时；

步骤d)中加入的石油醚为0.5重量份；

步骤e)中加入的乙腈的体积为石油醚体积的1/3；

步骤g)中样品溶液的浓度为0.1g/ml；

步骤g)中加入的碱是氢氧化钠、强氧化钾、甲醇钠、乙醇钠，优选为氢氧化钠和甲醇钠，加入碱后，碱的浓度为0.1-0.5M；

步骤g)碱水解为加入0.25M的氢氧化钠30℃水解24小时或0.2M的甲醇钠25℃水解24小时；

步骤k)结晶的条件为-15℃放置24小时。

经过HPLC、红外(IR)、炭(¹³C-NMR)谱和氢(¹H-NMR)谱检测和鉴定，上述方法所制备的大戟科大戟属植物提取物为高纯度的大戟二萜醇(ingenol)。

含量测定照中国药典高效液相色谱法(附录VID)测定。

色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水(53∶47)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按ingenol峰计算应不低于1000。

本发明优选采用千金子和甘遂两种植物作为提取来源的优点在于：这两种植物都是国内已经广泛种植的药用植物，且两种都是《中国药典》收载的品种，这有助于持续、稳定、大量得到原料，从源头上保证了ingenol的持续、稳定、大量供应，不至于因ingenol的大量需求导致资源的掠夺式采收而破坏自然生态环境。

本发明的优点和创新点在于：

(1)、本发明用价格低廉易得的石油醚，代替现有技术中采用的价格昂贵的环己烷，在能达到良好萃取分离效果的同时，大大降低生产成本。

(2)、本发明用价格低廉易得的氢氧化钠和甲醇钠代替工业几乎无法获得的剧毒化学品氰化钾，在能达到较好水解效果的同时，使工业化生产成为可能，并大大降低生产成本。

(3)、原有工艺碱水解的时间为7天，本发明采用氢氧化钠和甲醇钠，使碱水解的时间 缩短为1天以内，大大缩短ingenol生产的周期。

(4)、本发明采用乙酸乙酯重结晶，可借助结晶办法除去经过硅胶柱层析后仍然残存的烯烃醇等脂溶性杂质，产品纯度可达99.9％以上。

附图说明

图1大戟二萜醇的结构式图；

图2经本发明所得到的大戟二萜醇的HPLC谱图；

图3经本发明所得到的大戟二萜醇的IR谱图；

图4经本发明所得到的大戟二萜醇的¹H-NMR谱图；

图5经本发明所得到的大戟二萜醇的¹³C-NMR谱图；

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明：

实施例1

a)选取千金子100kg，粉碎成颗粒状。

b)回流提取：将上述粉碎后的植物颗粒，用甲醇回流提取3次。第一次加入甲醇600L回流提取2小时，第二次加入500L回流提取1.5小时，第三次加入500L回流提取1.5小时，

c)减压浓缩：将上述三次提取液合并后抽入浓缩罐中进行减压浓缩至稀膏状，放出冷却。

d)萃取：加入60L石油醚萃取上述稀膏状。将上层石油醚，从下层的水及不溶性固体中分离。

e)反萃取：收集上述石油醚液，放置于萃取罐中，加入20L乙腈后，搅拌5分钟静置分层，放出下层乙腈萃取液，然后按照相同操作，再反萃取2次，将3次萃取的乙腈合并。

f)减压浓缩：将乙腈萃取液减压回收至浸膏状。

g)碱水解：将上述样品溶解于40L甲醇中，加入氢氧化钠400g。温度30摄氏度水解24小时。

h)中和：上述碱水解液加入盐酸约550ml调节PH至7

i)减压浓缩：将调节调节PH至7的甲醇溶液减压回收至浸膏状。

j)硅胶层析：将上述浸膏跟600g硅胶拌样，烘干后，加入下层装有3kg硅胶的层析柱中进行层析分离，用石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1洗脱除杂后，改用乙酸乙酯洗脱得到目标化合物大戟二萜醇。

k)结晶：将上述乙酸乙酯部位减压浓缩后冰箱-5摄氏度放置24小时，结晶析出大戟二萜醇18g，经高效液相检测含量达到99.9％以上。

实施例2

a)选取甘遂100kg，粉碎成颗粒状。

b)回流提取：将上述粉碎后的植物颗粒，用甲醇回流提取3次。第一次加入500L回流提取2小时，第二次加入400L回流提取1.5小时，第三次加入400L回流提取1.5小时，

c)减压浓缩：将上述三次提取液合并后抽入浓缩罐中进行减压浓缩至稀膏状，放出冷却。

d)萃取：加入50L石油醚萃取上述稀膏状。将上层石油醚，从下层的水及不溶性固体中分离。

e)反萃取：收集上述石油醚液，置于萃取罐中，加入16L乙腈后，搅拌5分钟静置分层，放出下层乙腈萃取液，然后按照相同操作，再反萃取2次，将3次萃取的乙腈合并。

f)减压浓缩：将乙腈萃取液减压回收至浸膏状。

g)碱水解：将上述样品溶解于40L甲醇中，加入甲醇钠216g。温度30摄氏度水解24小时。

h)中和：上述碱水解液加入盐酸约30ml调节PH至7

i)减压浓缩：将调节调节PH至7的甲醇溶液减压回收至浸膏状。

j)硅胶层析：将上述浸膏跟500g硅胶拌样，烘干后，加入下层装有2.5kg硅胶的层析柱中进行层析分离，用石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1洗脱除杂后，改用乙酸乙酯洗脱得到目标化合物大戟二萜醇。

k)结晶：将上述乙酸乙酯部位减压浓缩后冰箱-5摄氏度放置24小时，结晶析出大戟二萜醇15g，经高效液相检测含量达到99.9％以上。

实施例3

a)选取千金子100kg，粉碎成颗粒状。

b)回流提取：将上述粉碎后的植物颗粒，用95％乙醇回流提取3次。第一次加入600L回流提取2小时，第二次加入500L回流提取1.5小时，第三次加入500L回流提取1.5小时，

c)减压浓缩：将上述三次提取液合并后抽入浓缩罐中进行减压浓缩至稀膏状，放出冷却。

d)萃取：加入60L石油醚萃取上述稀膏状。将上层石油醚，从下层的水及不溶性固体中分离。

e)反萃取：收集上述石油醚液，置于萃取罐中，加入20L乙腈后，搅拌5分钟静置分层，放出下层乙腈萃取液，然后按照相同操作，再反萃取2次，将3次萃取的乙腈合并。

f)减压浓缩：将乙腈萃取液减压回收至浸膏状。

g)碱水解：将上述样品溶解于50L甲醇中，加入乙醇钠350g。温度30摄氏度水解24小时。

h)中和：上述碱水解液加入盐酸约38ml调节PH至7

i)减压浓缩：将调节调节PH至7的甲醇溶液减压回收至浸膏状。

j)硅胶层析：将上述浸膏跟450g硅胶拌样，烘干后，加入下层装有2.5kg硅胶的层析柱中进行层析分离，用石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1洗脱除杂后，改用乙酸乙酯洗脱得到目标化合物大戟二萜醇。

k)结晶：将上述乙酸乙酯部位减压浓缩后冰箱-20摄氏度放置24小时，结晶析出大戟二萜醇17g，经高效液相检测含量达到99.9％以上。