通过酶促水解及随后的化学/酶促酯化生产生物柴油

摘要

通过酶促水解油或脂肪然后化学/酶促酯化在水解步骤中所产生的游离脂肪酸来生产生物柴油的方法。该方法包括将甘油三酯酶促水解以形成脂肪酸和甘油；以及用所述脂肪酸将低级醇酯化以形成生物柴油。

说明书

发明背景

生物柴油(长链脂肪酸的烷基酯)是通过天然甘油三酯(如植物油，动物脂)与通常为甲醇的低分子量醇进行酯交换而合成的环保燃料。生物柴油在工业上是通过使用强碱作为催化剂的化学催化来生产的(参见Connemann J and Krallmann A.，Process for the continuous production of lower alkyl esters of higher fatty acid(连续生产高级脂肪酸的低级烷基酯的方法).，美国专利5,354,878号；Hanna MA，Transesterification process for production of Biodiesel(生产生物柴油的酯交换方法)，美国专利公开2003/0032826 A1；Lee JH，One-stage process for feed and Biodiesel and Lubricant oil(用于饲料和生物柴油及润滑油的一步法)，美国专利公开2004/0022929 A1)。然而，强碱方法有一些缺点，例如难以回收甘油，需要从产物除去碱催化剂以及处理碱性废水。此外，原料必须符合严格的规格(参见Lotero E.et al.，Ind.Eng.Chem.Res.Rev，44：5353-5363(2005))。例如，原料必须基本上无水并且FFA含量不能超过0.5wt％。杂质的存在会使得碱方法产生皂，从而增加粘度。高粘度会导致在下游分离中的困难，从而严重妨碍燃料级生物柴油的生产。为了满足上述的原料规格要求，需要使用高度精炼的植物油，其价格可以占到生物柴油最终成本的60-75％(参见Lotero E.et al.，Ind.Eng.Chem.Res.Rev，44：5353-5363(2005))。此外，精炼过程(250℃和1-3mmHg)破坏了抗氧化剂(维生素E和胡萝卜素)，从而降低了生物柴油的氧化稳定性。

碱方法的上述缺点使得研究者寻求可以降低难度并减少成本的催化和加工的替代选择。基于酸催化反应的方法具有实现这一目的的潜力，因为酸催化剂对FFA较不敏感，并且可以同时催化酯化和酯交换。然而，液体酸催化的酯交换方法在商业应用上并不像其对应的碱催化反应一样普及。液体酸催化反应比液体碱催化反应慢很多的这一事实是主要原因之一(参见Srivastava A and Prasad R.，Renewable Sustainable Energy Rev.，4：111-133(2000))。虽然反应速率可以通过提高温度来增加，但是在高温和高压下可能发生诸如醇醚化的副反应。此外，液体催化剂导致严重的污染问题，这使得必须进行良好的分离和产品纯化流程。为了减少分离和纯化的问题，已报道了固体酸催化剂，但是该方法仍然需要高反应温度和压力。例如，活化的蒙脱石KSF在220℃和52巴下表现出的转化率为100％(参见Lotero E.et al.，Ind.Eng.Chem.Res.Rev，44：5353-5363(2005))。研究了使用大孔树脂15(Amberlyst 15)的酯化和酯交换反应。虽然大孔树脂对于羧酸的酯化具有很高的活性，但是其对于油或脂肪的酯交换的活性非常低，而且需要温和的反应条件以避免催化剂的降解。在相对较低的温度(60℃)下，当反应在大气压下进行并且甲醇和油的起始摩尔比为6∶1时，葵花籽油的转化率据报道仅为0.7％(参见Vicente G et al.，Ind.Crops Products，8：29-35(1998))。

利用脂酶的酶促酯交换对于生物柴油燃料生产更有吸引力，因为可以容易地回收作为副产物而产生的甘油，并且易于完成脂肪酸甲酯的纯化。已证实利用酶(如固定的南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂酶)来进行植物油的甲醇分解可以用于生产生物柴油(参见美国专利5,713,965号；Shimada，Y.et al.J.Am.Oil Chem.Soc.1999，76，789；Nelson，L.A.et al.J.Am.Oil Chem.Soc.1996，73，1191)。然而，低级醇(如甲醇)容易使酶中毒，从而导致酶活性降低；或者副产物吸附在酶表面而阻断底物到达酶的活性位点，从而抑制酶活性。

因为前述原因，需要开发有效的且经济可行的方法，使用诸如含有大量水和FFA的粗棕榈油(CPO)的低成本原料来生产生物柴油。该方法应当提供使得催化剂(化学催化剂或酶)可再循环，并对水、FFA和甲醇较不敏感的系统。本发明满足了这些和其他需求。

发明概述

本发明提供了通过酶催化水解然后酯化来从油或脂肪生产生物柴油的尤其高效的方法。在某些实施方案中，该方法需要温和的反应条件，并且使用低成本的原料，例如含有大量水和游离脂肪酸的粗棕榈油(“CPO”)。本文所述的方法减少了与商业上所用的碱催化方法相关的问题。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了生产生物柴油的方法，该方法包括：

将甘油三酯酶促水解以形成脂肪酸和甘油；以及

用所述脂肪酸将低级醇酯化从而形成生物柴油。

在某些方面，所述酯化步骤是化学催化或酶促催化的。例如，在一个实施方案中，所述脂肪酸的化学酯化包括：

将脂肪酸与醇和酸催化剂混合；以及

将混合物在足够的温度下孵育足够的时间以形成生物柴油。

在其他方面，所述脂肪酸的酶促酯化包括：

将脂肪酸与醇和脂酶混合；以及

将混合物在足够的温度下孵育足够的时间以形成生物柴油。

与现有技术相比，本发明的方法使得产量更高、催化剂回收更容易并且产品分离更简单。通过下文的发明详述和附图，上述和其它目的、方面以及实施方案会更显而易见。

附图说明

图1示出本发明的实施方案。

图2示出本发明的实施方案。

图3A-B示出脱胶CPO水解前(A)和水解后(B)样品的UV光谱。

图4A-B示出棕榈脂肪酸酯化前(A)和酯化后(B)样品的UV光谱。

图5示出在缓冲液中不同脂酶浓度下的CPO水解。反应条件：CPO2g，脂酶溶液2ml，振荡速度250rpm，温度40℃。

图6示出脱胶CPO在不同温度下的水解反应。反应条件：CPO 2g，脂酶溶液(1mg/ml)2ml，振荡速度250rpm。

图7示出脱胶CPO在不同缓冲液与油比例(v/v)下的水解反应。反应条件：CPO 2g，脂酶2mg，振荡速度250rpm，温度40℃。

图8示出异辛烷中大孔树脂15催化的棕榈FFA的甲基和乙基酯化。反应条件：10ml原料(异辛烷中的FA，0.32M)，1g大孔树脂15，温度60℃，400％化学计量的甲醇或乙醇，250rpm振荡。

图9示出Novozym 435催化的棕榈FFA的甲基和乙基酯化。反应条件：10ml原料(异辛烷中的FFA，0.32M))，0.04g Novozym 435[15？]，温度40℃，120％化学计量的甲醇或乙醇，250rpm振荡。

图10示出Novozym 435催化与大孔树脂15催化的棕榈FFA甲基酯化的比较。

图11示出本发明的一个实施方案中大孔树脂15(A)和Novozym435(B)重复使用的结果。

图12示出本发明的实施方案中脱胶CPO的酶促水解以及大孔树脂15或Novozym 435催化的酯化的结果，这提供了良好的产率(98-99％)。

发明详述

I.定义

本文所用的术语“低级烷基”包括C₁至C₆的饱和直链、支链或环化烃，并且特别地包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基，、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基和2，3-二甲基丁基。

本文所用的术语“醇”包括含有一个或多个羟基的烃类化合物，并且包括例如以下的醇：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环戊醇、异戊醇、新戊醇、己醇、异己醇、环己醇、3-甲基戊醇、2，2-二甲基丁醇、2，3-二甲基丁醇，以及它们的异构体。

本文所用的术语“油(oil)”或“油(oils)”包括植物油或脂肪、动物油或脂肪、海产油或脂肪、微生物来源的油或脂肪、废弃油或润滑脂、提炼产品(rendered product)或它们的任何混合物。

本文所用的术语“提炼产品”包括通常通过加热处理来除去水、固体和其他杂质的脂肪。

本文所用的术语“生物柴油”包括用作运输和发电燃料或添加剂的脂肪酸烷基酯。

本文所用的术语“原料”包括粗棕榈油；或者任何油或脂肪，其来源于任何植物油或脂肪、动物油或脂肪、海产油或脂肪、微生物来源的油和人工或合成的甘油酯；以及来自上述材料的加工过程的废弃物、废水和残留物。

本文所用的术语“植物油”包括来自诸如农作物和林产品的植物来源的脂肪、油或脂类，以及来自诸如皂脚的上述材料加工过程的废弃物、废水和残留物。

本文所用的术语“动物油”包括来自动物来源的脂肪、油或脂类，以及来自上述材料加工过程的废弃物、废水和残留物。

本文所用的术语“海产油”包括来自水流中海产来源的脂肪、油或脂类，以及来自上述材料加工过程的废弃物、废水和残留物。

本发明使用的甘油酯包括化学式为(R)CH(R)CH(R’)(R”)CH(R”)的分子，其中R、R’和R”选自-H、-OH或分子式-O(C＝O)R”’所示的脂肪酸基团，其中R”’是饱和、不饱和或多不饱和，直链或支链，具有或无取代基的碳链，其中甘油酯具有至少一个-O(C＝O)R”’。给定的甘油酯上的R、R’、R”可以相同或不同。R、R’和R”可以从本文所述的任何游离脂肪酸获得。本发明的甘油酯包括具有三个脂肪酸基团的甘油三酯，具有两个脂肪酸基团的甘油二酯和具有一个脂肪酸基团的甘油单酯。用作本发明的起始原料的甘油酯包括天然、加工、精炼以及人工或合成的脂肪和油。

术语“脂肪酸基团”或“酸基团”包括分子式-O(C＝O)R”’所示的化学基团。这些“脂肪酸基团”或“酸基团”通过与羰基碳单独结合的氧原子的共价键来与甘油酯的其余部分连接。相反地，术语“脂肪酸”或“游离脂肪酸”均指HO(C＝O)R”’，并且未与甘油酯共价结合。如本文所述，在“脂肪酸基团”、“酸基团”、“游离脂肪酸”和“脂肪酸”中，R”’是饱和、不饱和或多不饱和，直链或支链，具有或无取代基的碳链。本领域技术人员应当认识到，本文所述的“游离脂肪酸”或“脂肪酸”(即HO(C＝O)R”’)的R”’和与甘油酯相连接的或本发明中用作底物的其他酯的“脂肪酸基团”或“酸基团”中的R”’作用相同。即本发明的底物可以包括脂肪、油或其他具有由本文所述的游离脂肪酸或脂肪酸所形成的脂肪酸基团的酯。

II.实施方案

本发明提供了利用粗或精制植物油或动物脂生产生物燃料(例如生物柴油)的方法。在一方面，本发明涉及以含有甘油三酯的动物脂、植物油或它们的混合物为原料来生产脂肪酸酯。该方法包括通过酶促水解使得甘油三酯原料产生游离脂肪酸。然后，引入醇并用游离脂肪酸将所述醇酯化，从而形成含有脂肪酸酯的产物。

本发明提供了通过甘油三酯原料水解以及随后的醇酯化来经济地生产脂肪酸酯的方法。本文的方法可以通过产量高于现有技术方法的方式来连续实施。所产生的脂肪酸酯有益于生产润滑剂和诸如生物柴油的燃料。

图1示出生产生物柴油的方法100的一个实施方案。在一方面，将诸如植物油110的含有甘油三酯的原料酶促水解112产生游离脂肪酸115、甘油和水120。甘油三酯可以来源于植物油、动物脂、牛脂、润滑脂或回收提炼的油或脂肪。然后，利用催化剂(例如酸或酶催化剂)，可以将脂肪酸115用于醇的酯化。通常，所述脂肪酸为C₁₂至C₂₂的脂肪酸。酯化反应122产生生物柴油130和水132。可以任选地精制来自粗植物油水解的甘油和水产物，其中将水蒸馏以生产精制的甘油161，或者可以将甘油用于例如其他化学品141的发酵反应。

现在转向图2，其示出了本发明方法更详细的工艺流程200，其中在含水212(例如再循环的)和有机溶剂215(例如再循环的)的反应器225中，将含有甘油三酯的粗棕榈油(CPO)或者植物油或脂肪202利用例如酶催化剂210(例如脂酶)进行水解。将含有游离脂肪酸、甘油和水的产物从反应器225转移到分离容器230，其中游离脂肪酸233可被转移到含有诸如脂酶或酸的催化剂的第二反应器248或250(例如一个在使用，而另一个在再生)中。可以将甘油、水和脂酶的混合物235转移至中空纤维膜236，并且使脂酶211循环回到反应器225。可以将来自膜236的甘油和水237用于发酵生成其他化学品240。在反应器248或250中，将游离脂肪酸233用于酯化诸如低级醇(例如C₁-C₆醇，如甲醇或乙醇)的醇。低级醇242的酯化可以利用脂酶(例如Novozym435)或酸催化剂(例如大孔树脂15)催化。反应容器248或250中的催化剂可以利用诸如叔丁醇的极性溶剂进行再生。在反应结束后，来自反应混合物的酯可以通过蒸馏271分离，其中将醇238、溶剂258和水262蒸馏和再循环。可以使用最终的生物柴油产物260，或将其与石油柴油混合。合适的反应器包括但不局限于固定床反应器、流化床反应器和搅拌槽式反应器。

在某些情况下，将原料和酶(例如脂酶)与水及任选的有机溶剂一起装入反应器。有利地，包含甘油三酯的原料可以含有水。将原料(例如脱胶CPO)装入反应器，任选地预热至约20-60℃，优选约25℃至约50℃(例如40℃)，并加入水解酶(例如脂酶)。脂酶可以来源于植物、细菌、真菌和更高等的真核生物。脂酶可以来源于细胞外或细胞内，或者为全细胞的形式。适合用于水解反应或酯化反应的脂酶包括但不局限于来源于皱褶假丝酵母(Candida rugusa)、圆柱假丝酵母(Candida cylindracea)、米根霉(Rhizopus oryzae)、粘质色杆菌(Chromobacterium viscosum)、洋葱假单胞菌(Pseuodomonus cepacia)、猪胰腺(Hog pancrease)、荧光假单胞菌(Pseudomonus fluorescent)、南极假丝酵母B(Candida antarctica B)和Novozym 435(固定的南极假丝酵母脂酶B)的脂酶。可以将脂酶固定在丙烯酸树脂或任何固体支持物上。本领域技术人员能够知道其他适用于本发明的脂酶。任选地，将脂酶通过使用诸如叔丁醇的极性溶剂洗涤来再生。其他合适的极性溶剂包括但不局限于C₁-C₆烷醇和其他空间位阻烷醇。

酶的固定可以通过任何已知方法进行，例如包括无机载体共价键方法和有机载体共价键方法的载体结合、交联、捕获和吸附(参见美国专利4,798,793号、5,166,064号、5,219,733号、5,292,649号和5,773,266号)。考虑到操作，优选载体结合方法。载体结合包括通过化学吸附或物理吸附将酶吸附到任何固体支持物(例如离子交换树脂)。在本发明中，优选利用多孔载体的物理吸附。

描述了一些用于酶固定的有用载体(参见美国专利4,940,845号和5,219,733号)。有用的载体优选为微孔的，并具有疏水的多孔表面。通常，孔的平均半径为约至约孔隙率为约20体积％至约80体积％，更优选为约40体积％至约60体积％。孔为载体提供了增加的每载体颗粒的酶结合面积。优选的无机载体的实例包括但不局限于多孔玻璃，多孔陶瓷，寅式盐(celite)，诸如二氧化钛、不锈钢或氧化铝的多孔金属颗粒，多孔硅胶，分子筛，活性炭，粘土，高岭石，珍珠岩，玻璃纤维，硅藻土，膨润土，羟基磷灰石，磷酸钙凝胶，无机载体的烷基胺衍生物以及它们的组合。优选的有机载体的实例包括但不局限于微孔特氟隆、脂肪族烯烃聚合物(例如聚乙烯、聚丙烯、苯乙烯的均聚物或共聚物或者它们的混合物或者预处理的无机支持物)尼龙、聚酰胺、聚碳酸酯、硝基纤维素、乙酸纤维素以及它们的组合。其他合适的有机载体包括但不局限于诸如琼脂糖凝胶的亲水多糖，其具有烷基、苯基、三苯甲基或其他类似的疏水基团以提供疏水孔表面。微孔吸附树脂包括但不局限于那些由苯乙烯或烷基胺聚合物制成的微孔吸附树脂；螯合树脂；离子交换树脂，例如具有叔胺作为交换基团的弱碱性阴离子交换树脂；基本上由聚苯乙烯链交联二乙烯基苯组成的微孔吸附树脂；以及亲水纤维素树脂，例如通过掩盖纤维素载体的亲水基团而制备的亲水纤维素树脂。

酶的固定可以通过将酶固定在合适的载体上来进行。许多无机和有机载体可以用于固定酶。载体的实例包括但不局限于寅式盐、离子交换树脂、陶瓷等。在某些实施方案中使用离子交换树脂。离子交换树脂的材料、性质和离子交换基团可以根据要吸附的酶的吸附力和具有的活性水平来选择。在其他实施方案中使用阴离子交换树脂。阴离子交换树脂的实例包括但不局限于基于酚甲醛的阴离子交换树脂、基于聚苯乙烯的阴离子交换树脂、基于丙烯酰胺的阴离子交换树脂和基于二乙烯基苯的阴离子交换树脂。本领域技术人员应当认识到，其他合适的载体可以用于固定本发明所用的酶。

固定的温度依据酶的属性来确定。固定需要在酶活性未丧失的温度下进行。固定可以在约0℃至约60℃下进行，优选在约5℃至约40℃下进行。

对于酶与固定载体的比例，对于每重量份固定载体而言，优选使用0.05至10重量份、尤其是0.1至5重量份的酶。

酶促活性通常会受到诸如温度、光线和湿度的因素的影响。光线可以通过使用本领域已知的各种光线遮挡或过滤的方法来遮挡。湿度，包括周围大气中的水分，可以通过在封闭系统中操作工艺来控制。封闭系统可以处于正的惰性大气压力下以排除水分。或者，可以在底物、纯化床或柱、或者脂酶填充柱上面放置氮气床。也可以使用其他诸如氦或氩的惰性气体。这些技术具有使得诸如氧的大气中的氧化性化合物远离底物、产物或酶的额外好处。

在某些情况下，脂酶被固定在例如多孔载体或粉末上。酶促水解反应优选在约为20℃至50℃的温度下孵育。在一方面，酶促水解反应孵育时间为约0.5小时至约24小时，以实现由甘油三酯向游离脂肪酸的转化。酶促水解反应优选在水的存在下进行。在某些方面，酶促水解反应在缓冲溶液中进行。在一方面，水与甘油三酯的比例为约1∶10(v/v)至约20∶1(v/v)。脂酶浓度可为约0.125mg/ml至约2mg/ml。在某些方面，酶促水解反应还含有有机溶剂，如C₅-C₁₂烷或空间位阻烷醇。

在优选实施方案中，加入酶(例如1mg/ml)以起始反应，将反应混合物振荡和混合2小时至约10小时，优选约2至6小时(例如3小时)。在某些情况下，水解反应速率随着脂酶浓度的提高而成比例地增加。

虽然水解反应的温度和压力并不特别重要，但是可以调整这些参数以增加反应速率。在某些情况下，温度可以影响水解速率。例如，甘油三酯的水解在约20℃至约60℃下进行，优选在约30℃至约50℃下进行，更优选在约35℃至约45℃下进行。在一个优选实施方案中，反应在45℃下进行。

此外，在某些方面，缓冲液浓度可以影响水解速率。在某些优选方面，缓冲液浓度与甘油三酯的比例为约0.5(v/v)至约2.0v/v(0.5∶2)，优选的缓冲液浓度与甘油三酯的比例为约1∶1(v/v)。合适的缓冲液包括但不局限于磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐等。

反应结束后，加入有机溶剂(例如异辛烷或己烷)以将产生的脂肪酸(FA)与甘油和水分离。然后可以任选地将混合物离心，上层相可以直接用作酯化反应的原料。在某些方面，然后将脂肪酸原料和催化剂(例如酸或酶)与醇混合以开始酯化反应。

虽然酯化反应的温度和压力并不特别重要，但是可以调整这些参数以提高反应速率。在化学催化的情况下，任选地将FFA原料预热到约40℃至约80℃，优选约50℃至约70℃(例如60℃)。在酶催化的情况下，任选地将FFA原料预热到约20℃至约60℃，优选约25℃至约50℃(例如40℃)。反应通过加入低级醇来开始。反应结束后，移除催化剂。

适用于酯化反应中的醇包括但不局限于具有一个至八个碳原子的一元脂族伯醇和仲醇。酯化过程中使用的优选醇有甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇，其中甲醇和乙醇是最优选的。例如，尤其优选的醇为甲醇、乙醇和它们的组合。

合适的酸催化剂包括无机酸催化剂(例如矿物酸，如HCl、H₂SO₄等)或有机酸催化剂(例如苯甲酸)。酸催化剂可以为液体或固体。酸可以采取分子筛的形式。在一种情况下，酸催化剂为酸性苯乙烯-二乙烯基苯磺化离子交换树脂。通常，酯化反应混合物含有诸如C₅-C₁₂烷或空间位阻烷醇的有机溶剂。在一个实施方案中，孵育温度为约20℃至约90℃。在某些情况下，孵育时间为约0.2小时至约24小时。此外，固体酸催化剂与脂肪酸的比例通常为约1∶10至约10∶1(w/w)。任选地将酸催化剂通过用诸如甲醇的极性溶剂进行洗涤而再生。其他合适的极性溶剂包括C₁-C₆烷醇或空间位阻烷醇。

在某些情况下，酯化过程中醇与游离脂肪酸的摩尔比为约6∶1(mol∶mol)至约1∶1，更优选约4∶1至约3∶1，或约2∶1，或约1.2∶1或约1∶1。对于酸催化，醇与甘油三酯的摩尔比可以为约6∶1至约3∶1(例如4∶1)。在一个实施例中，当使用大孔树脂15时，醇与FFA比例为4∶1。

对于酶催化的酯化，合适的酶包括脂酶以及其他催化酯形成的酶。通常，反应含有诸如C₅-C₁₂烷或空间位阻烷醇的有机溶剂。在某些情况下，反应在温度约20℃至约70℃下进行约0.2小时至约24小时。

对于酶催化，醇与脂肪酸的比例为约1∶1至约2∶1(mol/mol)。在其他情况下，所述比例优选为约1.2∶1或1.3∶1或1.4∶1或约1.5∶1。在一个实施例中，当使用Novozym 435时，使用相当于约120％化学计量的醇量。在一个实施例中，脂酶与脂肪酸的比例为约0.005∶1至约1∶1(w/w)。

酯化结束后，将脂肪酸酯与任何反应物分离。分离可以通过本领域通常已知的任何方法实现，优选通过比重分离和倾析或离心。分离的脂肪酸酯产品可以用循环的水洗涤然后干燥。据发现，本发明的方法所达到的甘油三酯原料向脂肪酸酯的总转化率为约95％至约97％。

根据本发明方法制备的生物柴油可以用本领域技术人员已知的各种装置来分析。例如，解析分析可以使用带有UV检测器的HPLC来进行。在一方面，所述检测器设置在210nm并且可以使用常用的C185u柱(250×4.6mm，Alltech Associates，Inc.，USA)。流动相包括例如三个不同组分：己烷、异丙醇和甲醇。储蓄器A含有甲醇，储蓄器B含有异丙醇和己烷的混合物(5∶4，v/v)。在一方面，使用100％A至50％A+50％B的线性梯度超过30min。流动相的流速可以为1ml/min，样品进样体积为10l。该非水性RP-HPLC方法是现有技术方法(参见Holcapek，M.et al.J Chromatogr A 1999，858，13)的改进。

III.实施例

1.材料和方法

1.1材料

脱胶粗棕榈油购自马来西亚柔佛州的Wawasan Tebran Sdn Bhd，来源于皱褶假丝酵母的脂酶购自日本的Meito Sangyo Co.。来源于洋葱假单胞菌、粘质色杆菌、圆柱假丝酵母的脂酶和Novozym 435(固定在丙烯酸树脂上的南极假丝酵母脂酶B)购自Sigma-Aldrich(USA(美国))。来源于猪胰腺、洋葱假单胞菌和南极假丝酵母B(粉末)的脂酶来自Fluka(USA)。大孔树脂15(强酸性苯乙烯-二乙烯基苯磺化离子交换树脂，4.7mequiv/g)购自Sigma(USA)。异辛烷购自美国新泽西州的Fisher Chemical。

1.2脱胶粗棕榈油的水解

将装有脱胶CPO(2g)的80ml螺盖玻璃瓶预热至反应温度40℃约10分钟。将2ml脂酶溶液(1mg/ml)加入到预热的CPO中，将混合物在250rpm下振荡3h(小时)。反应结束后，将20ml异辛烷或己烷与反应混合物混合以便使产生的脂肪酸与甘油和水分离。然后将该混合物在5000rpm下离心5分钟。收集上层相并直接用作酯化的原料。

1.3游离棕榈脂肪酸的酯化

将含有10ml原料(异辛烷中的FA酸，0.32M)和1g大孔树脂15或0.04g Novozym 435的反应混合物预热至反应温度60℃(对于大孔树脂15)和40℃(对于Novozym 435)，并且振荡速度为250rpm。分别加入相当于大孔树脂15的400％化学计量或相当于Novozym 435的120％化学计量的甲醇或乙醇以起始反应。反应结束后，滤出Novozym435和大孔树脂15，并分别用叔丁醇(HPLC级)和甲醇洗涤。将它们冻干过夜备用。

1.4分析

反应混合物中的脂肪酸含量通过用0.2M NaOH滴定来测量。甘油三酯的转化通过带有210nm UV检测器的HPLC来确认(参见图3A-B)。使用常用的C 18 5u柱(250×4.6mm，Alltech Associates，Inc.，USA)。流动相包括三个不同组分：己烷、异丙醇和甲醇。储蓄器A含有甲醇，储蓄器B含有异丙醇和己烷的混合物(5∶4，v/v)。使用100％A至50％A+50％B的线性梯度超过30分钟。流动相的流速为1ml/min，样品进样量为10μl。该非水性RP-HPLC由Holcapek等报道的方法(Holcapek M et al.，J Chromatogr A，858：13-31(1999))改进而来。酯化反应中消耗的脂肪酸通过用0.2m NaOH滴定来监测。甲基或乙基酯(生物柴油)的产量通过上述HPLC系统来确认(参见图4A-B)。

2结果

2.1不同脂酶水解脱胶粗棕榈油的效果

表1示出了不同脂酶在固定蛋白浓度下将CPO转化为FFA的效果。很明显，来源于皱褶假丝酵母和粘质色杆菌的脂酶最有效。虽然Novozym 435(固定在丙烯酸树脂上的南极假丝酵母脂酶B)对于酯化和酯交换活性很高，但是其水解活性很低。因为皱褶假丝酵母脂酶比粘质色杆菌脂酶便宜50倍，所以选择它用于进一步的研究。

表1：不同脂酶水解粗棕榈油的效果^*

^*实验条件：除Novozym 435(160mg)以外，所有脂酶在缓冲液中的蛋白浓度保持恒定在0.5mg/ml，缓冲液2ml，CPO 2g，温度40℃，振荡速度250rpm，时间1h。

2.2不同皱褶假丝酵母脂酶浓度下脱胶CPO的水解

图5示出了反应速率随着缓冲液中脂酶浓度的增加而加快。对于除0.125mg/ml外任何脂酶浓度，反应在FFA产量为99.0％时达到平衡。反应速率在低脂酶浓度下缓慢，并且在0.125mg/ml的浓度下需要多于20h以完成反应。

2.3不同温度下脱胶CPO的水解

图6示出了在不同反应温度下CPO的水解。反应速率在40℃和55℃下几乎相同，然而在30℃下较低。因为脂酶在较低温度下更加稳定并且CPO熔点在35℃附近，所以对于后续实验选择40℃为反应温度。

2.4不同缓冲液与CPO比例(v/v)下CPO的水解

可以看出最佳的缓冲液与CPO比例为1∶1(v/v)，低于或高于该比例时，反应速率和FFA产量都会降低(图7)。

2.5大孔树脂15催化的棕榈FFA的甲基和乙基酯化

图8示出了大孔树脂15催化的FFA甲基和乙基酯化的比较。虽然在两种情况下，生物柴油的产量均达到99％，但是甲基酯化过程比乙基酯化更快。甲醇的低成本使其成为酯化反应的良好选择。然而，乙醇可以作为合成完全生物生成燃料的理想候选，因为其来源于农产品并且比甲醇毒性低。

2.6Novozym 435催化的棕榈FFA的甲基和乙基酯化

很明显，虽然Novozym 435催化的甲基酯化过程比乙基酯化快，但是2h后在BD产量99％时两个反应均达到平衡(图9)。因为甲醇在高浓度下对Novozym 435有毒性，所以乙醇是Novozym 435催化的棕榈FFA酯化的正确选择。

2.7大孔树脂15和Novozym 433的重复使用

将催化甲基和乙基酯化的大孔树脂15和Novozym 435分别用溶剂洗涤和冻干后重复使用。用于洗涤大孔树脂15和Novozym 435的溶剂分别为甲醇和叔丁醇。图10示出了每个循环中反应1.5h(对于大孔树脂15)和3h(对于Novozym 435)后的BD产量。可以看出大孔树脂15和Novozym 435可以分别重复使用多于100个循环和50个循环(见图11)。

本发明方法与已公开技术的比较

由表2可见，皱褶假丝酵母脂酶催化水解然后大孔树脂15或Novozym 435催化酯化的方法在合理的加工时间(4-5h)内提供了更高的产量(98-99％)。如该表所示，在KOH-或NaOH-催化的酯交换中产量相对较低(见图12)。

表2：本发明方法与已公开技术的比较

脱胶粗棕榈油(CPO)的酯交换

利用甲醇的CPO酯交换在80mL螺盖玻璃瓶中，250rpm振荡并且在40℃(对于Novozym 435)或60℃(对于大孔树脂15)下进行。标准反应混合物包含CPO、甲醇和Novozym 435(分别存在和不存在0.75ml LiCl饱和溶液或10ml叔丁醇)或大孔树脂15。使用的甲醇分别相当于大孔树脂15的400％化学计量和Novozym 435的120％化学计量。大孔树脂15的用量为0.2g每克CPO，Novozym 435的用量为0.04g每克CPO。对于无溶剂系统中Novozym 435催化的甲醇分解，在反应时间为0、5和10h时加入40％化学计量的甲醇三次。

本说明书所引用的全部公开出版物和专利申请通过引用的方式并入本文，如同每一个公开出版物或专利申请通过引用的方式特别地和单独地并入本文。尽管通过示例和举例的方式详细地描述了前述发明以便于清楚地理解，但是对本领域技术人员显而易见的是，根据本发明的教导，可以在不偏离所附权利要求的精神或范围的前提下对其进行某些变化和修饰。