FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒

摘要

本发明提供的FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒，内有DNA序列为5’-TGGCCTTGACATGTCTGGAATCCT-3’的上游引物、DNA序列为5’-ACCATTACGTGCTGGCAACAAAGG-3’的下游引物、DNA序列为5’-（FAM）-AATCAGAACACAGGTGCTGCATGGCT-（TAMRA）-3’的TaqMan探针，各试剂分别密封包装。本发明所说两种菌中共有的16SrDNA而设计，与现有技术相比，本发明仅采用1对通用引物，即可同时检测该2种致病菌，实现应急预警和突发疾病处理方面实时、快速的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒，属化学中包含酶或微生物的测定或检验技术领域。

背景技术

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）在自然界中有广泛分布，普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，可感染鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类等动物，人也可感染该菌而发生食物中毒、腹泻，影响食品安全，并且是免疫抑制患者和肝功能疾病患者的机会致病菌，是一种典型人、兽、鱼共患病病原菌，除了对水产养殖业带来巨大经济损失外，其公共卫生学意义，尤其是在临床疾病和食品安全方面，日益受到相关部门重视。

温和气单胞菌（Aeromonas sobria）又称威隆气单胞菌温和生物型（A.veronii bv.sobria），属常见的腐物寄生菌，广泛存在于水域、土壤及水生动物体内，是一种条件性致病菌，其主要致病因子是温和气单胞菌产生的多种溶血素和肠毒素，这些毒素具有多种生物活性可引起动物体发生复杂的病理变化。它能单独引起鱼类、爬行类、两栖类等冷血动物发病或与嗜水气单胞菌共同引起鱼类的败血病，是危害我国淡水养殖业的重要病原菌之一；同时，该菌也是重要的人、畜、鱼共患病病原菌，能引发腹泻、伤口感染和败血症等症状。基于此，它与嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila） 一样也在水产养殖、临床疾病和食品安全等诸方面日益受到相关部门重视。

目前，嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的检测方法多为传统的生理生化鉴定和免疫学诊断，由于它们的许多生化特征不稳定，血清型也较复杂，故采用以上方法鉴定时易产生误判。也有针对细菌的种特异性基因采用 PCR 技术进行快速检测的手段，但都只能单一地对其中一种进行检测。由于在评判致病可能性的大小时是需要一个总的致病菌含量的，所以对于同一样品要使用两种不同的试剂盒、经过两次PCR检测才能得到该两种菌的总量数据，在疫情预报、预防、控制等方面显得不够快速。

发明内容

针对上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是从嗜水气单胞菌与温和气单胞菌中选择一个共有基因为靶，提出针对该基因靶的FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒。

本发明提供的FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒，内有DNA序列为5’-TGG CCT TGA CAT GTC TGG AAT CCT-3’ 的上游引物、DNA序列为5’-ACC ATT ACG TGC TGG CAA CAA AGG-3’ 的下游引物、DNA序列为5’-（FAM）-AAT CAG AAC ACA GGT GCT GCA TGG CT-（TAMRA）-3’ 的TaqMan探针，各试剂分别密封包装。

本发明提供的FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒，针对嗜水气单胞菌与温和气单胞菌中共有的16S rDNA而设计，通过FQ-PCR可以检测样品中是否含有嗜水气单胞菌与温和气单胞菌及其所含的总量。与现有技术相比，本发明仅采用1对通用引物，即可同时定性、定量检测温和气单胞菌和嗜水气单胞菌2种致病菌，至少单一致病菌的检测时间缩短一半，实现应急预警和突发疾病处理方面实时、快速的效果。

16S rDNA中既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟，非常适合用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。嗜水气单胞菌与温和气单胞菌亲缘关系很近，均属嗜温、有运动力的气单胞菌，故具有对它们设计通用引物和探针序列的可能性。

所说试剂盒内还有密封包装的内含buffer、ExTagHS、dNTP Mixture、Mg²⁺的2X Premix EX Taq反应液；还有密封包装的无菌双蒸水；还有密封包装的DNA快速提取剂，DNA快速提取剂由重量体积百分比为0.9%的NaCl、重量体积百分比为0.01%的SDS、体积百分比为0.1%的β-巯基乙醇、其余为水构成。

所说试剂盒内的上游引物浓度为4μM、下游引物浓度为4μM、TaqMan探针浓度为2μM。

所说试剂盒内包装的试剂量是各试剂一次试验量的倍数，各试剂的一次试验量为：

4μM上游引物0.4 μL；

4μM下游引物0.4μL；

2μM TaqMan探针0.4μL；

2X Premix EX Taq反应液10μL；

无菌双蒸水6.8μL；

DNA快速提取剂50μL。

具体实施方式

1、一种FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒，由包装盒和所包装的试剂构成，每种试剂都由试剂瓶密封包装。其中所包装的试剂清单为：

4μM上游引物4 μL一支，上游引物的DNA序列为5’-TGG CCT TGA CAT GTC TGG AAT CCT-3’ ；

4μM下游引物4μL一支，下游引物的DNA序列为5’-ACC ATT ACG TGC TGG CAA CAA AGG-3’；

2μM TaqMan探针4μL一支，TaqMan探针的DNA序列为5’-（FAM）-AAT CAG AAC ACA GGT GCT GCA TGG CT-（TAMRA）-3’。

2、除上例试剂外，本例试剂盒内还包装有

2X Premix EX Taq反应液100μL一支；

无菌双蒸水68μL一支。

3、除上两例试剂外，本例试剂盒内还包装有

DNA快速提取剂0.1mL一支。

本发明提供的试剂盒，其使用方法同通常FQ-PCR方法一致，过程是：

一、样品DNA提取：

① 取样品清液1ml加入到1.5ml无菌eppendorf管中，在15000r/min下高速离心2min后，吸弃上清，保留沉淀；

在沉淀中加入DNA提取剂50μl，将沉淀混匀后100℃加热处理2min；

15000r/min下高速离心2min，取上清为模板（样品DNA）。

二、PCR

1、扩增反应液准备：

① 从冰箱中取出试剂盒；

② 根据每个PCR反应管内所需的2X Premix EX Taq反应液10μl（内含Taq 酶、buffer、dNTP Mixture、Mg2+等）、4 μM上游引物、4 μM下游引物、2μM TaqMan探针各0.4 μL、无菌双蒸水6.8 μL，按实验所需的反应管数，计算出所需的试剂量依次加入，涡旋混匀，按每管18μL分装到PCR玻璃毛细管中。

2．加样：

① 分别取2μL模板，加入到分装好扩增反应液的PCR玻璃毛细管中；

② 盖好PCR玻璃毛细管盖，然后在2000r/m下低速离心30s。

3、上机：

① 开机，并进行仪器性能自检；

② 将准备好的PCR玻璃毛细管，放置在仪器样本孔相应位置；

③ 在荧光PCR仪器上设置好以下参数：预变性：95℃30秒一个循环；扩增：变性95℃5秒、退火延伸63 ℃20秒共35个循环；在63℃收集荧光信号，收集方式设为“单点收集（SINGLE）；仪器检测通道选择“F1”； 温度变化速率选择20℃/秒。

④ 选择运行（RUN）后，开始进行PCR扩增。

4、阈值设定与检测结果判定：

① 阈值设定原则为超过阴性对照扩增线（无规则噪音线）的最高点。

② ct值＜30时提示样本中含有嗜水气单胞菌和温和气单胞菌，ct值在31~35之间提示为不确定样本需重新增菌后再次测定。

③ 无ct值显示则提示样本中不含有嗜水气单胞菌和温和气单胞菌或数量极少低于检测限。

④ 若需定量检测时，要加入4~5个不同浓度的标准品与样本同时检测，荧光定量PCR仪会根据各个标准品测得的Ct值绘制成标准曲线后仪器自动计算阳性标本的定量数据，并在电脑界面上显示浓度。

阴性与阳性对照不能正确显示ct值则判定检测失败。

使用本发明提供的试剂盒、用FQ-PCR检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌还有如下特点：

检测速度：

模板DNA制备与扩增反应所需时间分别为5分钟与25分钟，从样本接收到结果报告仅需30分钟左右。

检测灵敏度：

检出限为5.0×10¹cfu/ml，在5.0×10³cfu/ml—5.4×10⁷cfu/ml的范围内标准曲线呈良好的线性关系。

批内重复性：

分别取5份不同浓度的嗜水气单胞菌与温和气单胞菌DNA样本，每个浓度分成3份进行测试，通过用测定值的均值                                                计算ct值的标准差（s）和变异系数（cv）来验证批内重复性见下表：

特异度：

在35个循环内对副溶血弧菌（ATCC33847）、金黄色葡萄球菌(ATCC25723、ATCC29213)，大肠埃希菌(ATCC25922)、豚鼠气单胞菌、麦氏弧菌、O139群霍乱弧菌、O1群霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、铜绿色假单胞菌、甲型副伤寒杆菌、鸭沙门氏菌、福氏志贺菌、宋氏志贺菌、肠出血型大肠埃希菌O157（933）、单增李斯特菌的纯菌DNA提取液（模板），除了嗜水气单胞菌与温和气单胞菌外其余菌株均无扩增现象。