自组装性多细胞体和使用其制备三维生物结构的方法

摘要

用于组织工程的结构和方法包括多细胞体，所述多细胞体包括多个活细胞。多个多细胞体可以布置成图案，并允许融合以形成工程组织。所述布置可包括填料体，所述填料体包括生物相容性材料，所述生物相容性材料抵抗来自多细胞体的细胞迁移和向内成长，并且抵抗细胞与其粘连。三维构造可以通过下列方式来组装：合适地沿着具有实质长度的接触区域印刷或者堆叠多细胞体和填料体，使得毗邻多细胞体之间存在直接接触。多细胞体之间的直接接触促进高效和可靠的融合。毗邻多细胞体之间增加的接触区域也促进高效和可靠的融合。还提供具有促进三维构造的组装的特性的多细胞体的制备方法。

说明书

资助声明

本发明部分得自美国国家科学基金资助No.NSF-0526854下的政府支持。美国政府具有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及再生医学和组织工程领域，更特别地，本发明涉及具有期望结构的工程组织/器官的制备。

背景技术

组织工程为由越来越多的器官和组织置换需求以及可移植器官(包括血管)的长期短缺导致的问题提供了有希望的解决方案。例如，在美国，成千上万的人处于器官移植物的国家等候目录中。许多人可能由于缺乏病变动脉或静脉的置换用血管或者置换用腹部器官而死亡。为了减轻，并且最终解决移植用血管和器官的供应不足而导致的问题，组织工程学家试图在实验室内以高精度、相对较短的时间大规模地构建可移植血管、血管替代物、器官或器官替代物，并且使之生长。

人们已经试图开发了构建工程组织的多种方法，这些方法具有有限的成功。然而，尚未实现对带血管的三维器官的组装。

虽然现有技术的方案具有希望，但是其也具有各种问题。支架选择、免疫原性、降解速率、降解产物的毒性、宿主炎症反应、由于支架降解而导致的纤维组织形成以及与周围组织的机械失配均可能影响工程组织构造体的长期行为，并且直接干扰其主要的生物功能。例如，心肌组织需要高的细胞密度，以确保通过与周围细胞紧密互连的缝隙连接实现同步的搏动。在心脏组织工程中使用支架已经导致细胞之间的连接减少，以及细胞外基质(ECM；例如，胶原质和弹力蛋白)的沉积和排列失误，从而影响支架的生物降解，以及心肌构造物产生力的能力。与ECM相关的因素还可能在血管组织工程中是特别关键的。其原因主要是，具有与天然血管相当的机械强度的支架工程化小直径血管替代物在成人动脉重建方面的希望(也称为组织工程的“圣杯”)仍然未实现。除了常见的在体外产生弹性纤维的难题之外，使用支架还具有其他的问题。凝胶的固有脆弱性可能妨碍组织工程化的血管的最终强度。此外，残余聚合物片段的存在可能破坏血管壁的正常结构，甚至影响平滑肌细胞(SMC)表型。因此，不出意料的是，组织工程血管移植物的一线临床应用或者针对低压应用，或者依赖于被称为基于片材的组织工程的完全无支架的方法。

器官印刷法(特别是美国专利申请No.10/590,446中所述的技术)已经显示出制造三维组织的潜力。器官印刷法通常为计算机辅助的、基于分配器的三维组织-工程技术，其旨在以叠层方式构造功能器官模组，并且最终构造出整个器官。在美国专利申请No.10/590,446中所述的技术中，单独的多细胞聚集体被印刷到凝胶或其他支撑基质上。最终的功能组织由单独聚集体的印刷后融合而获得。

发明概述

本发明的一方面是细长多细胞体。所述体包括多个活细胞和组织培养基。细胞彼此粘附。多细胞体的长度为至少约1000微米，并且沿着其长度的平均横截面积在约7,850平方微米至约360,000平方微米的范围内。

本发明的另一方面是工程化细长多细胞体。所述体包括彼此粘附的多个活细胞。多细胞体的长度为至少约1000微米，并且沿着其长度的平均横截面积在约7,850平方微米至约360,000平方微米的范围内。

另一实施方案是非神经支配和非软骨细长多细胞体。所述体包括彼此粘附的多个活细胞。多细胞体的长度为至少约1000微米，并且沿着其长度的平均横截面积在约7,850平方微米至约360,000平方微米的范围内。

本发明的进一步方面是无管腔细长多细胞体。所述体包括多个活细胞和组织培养基。细胞彼此粘附。多细胞体的高宽比至少约2。

在本发明的一方面中，描述由粘弹性一致期望三维形状的多个细胞或细胞聚集体制得的多细胞体。多细胞体包含多个细胞或细胞聚集体，其中细胞或细胞聚集体粘附在一起以形成构造体，所述构造体具有粘弹性一致的预定形状、期望细胞密度和足够的完整性以用于容易地操作和处理。

本发明的又一方面是制备包括多个活细胞的细长多细胞体的方法。细胞糊包括多个活细胞成形为细长形状。成形的细胞糊在控制环境中孵育以允许细胞彼此粘附，从而形成细长多细胞体。

根据本发明制备包括多个活细胞的多细胞体的另一方法包括使包括多个活细胞的细胞糊在装置中成形，所述装置保持所述细胞糊为三维形状。成形的细胞糊在控制环境中孵育，同时其保持为所述三维形状足够的时间以制备这样的体，所述体具有足够的粘附以在平坦表面上支撑自身。

还提供一种制备包含多个活细胞的细长多细胞体的方法。所述方法包括：使包含多个活细胞的细胞糊成形为细长形状；以及在控制环境中孵育所述成形的细胞糊以允许所述细胞彼此粘附，从而形成细长多细胞体。在本发明的该方面中，描述了一种制备包含具有粘弹性一致的预定形状的多个细胞或细胞聚集体的细长多细胞体的方法。在一个实施方案中，制备多细胞体的方法包括下列步骤：1)提供细胞糊，所述细胞糊包含具有期望细胞密度和粘度的多个预选择的细胞或细胞聚集体；2)操作细胞糊成期望形状；以及3)通过成熟使多细胞体成型。

在本发明的又一方面中，描述了联合使用上述多细胞体以构建期望三维生物构造的填料体。填料体包含预定形状的材料，其中材料抵抗细胞的向内生长、迁移和粘连，并且还能够是可渗透组织培养基的(即，可渗透营养物)。填料体由诸如琼脂糖、琼脂和/或其他水凝胶之类的材料制得。在生物构造的构造过程中，根据预定图案，填料体用于限定缺乏多细胞体的域。

在本发明的又一方面中，描述了使填料体成型的方法。通常，该方法用于在凝胶样条件下使预选择的合适材料制备(例如，操作)成期望形状。根据本发明的一个实施方案，所述制备方法还可包括下列步骤：1)减小材料的粘度成液态样材料；2)使液态样材料成形为预定形状；以及3)增加材料的粘度至期望凝胶样填料基质单元的粘度。

本发明的又一实施方案是包括多个非神经支配细长多细胞体的三维结构。多细胞体均包括彼此粘附的多个活细胞。多细胞体布置成图案，其中各多细胞体接触至少一种其他多细胞体，并且多细胞体不彼此粘附。

本发明的进一步的方面是三维结构。结构包括多个工程化细长多细胞体。多细胞体均包括彼此粘附的多个活细胞。多细胞体布置成图案，其中各多细胞体接触至少一种其他多细胞体，并且多细胞体不彼此粘附。

在另一实施方案中，三维结构包括多个细长多细胞体。多细胞体均包括彼此粘附的多个活细胞和组织培养基。多细胞体布置成图案，其中各多细胞体接触至少一种其他多细胞体，并且多细胞体不彼此粘附。

在又一实施方案中，三维结构包括多个非神经支配多细胞体。多细胞体均包括彼此粘附的多个活细胞。多细胞体布置成图案，其中沿着长度为至少约1000微米的接触区域所述多细胞体中的至少一种接触所述多细胞体中的另一种。

在本发明的另一方面中，三维结构包括多个工程化多细胞体。多细胞体均包括彼此粘附的多个活细胞。多细胞体布置成图案，其中沿着长度为至少约1000微米的接触区域所述多细胞体中的至少一种接触所述多细胞体中的另一种。

在本发明的又一实施方案中，三维结构包括多个多细胞体。多细胞体均包括彼此粘附的多个活细胞和组织培养基。多细胞体布置成图案，其中沿着长度为至少约1000微米的接触区域所述多细胞体中的至少一种接触所述多细胞体中的另一种。

三维结构的另一实施方案包括多个多细胞体。多细胞体均包括彼此粘附的多个活细胞。结构还包括多个离散的填料体。填料体均包括生物相容性材料，所述生物相容性材料抵抗来自所述多细胞体的细胞迁移和向内成长到所述填料体中，并且抵抗所述多细胞体中的细胞与所述填料体粘连。多细胞体和填料体布置成图案，其中各填料体接触至少一种其他多细胞体或至少一种填料体。

本发明的另一进一步方面是包括多个多细胞体的三维结构。多细胞体均包括彼此粘附的多个活细胞。结构还包括多个填料体。填料体均包括生物相容性材料，所述生物相容性材料抵抗来自所述多细胞体的细胞迁移和向内成长到所述填料体中，并且抵抗所述多细胞体中的细胞与所述填料体粘连。多细胞体和填料体布置以在三维结构中形成多个空间，所述空间不被多细胞体占据并且不被填料体占据。

本发明的另一方面是制备三维生物工程组织的方法。该方法包括根据图案布置多个细长多细胞体，使得各多细胞体接触至少一种其他多细胞体。多细胞体均包括多个活细胞。所述多细胞体中的至少一种允许和至少一种其他多细胞体融合。

在制备三维生物工程组织的方法的另一实施方案中，根据图案布置多个多细胞体和多个填料体，使得各多细胞体接触至少一种(i)另一多细胞体或(ii)填料体。多细胞体均包括多个活细胞。各填料体包括生物相容性材料，所述生物相容性材料抵抗来自所述多细胞体的细胞迁移和向内成长到所述生物相容性材料中，并且抵抗所述多细胞体中的细胞与所述填料体粘连。所述多细胞体中的至少一种允许和至少一种其他多细胞体融合。

在制备三维生物工程组织的方法的又一实施方案中，该方法用于在预选择的接收环境中将多个多细胞体递送成预定图案。根据工程方法的一个实施方案，多细胞体可联合使用预选择的填料体。更特别地，在一个实施方案中，该方法包括下列步骤：1)根据预定图案，以预定联合多个填料体的方式递送多个多细胞体，以形成叠堆的或层化构造体，其中多细胞体和填料体是邻接的；2)在预选择的控制环境中沉积层化构造体以用于成熟，从而多细胞体彼此融合以导致融合构造体；以及3)从融合构造体中除去填料体以制备期望生物构造体。

本发明的另一实施方案是三维结构，其包括至少一种填料体和彼此粘附的多个活细胞。所述细胞形成基本上围绕至少一种填料体的管状结构。填料体包括适应性生物相容性材料，所述生物相容性材料抵抗细胞迁移和向内成长到所述材料中，并且抵抗所述细胞与所述材料粘连。

本发明的又一方面是制备包含彼此粘附的多个活细胞的多细胞体的模具。模具具有生物相容性基底，所述生物相容性基底抵抗细胞迁移和向内成长到所述基底中，并且抵抗所述细胞与所述基底粘连。所述基底被成形以接收包含多个细胞的组合物，所述细胞具有相对低的粘附性，并且在成熟期过程中保持所述组合物为期望形状，在所述成熟期过程中所述粘附性增加以形成所述多细胞体。所述多细胞体的期望形状具有至少约1000微米的长度，并且被构造使得所述多细胞体内的每个细胞从所述体的外部不超过约250微米。

本发明的另一实施方案是制备适于制备多个多细胞体的模具的工具，其中各体包含彼此粘附的多个活细胞。所述工具包含具有顶部和底部的主体。从所述主体的底部延伸多个叶片。所述叶片的宽度均在约100微米至约800微米的范围内以在生物相容性凝胶基底中形成沟槽，所述生物相容性凝胶基底被构造用于使置于所述沟槽中的活细胞成型为细长多细胞体。所述叶片具有纵轴，并且所述叶片中的至少一个与所述叶片的另一个的纵轴侧向间隔。

附图概述

图1A是本发明的多细胞体的一个实施方案的透视图；

图1B是由表面支撑的多细胞体的放大透视图；

图1C是在表面上呈彼此并列毗邻关系的多个多细胞体的端部的放大透视图；

图2是三维构造的一个实施方案的透视图，所述三维构造包括多个多细胞体和多个填料体，它们布置成适于产生工程组织的一个实施方案的图案；

图3A-3D示出制备图1A、1B、1C和2中所示的多细胞体的方法的一个实施方案；

图4A是适用于图3A-3D中所示的方法的模具的一个实施方案的透视图；

图4B是模具的俯视图；

图4C是在图4B上沿包括线4C--4C的平面示出的模具的横截面；

图4D是图4C中示出的模具的一部分的放大横截面；

图5A是可用于制备图4A-4D中所示的模具的工具的一个实施方案的透视图；

图5B是图5A中所示的工具的侧视图；

图5C是图5B中示出的工具的一部分的放大侧视图；

图6A-6C示出使用图5A-5C中示出的工具来制备图4A-4D中示出的模具的方法的一个实施方案；

图7、7A和8-10是由多个多细胞体和多个填料体制得的三维构造的多种实施方案的示意性透视图；

图11和12示意性示出从多个多细胞体和填料体制备三维构造的多种方法；

图13根据本文所述的方法工程化的两种管状结构的照片，它们的外径分别为1200微米和900微米；

图14是根据本文所述的方法工程化的另一管状结构的照片；

图15是根据本文所述的方法联合管状结构的管腔中的填料体工程化的管状结构的一个实施方案的示意性透视图；

图16包括示出球形多细胞体融合以形成分支管状结构的一组照片；

图17包括示出第一组多细胞体和第二组多细胞体的融合的一组照片，所述第二组多细胞体的细胞类型组成不同于第一组中多细胞体的组成；和

图18包括示出示出包括明胶和纤维蛋白的管状工程化结构的一组照片。

在整个附图中对应的附图标记表示对应的部件。

发明详述

本文引用的所有的公开、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用的方式全部并入本文。

提供制备工程组织的新颖结构和方法。所述技术包括使用新型多细胞体作为构件，所述构件可用于组装三维构造，所述三维构造可通过成熟变成期望工程组织。各多细胞体包含多个活细胞，所述多个活细胞足够地彼此粘附，以允许所述体被作为单一目标处理(例如，捡拾和移动)。多细胞体的粘附合适地足以允许所述体支撑自身(例如，在工作表面上或在包括多个多细胞体的组装中)一段时间，该时间足以使活细胞能够粘附毗邻多细胞体的活细胞。以自支撑多细胞体的形式捡拾和移动多个活细胞的能力提供组装多种不同三维构造的灵活性。例如，多细胞体可联合使用一种或多种填料体(例如，所述体包含生物相容性材料，所述生物相容性材料抵抗来自多细胞体的细胞迁移和向内成长到填料体中，并且抵抗细胞与填料体的粘连)来组装构造体，所述构造体可通过成熟变成管状工程组织。多细胞体和填料体还可用于组装构造体，所述构造体通过成熟变成具有其他形状的工程组织。此外，因为多细胞体是自支撑的，因此无需使多细胞体嵌入支撑凝胶或支架。相反，″在空气中印刷″的能力促进以这样的方式布置多细胞体，该方式为确保多细胞体彼此直接接触。多细胞体之间更好的接触可以促进在成熟过程中多细胞体的高效和可靠的融合。另外，填料体可容易地从成熟工程组织的外部和内部(例如管状结构的管腔)中除去。

另外，本发明的一些方法使用细长多细胞体作为用于工程组织的构件。因为细长多细胞体已经沿着所述体的纵轴在显著长度上彼此粘附，因此多细胞体的融合更加可靠，并且可在更少时间内实现。此外，细长多细胞体可以以并排毗邻关系布置，从而沿着具有实质长度的接触区域在多细胞体之间建立接触。这可促进毗邻多细胞体彼此快速和可靠的融合。

提供了使用本发明的材料和方法来制备三维生物工程组织的方法的总的综述，现在将更详细地说明这些方法和材料。

多细胞体

图1中示出多细胞体的一个实施方案(本文中也称为中间体细胞单元)，通常表示为1。多细胞体1包括彼此粘附的多个活细胞。多细胞体1包含粘附在一起的多个细胞，其为粘弹性一致的期望三维(3-D)形状，并且具有足够的完整性以用于在生物-工程方法(例如组织或器官工程)的过程中容易地操作和处理。足够的完整性是指多细胞体在随后的处理过程中能够保持其物理形状，其不是刚性的，但具有粘弹性一致，并且保持细胞的活力。

多细胞体1可由任意一种或多种预选择的细胞类型构成。通常，细胞类型的选择将取决于期望三维生物组织而变化。例如，如果多细胞体用于工程化血管型三维结构，用于形成多细胞体的细胞可有利地包含通常在脉管组织(例如，内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等)中发现的细胞类型或细胞类型。其他细胞类型可用于形成多细胞体，如果其用于工程化不同类型的三维组织(例如，肠、肝、肾等)。本领域技术人员能够选择合适的细胞类型或基于待工程化的三维组织的类型用于多细胞体的类型。其中，合适的细胞类型的非限制性例子包括收缩或肌肉细胞(例如，横纹肌细胞包括肌原细胞和心肌细胞，以及平滑肌细胞)、神经细胞、成纤维细胞、结缔组织细胞(包括构成骨骼和软骨的细胞类型、能够分化成骨骼形成细胞和软骨细胞的细胞、以及构成淋巴组织的细胞类型)、实质细胞、上皮细胞(包括形成腔室和血管或通道中的内层的内皮细胞、外分泌和内分泌上皮细胞、上皮吸收细胞、角质化上皮细胞和细胞外基质分泌细胞)、肝细胞和未分化细胞(例如胚细胞、干细胞和其他前体细胞)。例如，用于形成多细胞体1的细胞可得自活体人或动物受试者并且培养为初级细胞系。

多细胞体1可以是同型细胞的或异型细胞的。在同型细胞的多细胞体中，多个活细胞包括单一细胞类型的多个活细胞。同型细胞的多细胞体中几乎所有的活细胞是单一细胞类型的细胞，对于低含量的杂质具有一些耐受性，所述杂质包括相对少量的不同细胞类型的细胞，所述不同细胞类型的细胞对于构造体(包括同型细胞的多细胞体)的成熟产生可忽略不计的影响。

相反，异型细胞的多细胞体包括多于一种细胞类型的明显数量的细胞。例如，多细胞体可包含第一类型的多个活细胞和第二类型(等)的多个活细胞，第二细胞类型不同于第一细胞类型。如果多细胞体用于产生脉管组织，例如，第一类型的细胞可以是内皮细胞并且第二类型的细胞可以是平滑肌细胞，第一类型的细胞可以是内皮细胞并且第二类型的细胞可以是成纤维细胞，或者第一类型的细胞可以是平滑肌细胞并且第二类型的细胞可以是成纤维细胞。异型细胞的多细胞体还可包括第一细胞类型的多个细胞、第二细胞类型的多个细胞和第三细胞类型的多个细胞，第一、第二和第三细胞类型中的各种不同于第一、第二和第三细胞类型中其他种。例如，适于制备工程化血管的细胞体可包括内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞。异型细胞体中的活细胞可在融合过程过程中保持未整理或可″整理″(例如，自组装性)，以形成用于工程组织的特定内部结构。细胞的自整理和差异粘附假说(DAH)的预测一致。DAH解释了就组织表面和由组成细胞之间的粘连和粘附相互作用而产生的界面张力而言，细胞群的液态样行为。通常，细胞可基于细胞的粘连强度的差异而整理。例如，整理至异型细胞的多细胞体的中心的细胞类型通常具有更强的粘连强度(因此更高表面张力)，这比整理至多细胞体的外侧的细胞的情况要强。

此外，当异型细胞的多细胞体由来自邻近正常发育的组织的细胞构成时，在整理的过程中它们可恢复它们的生理构象。因此，异型细胞的多细胞体可包含一种预构建内部结构，这基于组成细胞的粘连和粘附性能以及细胞所位于的环境。这可用于构建更复杂的生物结构。例如，当构建简单的收缩管时，可以使用由肌肉细胞构成的同型细胞的多细胞体；为了构建血管样结构，可以使用至少两种细胞类型。例如，用于构建工程化血管的异型细胞的多细胞体可合适地包括(i)内皮细胞和平滑肌细胞；(ii)平滑肌细胞和成纤维细胞；(iii)内皮细胞和成纤维细胞；或(iv)内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞。通过使用由这些多种不同细胞类型构成的多细胞体随机分散在所述体中来构建三维生物结构，在结构成型的过程中，不同细胞类型可以进行整理，因此内皮细胞列于管(即，管腔)的内部结构，平滑肌细胞形成围绕内皮细胞的层，并且成纤维细胞形成围绕平滑肌层的外层。最佳结构可通过改变多细胞体的组成(例如，各种不同细胞类型彼此的比)和多细胞体的大小而实现。作为另一例子，异型细胞的多细胞体可以包括第一细胞类型的多个活细胞、第二类型的多个细胞和第三类型的多个细胞。如果这种多细胞体用于产生脉管组织，例如，第一细胞类型的细胞可合适地是内皮细胞，第二细胞类型的细胞可合适地是平滑肌细胞，并且第三细胞类型的细胞可合适地是成纤维细胞。再次，细胞的自整理可发生在这种异型细胞的多细胞体中。因此，当这些多细胞体用于构建三维生物结构时，例如管状结构，在结构成型的过程中，这些细胞类型可以进行整理，使得内皮细胞列于管(即，管腔)的内部结构，平滑肌细胞形成基本上围绕内皮细胞的层，并且成纤维细胞形成基本上围绕内皮细胞层和平滑肌细胞层的管状结构的外层。

在一些情况下，除了多个细胞，多细胞体1合适地包括一种或多种细胞外基质(ECM)组分、或者一种或多种ECM组分的一种或多种衍生物。例如，多细胞体可含有多种ECM蛋白(例如，明胶、纤维蛋白原、纤维蛋白、胶原质、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹力蛋白和/或蛋白聚糖)。ECM组分或ECM组分的衍生物可加入用于形成多细胞体的细胞糊中，下面进一步详细讨论。加入细胞糊中的ECM组分或ECM组分的衍生物可纯化自人或动物源，或通过本领域已知的重组方法来制备。或者，ECM组分或ECM组分的衍生物可由多细胞体中的细胞自然分泌，或用于制备多细胞体的细胞可通过本领域已知的任何合适的方法基因操作来改变一种或多种ECM组分或ECM组分的衍生物、和/或一种或多种细胞粘连分子或细胞-基底粘连分子(例如，选择蛋白、整联蛋白、免疫球蛋白和钙粘着蛋白)的表达水平。ECM组分或者ECM组分的衍生物可促进细胞在多细胞体中的粘附，例如，明胶和/或纤维蛋白原可合适地加入用于形成多细胞体的细胞糊中。然后通过加入凝血酶，纤维蛋白原可转化至纤维蛋白。

如上所述，在一些情况下多细胞体1合适地包括组织培养基。组织培养基可以是任何生理相容性培养基，并且通常根据本领域熟知所涉及的细胞类型来进行选择。组织培养基可包含例如基础营养物，例如糖和氨基酸、生长因子、抗生素(使污染最小化)等。

细胞在多细胞体1中的粘附合适地足够强以允许多细胞体保持三维形状，同时在平坦表面上支撑自身。在图1B中，例如，多细胞体1在平坦表面13上支撑自身。尽管存在一些微小变形(例如，在多细胞体1接触表面13的情况下)，但是多细胞体足够地粘附以保持这样的高度，该高度合适地为其宽度的至少一半，更合适地约等于宽度。此外如图1B中所示，例如，通过多细胞体和表面13之间的接触，多细胞体1被在多细胞体的底部上形成的平坦外部表面15支撑。当多细胞体1的全重被表面13支撑时，由于多细胞体的轻微变形，接触表面15的面积A1可能大于初始接触区域。然而，接触表面15的面积A1合适地小于支撑表面13上的多细胞体1的二维凸起的面积A2(参见图1B)。这意味着多细胞体1的一部分(例如，图1B中示出的各个侧面)被工作表面13上方的多细胞体1支撑。同样，当两种或多种多细胞体1以彼此并列毗邻的关系置于平坦表面13上时(图1C)，它们的自支撑能力联合三维形状(它们保持它们自身)可以在它们侧面下方和工作表面上方形成孔隙空间17。

细胞在多细胞体1中的粘附还合适地足够强以当多细胞体组装成构造体时(其中多细胞体和填料体堆叠在彼此顶部)(参见图2，下面更详细讨论)，允许多细胞体支撑至少一种类似设置大小和成形的多细胞体或填料体的重量。细胞在多细胞体1中的粘附还合适地足够强以允许多细胞体通过工具被捡拾(例如，毛细管微量移液管)(参见图3D，下面更详细讨论)。

此外，多细胞体1可合适地是非神经支配(即，其基本上不含神经元)或非软骨、或者非神经支配和非软骨的。多细胞体可描述为″工程化″多细胞体，因为其不同于无需人类智慧教导而起源的生物结构。换言之，多细胞体是合成或非自然产生的。

多细胞体1可以具有本发明范围内的多种大小和形状。例如，图1中所示的多细胞体1是无管腔体，意味着没有开口通道延伸通过多细胞体。例如，多细胞体1在所述体内合适地基本上不具有孔隙、中空空间等。在图1中示出的多细胞体1和现有技术工程化血管与其他现有技术管状工程组织之间存在一点差别。

图1A-1B中示出的多细胞体1被构造为限制细胞坏死，所述细胞坏死由于氧和/或营养物不能扩散到多细胞体的中间部分而引起。例如，多细胞体1被合适地构造，使得其中没有活细胞从多细胞体的外部表面大于约250微米，更合适地使得其中没有活细胞从多细胞体的外部表面大于约200微米。因为多细胞体1的中间部分中的细胞接近多细胞体的外部表面，所以多细胞体中的细胞可通过从多细胞体的外部表面处的孔隙空间朝向所述体的中间部分扩散而供应氧和/或营养物。尽管在多细胞体的一个或多个部分(例如，中间部分)中可能存在一些细胞坏死，但是所述坏死受到限制。

图1中的多细胞体1也是细长体，其具有明显大于其高度H1和其宽度W1的长度L1。多细胞体1的长度L1合适地为至少约1000微米(例如，在约1000微米至约30厘米的范围内)，更合适地为至少约1厘米(例如，在约1厘米至约30厘米的范围内)，甚至更合适地为至少约5厘米(例如，在约5厘米至约30厘米的范围内)。对于多细胞体的长度L1没有理论上限。因此，认识到可以制备长度超过30厘米(或不同于30厘米的任意长度)的多细胞体也在本发明的范围内，只要人们希望克服和制备长的多细胞体相关联的实际困难即可，所述困难例如获得足够量的活细胞或处理较长的多细胞体等。

图1中示出的细长多细胞体1的高度H1和宽度W1合适地明显小于其长度L1。例如，长度L1合适地为宽度W1的至少两倍和高度H1的至少两倍，这意味着体1的高宽比(即，长度和正交于长度的最长尺寸的比)为至少约2，更合适地为至少约10，甚至更合适地为至少20。从上面多细胞体1的尺寸的描述注意到高宽比显著高于20也可在本发明的范围内；例如高宽比可以是2000。

图1中所示的多细胞体1也具有相对窄的宽度W1和相对短的高度H1。例如，沿着其长度L多细胞体1的平均横截面积在约7,850平方微米至约360,000平方微米的范围内，更合适地在约31,400平方微米至约250,000平方微米的范围内，甚至更合适地在约31,400平方微米至约90,000平方微米的范围内。对于另一例子，图1中示出的多细胞体1(其基本上圆柱形并且具有圆形横截面)沿着其长度合适地具有的平均直径在约100微米至约600微米的范围内(对应于平均横截面积在约7,850平方微米至约282,600平方微米的范围内)，更合适地在约200微米至约500微米的范围内(对应于平均横截面积在约31,400平方微米至约196,250平方微米的范围内)，甚至更合适地在约200微米至约300微米的范围内(对应于平均横截面积在约31,400平方微米至约70,650平方微米的范围内)。

尽管图1中示出的多细胞体1是基本上圆柱形并且具有基本上圆形横截面，但是具有不同尺寸和形状的多细胞体在本发明的范围内。例如，多细胞体可以是具有方形、矩形、三角形或本发明范围内的其他非圆形横截面形状的细长形状(例如，圆柱形)。同样，多细胞体可具有本发明范围内的通常球形、非细长圆柱形或立方体形形状。

制备多细胞体的方法

有多种方式来制备具有本发明范围内的上述特性的多细胞体。例如，多细胞体可由含有多个活细胞或具有期望细胞密度和粘度的细胞糊来制备。细胞糊可以成形为期望形状，并且多细胞体通过成熟(例如，孵育)成型。在另一例子中，细长多细胞体通过使包括多个活细胞的细胞糊成形为细长形状而制备。细胞糊在控制环境中孵育以允许细胞彼此粘附，从而形成细长多细胞体。在又一例子中，多细胞体通过使包括多个活细胞的细胞糊在装置中成形而制备，所述装置保持细胞糊的三维形状。细胞糊在控制环境中孵育，同时其保持三维形状足够的时间以制备具有足够的粘附以在平坦表面上支撑自身的体，如上所述。

细胞糊可合适地通过下列方式来提供：(A)混合细胞或细胞聚集体(本文中也称为″预选的″细胞或细胞聚集体)(可以是一种或多种细胞类型)和细胞培养基(本文中也称为″预选的″培养基)(例如，以预定比例)，以导致细胞悬液(本文中也称为细胞混合物)；以及(B)压制细胞混合物以制备具有期望细胞密度和粘度的细胞糊。压制可通过多种方法来实现，例如通过浓缩源自细胞培养基的特定细胞悬液以获得细胞糊所要求的期望细胞浓度(密度)、粘度和一致性。例如，来自细胞培养基的相对稀释的细胞悬液可被浓缩预定时间，以获得存在粒状沉淀的细胞浓度，这允许在模具中成形。正切流动过滤(″TFF″)是另一种浓缩或压制细胞的合适的方法。化合物也可联合细胞悬液提供要求的挤出性能。可在本发明中使用的合适化合物的一些例子包括胶原质、水凝胶、基质胶、纳米纤维、自组装性纳米纤维、明胶、纤维蛋白原等。

因此，在这些方法中使用的细胞糊合适地通过下列方式制备：混合多个活细胞和组织培养基；和压制活细胞(例如，通过离心)。如果一种或多种ECM组分或者一种或多种ECM组分的一种或多种衍生物包括在细胞糊中(下面进一步详细讨论)，细胞粒状沉淀可合适地重悬于含有ECM组分或ECM组分的衍生物的一种或多种生理学上可接受的缓冲液中，并且将所得细胞悬液再次离心以形成细胞糊。

期望用于进一步加工的细胞糊的细胞密度可以随着细胞类型的改变而改变。细胞之间的相互作用决定细胞糊的性能，并且不同细胞类型将在细胞密度与细胞-细胞相互作用之间具有不同的关系。在使所述细胞糊成形之前，所述细胞可预处理以增加细胞相互作用。例如，在离心后细胞可在离心管的内部孵育，以在使所述细胞糊成形之前增加细胞-细胞相互作用。

多种方法可用于使本发明下的细胞糊成形。例如细胞糊可操作、手工模制或压紧(例如，在浓缩/压制后)以实现期望形状。例如，细胞糊可吸收(例如，吸出)到预成型装置，例如微量移液管(例如，毛细吸管)，使细胞糊变形以适形装置的内部表面。微量移液管(例如，毛细吸管)的横截面形状可以是圆形、方形矩形、三角形或其他非圆形横截面形状。细胞糊也可通过将其沉积到预成型模具中而成形，例如塑料模具、金属模具或凝胶模具。此外，离心浇注或连续浇注可用于使细胞糊成形。

在所述方法的一个例子中，成形包括将细胞糊保持在成形装置中以允许细胞在成形装置中部分彼此粘附。例如如图3A中所示，细胞糊55可吸出到成形装置51(例如，毛细吸管)中，并保持在成形装置中用于成熟期(本文中也称为孵育期)(图3B)，从而允许细胞至少部分彼此粘附。如果细胞能够在第一成形装置51中实现足够的粘附，多细胞体1可在仅具有单一成熟步骤(例如单一孵育步骤)的方法中制备。例如，所述方法合适地包括使细胞糊55在单一成形装置51中成形，并且在单一控制环境中孵育成形的细胞糊以允许细胞彼此粘附，从而形成多细胞体1。如果是这样情况，成形装置51(例如，毛细吸管)可合适地是生物印刷器或类似设备的印刷头的一部分，其可操作以自动将多细胞体放置在三维构造中，这将在下面更详细地描述。将ECM组分或ECM组分的衍生物(例如明胶和/或纤维蛋白原)加入细胞糊可促进多细胞体在单一成熟步骤中的制备，因为这种组分可促进多细胞体的总的粘附。然而，对于细胞可保持在成形装置例如毛细吸管中的时间的量有限制，这在细胞的活力受到影响之前提供细胞至多有限地接近氧和/或营养物。

如果细胞不能保持在成形装置51中用于成熟期足够长以获得期望粘附，部分粘附的细胞糊55合适地从成形装置(例如，毛细吸管)转移至第二成形装置301(例如，模具)，所述第二成形装置允许营养物和/或氧供应至细胞，同时它们保持在第二成形装置中用于另外的成熟期。允许供应细胞营养物和氧的合适的成形装置301的一个例子示于图4A-4D中。该成形装置是用于制备多个多细胞体(例如，基本上相同的多细胞体)的模具301。模具301包括由这样的材料制成的生物相容性基底303，所述材料抵抗细胞迁移和向内成长到基底中，并且抵抗细胞与基底的粘连。模具301可由排除细胞生长或迁移到模具中或者与模具粘连的任何材料制成。例如，基底303可合适地由下列材料制成：(PTFE)、不锈钢、透明质酸、琼脂糖、琼脂糖、聚乙二醇、玻璃、金属、塑料或凝胶材料(例如，琼脂糖凝胶或其他水凝胶)和类似材料。

基底303被成形以接收包含多个细胞的组合物(例如，来自第一成形装置51)，所述细胞具有相对低的粘附性，并且在成熟期过程中保持所述组合物为期望三维形状，在所述成熟期过程中所述粘附性增加以形成所述多细胞体，所述多细胞体相对于成熟期之前的组合物(例如具有上述多细胞体1的任意特性的多细胞体)具有更大的粘附性。模具301还合适地被构造，使得组织培养基可供应至细胞糊55(例如，通过将组织培养基配送到模具的顶部上)。例如，如图4A-4D中所示，多个细长沟槽305形成在基底303中。如图4D中所示，各沟槽的深度D2合适地在约500微米至约1000微米的范围内。在示意性实施方案中，各沟槽305的底部合适地具有拱形(例如，半圆形)截面形状以形成具有基本上圆形截面形状的细长圆柱多细胞体。沟槽305的宽度W5合适地稍微大于待在模具301中制备的多细胞体的宽度。例如，沟槽的宽度W5合适地在约300微米至约1000微米的范围内。沟槽305之间的间隔并不关键，但其通常期望使沟槽彼此相对紧密地间隔，以增加可在模具301中制备的多细胞体的数量。在示意性实施方案中，例如，沟槽305之间的基底303的条带各自具有约2mm的宽度W4。

有多种方式来制备本发明范围内的合适的模具。例如，图5A-5C示出工具的一个实施方案，通常表示为201，其可用于制备适于制备上述多细胞体的模具。通常，工具201的一部分被构造为是在第二成熟期的过程中保持部分粘附的细胞糊的模具301的那部分的阴模(negative)。例如，工具201合适地包括体203和从所述体延伸的多个凸起205。各凸起205被合适地设置大小和成形以在模具基底中形成凹陷或接收区域，所述模具基底保持细胞糊55的形状，使得通过凸起形成在模具中的凹陷/接收区域中没有细胞从成形的细胞糊的外部表面超过约300微米。

图5A-5C中示出的特定工具201被构造为制备图4A-4B中示出的模具301。凸起205被构造为从体203的底部207延伸的多个叶片。各叶片205是模具301中的沟槽305中的一个的阴模。叶片205具有纵轴209(图5A)，并且被构造为制备可用于制备上述细长多细胞体1的模具。叶片205中的至少一个从叶片的另一个的纵轴209侧向间隔。在工具201和用于在凝胶中形成孔以进行凝胶电泳的常规梳状物之间有一个区别。在示意性实施方案中，所有叶片205基本上彼此平行，并且各叶片相对于它们的纵轴209和其他叶片侧向间隔。叶片205合适地全是基本上彼此相同的。参照图5C，各叶片205合适地从距离D1为约1.5mm的体203延伸。叶片205的末端具有对应于模具301中的沟槽305的底部形状的拱形(例如，半圆形)截面形状。各叶片的宽度W3合适地在约300微米至约1000微米的范围内。分离叶片的距离W2合适地为约2mm。工具201上的唇部211合适地被构造为设置在细胞培养皿的边缘上，以保持凸起在皿的底部的上方。工具201可由多种材料制成(由所述材料模具容易地分离)，例如(PTFE)、不锈钢等。

为了制备模具301，细胞培养皿221合适地填充液体223，所述液体可制备以固化或建立为凝胶，如图6A中所示。例如，液体可以是琼脂糖溶液223。工具201放置在细胞培养皿221的顶部(图6B)，使得唇部211设置在细胞培养皿的边缘225上，并且凸起205(例如，叶片)从工具201的底部207延伸到液体223中。液体223被允许建立以形成围绕凸起205(例如，叶片)的末端的固体或凝胶基底。然后工具201离开细胞培养皿以从新制备的模具301分离工具201(图6C)。

因此，如果使用第二成形装置，部分粘附的细胞糊55合适地从第一成形装置51(例如，毛细吸管)转移至第二成形装置(例如，图4A-4D中示出的模具301)。部分粘附的细胞糊55可通过第一成形装置51(例如，毛细吸管)转移至模具301的沟槽305，如图3C中所示。因此，所述方法包括将部分粘附的细胞糊55转移至第二成形装置301，并且将部分粘附的细胞糊保持在第二成形装置中以形成多细胞体1。在成熟期后(其中模具301被孵育以及其中的细胞糊55保持在控制环境中以允许细胞糊中的细胞进一步彼此粘附以形成多细胞体1)，细胞的粘附足够强以允许所得多细胞体1通过工具51′例如图3D中所示的毛细吸管被捡拾。毛细吸管51′(现在含有已经从模具301的沟槽305中捡拾出来的成熟多细胞体1)可合适地是生物印刷器或类似设备的印刷头的一部分，其可操作以自动将多细胞体放置在三维构造中，这将在下面更详细地描述。

因此，在所述制备多细胞体1的方法的一个例子中，成形包括将细胞糊55保持在第一成形装置51中以允许细胞在第一成形装置中部分彼此粘附，将部分粘附的细胞糊转移至第二成形装置301，将部分粘附的细胞糊保持在第二成形装置中以形成多细胞体1。然而，在一些实施方案中，例如当明胶和/或纤维蛋白原加入细胞糊中时，细胞可足够地粘附以在第一成形装置51中形成多细胞体，因此将细胞糊55转移至第二成形装置301和将细胞糊保持在第二成形装置中的步骤可不是必须的。

第一成形装置51可合适地包括毛细吸管，并且第二成形装置可包括装置，所述装置允许营养物和氧供应至细胞，同时它们保持在第二成形装置中，例如上述模具301。

多细胞体的截面形状和尺寸将基本上对应于第一成形装置的截面形状和尺寸，并任选地对应于用于制备多细胞体的第二成形装置的截面形状和尺寸，并且熟练技术人员将能够选择具有合适的成形装置，所述装置具有适于产生具有上述截面形状、横截面积、直径和长度的多细胞体的合适的截面形状、横截面积、直径和长度。

如上所述，大范围细胞类型可用于产生本发明的多细胞体。因此，一种或多种类型的细胞或细胞聚集体，人和动物体细胞，包括例如上述所有细胞类型，可用作起始材料以产生细胞糊。例如，可以使用下列细胞：例如平滑肌细胞、内皮细胞、软骨细胞、间充质细胞干细胞、肌原细胞、成纤维细胞、心肌细胞、Schwann细胞、肝细胞或中国仓鼠卵巢(″CHO″)细胞。来自预期接受者的细胞的样品(例如通过组织切片获得)或来自一种或多种建立的细胞系的细胞的样品可被培养以产生足够量的细胞来用于制备多细胞体。由来自预期接受者的细胞制成的多细胞体有利地用于避免宿主炎症反应或接受者的移植的器官或组织的其他急性或慢性排斥。

如上所述，多细胞体可以是同型细胞的或异型细胞的。为了制备同型细胞的多细胞体，细胞糊合适地是同型细胞的，即，其包括单一细胞类型的多个活细胞。用于产生同型细胞的多细胞体的细胞糊中几乎所有的活细胞是单一细胞类型的细胞，对于低含量的杂质具有一些耐受性，所述杂质包括相对少量的不同细胞类型的细胞，所述不同细胞类型的细胞对于构造体(包括由这种细胞糊制成的同型细胞的多细胞体)的成熟产生可忽略不计的影响。例如，用于制备同型细胞的多细胞体的细胞糊合适地包括第一类型的细胞，其中细胞糊中至少约90％的细胞是第一细胞类型的细胞。

为了制备异型细胞的多细胞体，另一方面，细胞糊合适地包括多于一种细胞类型的明显数量的细胞(即，细胞糊是异型细胞的)。例如，细胞糊可包含第一类型的多个活细胞和第二类型的多个活细胞，第二细胞类型不同于第一细胞类型。在另一例子中，细胞糊可包含第一细胞类型的多个活细胞、第二细胞类型的多个活细胞和第三细胞类型的多个活细胞。因此，如果使用细胞糊来制备异型细胞的多细胞体(其继而用于制备脉管组织)，细胞糊中的多个活细胞可合适地包括：(i)内皮细胞和平滑肌细胞；(ii)平滑肌细胞和成纤维细胞；(iii)内皮细胞和成纤维细胞；或(iv)内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞。如上面更详细地讨论地，当异型细胞的细胞糊用于产生多细胞体时，活细胞在成熟和粘附方法的过程中基于细胞的粘连强度的差别可″整理″，并且可恢复它们的生理构象。

除了多个活细胞，一种或多种ECM组分、或者一种或多种ECM组分的一种或多种衍生物(例如，明胶、纤维蛋白原、胶原质、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹力蛋白和/或蛋白聚糖)可合适地包括在细胞糊中以将这些物质引入多细胞体中，如上所述。加入细胞糊中的ECM组分或ECM组分的衍生物可纯化自人或动物源，或通过本领域已知的重组方法来制备。向细胞糊中加入ECM组分或者ECM组分的衍生物可促进细胞在多细胞体中的粘附。例如，明胶和/或纤维蛋白原可加入细胞糊。更特别地，10-30％明胶的溶液和10-80mg/ml纤维蛋白原放热溶液可和多个活细胞混合以形成含有明胶和纤维蛋白原的细胞悬液。然后细胞悬液可压制(例如，通过离心)以形成细胞糊。然后通过该方法形成的细胞糊可在控制环境中成形和孵育，以允许细胞彼此粘附，从而形成多细胞体。通过凝血酶纤维蛋白原可转化成纤维蛋白(例如，在印刷方法的过程中)。当ECM组分或ECM组分的衍生物(例如明胶和纤维蛋白原)加入细胞糊时，成形步骤合适地包括在单一成形装置中保持细胞糊以形成多细胞体，并且孵育步骤合适地包括在单一控制环境中孵育成形的细胞糊以允许细胞彼此粘附，从而形成多细胞体。

本发明还提供制备包含形成为期望3-D形状的多个细胞或细胞聚集体的多细胞体的方法。本发明的制备方法总体上包括下列步骤：1)提供细胞糊，所述细胞糊包含多个预选择的细胞或细胞聚集体(例如，具有期望细胞密度和粘度)；2)使所述细胞糊成形(例如，成形为期望形状)；以及3)通过成熟使多细胞体成型。

上述成型步骤可通过一个或多个步骤实现以确保多细胞体(例如，细胞单元)的粘附性。在某些方法中，在初始成熟时，细胞糊可部分稳定或部分硬化以形成多细胞体，所述多细胞体的完整性足以允许进一步处理。

根据一个实施方案，成型步骤可包括两个子步骤：A)使细胞糊保持在成形装置例如微量移液管(例如，毛细吸管)中第一时间期限(例如，预定时间期限)以用于初始成熟；和B)使成形的细胞糊沉积到保持装置例如模具中第二时间期限(例如，预定时间期限)以用于进一步成熟，其中保持装置由能够排除细胞生长或迁移到装置中或者与装置粘连的材料制成。初始成熟将提供具有足够稳定性的细胞糊，以在进一步成熟方法的处理过程中保持不变。

多种方法可用于促进进一步成熟过程。在一个实施方案中，细胞糊可在约37℃孵育一定时间期限(其可以是细胞类型依赖性的)以增强粘附性。或者或另外，细胞糊可在存在含有因子和/或离子的细胞培养基的条件下保持以增强粘附性。

例如，当圆柱形状的细胞糊在微量移液管(例如，毛细吸管)中孵育(即，初始成熟过程)直到细胞的粘连为使得圆柱体可在不破裂的情况下从微量移液管挤出后，然后细胞糊可在进一步成熟方法中进一步孵育并和培养基培养，这将有利于保持期望形状。

填料体

本发明还提供可联合使用上述多细胞体以形成期望三维生物工程组织的填料体。具体而言，本发明还提供联合使用多细胞体作为构件以用于构造生物构造的填料体(本文中也称为″填料基质单元″)，其中填料体用于限定缺乏多细胞体的期望3-D生物-构造体的域。填料体合适地是具有预定形状的体，其由能够排除细胞生长或迁移到其中或与其粘连的材料制成。填料体材料合适地可渗透营养物培养基(本文中也称为组织培养基或细胞培养基)。例如，填料体材料合适地是生物相容性凝胶材料，选自由琼脂糖、透明质酸、聚乙二醇和琼脂、或其他水凝胶或非凝胶挠性生物相容性材料构成的组。填料体可合适地用不同材料或不同浓度的相同材料形成。例如，管腔-成型填料体可由4％琼脂糖制成，而用于构造期望三维生物工程组织的剩余填料体可由2％琼脂糖制成。填料体可根据对应多细胞体的形状或大小而呈现任意形状或大小，并且优

在一些实施方案中，填料体的形状和尺寸基本上相同于它们用于构建期望三维生物工程组织的多细胞体的形状和尺寸。因此，例如，填料体可合适地具有结合多细胞体1的上述任何形状。例如，填料体和多细胞体可都是基本上圆柱形的，并且具有基本上相同的直径的基本上圆形横截面(如图2中所示)。

填料体和多细胞体可具有不同大小和/或形状，只要填料体和多细胞体可根据图案布置为使得当多细胞体彼此融合时形成期望三维生物工程组织。例如，填料体可以是基本上圆柱形，并且多细胞体可以是基本上球形(如图2中所示)。此外，填料体和多细胞体可是细长和基本上圆柱形的，但具有不同长度。熟练技术人员将认识到存在多种方式，其中改变大小和形状的填料体和多细胞体可结合以形成期望三维生物工程组织。

填料体合适地通过使合适的凝胶样材料成形为预定形状而制备。根据一个实施方案，该方法还可包括下列步骤：1)减小(降低)填料物质(即，预选择的填料物质)的粘度至液态样材料；2)使液态样材料成形(例如，成形为预选择的形状)；以及3)提高(增加)材料的粘度以固化成填料体(例如，具有预选择的形状)。

许多已知方法可用于降低填料物质的粘度，包括直接或间接加热材料、施加压力或改变其浓度。而且，许多方法可用在成形步骤中，例如沉积材料到预浇注模具中，或通过吸液管或活塞的负位移将其拉制到期望形状的室中。此外，许多已知方法可用于增加材料的粘度以固化其形状，包括直接或间接冷却材料，引起或允许溶剂除去或蒸发，允许化学作用以硬化材料，改变组分的浓度或允许通过化学或其他作用使聚合物材料交联。

例如，根据一个实施方案，琼脂糖溶液(初始为粉末相的琼脂糖混合缓冲液和水)可加热以降低其粘度并吸收(例如，吸出)到具有期望尺寸的毛细吸管(即，微量移液管)中(或通过活塞的负位移吸收到期望形状的室中)。取决于填料体的期望截面形状，可以使用具有多种截面形状的毛细吸管。例如，可以使用沿着其长度具有基本上圆形截面形状的毛细吸管来制备基本上圆柱形和具有基本上圆形横截面形状的填料体。或者，可以使用沿着其长度具有基本上方形横截面的毛细吸管来制备基本上圆柱形和具有方形截面形状的填料体。熟练技术人员将认识到以和上述使用毛细吸管来制备多细胞体类似的方式，可以制备具有无数截面形状的填料体。

吸液管(或室)中的琼脂糖溶液可冷却至室温，例如通过使空气置于吸液管的外部或使吸液管投入具有冷液体的容器中来冷去，使得其可以固化成具有期望形状的琼脂糖凝胶，即填料体。所得填料体可在特定生物构造体的构造过程中从吸液管或室中挤出。

在其组装包含多细胞体和填料体的布置的三维构造时，填料体可合适地通过生物印刷器或类似设备来制备。例如毛细吸管可以是生物印刷器的印刷头的一部分。当填料体需要用于三维构造时，毛细吸管可传送至液体源，其可建立为凝胶。例如，毛细吸管可传送以供应琼脂糖溶液，所述溶液被加热以保持其为液体状态。液体可吸出到毛细吸管中，以使液体成形为填料体的形状。然后毛细吸管可骤冷(例如，将其浸入冷水浴)以加快琼脂糖凝胶的安装。

三维结构

可以按照本发明的方法来使用上述多细胞体和填料体，以制备三维生物工程组织。简言之，根据图案布置多个多细胞体和多个填料体，使得每个多细胞体与(i)另一多细胞体或(ii)填料体中的至少一者相接触。然后，使多细胞体与至少另一多细胞体相融合以形成三维生物工程组织。然后，可以将填料体从融合多细胞体中分离以得到所述工程组织.

图2示出本发明的三维结构的一个实施方案(其统称为“101”)。结构101包括多个细长多细胞体1，合适的是，每个细长多细胞体1均与上述的细长多细胞体1相同。例如，每个细长多细胞体1均根据上述的用于制备能够在空气中打印的自支撑多细胞组织体的方法来合适地制备。将多细胞体1布置成图案，该图案中每个多细胞体与至少另一多细胞体相接触。如参照图1C而最佳理解到的那样，至少多细胞体1中的一个与多细胞体中的另一个沿着具有实质长度的接触区域相接触。尽管图1C示出的两个多细胞体1是在表面13上以并列毗邻关系布置而不是按照图2所示图案布置的，应理解，在两个多细胞体1之间的接触区域可以基本上与图1C所示的接触区域相似，无论它们是否被布置成其中它们彼此呈并列毗邻关系的图案。例如，在图2的布置中，每个多细胞体1与至少一个(例如，两个)其他的多细胞体在具有实质长度的接触区域相接触。合适的是，位于毗邻的并列关系的细长多细胞体之间的接触区域具有至少约1000微米的长度，更合适的是，至少约1厘米，更合适的是，至少约5厘米，进一步更合适的是，在约5厘米至约30厘米的范围。在另一例子中，接触区域的长度合适的是，在约1000微米至约30厘米的范围，更合适的是，在约1厘米至约30厘米的范围。接触区域的长度可对应于多细胞体1的长度。由于多细胞体1的长度没有理论上限，接触区域的长度只要在本发明的范围内可以超过30厘米(或者不同于30厘米的任意长度)，除非某人员想要克服与长多细胞体的生产相关的实际困难(例如，获得足够量的细胞糊的需要)。尽管多细胞体1在图2中彼此接触，在成熟的这个初始阶段，多细胞体没有彼此粘附.

结构还包括一个或多个填料体5，合适的是，每个填料体5均与上述的填料体相符合。例如，图2中的结构包括多个离散的填料体5。将填料体5与多细胞体布置成图案，使得每个填料体与至少一个多细胞体或另一填料体相接触。布置图2中的多细胞体1和填料体5以在结构101中形成多个未被多细胞体或填料体占据的空间17。合适的是，空间17包含组织培养基，可以通过将组织培养基倾倒在多细胞体1和填料体5的上方来将所述组织培养基添加到结构101中。因此，空间17可以促进多细胞体1中营养物和/或氧向细胞的供应(例如，在成熟的过程中)。

图2所示的结构中的多细胞体1可以是同型细胞体、异型细胞体、或其组合。特别地，多细胞体1可合适地包括任一上述的细胞类型和上述细胞类型的组合。如所示的，合适的是，所述多细胞体在所包含的细胞类型方面是基本上相同的。然而，可能一个或多个所述多细胞体包含与结构中的另一多细胞体的细胞类型所不同的细胞类型的、本发明的范围内的细胞。例如，合适的是，一个或多个多细胞体1中的每个多细胞体1中，细胞的大部分可以是第一细胞类型的细胞(例如，内皮细胞或平滑肌细胞)，并且结构101中的一个或多个其他多细胞体中的每个多细胞体中，细胞的大部分可以是不同于第一细胞类型的第二细胞类型的细胞(例如，平滑肌细胞或成纤维细胞)。多细胞体1合适地具有基本上均匀的形状。填料体还合适地具有基本上均匀的形状。此外，如图2中所示，多细胞体1具有基本上相同于填料体5的形状的形状。

布置至少一些多细胞体1(例如，所有多细胞体)以形成管样结构31。至少一个填料体5′在管样结构31中、并基本上被形成管样结构的多细胞体1所包围。例如，以六角形构型布置图2中的多细胞体1，从而形成包围填料体5之一的管样结构31。图2的六角形构型中的每个多细胞体1与至少两个相邻的细长多细胞体呈并列毗邻关系。在该布置中，管样结构31中的一个或多个填料体5′为管腔-成型填料体。如此述及所述一个或多个管腔-成型填料体5′是因为：它们防止细胞从多细胞体1迁移并向内成长至在整个管样结构31中延伸的细长空间，根据下述方法，该细长空间在所述结构成熟后成为管腔。在成熟过程中，所述一个或多个管腔-成型填料体5′不会在其中发展出任何管腔。通常，多细胞体(其能够通过成熟生产包括有多个活细胞的管状工程组织)的任何布置均可被认为是管样结构，无论该管样结构中有无填料体。由以上内容显而易见的是，所述管样结构可以不同于管状结构，这是基于以下事实：在成熟的这个阶段，毗邻多细胞体没有彼此粘附，这样，可以将一个物体推入两个形成管样结构的毗邻多细胞体之间的空间。

图7示出三维结构的另一实施方案(其统称为“201”)。除了特别指出的内容，该结构可以基本上相同于上述的和图2所示的结构。图7中的结构201包括多个多细胞体，每个多细胞体可以与上述的多细胞体1相符合。然而，在该结构201中，将两个不同组的多细胞体1′、1″布置成形成所述结构的图案。第一组的多细胞体1′中，细胞的大部分(例如，至少约90％的细胞)可以是第一细胞类型的细胞，并且第二组的多细胞体1″中，细胞的大部分(例如，至少约90％的细胞)可以是不同于第一细胞类型的第二细胞类型的细胞。例如，合适的是，第一组多细胞体1′中的细胞的大部分可以是内皮细胞，并且，合适的是，第二组多细胞体1″中的细胞的大部分可以是平滑肌细胞。作为另一个例子，合适的是，第一组多细胞体1′中的细胞的大部分可以是内皮细胞，并且，合适的是，第二组多细胞体1″中的细胞的大部分可以是成纤维细胞。作为再一个例子，合适的是，第一组多细胞体1′中的细胞的大部分可以是平滑肌细胞，并且，合适的是，第二组多细胞体1″中的细胞的大部分可以是成纤维细胞。第一组多细胞体1′被布置成包围着一个或多个管腔-成型填料体5′的六角形构型(与上述的六角形构型相似)。第二组多细胞体1″被布置成包围着第一组多细胞体1′以及一个或多个管腔-成型填料体5′的更大的六角形构型。多细胞体1′、1″共同形成管样结构231，管样结构231包括两种不同类型的细胞。布置第一组多细胞体1′以形成管样结构231的内层，布置第二组多细胞体1″以形成管样结构231的外层。因此，第一细胞类型的细胞(例如，内皮细胞)在管样结构231的内部更集中，第二细胞类型的细胞(例如，平滑肌细胞)在管样结构231的外部更集中，使得第一组多细胞体1′中内皮细胞数与非内皮细胞数的比率高于第二组多细胞体1″中内皮细胞数与非内皮细胞数的比率，或者第二组多细胞体1″中平滑肌细胞数与非平滑肌细胞数的比率高于第一组多细胞体1′中平滑肌细胞数与非平滑肌细胞数的比率。该布置可促进管状工程组织的生产，该管状工程组织具有由第一类型的细胞形成的内层和由第二类型的细胞形成的外层。例如，结构201可用于生产工程化血管，该工程化血管具有由内皮细胞形成的内层和由平滑肌细胞形成的外层。在另一例子中，布置每个第一组的多细胞体1′(其包含多个内皮细胞和多个平滑肌细胞)以形成管样结构231的内层，并布置每个第二组的多细胞体1″(其包含成纤维细胞)以形成所述管样结构的外层。因此，内皮细胞在管样结构231的内部更集中，平滑肌细胞在所述管样结构的中间部分更集中，成纤维细胞在所述管样结构的外部更集中，使得第二组多细胞体1″中成纤维细胞数与非成纤维细胞数的比率高于第一组多细胞体1′中成纤维细胞数与非成纤维细胞数的比率。在另一例子中，布置每个第一组的多细胞体1′(其包含内皮细胞)以形成管样结构231的内层，并布置每个第二组的多细胞体1″(其包含多个平滑肌细胞和多个成纤维细胞)以形成所述管样结构的外层。因此，内皮细胞在管样结构231的内部更集中，平滑肌细胞在所述管样结构的中间部分更集中，成纤维细胞在所述管样结构的外部更集中，使得第一组多细胞体1′中内皮细胞数与非内皮细胞数的比率高于第二组多细胞体1″中内皮细胞数与非内皮细胞数的比率。

图7A示出本发明的三维结构251的另一例子。该结构251与图7所示的结构基本相同，不同之处在于，它还包括第三组多细胞体1′″。第三组中的多细胞体1′″中，大部分细胞的细胞类型不同于分别构成第一和第二组中的多细胞体1′、1″的主要细胞类型的各细胞类型。第三组中的多细胞体1′″通常合适地布置成包围并毗邻第二组中的多细胞体1″的六角形构型。因此，合适的是，第三组中的多细胞体1′″包围第二组中的多细胞体1″和第一组中的多细胞体1′。合适的是，多细胞体1′、1″、1′″共同形成由三层多细胞体形成的管样结构261。一个或多个管腔-成型填料体5′沿整个管样结构261轴向延伸。如果结构251用于形成工程化血管，合适的是，第一组中的多细胞体1′中的大部分细胞为内皮细胞，合适的是，第二组中的多细胞体1″中的大部分细胞为平滑肌细胞，合适的是，第三组中的多细胞体1′″中的大部分细胞为成纤维细胞，使得第三组中的多细胞体1′″中成纤维细胞数与非成纤维细胞数的比率高于第一组多细胞体1′或第二组中的多细胞体1″中成纤维细胞数与非成纤维细胞数的比率。然而，多细胞体1′、1″、1′″可以具有本发明的范围内的其他主要细胞类型。

本发明的三维结构301的另一实施方案示于图8中。除了特别指出的内容，该结构301基本上相同于上述的和图2所示的结构结构101。在该实施方案中，用一组基本上球形的多细胞体11来代替图2所示的结构101中所使用的每个细长圆柱形的多细胞体1。合适的是，球形多细胞体11是根据上述的用于生产自支撑多细胞体的方法来生产的。当然，球形多细胞体11的形状不同于上述多细胞体1，因为它们不具备任何上述多细胞体1的细长的特性。合适的是，布置球形多细胞体11以形成包围一个或多个管腔-成型填料体5′的管样结构331。为了促进球形多细胞体的融合，每组(例如，行)多细胞体可以偏离相邻组的多细胞体，这样，每个球形多细胞体的中心在轴向方向上与相邻组中的相毗邻的球体之间的距离的中点排成一线。这能够促进融合，因为这引起了相邻的球形多细胞体11之间的接触区域的增加。虽然图8中多细胞体11只有一层包围一个以上的管腔-成型填料体5′，但是也可以用球形多细胞体11代替图7或7A中的多细胞体1′、1″和1′″。关于不同多细胞体中的细胞类型、细胞类型的组合、以及多细胞体中细胞类型的混合，球形多细胞体提供了与细长多细胞体相同的选项。

在未示出的本发明的三维结构的另一实施方案中，该结构基本上相同于上述的和图2所示的结构结构101。在该实施方案中，图2所示的结构结构101中所使用的每个细长圆柱填料体已经被一组基本上球形的填料体所代替。合适的是，球形填料体是根据上述的用于生产自支撑多细胞体的方法来生产的。当然，球形填料体的形状不同于上述填料体，因为它们不具备任何上述填料体的细长的特性。为了促进球形填料体的堆叠，每组(例如，行)填料体可以偏离相邻组的填料体，这样，每个球形填料体的中心在轴向方向上与相邻组中的相毗邻的球体之间的距离的中点排成一线。这能够促进堆叠，因为这引起了相邻的球形填料体之间的接触区域的增加。关于材料(例如，琼脂糖等)，球形填料体提供了与细长填料体相同的选项。

在未示出的本发明的三维结构的另一实施方案中，该结构基本上相同于图8所示的结构，不同之处在于，该结构还包括上述的球形填料体以代替图8所示的细长填料体的至少一部分。

图9示出了三维结构的另一实施方案的一部分(其统称为“401”)。合适的是，该结构由细长多细胞体1和多个填料体5布置而成，该细长多细胞体1基本上相同于上述的多细胞体1。图9中，多细胞体1和填料体5中的一部分被去除以示出多细胞体和填料体的内部布置。在该结构401中，将一个或多个填料体5布置为管腔-成型填料体5′。如所示的，布置管腔-成型填料体5′以防止细胞从多细胞体向内成长到第一和第二细长空间411、413。管腔-成型填料体5′基本上由多细胞体1包围。例如，合适地布置多细胞体以形成包围第一细长空间411的第一管样结构431′、和包围第二细长空间413的第二管样结构431″。尽管管样结构431′、431″并未完全示出，除了特别指出的内容以外，它们与图2中的管样结构31相似。

管样结构431″中的一者具有比另一管样结构431′的直径更大的直径。形成较小直径的管样结构431′的细长多细胞体1的至少一部分与在管状结构431′的交叉部位441处形成较大直径的管样结构的细长多细胞体1的至少一部分相接触。此外，合适的是，至少一个管腔-成型填料体5′在多细胞体1中的间隙451中延伸以将第一细长空间的一端与第二细长空间相连接，这样，由管腔-成型体5′形成于管样结构431′、431″中的管腔被相互连接。因此，该结构的成熟可以生产分支管状工程组织(例如，工程化血管)。图9所示的例子生产单一的分支，但是，可以将该技术扩展以生产高次分支结构，所述高次分支结构包括具有拥有多个不同直径的结构。并且，可以用图10中的结构501所示的球形多细胞体11来代替图9中的细长多细胞体1。合适的是，可以对由细长多细胞体1(图9)或球形多细胞体(图10)形成的管样结构431′、431″进行改变，从而以与图7和7A所示的方式相似的方式包括一个或多个额外组的多细胞体。图9和10所示的结构401、501也可应用与关于上述不同多细胞体中的细胞类型、细胞类型的组合、以及多细胞体中细胞类型的混合的相同的那些选项。

图1C示出本发明的另一三维结构601。该结构601不必包括任何填料体。相反，以并列毗邻关系布置一组细长多细胞体以形成片状样结构。虽然在图1C所示的片状结构601中只有两个多细胞体，但是可以将任意数量的额外的多细胞体与这些多细胞体并列放置，这样每个多细胞体均与至少另一多细胞体相接触以增加片状结构的宽度。

制备三维结构的方法

存在多种不同的方法使用上述多细胞体(包括细长多细胞体1和球形多细胞体11)来制备(在一些情况下，与填料体5结合)本发明范围内的上述三维生物构造。例如，一种方法通常包括：按照这样的图案布置多个细长多细胞体1，该图案使得每一个多细胞体都与至少另一个多细胞体接触，然后允许至少一个(例如，全部)多细胞体与至少另一个多细胞体融合，从而产生期望的三维生物工程组织。布置多细胞体不一定包括任何填料体(例如参见图1C)。然而，还可以布置多个多细胞体(包括上述细长多细胞体1和球形多细胞体11)和一个或多个填料体5，以便每一个多细胞体都接触至少另一个多细胞体、或填料体，然后允许多细胞体融合，以形成期望的三维生物工程组织。

可以采用多种方法以预定的图案输送多细胞体，以产生期望的三维结构。例如，可以手工将多细胞体放置为彼此接触或与填料体接触，通过用吸液管、管嘴或针头挤出将多细胞体沉积在合适位置，或者通过自动化机器将其接触定位。如图11中所示，例如，采用一种或多种工具(其可合适地包括上述的第一成形装置51、从上述的模具01中取出多细胞体的毛细吸管51′、和/或不同工具)来捡拾多细胞体(例如，将它们从上述的模具301中取出)。工具传送多细胞体至组装区域(例如玻璃表面)，在此处三维构造(例如，如图1C、2、7、7A或8-10中任意一个所示)被组装，并且该工具分配或以其他方式将多细胞体相对于任意其他的多细胞体或任何填料体(其已经被传送到组装区域并且置于被组装的构造体内)定位。

在将多细胞体置于其位置之后，适当地重复上述过程，以将另一个多细胞体、或填料体加入到构造体内(例如，通过将其与已经置于构造体内的多细胞体并排放置)。如果待组装的构造体包括一个或多个填料体，则适当地采用其他的工具(其未被示出，但是可以与成形装置51或毛细吸管51′相似)捡拾填料体5(或如上所述的那样制备填料体)、传送填料体至组装区域，并且无论何时需要填料体，均可将其分配或以其他方式放置在正在组装的构造体内的相应位置内。通过能够操作以期望的图案布置多细胞体和填料体的生物印刷器或其他自动化机器适当地承载用于将将多细胞体传送至组装区域的工具51、51′。例如，一种合适的生物印刷器在美国专利申请No.20040253365中公开，其通过引用的方式并入本文。组织工程领域内的技术人员熟悉其他合适的生物印刷器，以及用于将多细胞体(和填料体，如果它们使用的话)置于合适的构造体内的相似装置。用于将填料体传送到组装区域内的工具可以适当地为生物印刷器的另一个印刷头的一部分。生物印刷器可以具有多个印刷头，并且/或者可以将用于传送多细胞体和填料体的多个工具51、51′依次加载到一个或多个生物印刷器印刷头内。虽然采用生物印刷器或类似的装置自动地构造体是有利的，但是本发明所述的方法可以在本发明的范围内手工进行(例如，采用一个或多个毛细吸管)。

如图11中所示，可以适当地将多细胞体1置于(例如，堆叠)到一个或多个填料体5的上部。可以适当地将多细胞体1与其他的多细胞体和/或填料体5相邻设置。因此，多细胞体1并不被推入或嵌入任意的填料体5内。这可以成为“空气内印刷”，因为多细胞体并未分配到凝胶或液体内。图12所示的方法基本上类似于图11所示的方法，不同之处在于采用球形多细胞体11代替图11所示的细长多细胞体1。图11和12分别示出了制备图2和8所示的构造体的方法，但是应理解，诸如图1C、7、7A、8和9以及上述的构造体(以及其他许多构造体)可以在本发明的范围内以相似的方法制备。

一旦完成组装构造体，将组织培养基适当地倒入构造体的上部上。组织培养基可以进入多细胞体和填料体之间的间隙内，以支撑多细胞体内的细胞。使三维构造内的多细胞体彼此融合，以制备生物工程组织。“融合”是指邻接的多细胞体的细胞直接通过细胞表面蛋白的相互作用或者间接通过细胞与ECM成分或ECM成分的衍生物的相互作用彼此粘附。在融合之后，将任何包括在构造体内的填料体与工程组织分离。在包括管状结构的构造体的情况下，例如，可以出去管的外部的任何填料体(例如，通过将它们与由管状构造形成的管状结构剥离)。可以适当地将管状结构内的任何管腔-成型填料体5′从管状结构的开口端拉出。如果需要的话，管腔-成型填料体5′可以适当地由挠性材料制成，以促进从管腔内拉出填料体，这可能是有用的(例如，如果工程组织是支化管状结构)。另一个选择是由能够在融合后溶解(例如，通过升温、光火其他刺激物溶解)的材料制备填料体5和管腔-成型填料体5′。

本发明还提供通过以下方法使用多细胞体制造具有三维形状的生物构造体(例如，组织、血管或器官)，所述方法为：在预先选择的接收环境内根据预定的三维图案进一步输送多个多细胞体，使得细胞单元可以融合为所需的生物构造体。融合的两个或多个多细胞体可以具有相同或不同的形状或尺寸，并且可以含有相同或不同的细胞类型。多细胞体可以以多种方式用于生物-构造体-工程中。例如，可以制造包含所需结构的上半部和下半部的两种不同形状的多细胞体，并且可以使之接触，并且允许其融合。或者，可以组装多个多细胞体，并且允许其与填料体组合而融合为所需的形状。根据一个实施方案，当多细胞体与填料体一起使用时，工程化方法可以包括以下步骤：A)以与多个填料体的预定组合根据预定图案输送多个多细胞体，以形成层化构造体，由此多细胞体和填料体相邻接，B)将层化构造体沉积到预选择的控制环境内以进行熟化，由此多细胞体彼此融合，从而产生融合构造体；并且C)从融合构造体中除去填料体，从而形成期望的生物构造体。

此外，各多细胞体1、11可以由两种或多种细胞类型构成，从而产生含有两种或多种细胞类型的生物构造体。这些细胞类型预期可以根据其对结构表面的亲和力或其他力(如细胞相互作用)的不同而分离。例如，例如，圆柱形模制的多细胞体可以由平滑肌细胞和内皮细胞的混合物产生，从而产生管状结构，例如可移植的血管。然后可以将这些多细胞体定位(如图12所示的那样)，并且允许其融合为管状构造体。在通过构造体的管腔注入内皮细胞后，预期其移动到管状构造体的中心内表面，而平滑肌细胞主要集中于外部。作为另一个例子，如果多细胞体1包括内皮细胞和成纤维细胞的混合物，预期内皮细胞在通过构造体的管腔注入到构造体内后，移动到管状构造体的中心内表面，而成纤维细胞主要集中于外部。作为又一个例子，如果多细胞体包括内皮细胞，平滑肌细胞和成纤维细胞的混合物，则预期内皮细胞在通过构造体的管腔注入到构造体内后，移动到管状构造体的中心内表面，预期成纤维细胞移动到构造体的外层，并且可以预期平滑肌细胞移动到介于内皮细胞层和外成纤维细胞层之间的中间层。

三维工程化管状结构

本发明还提供根据本发明的方法制造细胞管状构造体。图13和14示出了通过本文所述的方法构建的实际生物构造体。图13示出在成熟并且除去填料体之后、两种不同的管状生物-构造体的侧面。图14示出在除去所有填料体之后、管状构造体的端面。

上述构造体的一个实施方案示意性地示于图15中，并且通常表示为801。三维管状结构801包括至少一个填料体5′和多个彼此粘附的活细胞，细胞形成基本上围绕至少一个填料体的管状结构801。填料体5′包含这样的适应性生物相容性材料，该材料抵抗细胞迁移和向内成长而进入材料内，并且抵抗细胞粘连到材料上。生物相容性材料也可渗透营养物。

三维管状结构的长度合适地为至少约1000微米，长度更合适地为至少约5厘米(例如，在约5厘米至约30厘米的范围内)。在一些情况下，三维管状结构适合的长度合适地为小于约30厘米。对于多细胞体，对三维管状结构的长度没有理论上限，因此应认识到，可以在本发明的范围内制备长度超过30厘米(或不同于30厘米的任意长度)的三维管状结构，只要人们自愿克服与制备长管状结构相关的困难即可(例如，获得足量的细胞，处理可能需要制备上述结构的长多细胞体等)。

与单独的多细胞体一样，三维管状结构可以由单独的细胞类型组成，或者可以包括多种细胞类型。可以使用上述的任意细胞类型制备三维管状结构。因此，例如，管状结构可以基本上为同型细胞的(即，管状结构内的几乎所有的活细胞是单一细胞类型的细胞，对于低含量的杂质具有一些耐受性，所述杂质包括相对少量的不同细胞类型的细胞，所述不同细胞类型的细胞对于管状构造体的成熟产生可忽略不计的影响)。更具体而言，管状结构的细胞可以合适地基本上由单一细胞类型的细胞组成。或者，管状结构的细胞可以合适地包含第一细胞类型的细胞，并且至少约90％的细胞为第一细胞类型的细胞。

管状结构还可以是异型细胞的，其包括两种或多种不同的细胞类型。如果管状结构是血管状结构，则管状结构有利地包括细胞类型通常在血管组织内存在的细胞(例如，内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等)。在一个例子中，管状结构的细胞包括多个第一细胞类型的活细胞和多个第二细胞类型的活细胞，第二细胞类型不同于第一细胞类型。在另一例子中，管状结构的细胞包括多个第一细胞类型的活细胞、多个第二类型的活细胞和多个第三细胞类型的活细胞。因此，对于血管状结构而言，细胞可合适地包括：(i)内皮细胞和平滑肌细胞；(ii)平滑肌细胞和成纤维细胞；(iii)内皮细胞和成纤维细胞；或(iv)内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞。此外，在血管状结构中，内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞可有利地形成模拟自然产生的组织内存在的细胞类型层。因此，在一个例子中，在含有内皮细胞和平滑肌细胞的血管状结构内，内皮细胞有利地形成基本上围绕所述至少一种填料体的内层，并且平滑肌细胞有利地形成基本上围绕所述至少一种填料体层和由内皮细胞形成的内层的层。在另一例子中，在含有内皮细胞和成纤维细胞的血管状结构内，内皮细胞有利地形成基本上围绕所述至少一个填料体的内层，并且成纤维细胞有利地形成基本上围绕所述至少一个填料体和由内皮细胞形成内层的层。作为另一个例子，在含有平滑肌细胞和成纤维细胞的血管状结构内，平滑肌细胞有利地形成基本上围绕所述至少一个填料体的内层，并且成纤维细胞有利地形成基本上围绕所述至少一个填料体和由平滑肌细胞形成的内层的层。在另一例子中，在含有内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的血管状结构内，内皮细胞合适地形成基本上围绕所述至少一个填料体的内层，平滑肌细胞合适地形成基本上围绕所述至少一个填料体和由内皮细胞形成的内层的第二层，并且成纤维细胞合适地形成基本上围绕所述至少一个填料体、由内皮细胞形成的内层和由平滑肌细胞形成的第二层的层。

三维支化管状结构也处于本发明的范围内。在该结构的一个例子中，多个活细胞形成基本上围绕作为管腔-成型填料体的一个或多个填料体的支化管状结构。管腔-成型填料体被布置，以防止活细胞向内成长为第一和第二细长空间，其中第一细长空间的端部与第二细长空间的端部相邻。

至少一个填料体的适应性生物相容性材料选自由琼脂糖、琼脂、透明质酸和聚乙二醇构成的组。可以通过将填料体从管状结构中拉出，从而将至少一个填料体与管状结构分离。

实施例

实施例1：多细胞体的制备以及使用猪平滑肌细胞的组织工程

I.猪平滑肌细胞使猪平滑肌细胞(SMC)在以前研究中所用的相同条件下生长。培养基组成为Dulbecco′s Modified Eagle低糖培养基(DMEM)，其补充有10％猪血清、10％牛血清、50mg/L of脯氨酸、20mg/L的丙氨酸、50mg/L的甘氨酸、50mg/L的抗坏血酸、12μg/L的得自血小板的生长因子BB(PDGF-BB)、12μg/L的基础成纤维细胞生长因子(bFGF)、3.0μg/L的CuSO₄、0.01M的HEPES缓冲液和1.0x10⁵单位/L的青霉素和链霉素。使细胞在涂敷于10cm Petri培养皿上的明胶(得自猪皮的明胶)上生长，并且在37℃、5％CO₂的条件下孵育。在用于多细胞体(例如，细胞单元)制备之前，将SMC次培养至第7代。需要18个长满的Petri(即，细胞培养物)培养皿来制备24个细胞单元和4个管(外径(OD)：1.5mm；内径(ID)：0.5mm；长度(L)：5cm)。

II.琼脂糖模具

(i)2％琼脂糖溶液的制备。将2g超纯低熔点(LMP)琼脂糖溶解于100ml的超纯水/缓冲溶液(1∶1，v/v)中。缓冲溶液可以是PBS＝Dulbecco’s磷酸盐缓冲液1x或HBSS＝Hanks平衡盐溶液1x。将琼脂糖溶液置于含有温水(超过80℃)的烧杯内，并且保持在热板上，直至琼脂糖完全溶解为止。只要温度高于36℃，琼脂糖溶液就保持为液体。在低于36℃时，发生相转变，粘度增加并且最终琼脂糖形成凝胶。

(ii)制备琼脂糖模具。使用纳入Petri培养皿(直径为10cm)的Teflon印刷器(即，Teflon工具)形成琼脂糖模具(图5A-5C)。将组件(Teflon印刷器+Petri培养皿)水平保持，并且将约40ml的预热的琼脂糖通过Teflon印刷器的孔倒入至Petri培养皿内。在除去所有起泡之后，将组件置于4℃下至少1小时。在琼脂糖完全凝胶化之后，除去Teflon印刷器，并且在琼脂糖内可以看到沟槽(参见图4D中的沟槽305)。将10ml的培养基加入模具中。

III.多细胞体的制备

从长满的Petri培养皿中取出培养基，并且用10ml的HBSS+2mMCaCl₂洗涤细胞。均匀地铺撒1.5ml的胰蛋白酶(0.1％)，以使得细胞从表面上脱离。将5ml的培养基+2mM CaCl₂加入到Petri培养皿中。使细胞悬液在900g的速度下离心5分钟。在除去培养基(即，上清液)之后，将细胞粒状沉淀重悬浮在200μl的培养基+2mM CaCl₂中，并且上下抽吸(即，剧烈吸移)几次，以破坏细胞团聚体，并且获得单独细胞的悬液。将溶液转移到置于15ml离心管内的2ml Eppendorf管内。通过在1300g的速度下离心2分钟而形成高密度细胞糊。除去培养基(即，上清液)，并且通过抽吸将细胞糊转移到毛细管(OD 1mm，ID 0.5或0.3mm)内，所述毛细管插入到安装于1ml Eppendorf吸移管管理器上的1ml末端内。将含有细胞糊的毛细管于37℃、5％CO₂的条件下在培养基+2mM CaCl₂内孵育15分钟。用柱塞将成形的细胞糊从毛细管内挤压到填充有培养基的琼脂糖模具的沟槽内(图3C)。将模具置于孵育器内过夜。第二天，将成熟多细胞体人工吸入(即，吸回)到毛细管(图3D)内，并置于培养基中，直到进一步使用。

IV.组织工程.

将10ml预热的2％琼脂糖溶液沉积在直径为10cm的Petri培养皿上，并且均匀地铺展，以形成均一的层。在4℃的冰箱内制备琼脂糖凝胶。用琼脂糖溶液填充毛细管，并且迅速冷却(采用吹扫的冷风或冷PBS溶液)，以形成填料体。对于管腔-成型填料体，琼脂糖浓度为4％；对于其他任何填料体，琼脂糖浓度为2％。在双筒显微镜下，使用柱塞或丝线将填料体从毛细管中挤出，并且将5cm的琼脂糖棒(即，填料体)直放在琼脂糖Petri培养皿内的琼脂糖层上。将第二填料体与第一个并置，诸如类推，直至沉积9个填料体以形成第一层。按照图11所示的方式沉积构成第二层的6个填料体。将两个多细胞体沉积在第4和第5位置，以形成管的第一层。通过在第3和第5位置沉积5个填料体和2个多细胞体而形成第三层。第四层由置于第3和第4位置的4个填料体和2个多细胞体组成。第5层由5个填料体组成(图2)。在整个沉积过程中，将少量的培养基(此时为10μl)加入到构造体的侧面，以避免材料(琼脂糖和多细胞体)的脱水。将0.5to 1ml液态琼脂糖(37℃＜T＜40℃)倒入至构造体的周围和上部，以保持其完整性。在凝胶化后，加入培养基直至构造体完整地浸入。将构造体置于孵育器内。在48小时之后，多细胞体已经彼此融合。通过从管状结构的外表面剥离琼脂糖，并且将填充管状结构的管腔的填料体从管状结构中取出，从而除去琼脂糖。然后将管转移到生物反应器内，以进一步熟化。可以使用任何市售可得的生物反应器进行熟化。

实施例2：可供选用的用于制备多细胞体以及进行组织工程的其他过程

I.各种类型的细胞的生长条件

将用钙粘蛋白传染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在Dulbecco′sModified Eagle培养基(DMEM)中生长，所述培养基补充有10％的牛胚胎血清(FBS)、抗生素(100U/mL青霉素-链霉素和25μg/mL的庆大霉素)以及400μg/ml的遗传霉素。除了庆大霉素之外，所有抗生素均购自Invitrogen公司。

人脐静脉平滑肌细胞(HUSMC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)购自美国典型培养物保藏中心(编号分别为CRL-2481和CRL-2522)。使HUSMC在DMEM内生长，所述DMEM含有Ham′s F12(比例为3∶1)、10％FBS、抗生素(100U/mL青霉素-链霉素和25μg/mL的庆大霉素)、20μg/mL内皮细胞生长补充物(ECGS)和0.1M的丙酮酸钠(NaPy)。使人皮肤成纤维细胞(HSF)在DMEM内生长，所述DMEM含有Ham′s F12(比例为3∶1)、20％FBS、抗生素(100U/mL青霉素/链霉素和25μg/mL的庆大霉素)、2mM谷氨酸盐和0.1M的NaPy。

使刚分离的猪大动脉平滑肌细胞(PASMC)在低糖DMEM中生长，所述DMEM含有10％FBS、10％猪血清、L-抗坏血酸、硫酸铜、HEPES、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-甘氨酸和青霉素G。

将所有细胞系(除了CHO之外)在涂敷于培养皿上的0.5％明胶(猪皮明胶)上培养，并且保持在37℃的含有5％CO₂的湿润气氛中。

II.多细胞体的制备

用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞培养基两次，用0.1％胰岛素处理10分钟，并且将所得细胞悬液在1,500RPM的速度下离心5分钟。将细胞重悬浮在4ml的细胞型特异性培养基内，并且在转动摇床上的10-ml组织培养烧瓶内于37℃、5％CO₂的条件下孵育1小时，以进行恢复粘附性，然后在1,500RPM的速度下离心5分钟。然后，将细胞重悬浮，并且在200μl的培养基内剧烈抽吸，然后于3,500RPM的速度下重新离心2分钟。所得细胞粒状沉淀(细胞糊)转移至内径为300μm或500μm的毛细管内，并且在37℃、5％CO₂的条件下孵育15分钟。

对于基本上球形的多细胞体，使用HSF或CHO细胞，并且将部分粘附的细胞糊机械挤出，并且剪切为相等的片段，从而允许其在转动摇床上于37℃、5％CO₂的条件下聚集过夜。根据毛细管的直径的不同，该工序提供了具有确定的大小和细胞数量的规则球状体。

对于细长多细胞体，使用PASMC、HUSMC或HSF，并且使用生物印刷器将部分粘附的细胞糊机械挤出到特别制备的非粘附性Teflon或琼脂糖模具内。在模具内于37℃、5％CO₂的条件下熟化过夜之后，多细胞体具有足以与填料体一起沉积的粘附力，从而产生实施例1所述的三维工程组织。

III.填料体的制备

为了制备琼脂糖棒，将液态琼脂糖(温度＞40℃)加载到毛细管(300或500μm ID)中。对于管腔-成型填料体，琼脂糖浓度为4％；对于所有其他填料体，琼脂糖浓度为2％。将加载的毛细管浸入冷PBS(4℃)中。由于琼脂糖不粘连毛细管，因此在凝胶化后，通过生物印刷器使用另一印头可容易地挤出连续的棒。

IV.免疫组织化学

将组织在4％的多聚甲醛内固定过夜。在脱水之后，将组织处理，以渗入并且嵌入石蜡内。总体而言，将5μm切片用苏木精-伊红染色。对于免疫组织化学法，将切片和下列抗体孵育：抗-分裂半胱天冬酶-3(与小鼠和人分裂半胱天冬酶-31∶50反应的兔抗-分裂半胱天冬酶-3多克隆抗体的1∶50稀释液)、抗-平滑肌肌动蛋白(鼠抗人平滑肌肌动蛋白(1A4)的1∶400稀释液)。使用DAB(3′-二氨基对氨基联苯四盐酸盐)目视观察第二抗体(EnVision+，与抗-鼠抗体或抗-兔抗体结合的辣根过氧化酶标记的聚合物)。将切片用Mayer′s苏木精逆染色，并且放上盖玻片，以进行显微镜观察(1X70)。

V.使用基本上球形的多细胞体的组织工程

为了将基本上球形的多细胞体组装成具有确定结构的定制管状结构，通过将填料体(例如琼脂糖棒)用作构件，设计无骨架的方法。当琼脂糖棒与基本上球形和基本上均匀的多细胞体叠层沉积时，可以对管直径、壁厚度和分支图案进行精确控制(图10)。

采用该方法，可以最初根据图8所示的图案手工构建直管。使用由HSF构成的基本球形的多细胞体组装最小的管，并且其直径为900μm，壁厚度为300μm(图16A)。在组装后，基本上球形多细胞体在5至7天内彼此融合，从而产生最终管状构造体。为了更详细地研究融合过程，用绿色或红色膜染料对CHO细胞染色，从而产生基本上球形的多细胞体，然后根据图6所示的方案进行组装。绿色和红色球状体的交替融合示于图16B中，并且显示出明显的融合边界(其中稍微掺杂)，从而证实了早期的发现。

除了管直径和壁厚度的灵活性之外，作为其独特的特征，所提出的方法还提供了构造分支大脉管结构的方式。为此，为了确保正确的腔内连接，将血管树的不同分支同时进行组装。使用由HSF构成的直径为300μm的基本上球形的多细胞体构建具有直径不同的分支的支化管状结构(图16C)。分支的直径为1.2mm(实线箭头)和0.9mm(破折箭头)(图16C)。基本上球形的多细胞体在5至7天内彼此融合以形成融合的支化管状结构(图16D)。

VI.使用细长多细胞体来形成单层和双层脉管的组织工程

为了提高速度、精密度和重现性、从而适应潜在的临床应用的方法，特别构建的三维输送装置(即，生物印刷器)适合于沉积填料体(例如，琼脂糖棒)和细长多细胞体，从而维持了上述的相同概念方法(图2)。

计算机辅助快速原型设计生物印刷技术允许根据上述的模板(图2)受控地同时沉积填料体(例如，琼脂糖棒)和细长多细胞体(例如，多细胞圆柱体)。使用装有两个垂直移动的印刷头的生物印刷器进行沉积，一个用于制备和挤出琼脂糖棒，另一个用于沉积多细胞圆柱体。琼脂糖棒的装载、凝胶化和挤出以完全自动的循环进行。与印刷头相连的毛细吸管-柱子首先移动到温热的液态琼脂糖容器，以进行装载。接着，为了允许琼脂糖的快速凝胶化，将装载的柱子浸入到PBS的冷容器内。最终，将所得琼脂糖棒挤压到Petri培养皿内。当沉积方案需要输送多细胞圆柱体时，将一个所述的圆柱体从琼脂糖模具引入到毛细吸管内。然后，将毛细吸管加载入第二印刷头，并且将多细胞圆柱体类似地挤出到琼脂糖棒上。根据图2所示的设计印刷简单的HUSMC直管。两个印刷头在计算机辅助下的移动和协作确保了预先设计的图案的重现性。在组装后，由HUSMC制成的多细胞体在2至4天内融合为最终管状结构，并且除去支撑用的琼脂糖棒。两个不同直径的融合管(外径分别为1200微米和900微米)示于图13中。

接下来，构建类似于具有基质和外膜的大脉管系统内的血管的双层脉管。为此，根据图17所示图案将HUSMC和HSF圆柱体同时用作构件。为了表明所述方法的通用性，还通过交替沉积由HUSMC和HSF组成的多细胞圆柱体(不具有体内等同性的图案)，从而设计出管(图17E)。苏木精-曙红(H&E)(图17B，17F)和HUSMC的平滑肌肌动蛋白染色(图17C，17G)表明在3天融合后的工程化构造中，SMC和成纤维细胞层或区域之间具有明显的边界。半胱天冬酶3染色显示出在管状结构的壁内出现一些程序性死亡的细胞(图17D、17H)。图17A-D中示出的更复杂双层结构需要更多时间来融合。

单一和双层管的外径在约0.9mm至约2.5mm的范围内。

在本发明的组织工程方法中，工程化的构造体仅由细胞构建，从而获得了最高可能的细胞密度。这是重要的，因为天然血管具有细胞相对稠密的基质层以及相邻的重叠SMC。本发明的方法采用多细胞三维球状体或圆柱体作为构件。之前已经通过液相系统模拟将通过细胞-细胞相互作用产生的组织粘附性进行定量，并且报导了SMC为迄今所观察到的最具有自我粘附性的细胞类型之一。多细胞组装体和液相之间的模拟对本文所用的某些形态学发展过程提供了更好的理解。本研究中所述的多细胞球状体和圆柱体的整合或融合与生理理解是一致的：在以小时计的时刻表中，由游动的、粘附的细胞构成的组织模拟高度粘性的不可压缩的液体，这是一种组织工程之前所采用的概念。

实施例3：明胶和/或纤维蛋白在制备多细胞体和三维融合的管状结构中的用途

人大动脉平滑肌细胞(HASMC)购自Cascade Biologies公司(C-007-5C)。使HASMC在补充有平滑肌生长补充物(SMGS)的培养基231中生长。使HASMC在未涂覆的细胞培养皿上生长，并且保持在37℃的含有5％CO₂的湿润气氛内。

将HASMC受胰蛋白酶作用，重悬浮于组织培养基内，并且按照上述实施例1和2的方式离心。离心之后，除去组织培养基(即，上清液)，并且将细胞(1个长满的Petri培养皿)首先重悬浮于100μl纤维蛋白原(50mg/ml，在0.9％NaCl溶液中)的溶液内，然后加入70μl的明胶溶液(20％，在磷酸缓冲液(PBS)内)。将细胞悬液再次离心，除去上清液，并且将含有细胞粒状沉淀的离心管置于37℃水浴(明胶保持液态的温度)中，直到可以将细胞糊吸入到毛细管中。然后将细胞糊吸入到毛细管中，并置于PBS的冰冷溶液内15分钟。在该步骤中，明胶凝胶化并且赋予多细胞体足够的粘附性，使得它们可以立即印刷，而无需第二成形步骤或第二孵育步骤。将多细胞体与填料体一起沉积在上述实施例1中所述的接收表面上，从而形成期望的三维生物结构(例如，管状结构)。在沉积各层以将纤维蛋白原转化为纤维蛋白之后，加入凝血酶溶液(50U/ml)。然后将三维结构置于孵育器内，以按照上述实施例1的方式进行熟化，以及多细胞体彼此之间的融合。

图18示出使用该方法在沉积12天后产生的管状结构。图18A示出在除去琼脂糖填料体之前采用上述方法产生的管状结构，并且图18B-G示出除去琼脂糖之后的上述结构。图18C和18D示出采用所述方法产生的管状结构，该结构已经沿纵向切开，以示出多细胞体之间的融合程度。图18E-18G是使用该方法制备的管状结构的横断面视图。

虽然结合具体的实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解，本发明的方法能够进行各种改变。本专利申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途和改编，其通常采用本发明的原理，并且包括用本发明所述技术领域内的已知或惯用手段得到的不同于本发明公开的内容，并且可以采用之前阐述，并且在后面所附权利要求范围内的基本特征。