在生理pH缓冲液中具有增强的溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物

摘要

本发明公开了具有改善的溶解性和/或半衰期而仍然保持胰高血糖素激动剂活性的修饰的胰高血糖素肽。通过将原始氨基酸替换为带电的氨基酸和/或向肽的羧基末端添加带电的氨基酸对胰高血糖素肽进行修饰。可以通过聚乙二醇化或通过添加选自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23的羧基末端肽或通过这二者对修饰的胰高血糖素激动剂进行进一步修饰，以进一步增强胰高血糖素激动剂类似物的溶解性。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求下列优先权：2008年6月17日提交的美国临时专利申请号61/073,193，2008年7月3日提交的美国临时专利申请号61/078,165和2008年8月20日提交的美国临时专利申请号61/090,415。每个申请的公开内容均明确地通过引用的方式全文并入本文。

背景技术

前胰高血糖素原(pre-proglucagon)是158个氨基酸的前体多肽，其在不同组织中被处理以形成多个不同的胰高血糖素原衍生的肽，包括胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-1)和胃泌酸调节素(OXM)，它们参与众多生理学功能，包括葡萄糖体内平衡、胰岛素分泌、胃排空和肠生长，以及食物摄入的调节。胰高血糖素是29个氨基酸的肽，其对应于前胰高血糖素原的氨基酸33至61，而GLP-1作为37个氨基酸的肽产生，其对应于前胰高血糖素原的氨基酸72至108。

当血糖水平降得太低以致于不能为身体活动提供足够能量时，发生低血糖症。在成人或10岁以上的儿童中，低血糖症较不常见，除非是作为糖尿病治疗的副作用，但是它可以来源于其它药物治疗或疾病、激素或酶缺乏、或肿瘤。当血糖开始下降时，由胰腺产生的激素胰高血糖素向肝脏发出信号，使肝脏分解肝糖原并释放葡萄糖，使血糖水平朝着正常水平升高。因此，普遍认为胰高血糖素在葡萄糖调节中的作用是抵消胰岛素的作用并维持血糖水平。但是对于糖尿病而言，这种针对低血糖症的胰高血糖素响应可能被破坏，使葡萄糖水平难以恢复至正常范围。

低血糖症是威胁生命的事件，其需要立即进行医疗关注。给予胰高血糖素是已经建立起来的治疗急性低血糖症的药物治疗，它可以在给药数分钟内恢复葡萄糖的正常水平。当胰高血糖素用于低血糖症的急性医疗处理时，将晶体形式的胰高血糖素溶解于弱酸缓冲液，并通过肌肉内注射该溶液。虽然该治疗是有效的，但方法很麻烦，且对于某些半昏迷状态的人员有危险。因此，需要这样一种胰高血糖素类似物，其保持母体分子的生物学表现但在相关的生理条件下具有足够的溶解性和稳定性，从而其可以预先配制为即用型注射溶液。

另外，鼓励糖尿病患者维持接近正常的血糖水平以延迟或预防微血管并发症。该目标的实现通常需要强化胰岛素治疗。在努力达到该目标的过程中，医生曾遇到过他们的糖尿病患者中的低血糖症的频率和严重性显著升高的问题。因此，需要改善的药物和方法来治疗糖尿病，所述药物和方法相对于目前的胰岛素治疗而言，较不容易诱导低血糖症。

如本文所述，提供了高效力的胰高血糖素激动剂，其在适合商用的药物组合物中在生理pH时具有升高的生物物理稳定性和水溶性。原始胰高血糖素在生理pH范围内既不可溶也不稳定，因此，其必须作为干燥产品生产，需要复原和立即使用。本文描述的胰高血糖素类似物具有增强的物理性质，这使其特别适合用于目前应用原始激素的目前的医疗环境中。根据一个实施方式，这些化合物可以用于制备用于治疗低血糖症的预先配制的即用型注射溶液。或者，胰高血糖素激动剂可以与胰岛素一起给药以缓冲胰岛素的效应，以便允许更稳定地维持血糖水平。另外，下文详细描述了包含本文公开的修饰的胰高血糖素肽的组合物的其它有益用途。

发明简述

本发明的一个实施方式提供了胰高血糖素肽，其保持胰高血糖素受体的活性并相对于原始胰高血糖素肽(SEQ ID NO：1)表现出改善的溶解性。原始胰高血糖素在水溶液中，特别是在生理pH时溶解性差，倾向于随时间发生聚集和沉淀。相反，相对于原始胰高血糖素，本发明的一个实施方式的胰高血糖素肽在25℃在6-8的pH，或6-9的pH，例如在pH为7时，在24小时后表现出至少2倍、5倍或更高的溶解性。

在一个实施方式中，胰高血糖素肽保持原始胰高血糖素的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％的活性、80％的活性、85％的活性、或90％的活性(按照胰高血糖素肽的EC50相对于胰高血糖素的EC50的反比计算，例如使用大体上如实施例13中描述的测定法通过cAMP的产生来测定)。在一个实施方式中，本发明的胰高血糖素肽具有等于或大于胰高血糖素的活性(与本文的“效力”一词同义使用)。在一些实施方式中，胰高血糖素肽保持多达约100％、1000％、10,000％、100,000％或1,000,000％的原始胰高血糖素活性。

胰高血糖素通常具有大约1％的原始GLP-1在GLP-1受体上的活性。GLP-1(7-36)酰胺(SEQ ID NO：57)或GLP-1(7-37)酸(SEQ ID NO：58)是GLP-1的生物学有效形式，它们在GLP-1受体上具有基本上相同的活性。相对于GLP-1受体，胰高血糖素对于胰高血糖素受体也具有10至20倍高的选择性(选择性按照胰高血糖素对于胰高血糖素受体的EC50相对于胰高血糖素对于GLP-1受体的EC50的反比计算)。例如，在某测定中，胰高血糖素对于胰高血糖素受体的EC50是0.22nM并且胰高血糖素对于GLP-1受体的EC50是3.85nM，则计算的选择性是17.5倍。可以通过例如使用大体上如实施例13描述的测定法通过cAMP的产生来测定活性。在一些实施方式中，本发明的胰高血糖素肽表现出小于大约5％、4％、3％、2％或1％的原始GLP-1在GLP-1受体上的活性，和/或相对于GLP-1受体而言，其对于胰高血糖素受体的选择性是大于约5倍、10倍、或15倍。例如，在一些实施方式中，本发明的胰高血糖素肽表现出小于5％的原始GLP-1在GLP-1受体上的活性，并且相对于GLP-1受体而言，其表现出对于胰高血糖素受体的大于5倍的选择性。

本发明的任何胰高血糖素肽还可能另外表现出改善的稳定性和/或减少的降解，例如，在25℃在24小时后保持至少95％的初始肽。在一些实施方式中，本发明的胰高血糖素肽表现出改善的稳定性，从而在至少20℃(例如21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、至少27.5℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少50℃)以及小于100℃、小于85℃、小于75℃，小于或70℃的温度，在溶液中1周或更长时间(例如，2周、4周、1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、12个月)之后，通过紫外线(UV)检测器在280nm可以检测到至少75％(例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、大于95％，直至100％)浓度的肽，或者小于大约25％(例如，小于20％、小于15％、小于10％，小于5％、4％、3％、2％、1％、直至0％)的降解的肽。

根据一个实施方式，提供了具有改善的溶解性的胰高血糖素肽，其中通过氨基酸替换和/或添加对所述肽进行修饰，所述氨基酸替换和/或添加向所述肽的C-末端部分引入带电的氨基酸，在一个实施方式中，是在SEQ ID NO：1的位置27的C-末端的位置。任选地，可以在C-末端部分引入1个、2个或3个带电的氨基酸，在一个实施方式中，是在(相对于)位置27的C-末端。根据一个实施方式，位置28和/或29的原始氨基酸被替换为带电的氨基酸，和/或1至3个带电的氨基酸被添加到肽的C-末端，在位置29之后。在示例性实施方式中，所述带电的氨基酸中的1个、2个或全部是带负电的。可以对胰高血糖素肽进行另外的仍允许它保留胰高血糖素活性的修饰，例如保守性替换。

根据一个示例性实施方式，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，或其类似物，所述类似物相对于原始胰高血糖素含有1至3个另外的氨基酸修饰，或它的胰高血糖素肽激动剂类似物。SEQ ID NO：11代表修饰的胰高血糖素肽，其中原始蛋白的位置28的天冬酰胺残基替换为天冬氨酸。在另一个示例性实施方式中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列，其中原始蛋白的位置28的天冬酰胺残基替换为谷氨酸。其它示例性实施方式包括SEQ ID NO：24、25、26、33、35、36和37的胰高血糖素肽。

根据另一个实施方式，提供了在胰高血糖素受体上具有增强的效力的胰高血糖素肽，其中所述肽包含在原始胰高血糖素(SEQ ID NO：1)位置16上的氨基酸修饰。通过非限制性举例方式，这样的增强的效力可以通过以下列氨基酸替换位置16的天然存在的丝氨酸来提供：谷氨酸或其它带负电的具有4个原子长度的侧链的氨基酸，或谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱氨酸中的任一个，或具有包含至少一个杂原子(例如N、O、S、P)的侧链和具有大约4个(或3-5个)原子长度的侧链的带电的氨基酸。以谷氨酸替换位置16的丝氨酸使胰高血糖素在胰高血糖素受体上的活性增强至少2倍、4倍、5倍、直至大于10倍。在一些实施方式中，相对于GLP-1受体，胰高血糖素肽保持对于胰高血糖素受体的选择性，例如至少5倍、10倍、或15倍的选择性。

可以通过向肽连接亲水性部分进一步改善前述任意化合物的溶解性。引入这样的基团还会延长作用时间，例如，按照循环中的延长的半衰期来度量。在一个实施方式中，亲水性部分是聚乙二醇(PEG)链或其它水溶性聚合物，其共价连接至所述胰高血糖素肽的位置16、17、21、24、29、40上的一个或多个氨基酸残基、C-末端延伸内的氨基酸残基或C-末端氨基酸的侧链。在一些实施方式中，在该位置的原始氨基酸替换为具有适合与亲水性部分交联的侧链的氨基酸，以促进亲水性部分与肽的连接。示例性的氨基酸包括Cys、Lys、Orn、高半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸(Ac-Phe)。在其它实施方式中，在C-末端向肽添加经修饰为包含亲水性基团的氨基酸。根据一个实施方式的聚乙二醇链的分子量介于大约500至大约40,000道尔顿的范围。在一个实施方式中，聚乙二醇链的分子量介于大约500至大约5,000道尔顿的范围。在一个另实施方式中，聚乙二醇链的分子量介于大约10,000至大约20,000道尔顿。在其它示例性实施方式中，聚乙二醇链的分子量介于大约20,000至大约40,000道尔顿。

根据一些实施方式，本文公开的胰高血糖素肽被修饰为包含酰基或烷基，例如对于天然存在的氨基酸而言不是原始的(non-native)酰基或烷基。酰基化或烷基化可以增加循环中的胰高血糖素肽的半衰期，可以有利地延迟在胰高血糖素和/或GLP-1受体上的作用起始和/或延长作用的持续时间，和/或提高对诸如DPP-IV的蛋白酶的抗性。酰基化或烷基化还可以增强肽在中性pH的溶解性。如本文所示，酰基化之后，维持了(如果没增强)胰高血糖素肽在胰高血糖素受体和GLP-1受体上的活性。

在一些方面，胰高血糖素肽通过间隔子共价连接到酰基或烷基，所述间隔子是例如氨基酸、二肽、三肽、亲水性双官能间隔子或疏水性双官能间隔子。在一些方面，在通过间隔子使肽酰基化之后，观察到在GLP-1和胰高血糖素受体上的活性增强。在选择的方面，诸如，例如，当肽缺少分子内桥(例如，共价分子内桥)的时候，相对于那些其中酰基不通过间隔子连接到肽上的酰基化的肽而言，在通过间隔子使肽酰基化之后，观察到在GLP-1和胰高血糖素受体上的活性的进一步增强。根据一些实施方式，间隔子是氨基酸或具有长度为3至10个原子(例如6至10个原子)的氨基酸或肽骨架结构的二肽。根据一些具体实施方式，间隔子和酰基或烷基的总长度是14至28个原子，例如17至28个，19至26个原子，19至21个原子。用于增强胰高血糖素活性目的的合适的间隔子在本文中另有详细描述。在一些实施方式中，本文描述的的酰基化或烷基化的肽还包含选择性地降低在GLP-1受体上的活性的修饰，例如位置7的Thr的修饰，例如以缺少羟基的氨基酸如氨基丁酸(Abu)或Ile替换位置7的Thr；删除在位置27或28的氨基酸的C-末端的(一个或多个)氨基酸(例如删除位置28和29的氨基酸中的一个或两个)，从而产生长度为27或28个氨基酸的肽。

可以在亲水性部分连接的相同氨基酸位置或在不同的氨基酸位置进行胰高血糖素肽的酰基化或烷基化。

在一些实施方式中，本发明提供了修饰为包含共价连接至胰高血糖素肽的位置10的氨基酸的酰基或烷基的胰高血糖素肽。胰高血糖素肽还可以在胰高血糖素肽的位置10的氨基酸和酰基或烷基之间包含间隔子。在一些实施方式中，所述酰基是脂肪酸或胆汁酸或其盐，例如C4至C30脂肪酸、C8至C24脂肪酸、胆酸、C4至C30烷基、C8至C24烷基、或包含胆汁酸的甾(steroid)部分的烷基。间隔子是具有结合酰基或烷基的适当的反应性基团的任意部分。在示例性的实施方式中，间隔子包含氨基酸、二肽、三肽、亲水性双官能间隔子例如氨基聚(烷氧基)羧酸基团(amino poly(alkyloxy)carboxylate)，或疏水性双官能间隔子。在一些实施方式中，间隔子选自Trp、Glu、Asp、Cys和包含NH₂(CH₂CH₂O)n(CH₂)_mCOOH的间隔子，其中m是1至6的任意整数，n是2至12的任意整数。这样的酰基化或烷基化的胰高血糖素肽还可以包含亲水性部分，任选为聚乙二醇。前述任意胰高血糖素肽可以包含两个酰基或两个烷基，或其组合。

本发明还包括所述胰高血糖素激动剂的药学上可接受的盐。

在其它示例性实施方式中，可以通过向胰高血糖素肽的羧基末端添加第二个肽而对任意前述化合物进行进一步修饰以改变其药学特性。在一个实施方式中，胰高血糖素肽通过肽键共价结合至第二个肽，其中所述第二个肽包含选自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的序列。

在一些实施方式中，位置1或2的修饰可以增加肽对二肽基肽酶IV(DPP IV)切割的抗性。例如，位置2的氨基酸可以替换为D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸或氨基异丁酸。或者或另外，位置1的氨基酸可以替换为D-组氨酸(D-His)、去氨基组氨酸(desaminohistidine)、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸、高组氨酸、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、或α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。

观察到位置2的修饰(例如位置2的AIB)以及在一些情况下位置1的修饰(例如位置1的DMIA)可降低胰高血糖素活性，有时显著降低；令人惊奇的是，胰高血糖素活性的这种降低可以通过胰高血糖素的C-末端部分(大约是氨基酸12-29)中的α-螺旋结构的稳定化得以恢复。在一些实施方式中，稳定化是通过位置“i”和“i+4”的氨基酸之间的共价键实现的，其中i是12至25的任意整数。在一些具体实施方式中，“i”和“i+4”是12和16，16和20，或，20和24，或，24和28。在一些实施方式中，该共价键是位置16的谷氨酸和位置20的赖氨酸之间的内酰胺桥。在示例性实施方式中，桥或接头的长度是大约8个(或大约7-9个)原子。在其它实施方式中，稳定化是通过位置“j”和“j+3”的氨基酸之间的共价键实现的，其中j是12至27的任意整数。在示例性实施方式中，桥或接头的长度是大约6个(或大约5-7个)原子。在其它实施方式中，稳定化是通过位置“k”和“k+7”的氨基酸之间的共价键实现的，其中k是12至22的任意整数。在一些实施方式中，该共价键是分子内桥而非内酰胺桥。例如，合适的形成共价键的方法(即形成共价分子内桥的方法)包括下列的任一个或多个：烯烃复分解(olefin metathesis)、基于羊毛硫氨酸的环化、二硫桥或修饰的含硫桥的形成、使用α，ω-二氨基烷烃系绳(diaminoalkane tethers)、金属-原子桥的形成和其它的肽环化方式。

在其它实施方式中，通过非共价键(即非共价的分子内桥)使螺旋稳定化，包括但不限于氢键、离子相互作用和盐桥。

在本发明的其它实施方式中，胰高血糖素肽的C-末端部分(大约是氨基酸12-29)中的α-螺旋结构的稳定化通过在保持想要的活性的位置上故意引入一个或多个α，α-双取代氨基酸来实现。在一些实施方式中，胰高血糖素肽的位置16、17、18、19、20、21、24或29中的1个、2个、3个、4个或更多个被α，α-双取代氨基酸替换。例如，以氨基异丁酸(AIB)替换胰高血糖素肽的位置16提供了不存在盐桥或内酰胺时的稳定的α-螺旋。这样的肽在本文中被认为是不含分子内桥的肽。在具体的方面，通过引入一个或多个α，α-双取代氨基酸而不引入共价的分子内桥例如内酰胺桥、二硫桥来实现α-螺旋的稳定化。这样的肽在本文中被认为是不含共价的分子内桥的肽。在一些实施方式中，位置16、20、21或24中的1个、2个、3个、或更多个被AIB替换。

因此，在一些实施方式中，本发明提供了具有胰高血糖素激动剂活性的胰高血糖素肽，其包含以下氨基酸序列：

X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z(SEQ ID NO：39)，其中具有1至3个氨基酸修饰，

其中X1和/或X2是非原始氨基酸，该非原始氨基酸降低胰高血糖素肽对二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性(或增加对其的抗性)，

其中Z选自-COOH(天然存在的C-末端羧酸基团)、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH和Y-COOH，其中Y是1至2个氨基酸，并且，

其中分子内桥，优选共价键，将位置i的氨基酸和位置i+4的氨基酸的侧链连接起来，其中i是12、16、20或24。

在一些实施方式中，分子内桥是内酰胺桥。在一些实施方式中，SEQ ID NO：39的位置i和i+4的氨基酸是Lys和Glu，例如Glu16和Lys20。在一些实施方式中，X1选自D-His、N-甲基-His、α-甲基-His、咪唑乙酸、去氨基-His、羟基-HIs、乙酰基-His、高组氨酸和α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)。在其它实施方式中，X2选自D-Ser、D-Ala、Gly、N-甲基-Ser、Val和α氨基异丁酸(AIB)。在一些实施方式中，胰高血糖素肽在氨基酸位置16、17、20、21、24、29、40中的任意位置、C-末端延伸内或C-末端氨基酸共价连接至亲水性部分。在示例性实施方式中，该亲水性部分共价连接至这些位置中的任意位置上的Lys、Cys、Orn、高半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基。示例性的亲水性部分包括聚乙二醇(PEG)，例如，分子量为大约1,000道尔顿至大约40,000道尔顿，或大约20,000道尔顿至大约40,000道尔顿。

在其它实施方式中，本发明提供了具有胰高血糖素激动剂活性的胰高血糖素肽，其包含以下氨基酸序列：

X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z(SEQ ID NO：39)，

其中X1和/或X2是非原始氨基酸，该非原始氨基酸降低胰高血糖素肽对二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性(或增加对其的抗性)，

其中胰高血糖素肽的位置16、20、21和24中的1个、2个、3个、4个或更多个被α，α-双取代氨基酸替换，并且

其中Z选自-COOH(天然存在的C-末端羧酸基团)、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH和Y-COOH，其中Y是1至2个氨基酸。

前述胰高血糖素肽或类似物的示例性的另外的氨基酸修饰包括：位置7的Thr替换为缺少羟基的氨基酸例如Abu或Ile，任选地，所述替换与包含共价连接至(任选地，通过间隔子)酰基或烷基(其中所述酰基或烷基对于天然存在的氨基酸而言不是原始的)的侧链的氨基酸的替换或添加相联合，位置12的Lys被Arg替换；位置15的Asp被Glu替换；位置16的Ser被Thr或AIB替换；位置20的Gln被Ser、Thr、Ala或AIB替换；位置21的Asp被Glu替换；位置24的Gln被Ser、Thr、Ala或AIB替换；位置27的Met被Leu或Nle替换；位置28的Asn被带电的氨基酸替换；位置28的Asn被选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的带电的氨基酸替换；位置28被Asn、Asp或Glu替换；位置28被Asp替换；位置28被Glu替换；位置29的Thr被带电的氨基酸替换；位置29的Thr被选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的带电的氨基酸替换；位置29被Asp、Glu或Lys替换；位置29被Glu替换；在位置29之后插入1-3个带电的氨基酸；在位置30(即在位置29之后)插入Glu或Lys；任选地在位置31插入Lys；向C-末端添加SEQ ID NO：20，任选地，其中位置29的氨基酸是Thr或Gly；替换为或添加共价连接至亲水性部分的氨基酸；或其组合。

在另一个示例性实施方式中，可以通过修饰SEQ ID NO：1的位置15的氨基酸对前述任意的肽进行进一步修饰以改善稳定性，以便减少该肽随时间的降解，特别是在酸性或碱性缓冲剂中的降解。在示例性的实施方式中，位置15的Asp替换为谷氨酸、高谷氨酸、半胱氨酸或高半胱氨酸。

或者，可以通过修饰SEQ ID NO：1的位置16的氨基酸对本文描述的任意胰高血糖素肽进行进一步修饰以改善稳定性。在示例性的实施方式中，位置16的Ser替换为Thr或AIB，或者上文描述的增强在胰高血糖素受体上的效力的任意氨基酸替换。这样的修饰减少Asp15-Ser16之间的肽键的切割。

在胰高血糖素受体上的维持的或增强的活性可以通过以谷氨酰胺类似物修饰位置3的Gln来实现。例如，在位置3包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素肽可以显示出原始胰高血糖素(例如SEQ ID NO：1)在胰高血糖素受体上的大约5％、大约10％、大约20％、大约50％或大约85％或更高的活性。在一些实施方式中，在位置3包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素肽可以显示出相应的胰高血糖素肽(其与包含谷氨酰胺类似物的肽具有相同的氨基酸序列，除了位置3的修饰的氨基酸之外)(例如SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：70)在胰高血糖素受体上的大约20％、大约50％、大约75％、大约100％、大约200％或大约500％或更高的活性。在一些实施方式中，在位置3包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素肽表现出在胰高血糖素受体上的增强的活性，但该增强的活性不超过原始胰高血糖素或相应的胰高血糖素肽(其与包含谷氨酰胺类似物的肽具有相同的氨基酸序列，除了位置3的修饰的氨基酸之外)的活性的1000％、10,000％、100,000％或1,000,000％。

在一些实施方式中，所述谷氨酰胺类似物是天然存在的或非天然存在的包含结构I、II或III的侧链的氨基酸：

结构I

结构II

结构III

其中R¹是C_0-3烷基或C_0-3杂烷基；R²是NHR⁴或C_1-3烷基；R³是C_1-3烷基；R⁴是H或C_1-3烷基；X是NH、O或S；并且Y是NHR⁴、SR³或OR³。在一些实施方式中，X是NH或Y是NHR⁴。在一些实施方式中，R¹是C_0-2烷基或C₁杂烷基。在一些实施方式中，R²是NHR⁴或C₁烷基。在一些实施方式中，R⁴是H或C¹烷基。在示例性的实施方式中，提供了包含结构I的侧链的氨基酸，其中R¹是CH₂-S，X是NH，并且R²是CH₃(乙酰氨基甲基-半胱氨酸，C(Acm))；R¹是CH₂，X是NH，并且R²是CH₃(乙酰二氨基丁酸，Dab(Ac))；R¹是C₀烷基，X是NH，R²是NHR⁴，并且R⁴是H(氨基甲酰二氨基丙酸，Dap(urea))；或R¹是CH₂-CH₂，X是NH，并且R²是CH₃(乙酰鸟氨酸，Orn(Ac))。在示例性的实施方式中，提供了包含结构II的侧链的氨基酸，其中R¹是CH₂，Y是NHR⁴，并且R⁴是CH₃(甲基谷氨酰胺，Q(Me))；在示例性的实施方式中，提供了包含结构III的侧链的氨基酸，其中R¹是CH₂并且R⁴是H(蛋氨酸-亚砜，M(O))。在具体的实施方式中，位置3的氨基酸替换为Dab(Ac)。例如，胰高血糖素激动剂可以包含SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74的氨基酸序列。

胰高血糖素肽在胰高血糖素受体上的增强的活性还可以通过将酰基或烷基(例如对于天然存在的氨基酸而言不是原始的酰基或烷基，例如C4-C30脂肪酰基，C4-C30烷基)共价结合至胰高血糖素肽的氨基酸的侧链来实现。在一些实施方式中，酰基化或烷基化的胰高血糖素肽缺少分子内桥，例如共价的分子内桥(例如内酰胺)。在一些方面，酰基或烷基通过间隔子连接至胰高血糖素肽的氨基酸侧链，例如长度为3-10个原子的间隔子。在一些实施方式中，酰基或烷基通过间隔子连接至胰高血糖素肽的位置10的氨基酸的侧链。在具体的实施方式中，酰基化或烷基化的胰高血糖素肽还包括选择性地降低肽在GLP-1受体上的活性的修饰。例如，酰基化或烷基化的胰高血糖素肽可以包含C-末端α羧酸基团(carboxylate)，以不含羟基的氨基酸例如Abu或Ile替换位置7的Thr，删除在位置27或28的氨基酸C-末端的(一个或多个)氨基酸以产生27或28个氨基酸的肽，或其组合。

在一些实施方式中，可以通过修饰位置20、21、24或27中的任意1个、2个、3个或所有4个来对本文描述的任意胰高血糖素肽进行进一步修饰以减少各个氨基酸位置的降解。示例性的实施方式包括以Ala或AIB替换位置20的Gln，以Glu替换位置21的Asp，以Ala或AIB替换位置24的Gln，以Leu或Nle替换位置27的Met。删除或替换蛋氨酸会减少由于蛋氨酸氧化造成的降解。删除或替换Gln或Asn会减少由于Gln或Asn的去酰胺化造成的降解。删除或替换Asp会减少通过Asp的脱水以形成环式琥珀酰亚胺中间体然后异聚化为异天冬氨酸而发生的降解。

在一些实施方式中，可以对本文描述的任意胰高血糖素肽进行修饰而不对其在胰高血糖素受体上的活性造成不利影响，并仍然保持至少部分的胰高血糖素受体活性。例如，可以在位置2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29中的任意位置进行保守性或非保守性替换、添加或删除。在示例性的实施方式中，位置12的Lys被替换为Arg。在其它示例性的实施方式中，位置29和/或28的氨基酸以及任选地位置27的氨基酸被删除。

当在过表达胰高血糖素受体的HEK293细胞中就cAMP的诱导进行测试时(例如使用实施例13的测定法)，本文描述的任意胰高血糖素肽可以显示出在人类胰高血糖素受体上的大约100nM、75nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、1nM或更低的EC50。通常来讲，聚乙二醇化的肽将显示出比未经聚乙二醇化的肽更高的EC50。例如，当未经聚乙二醇化时，本文描述的胰高血糖素肽在胰高血糖素受体上可以显示出至少20％(例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、100％、150％、200％、400％、500％或更高)的原始胰高血糖素(SEQ ID NO：1)在胰高血糖素受体上的活性。在一些实施方式中，当缺少亲水性部分时，本文描述的胰高血糖素肽显示出指明的百分比的原始胰高血糖素在胰高血糖素受体上的活性，但当包含亲水性部分时，其显示出降低的百分比的原始胰高血糖素在胰高血糖素受体上的活性。例如，当经过聚乙二醇化之后，本文描述的胰高血糖素肽在胰高血糖素受体上可以显示出至少2％(例如至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％)的原始胰高血糖素的活性。在一些实施方式中，本文描述的胰高血糖素肽可以显示出任意上述指明的活性但不超过1000％、10,000％、100,000％或1,000,000％的原始胰高血糖素在胰高血糖素受体上的活性。

在一些具体实施方式中，胰高血糖素肽包含(a)赋予DPP-IV抗性的在位置1和/或2的氨基酸修饰，例如在位置1替换为DMIA，或在位置2替换为AIB；(b)位置12-29内的分子内桥，例如在位置16和20，或以α，α-双取代氨基酸替换位置16、20、21和24的一个或多个氨基酸；任选地(c)连接至亲水性部分，例如PEG，例如通过位置24、29的Cys连接或在C-末端氨基酸连接；任选地(d)位置27的氨基酸修饰：以例如Nle替换Met；任选地(e)位置20、21和24的减少降解的氨基酸修饰；和任选地(f)连接至SEQ ID NO：20。当所述胰高血糖素肽连接至SEQ ID NO：20时，在某些实施方式中，位置29的氨基酸是Thr或Gly。在其它具体实施方式中，胰高血糖素肽包含(a)Asp28Glu29或Glu28Glu29或Glu29Glu30或Glu28Glu30或Asp28Glu30；和任选地(b)位置16的氨基酸修饰：以例如Thr或AIB替换Ser；和任选地(c)位置27的氨基酸修饰：以例如Nle替换Met；和任选地(d)位置20、21和24的减少降解的氨基酸修饰。在具体的实施方式中，所述胰高血糖素肽是T16，A20，E21，A24，Nle27，D28，E29。

胰高血糖素肽可以是二聚体、三聚体或更高级的多聚体的一部分，所述多聚体包含至少2个、3个或更多个通过接头连接的肽，其中至少一个或两个肽是胰高血糖素肽。二聚体可以是同型二聚体或异型二聚体。在一些实施方式中，接头选自双官能巯基交联剂和双官能胺交联剂。在一些实施方式中，所述接头是PEG，例如5kDa PEG、20kDa PEG。在一些实施方式中，所述接头是二硫键。例如，二聚体的每个单体可以包含Cys残基(例如位于末端或内部的Cys)并且每个Cys残基的硫原子参与二硫键的形成。在本发明的一些方面，单体通过末端氨基酸(例如N-末端或C-末端的)、通过内部氨基酸、或通过至少一个单体的末端氨基酸和至少另一个单体的内部氨基酸连接。在具体的方面，单体不通过N-末端氨基酸连接。在一些方面，多聚体的多个单体以“尾-尾相接”的方向连接，其中每个单体的C-末端氨基酸连接在一起。

缀合部分可以共价连接至本文描述的任意胰高血糖素肽，包括二聚体、三聚体或更高级的多聚体。包含任意SEQ ID NO：20-22的氨基酸序列的融合肽也考虑在内。

上文描述的任何增强胰高血糖素受体活性、保持部分胰高血糖素受体活性、改善溶解性、增加稳定性或减少降解的修饰可以单独地或组合地适用于胰高血糖素肽。因此，可以制备保持至少20％的原始胰高血糖素在胰高血糖素受体上的活性的胰高血糖素肽，并且其在6-8或6-9的pH(例如pH 7)在至少1mg/mL的浓度是可溶的，并且任选在25℃在24小时后保留至少95％的最初的肽(例如，5％或更少的最初的肽被降解或切割)。或者，可以制备高效力的胰高血糖素肽，其显示出至少大约100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％或10倍或更高的原始胰高血糖素在胰高血糖素受体上的活性，并且任选在6-8或6-9的pH(例如pH 7)在至少1mg/mL的浓度是可溶的，并且任选在25℃在24小时后保留至少95％的最初的肽(例如，5％或更少的最初的肽被降解或切割)。在一些实施方式中，当缺少亲水性部分时，本文描述的胰高血糖素肽显示出指明的百分比的原始胰高血糖素在胰高血糖素受体上的活性，但当包含亲水性部分时，其显示出降低的百分比的原始胰高血糖素在胰高血糖素受体上的活性。在一些实施方式中，本文描述的胰高血糖素肽可以显示出至少任意上述指明的相对水平的在胰高血糖素受体上的活性，但不超过10,000％、100,000％或1,000,000％的原始胰高血糖素在胰高血糖素受体上的活性。

根据一个实施方式，提供了包含本文公开的任意新型胰高血糖素肽和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，所述胰高血糖素肽优选是无菌的并且优选其纯度水平是至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。此类组合物可以包含浓度至少是A的胰高血糖素肽，其中A是0.001mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或更高。在其它实施方式，此类组合物可以包含浓度至多是B的胰高血糖素肽，其中B是30mg/ml、25mg/ml、24mg/ml、23mg/ml、22mg/ml、21mg/ml、20mg/ml、19mg/ml、18mg/ml、17mg/ml、16mg/ml、15mg/ml、14mg/ml、13mg/ml、12mg/ml、11mg/ml、10mg/ml、9mg/ml、8mg/ml、7mg/ml、6mg/ml、5mg/ml、4mg/ml、3mg/ml、2mg/ml、1mg/ml或0.1mg/ml。在一些实施方式中，所述组合物可以包含浓度介于A至Bmg/ml范围内的胰高血糖素肽，例如0.001至30.0mg/ml。在一个实施方式，所述药物组合物包含经灭菌的和任选储存于不同容器中的水溶液。根据一个实施方式，此类溶液可以用于制备即用型预先配制的注射溶液。在其它实施方式中，所述药物组合物包含冻干的粉末。所述药物组合物还可以包装为药盒的一部分，所述药盒包括用于给予患者所述组合物的可抛型装置。所述装置可以包括注射器和针，或预注入的注射器。容器或药盒可以标记为储存于环境室温或储存于冷冻温度。

根据一个实施方式，提供了使用预先配制的本发明的胰高血糖素肽的水性组合物迅速增加葡萄糖水平、使血糖水平正常、使血糖水平稳定、或预防或治疗低血糖症的方法。该方法包括以下步骤：给予有效量的包含本公开的新型的修饰的胰高血糖素肽的水溶液。在一些实施方式中，所述水性组合物预先包装在用于给予患者组合物的装置中。在另一个实施方式中，提供了引起肠道的暂时性麻痹的方法。该方法包括向有此需要的患者给予一种或多种本文公开的胰高血糖素肽的步骤。

在另一个实施方式中，提供了减少体重增加或引起体重下降的方法，其包括给予有效量的包含本发明的胰高血糖素肽的水性溶液。减少体重增加或引起体重下降的方法预期可用于治疗各种起因的肥胖，包括药物诱导的肥胖，并减少与肥胖相关的并发症，包括血管疾病(冠状动脉疾病、中风、周围血管疾病、缺血性再灌注等)、高血压、II型糖尿病的发作、高脂血症和骨骼肌疾病。

在另外的实施方式中，提供了治疗高血糖症或糖尿病的方法，其包括联合施用胰岛素和本发明的胰高血糖素肽。高血糖症包括糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病，无论是胰岛素依赖性的还是非胰岛素依赖性的，并减少糖尿病的并发症，包括肾病、视网膜病和血管疾病。联合施用胰岛素和本发明的胰高血糖素肽能够减少夜间低血糖症和/或缓冲胰岛素的使血糖过低的效应，允许给予相同或更高剂量的短效或长效胰岛素，但具有较少的不利的使血糖过低的效应。还提供了包含胰岛素以及本发明的胰高血糖素肽的组合物。

根据一个实施方式，提供了调节胰岛素依赖性患者中的血糖水平的改善的方法。该方法包括以下步骤：给予治疗上有效控制糖尿病的量的胰岛素并给予治疗上有效预防低血糖症的量的本公开的新型的修饰的胰高血糖素肽，其中所述给药步骤彼此间隔12小时内进行。在一个实施方式中，胰高血糖素肽和胰岛素作为单一的组合物联合给药。

本文描述的所有治疗方法、药物组合物、药盒和其它相似的实施方式均考虑到：术语胰高血糖素肽、胰高血糖素激动剂类似物、胰高血糖素激动剂或胰高血糖素类似物的使用包括其所有的药学上可接受的盐或酯。

示例性的胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：33，其中所述胰高血糖素肽的氨基酸29通过肽键结合至第二个肽，并且所述第二个肽包含SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22的序列。在一个实施方式中，胰高血糖素肽是聚乙二醇化的。在一个实施方式中，方法包括给予包含SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的序列的肽的步骤，其中聚乙烯链共价连接至位置21或位置24上的氨基酸。

胃泌酸调节素(oxyntomodulin)是37个氨基酸的肽，其包含胰高血糖素的29个氨基酸的序列(即SEQ ID NO：1)，后跟SEQ ID NO：21的8个氨基酸的羧基末端延伸(KRNRNNIA)。虽然本发明考虑到本文描述的的胰高血糖素类似物任选可以连接至这个8个氨基酸的羧基末端延伸(SEQ ID NO：21)，但是在一些实施方式中本发明还特别考虑到缺少所述的SEQ ID NO：21的8个连续羧基氨基酸的胰高血糖素类似物及所述胰高血糖素类似物的用途。

以上发明简述不是旨在定义本发明的每个方面，在其它部分描述了另外的实施方式，例如在发明详述中。整个文档旨在涉及统一的公开物，应该理解：可以考虑到本文描述的特征的所有可能的组合，即使特征的组合不一起存在于本文的同一个句子或段落或部分中。

此外，本发明包括在范围上以任何方式窄于本文具体段落定义的变体的本发明的任一个或所有的实施方式。例如，当本发明的某些方面描述为属时，应该理解为该属的每个成员都单独地是本发明的实施方式，并且该属的两个或更多个成员的组合是本发明的实施方式。

附图说明

图1的柱形图代表在37℃将胰高血糖素Cys²¹-马来酰亚胺PEG_5K分别温育24、48、72、96、144和166个小时后的稳定性。

图2代表在37℃在pH 5将胰高血糖素Cys²¹-马来酰亚胺PEG_5K分别温育24、72或144个小时后的HPLC分析产生的数据。

图3的数据代表在25℃，分别在pH 2、4、5.5、7和8，在60个小时后，胰高血糖素类似物(D28，E29，E30)相对于原始胰高血糖素的溶解性。

图4的数据显示了在25℃、24小时后，然后在4℃、24小时后，分别在pH 2、4、5.5和7，胰高血糖素类似物(E15D28，D28E29和D28E30)相对于原始胰高血糖素的溶解性。

图5代表在4℃pH 724小时后，胰高血糖素类似物D28、D28E30和E15，D28的最大溶解性。

图6的数据显示了相对于原始胰高血糖素■，胰高血糖素类似物(K29▲、K30▼和K29K30◆)诱导的胰高血糖素受体介导的cAMP。

图7的数据显示了相对于原始胰高血糖素■，胰高血糖素类似物(D28□、E29△、E30▽、K30K31◇和K30▼)诱导的胰高血糖素受体介导的cAMP。

图8的数据显示了相对于原始胰高血糖素■，胰高血糖素类似物(D28□、E28和K29▲)诱导的胰高血糖素受体介导的cAMP。

图9的数据显示了相对于原始胰高血糖素■，胰高血糖素类似物(D28E29+、D28E30×、E15D28和E29△)诱导的胰高血糖素受体介导的cAMP。

图10的数据显示了肌内给予胰高血糖素和胰高血糖素类似物之后，比格犬的血清葡萄糖浓度的变化。向动物给予剂量为0.005mg/kg的胰高血糖素、胰高血糖素类似物(胰高血糖素-CEX，包含胰高血糖素，并且SEQ ID NO：31的序列连接至胰高血糖素的羧基末端)、或包含在氨基酸28具有天冬氨酸替换的胰高血糖素类似物(胰高血糖素-Asp28)SEQ ID NO：11。

图11A和11B的数据分别显示了具有多个替换：T16，A20，E21，A24，Nle27，D28，E29的胰高血糖素类似物诱导的胰高血糖素受体介导的cAMP和GLP-1受体介导的cAMP。

图12是包含SEQ ID NO：71的肽的制剂在280nm的UV吸收曲线下的面积相对于时间(月)的函数的图形。

图13是包含SEQ ID NO：76的肽的制剂在280nm的UV吸收曲线下的面积相对于时间(月)的函数的图形。

图14是包含SEQ ID NO：78的肽的制剂在280nm的UV吸收曲线下的面积相对于时间(月)的函数的图形。

图15代表以指明的剂量注射载体对照、利拉鲁肽(Liraglutide)、(C16)胰高血糖素酰胺、γE-γE-C16胰高血糖素酰胺、AA-C16胰高血糖素酰胺或βAβA-C16胰高血糖素酰胺的小鼠的体重的总变化(％)的图形。

图16代表以指明的剂量注射载体对照、利拉鲁肽、(C16)胰高血糖素酰胺、γE-γE-C16胰高血糖素酰胺、AA-C16胰高血糖素酰胺或βAβA-C16胰高血糖素酰胺的小鼠在研究的第7天所测的脂肪质量(g)的图形。

图17代表以指明的剂量注射载体对照、利拉鲁肽、(C16)胰高血糖素酰胺、γE-γE-C16胰高血糖素酰胺、AA-C16胰高血糖素酰胺或βAβA-C16胰高血糖素酰胺的小鼠的血糖(mg/dL)变化的图形。

发明详述

定义

在描述和要求保护本发明时，根据下文给出的定义使用下列术语。

本文使用的术语“药学上可接受的载体”包括任意标准的药学载体，例如磷酸盐缓冲液、水、乳液例如油/水或水/油乳液，以及各种类型的润湿剂。该术语还包括美国联邦政府的管理机构通过的或美国药典中列出的用于动物，包括人类的任何试剂。

本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指保持母体化合物的生物学活性并且在生物学或其它意义上不是不合需要的化合物的盐。本文公开的很多化合物都能够通过存在的氨基和/或羧基或与之类似的基团形成酸和/或碱盐。

药学上可接受的碱加成盐可以从无机和有机碱制备。从无机碱衍生的盐，仅举例来讲，包括钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。从有机碱衍生的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺盐。

药学上可接受的酸加成盐可以从无机和有机酸制备。从无机酸衍生的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。从有机碱衍生的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲基磺酸、乙基磺酸、对甲基苯磺酸、水杨酸等。

本文使用的术语“治疗”包括预防具体的病症或病况，或减缓与具体的病症或病况相关的症状，和/或预防或消除所述症状。例如，本文使用的术语“治疗糖尿病”一般是指将血糖水平向着正常水平改变并可以包括升高或降低血糖水平，这取决于给定的情况。

本文使用的“有效”量或“治疗有效量”的胰高血糖素肽是指非毒性但足以提供想要的效应的肽的量。例如，一种想要的效应是预防或治疗低血糖症，通过例如血糖水平的升高来测定。“有效”量将在个体之间有所差异，这取决于个体的年龄和一般状况、给药模式等。因此，不可能总是指定精确的“有效量”。但是，任何个例中的合适的“有效”量可以由本领域普通技术人员通过常规实验来确定。

术语“非肠道”意思是不通过消化道而是通过一些其它途经，例如皮下、肌内、脊柱内或静脉内。

本文使用的术语“纯化的”和类似术语涉及以基本上不含在原始或天然环境中通常与分子或化合物结合的污染物的形式分离该分子或化合物。本文使用的术语“纯化的”不需要绝对纯度；而是，其意指相对定义。术语“纯化的多肽”在本文中用于描述已经从其它化合物中分离的多肽，所述其它化合物包括但不限于核酸分子、脂类和糖类。

术语“分离的”要求所提及的材料从其初始环境(例如，如果它是天然存在的，则是指天然环境)中分开。例如，存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸不是分离的，但是，从天然系统中共存的一些或所有材料中分离的同一多核苷酸则是分离的。

本文使用的术语“原始胰高血糖素”是指由SEQ ID NO：1的序列组成的肽，术语“原始GLP-1”是总称，其代表GLP-1酰胺(7-36)(由SEQ ID NO：57的序列组成)、GLP-1(7-37)酸(由SEQ ID NO：58的序列组成)或这两种化合物的混合物。本文使用的一般性指称“胰高血糖素”或“GLP-1”在没有任何其它指定的情况下分别意指原始胰高血糖素或原始GLP-1。

本文使用的“胰高血糖素肽”包括任意这样的肽：其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或SEQ ID NO：1的氨基酸序列的任意类似物，包括肽的氨基酸替换、添加或删除，或肽的翻译后修饰(例如甲基化、酰基化、泛素化等)，其中所述类似物刺激胰高血糖素或GLP-1受体的活性，例如，使用实施例13中描述的测定法通过cAMP的产生来测定。

术语“胰高血糖素激动剂”是指包含刺激胰高血糖素受体活性的胰高血糖素肽的复合物，所述活性通过例如使用实施例13中描述的测定法通过cAMP的产生来测定。

本文使用的“胰高血糖素激动剂类似物”是包含选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列或此类序列的类似物(已被修饰为在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29包含一个或多个保守性氨基酸替换)的胰高血糖素肽。

本文使用的氨基酸“修饰”是指氨基酸的替换、添加或删除，并包括以人类蛋白质中通常发现的20种氨基酸中的任意氨基酸以及非典型或非天然产生的氨基酸进行替换或添加。在本申请全文中，所有通过编号提及的特定氨基酸位置(例如位置28)是指原始胰高血糖素(SEQ ID NO：1)的该位置或其任意类似物中的相应氨基酸位置上的氨基酸。例如，本文中提及“位置28”意味着胰高血糖素类似物的相应的位置27，所述类似物中SEQ ID NO：1的第一个氨基酸被删除。类似地，本文中提及“位置28”将意味着胰高血糖素类似物的相应的位置29，所述类似物中SEQ ID NO：1的N-末端之前添加了1个氨基酸。

本文使用的氨基酸“替换”是指以不同的氨基酸残基替代一个氨基酸残基。

本文使用的术语“保守性氨基酸替换”在本文中定义为在下列5组中任一组之内的置换：

I.小的脂肪族、非极性或轻微极性的残基：

Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；

II.极性、带负电的残基及其酰胺：

Asp、Asn、Glu、Gln、半胱氨酸和高半胱氨酸；

III.极性、带正电的残基：

His、Arg、Lys、鸟氨酸(Orn)；

IV.大的脂肪族非极性残基：

Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、高半胱氨酸；

V.大的芳香族残基：

Phe、Tyr、Trp、乙酰基苯丙氨酸。

本文使用的一般性术语“聚乙二醇”或“PEG”是指环氧乙烷和水的缩合聚合物的混合物，所述聚合物为支链或直链的，由通式H(OCH₂CH₂)_nOH代表，其中n至少是9。在不存在任何其它表征的情况下，该术语意指包括平均总分子量为500至40,000道尔顿范围内的乙二醇的聚合物。“聚乙二醇”或“PEG”与数字后缀一起使用，所述后缀用于表示其大约的平均分子量。例如，PEG-5,000是指平均总分子量为大约5,000的聚乙二醇。

本文使用的术语“聚乙二醇化”和类似术语是指从其原始状态经过了将聚乙二醇聚合物连接至该化合物的修饰的化合物。“聚乙二醇化胰高血糖素肽”是具有共价连接至胰高血糖素肽的PEG链的胰高血糖素肽。

如本文使用，一般提及肽意指包括具有修饰的氨基和羧基末端的肽。例如，在末端羧酸的位置上包含酰胺基团的氨基酸链包括在代表标准氨基酸的氨基酸序列中。

本文使用的“接头”是使两个分开的实体彼此结合的键、分子或分子组。接头可以提供两个实体的最佳定位，或者还可以提供允许两个实体彼此分开的不稳定的键合。不稳定的键合包括光可切割的基团、酸不稳定的部分、碱不稳定的部分和酶可切割的基团。

本文使用的“二聚体”是包含通过接头彼此共价结合的两个亚基的复合物。当没有任何定性语言时，术语二聚体的使用包括了同型二聚体和异型二聚体。同型二聚体包含两个相同的亚基，而异型二聚体包含两个不同的亚基，虽然所述两个亚基彼此实质上相似。

本文使用的术语“pH稳定化的胰高血糖素肽”是指相对于原始胰高血糖素而言在用于药理学目的的最宽的pH范围的水性缓冲液中具有更优越的稳定性和溶解性的胰高血糖素激动剂类似物。

本文使用的术语“带电的氨基酸”是指在生理pH在水溶液中包含带负电的(即去质子化的)或带正电的(即质子化的)侧链的氨基酸。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸和高谷氨酸，而带正电的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电的氨基酸包括在人类蛋白质中通常发现的20种氨基酸以及非典型或非天然产生的氨基酸中的带电的氨基酸。

非天然产生的氨基酸是指不在体内天然产生但是可以掺入到本文描述的肽结构中的氨基酸。非典型氨基酸的商业来源包括Sigma-Aldrich(Milwaukee，WI)、ChemPep Inc.(Miami，FL)和Genzyme Pharmaceuticals(Cambridge，MA)。非典型氨基酸可以从商业供应者购买，从新合成，或从其它氨基酸进行化学修饰或衍生。

本文使用的术语“酸性氨基酸”是指包含第二个酸性部分(包括例如羧酸或硫酸基团)的氨基酸。

术语“烷基”是指含有指定数目的碳原子的线性或支链烃。示例性烷基包括甲基、乙基和线性丙基。

术语“杂烷基”是指含有指定数目的碳原子并在结构骨架中含有至少一个杂原子的线性或支链烃。适合于本文目的的杂原子包括但不限于N、S和O。

实施方式

增强的溶解性

申请人发现，可以通过在原始胰高血糖素的羧基末端引入电荷而对其进行修饰，以增强肽的溶解性并同时保持肽的激动剂特性。增强的溶解性允许在接近中性的pH制备和储存胰高血糖素溶液。在相对中性的pH(例如，大约6.0至大约8.0的pH)配制胰高血糖素溶液会改善胰高血糖素肽的长期稳定性。

因此，本发明的一个实施方式涉及这样的胰高血糖素激动剂，其相对于野生型肽His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO：1)而言经过了修饰以改善肽在水溶液中的溶解性，尤其是在大约5.5至大约8.0的pH范围内的溶解性，同时保留原始肽的生物学活性。在一个实施方式中，通过以带电的氨基酸替换原始的非带电的氨基酸而向所述肽中加入电荷，所述带电的氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，或者通过向肽的氨基或羧基末端添加带电的氨基酸而向所述肽中加入电荷。令人惊奇的是，申请人发现以带电的氨基酸替换位置28和/或29的天然存在的氨基酸，和/或在胰高血糖素肽的羧基末端添加1个或2个带电的氨基酸，使胰高血糖素肽在生理相关pH(即大约6.5至大约7.5的pH)的水溶液中的溶解性和稳定性增加了至少5倍以及多达30倍。

因此，本发明的一个实施方式的胰高血糖素肽保持胰高血糖素的活性，并且，当在25℃在24小时后测定时，其在大约5.5至8的给定pH(例如pH 7)时，相对于原始胰高血糖素显示出至少2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍或更高的溶解性。本文公开的任意胰高血糖素肽还可以在5.5至8的pH范围内显示出改善的稳定性，例如在25℃在24小时后保留至少75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的最初的肽。在一些实施方式中，本发明的胰高血糖素肽显示出改善的稳定性，从而在至少20℃(例如21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、至少27.5℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少50℃)以及小于100℃、小于85℃、小于75℃，或小于70℃的温度，在溶液中大约1周或更长时间(例如，大约2周、大约4周、大约1个月、大约2个月、大约4个月、大约6个月、大约8个月、大约10个月、大约12个月)之后，通过紫外线(UV)检测器在280nm可以检测到至少75％(例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、大于95％，直至100％)浓度的肽或者小于大约25％(例如，小于20％、小于15％、小于10％，小于5％、4％、3％、2％、1％、直至0％)的降解的肽。胰高血糖素肽可以包括改变其药学特性的另外的修饰，所述药学特性为例如，增加的效力，延长的循环中的半衰期、增加的保存期、减少的沉淀或聚集和/或减少的降解，例如储存后切割或化学修饰的发生减少。

在一个实施方式中，可以通过例如向原始胰高血糖素的C-末端部分引入1个、2个、3个或更多个带电的氨基酸来制备具有改善的溶解性的胰高血糖素肽，在一个实施方式中，向在位置27 C-末端的位置(at a position C-terminal to position 27)引入。可以通过例如在例如位置28或29以带电的氨基酸替换原始氨基酸，或者，通过在例如位置27、28或29之后添加带电的氨基酸，来引入这样的带电的氨基酸。在示例性的实施方式中，带电的氨基酸中的1个、2个、3个或全部是带负电的。在其它实施方式中，带电的氨基酸中的1个、2个、3个或全部是带正电的。在具体的示例性实施方式中，胰高血糖素肽可以包含下列修饰中的任1个或2个：N28替换为E；N28替换为D；T29替换为D；T29替换为E；在位置27、28或29之后插入E；在位置27、28或29之后插入D。例如，D28E29、E28E29、E29E30、E28E30、D28E30。

其它修饰和组合

可以对胰高血糖素肽进行另外的修饰，所述修饰可以进一步增加溶解性和/或稳定性和/或胰高血糖素活性。胰高血糖素肽可以替代性地包含其它修饰，所述其它修饰不实质上影响溶解性或稳定性，并且不实质上降低胰高血糖素活性。在示例性实施方式中，胰高血糖素肽相对于原始胰高血糖素序列可以包含总共1个、多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达6个、多达7个、多达8个、多达9个、多达10个、多达11个、多达12个、多达13个或多达14个氨基酸修饰。在一些实施方式中，此类胰高血糖素类似物在原始胰高血糖素的相应位置上保留至少22、23、24、25、26、27或28个天然存在的氨基酸(例如相对于天然存在的胰高血糖素具有1-7个、1-5个或1-3个修饰)。

在一些实施方式中，在位置2、5、7、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、27、28或29的任意位置进行1、2、3、4或5个非保守性替换并且在这些位置中的任意位置进行另外的多达5个保守性替换。在一些实施方式中，在位置1-16内的氨基酸进行1、2或3个氨基酸修饰并且在位置17-26内的氨基酸进行1、2或3个氨基酸修饰。

示例性的修饰包括但不限于：

(a)非保守性替换、保守性替换、添加或删除，但保留至少部分胰高血糖素激动剂活性，例如，在位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29中的一个或多个的保守性替换，在位置10以Val或Phe替换Tyr，在位置12以Arg替换Lys，在这些位置中的一个或多个位置替换为Ala；

(b)位置29和/或28和任选地位置27上的氨基酸的删除，但保留至少部分胰高血糖素激动剂活性；

(c)位置15的天冬氨酸的修饰，例如，替换为谷氨酸、高谷氨酸、半胱氨酸或高半胱氨酸，这可以减少降解；或位置16的丝氨酸的修饰，例如，替换为苏氨酸、AIB、谷氨酸或替换为另一个带负电的具有长度为4个原子的侧链的氨基酸，或替换为谷氨酰胺、高谷氨酸或高半胱氨酸中的任一个，这同样可以减少由于Asp15-Ser16键的切割造成的降解；

(d)在例如位置16、17、20、21、24、29、40或在C-末端氨基酸添加亲水性部分，例如本文描述的水溶性聚合物聚乙二醇，这可以增加溶解性和/或半衰期；

(e)位置27的蛋氨酸的修饰，例如，替换为亮氨酸或正亮氨酸，以便减少氧化降解；

(f)位置20或24的Gln的修饰，例如，替换为Ser、Thr、Ala或AIB，以便减少通过Gln的去酰胺化发生的降解；

(g)位置21的Asp的修饰，例如，替换为Glu，以便减少通过Asp的脱水以形成环式琥珀酰亚胺中间体然后异聚化为异天冬氨酸而发生的降解；

(h)如本文描述的在位置1或2上的修饰，其增强对DPP-IV切割的抗性，任选地联合分子内桥，例如位置“i”和“i+4”之间的内酰胺键，其中i是12至25的整数，例如12、16、20、24；

(i)如本文所述，使胰高血糖素肽发生酰基化或烷基化，这可以增加在胰高血糖素和GLP-1受体上的活性、延长循环中的半衰期和/或延长作用持续的时间和/或延缓作用的起始，任选地联合亲水性部分的添加，另外或者可替代地，任选地联合选择性降低在GLP-1肽上的活性的修饰，例如位置7的Thr的修饰，例如位置7的Thr替换为缺少羟基的氨基酸例如Abu或Ile；删除在位置27的氨基酸C-末端的氨基酸(例如，删除位置28和29的氨基酸中的一个或二者，从而产生长度为27或28个氨基酸的肽)；或其组合；

(j)如本文描述的C-末端延伸；

(k)如本文描述的同型二聚体化或异型二聚体化；和

上述各项的组合。

示例性的修饰包括选自组A的至少一个氨基酸修饰和选自组B和/或组C的一个或多个氨基酸修饰，

其中所述组A是：

位置28的Asn替换为带电的氨基酸；

位置28的Asn替换为选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的带电的氨基酸；

位置28替换为Asn、Asp或Glu；

位置28替换为Asp；

位置28替换为Glu；

位置29的Thr替换为带电的氨基酸；

位置29的Thr替换为选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的带电的氨基酸；

位置29替换为Asp、Glu或Lys；

位置29替换为Glu；

在位置29之后插入1-3个带电的氨基酸；

在位置29之后插入Glu或Lys；

在位置29之后插入Gly-Lys或Lys-Lys；

或其组合；

其中所述组B是：

位置15的Asp替换为Glu；

位置16的Ser替换为Thr或AIB；

并且其中所述组C是：

位置1的His替换为非原始氨基酸，其降低胰高血糖素肽对于二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性，

位置2的Ser替换为非原始氨基酸，其降低胰高血糖素肽对于二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性，

位置12的Lys替换为Arg；

位置20的Gln替换为Ala或AIB；

位置21的Asp替换为Glu；

位置24的Gln替换为Ala或AIB；

位置27的Met替换为Leu或Nle；

删除位置27-29的氨基酸；

删除位置28-29的氨基酸；

删除位置29的氨基酸；

或其组合。

位置3上的修饰

可以通过在位置3上进行氨基酸修饰来降低胰高血糖素受体活性，例如位置3的天然存在的谷氨酰胺替换为酸性、碱性、或疏水性氨基酸。例如位置3替换为谷氨酸、鸟氨酸或正亮氨酸，这实质上降低或破坏胰高血糖素受体活性。

可以通过以谷氨酰胺类似物修饰位置3的Gln来实现胰高血糖素受体上的活性的维持或增强。例如，在位置3包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素肽可以显示出大约5％、大约10％、大约20％、大约50％或大约85％或更高的原始胰高血糖素(SEQ ID NO：1)在胰高血糖素受体上的活性。在一些实施方式中，在位置3包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素肽可以显示出相应的胰高血糖素肽(其与包含谷氨酰胺类似物的肽具有相同的氨基酸序列，除了位置3上的修饰的氨基酸之外)(例如SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：70)的大约20％、大约50％、大约75％、大约100％、大约200％或大约500％或更高的活性。在一些实施方式中，在位置3包含谷氨酰胺类似物的胰高血糖素肽表现出在胰高血糖素受体上的增强的活性，但该增强的活性不超过原始胰高血糖素或相应的胰高血糖素肽(其与包含谷氨酰胺类似物的肽具有相同的氨基酸序列，除了位置3上的修饰的氨基酸之外)的活性的1000％、10,000％、100,000％或1,000,000％。

在一些实施方式中，所述谷氨酰胺类似物是天然存在的或非天然存在的包含结构I、II或III的侧链的氨基酸：

结构I

结构II

结构III

其中R¹是C_0-3烷基或C_0-3杂烷基；R²是NHR⁴或C_1-3烷基；R³是C_1-3烷基；R⁴是H或C_1-3烷基；X是NH、O或S；并且Y是NHR⁴、SR³或OR³。在一些实施方式中，X是NH或Y是NHR⁴。在一些实施方式中，R¹是C_0-2烷基或C₁杂烷基。在一些实施方式中，R²是NHR⁴或C₁烷基。在一些实施方式中，R⁴是H或C¹烷基。在示例性的实施方式中，提供了包含结构I的侧链的氨基酸，其中R¹是CH₂-S，X是NH，并且R²是CH₃(乙酰氨基甲基-半胱氨酸，C(Acm))；R¹是CH₂，X是NH，并且R²是CH₃(乙酰二氨基丁酸，Dab(Ac))；R¹是C₀烷基，X是NH，R²是NHR⁴，并且R⁴是H(氨基甲酰二氨基丙酸，Dap(urea))；或R¹是CH₂-CH₂，X是NH，并且R²是CH₃(乙酰鸟氨酸，Orn(Ac))。在示例性的实施方式中，提供了包含结构II的侧链的氨基酸，其中R¹是CH₂，Y是NHR⁴，并且R⁴是CH₃(甲基谷氨酰胺，Q(Me))；在示例性的实施方式中，提供了包含结构III的侧链的氨基酸，其中R¹是CH₂并且R⁴是H(蛋氨酸-亚砜，M(O))。在具体的实施方式中，位置3的氨基酸被Dab(Ac)替换。例如，胰高血糖素激动剂可以包含SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ IDNO：74的氨基酸序列。

通过以带电-中性基团，例如酰胺或酯替换C-末端氨基酸的羧酸提供在GLP-1受体上的增强的活性。相反，保留肽的C-末端的原始羧酸会维持胰高血糖素肽对于胰高血糖素受体比胰高血糖素肽对于GLP-1受体相对更高的选择性(例如，高大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍)。

DPP-IV抗性

在一些实施方式中，在位置1或2上对本文公开的胰高血糖素肽进行进一步修饰以降低对二肽基肽酶IV切割的敏感性。更特别地，在一些实施方式中，类似物肽的位置1替换为选自D-组氨酸、α，α-二甲基咪唑乙酸(DMIA)、N-甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、咪唑乙酸、去氨基组氨酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸和高组氨酸的氨基酸。

更特别地，在一些实施方式中，类似物肽的位置2替换为选自D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、氨基N-丁酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和氨基异丁酸的氨基酸。在一个实施方式中，类似物肽的位置2替换为选自D-丝氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、N-甲基丝氨酸和氨基异丁酸的氨基酸。在另一个实施方式中，类似物肽的位置2替换为选自D-丝氨酸、甘氨酸和氨基异丁酸的氨基酸。

当位置1或2上的替换或修饰或衍生降低在胰高血糖素受体上的活性时，肽的C-末端部分(氨基酸12-29)中的分子内桥(例如位置“i”和“i+4”的氨基酸侧链之间的内酰胺桥，其中i是12至25的整数)能够改善在胰高血糖素受体上的胰高血糖素活性。

亲水性部分的添加

可以在用于使蛋白质与活化的聚合物分子反应的任意合适条件下将亲水性部分例如PEG基团连接至胰高血糖素肽。可以使用本领域已知的任意方式，包括通过酰基化、还原性烷基化、米歇尔加成、巯基烷基化或通过PEG部分上的反应性基团(例如醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺或肼基)至目标化合物上的反应性基团(例如醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)的其它化学选择性缀合/连接方法。可用于将水溶性聚合物连接至一个或多个蛋白的活化基团包括但不限于砜、马来酰亚胺、硫氢基(sulfhydryl)、巯基(thiol)、三氟甲磺酸酯、三氟乙基磺酸酯(tresylate)、azidirine、氧杂环丙烷、5-吡啶基和α-卤化酰基(例如α-碘乙酸、α-溴乙酸、α-氯乙酸)。如果通过还原性烷基化连接至肽，则所选的聚合物应该具有单一的反应性醛，从而可以控制聚合度。参见，例如Kinstler等人，Adv.Drug.Delivery Rev.54：477-485(2002)；Roberts等人，Adv.Drug Delivery Rev.54：459-476(2002)；和Zalipsky等人，Adv.Drug Delivery Rev.16：157-182(1995)。

在本发明的具体方面，以亲水性部分例如PEG修饰胰高血糖素肽上具有巯基的氨基酸残基。在一些实施方式中，以马来酰亚胺活化的PEG在米歇尔加成反应中修饰所述巯基，以产生包含硫醚键的聚乙二醇化的肽，如下所示：

在一些实施方式中，以卤代乙酰基活化的PEG在亲核取代反应中修饰所述巯基，以产生包含硫醚键的聚乙二醇化的肽，如下所示：

合适的亲水性部分包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylated polyol)(例如POG)、聚氧乙烯化山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油(POG)、聚氧化烯、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇的共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、单-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物(PPG)和其它的聚烷撑氧(polyakylene oxides)、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、结肠酸(colonic acid)或其它多糖聚合物、Ficoll或葡聚糖及其混合物。

根据一些实施方式的聚乙二醇链的分子量介于大约500至大约40,000道尔顿的范围。在一个实施方式中，聚乙二醇链的分子量介于大约500至大约5,000道尔顿的范围，或大约1,000至大约5,000道尔顿的范围。在另一个实施方式中，聚乙二醇链的分子量介于大约10,000至大约20,000道尔顿的范围。在其它示例性实施方式中，聚乙二醇链的分子量介于大约20,000至大约40,000道尔顿的范围。

葡聚糖是葡萄糖亚单元的多糖聚合物，主要通过α1-6键连接。可以获得很多分子量范围的葡聚糖，例如大约1kD至大约100kD，或大约5、10、15或20kD至大约20、30、40、50、60、70、80或90kD。

考虑到线性或支链的聚合物。得到的缀合物的制备物可以基本上是单分散性的或多分散性的，并且每个肽可以具有大约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分。

酰基化

根据一个实施方式，胰高血糖素肽被修饰为包含酰基，例如不是氨基酸上天然存在的酰基(例如对天然存在的氨基酸而言不是原始的酰基)。添加酰基可以使肽具有下列一种或多种性质：延长的循环中的半衰期、延迟的作用起始、延长的作用持续时间、对诸如DPP-IV的蛋白酶的改善的抗性、和在GLP-1和胰高血糖素受体上的增加的效力。如本文所示，胰高血糖素肽的酰基化不引起在胰高血糖素和GLP-1受体上的活性降低。相反，在一些情况下，酰基化实际上增加在GLP-1和胰高血糖素受体上的活性。因此，酰基化的类似物的效力与未经酰基化的胰高血糖素共激动剂类似物是相当的，如果没有增强的话。

根据一个实施方式，胰高血糖素肽被修饰为包含酰基，所述酰基通过酯、硫酯或酰胺键连接至胰高血糖素肽，目的是延长循环中的半衰期和/或延迟作用起始和/或延长作用持续的时间和/或改善对诸如DPP-IV的蛋白酶的抗性。

可以在胰高血糖素肽内的任何位置进行酰基化，包括位置1-29中的任何位置，C-末端延伸内的位置，或C-末端氨基酸，条件是保持胰高血糖素和/或GLP-1活性，如果没有增强的话。非限制性例子包括位置5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29。在具体的实施方式中，酰基化发生在胰高血糖素肽的位置10，并且胰高血糖素肽缺少分子内桥，例如共价的分子内桥(例如内酰胺桥)。相对于对应的缺少共价的分子内桥的非酰基化的肽和相对于对应的缺少分子内桥并在位置10以外的位置进行酰基化的肽，这样的缺少分子内桥的酰基化肽显示出在GLP-1和胰高血糖素受体上的增强的活性。如本文所示，位置10的酰基化甚至能够将在胰高血糖素受体上几乎没有活性的胰高血糖素类似物转化为在胰高血糖素和GLP-1受体上都有活性的胰高血糖素类似物。因此，酰基化发生的位置能够改变胰高血糖素类似物的总体活性谱。

可以在连接亲水性部分的相同氨基酸位置或在不同的氨基酸位置进行胰高血糖素肽的酰基化。非限制性的例子包括在位置10进行酰基化且在胰高血糖素肽的C-末端部分中的一个或多个位置(例如位置24、28或29)、在C-末端延伸内或在C-末端(例如，通过添加C-末端Cys)进行聚乙二醇化。

酰基可以直接共价连接至胰高血糖素肽的氨基酸，或通过间隔子间接连接至胰高血糖素肽的氨基酸，其中所述间隔子位于胰高血糖素肽的氨基酸和酰基之间。

在本发明的具体方面，通过将胰高血糖素肽的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基直接酰基化来修饰胰高血糖素肽以使其包含酰基。在一些实施方式中，通过氨基酸的侧链胺、羟基或巯基直接使胰高血糖素肽酰基化。在一些实施方式中，在位置10、20、24或29进行酰基化。在这个意义上，酰基化的胰高血糖素肽可以包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或其修饰的氨基酸序列，所述修饰的氨基酸序列包含一个或多个本文描述的氨基酸修饰，在位置10、20、24和29上的至少一个氨基酸修饰为包含侧链胺、羟基或巯基的任意氨基酸。在本发明的一些具体实施方式中，通过位置10的氨基酸的侧链胺、羟基或巯基进行胰高血糖素肽的直接酰基化。

在一些实施方式中，包含侧链胺的氨基酸是式I的氨基酸：

其中n＝1-4

[式I]

在一些示例性实施方式中，式I的氨基酸是其中n等于4(Lys)或n等于3(Orn)的氨基酸。

在其它实施方式中，包含侧链羟基的氨基酸是式II的氨基酸：

其中n＝1-4

[式II]

在一些示例性实施方式中，式II的氨基酸是其中n等于1的氨基酸(Ser)。

在其它实施方式中，包含侧链巯基的氨基酸是式III的氨基酸：

其中n＝1-4

[式III]

在一些示例性实施方式中，式III的氨基酸是其中n等于1的氨基酸(Cys)。

在其它实施方式中，包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸是包含式I、式II或式III的相同结构的双取代氨基酸，只不过与式I、式II或式III的氨基酸的α碳键合的氢替换为第二个侧链。

在本发明的一个实施方式中，酰基化的胰高血糖素肽在肽和酰基之间包含间隔子。在一些实施方式中，胰高血糖素肽共价结合至间隔子，所述间隔子共价结合至酰基。

连接间隔子的氨基酸可以是包含允许连接至间隔子的部分的任意氨基酸(例如单一α-取代的氨基酸或α，α-双取代氨基酸)。例如，包含侧链NH₂、-OH或-COOH的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是适宜的。在这个方面，酰基化的胰高血糖素肽可以包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或其修饰的氨基酸序列，所述修饰的氨基酸序列包含一个或多个本文描述的氨基酸修饰，在位置10、20、24和29上的至少一个氨基酸修饰为包含侧链胺、羟基或羧基的任意氨基酸。

在一些实施方式中，间隔子是包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸，或包含含有侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。

当通过间隔子的氨基发生酰基化时，可以通过氨基酸的α胺或侧链胺发生酰基化。在α胺发生酰基化的情况下，间隔子的氨基酸可以是任意氨基酸。例如，间隔子的氨基酸可以是疏水性氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸。或者，间隔子的氨基酸可以是酸性残基，例如Asp和Glu。

在间隔子的氨基酸的侧链胺发生酰基化的情况下，间隔子的氨基酸是包含侧链胺的氨基酸，例如式I的氨基酸(例如Lys或Orn)。在这种情况下，间隔子的氨基酸的α胺和侧链胺二者都可以发生酰基化，从而所述胰高血糖素肽是双酰基化的。本发明的实施方式包括此类双酰基化的分子。

当通过间隔子的羟基发生酰基化时，氨基酸或二肽或三肽的氨基酸之一可以是式II的氨基酸。在具体的示例性实施方式中，所述氨基酸是Ser。

当通过间隔子的巯基发生酰基化时，氨基酸或二肽或三肽的氨基酸之一可以是式III的氨基酸。在具体的示例性实施方式中，所述氨基酸是Cys。

在一些实施方式中，间隔子是亲水性双官能间隔子。在一些实施方式中，所述亲水性双官能间隔子包含两个或更多个反应性基团，例如，胺、羟基、巯基和羧基或其任意组合。在一些实施方式中，所述亲水性双官能间隔子包含羟基和羧酸基团(carboxylate)。在其它实施方式中，所述亲水性双官能间隔子包含氨基和羧酸基团。在其它实施方式中，所述亲水性双官能间隔子包含巯基和羧酸基团。在具体的实施方式中，所述间隔子包含氨基聚(烷氧基)羧酸基团。在这个方面，所述间隔子可以包含例如NH₂(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_mCOOH，其中m是1至6的任意整数，n是2至12的任意整数，例如，例如，8-氨基-3，6-二氧杂辛酸，其可通过商业渠道从Peptides International，Inc.(Louisville，KY)获得。

在一些实施方式中，所述间隔子是疏水性双官能间隔子。疏水性双官能间隔子是本领域已知的。参见，例如Bioconjugate Techniques，G.T.Hermanson(Academic Press，San Diego，CA，1996)，其通过引用全文并入本文。在一些实施方式中，所述疏水性双官能间隔子包含两个或更多个反应性基团，例如，胺、羟基、巯基和羧基或其任意组合。在一些实施方式中，所述疏水性双官能间隔子包含羟基和羧酸基团。在其它实施方式中，所述疏水性双官能间隔子包含氨基和羧酸基团。在其它实施方式中，所述疏水性双官能间隔子包含巯基和羧酸基团。包含羧酸基团和羟基或巯基的适宜的疏水性双官能间隔子是本领域已知的，包括，例如，8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。

在一些实施方式中，双官能间隔子不是在羧基之间包含非支链的1-7个碳原子的亚甲基的二羧酸。在一些实施方式中，双官能间隔子是在羧基之间包含非支链的1-7个碳原子的亚甲基的二羧酸。

在具体的实施方式中，间隔子(例如氨基酸、二肽、三肽、亲水性或疏水性双官能间隔子)的长度为3至10个原子(例如6至10个原子，例如6、7、8、9或10个原子)。在更具体的实施方式中，间隔子长度是大约3至10个原子(例如6至10个原子)，并且酰基是C12至C18脂肪酰基，例如C14脂肪酰基、C16脂肪酰基，从而间隔子和酰基的总长度是14至28个原子，例如，大约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个原子。在一些实施方式中，间隔子和酰基的长度是17至28个(例如，19至26、19至21个)原子。

根据一些前述的实施方式，双官能间隔子可以是合成的或天然存在的氨基酸(包括但不限于，任意本文描述的那些)，所述氨基酸包含长度为3至10个原子的氨基酸骨架(例如，6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸)。或者，间隔子可以是具有长度为3至10个原子(例如6至10个原子)的肽骨架的二肽或三肽间隔子。二肽或三肽间隔子的每个氨基酸可以与该二肽或三肽的其它氨基酸相同或不同，并且可以独立地选自：天然存在的和/或非天然存在的氨基酸，包括，例如，任何D或L构型的天然存在的氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr)或任何D或L构型的非天然存在的选自下列的氨基酸：β-丙氨酸(β-Ala)、N-α-甲基-丙氨酸(Me-Ala)、氨基丁酸(Abu)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)、氨基己酸(ε-Ahx)、氨基异丁酸(Aib)、氨基甲基吡咯-羧酸、氨基哌啶羧酸、氨基丝氨酸(Ams)、氨基四氢吡喃-4-羧酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸(β-Asp)、氮杂环丁烷羧酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基正戊酸(瓜氨酸、Cit)、β-环己基丙氨酸(Cha)、乙酰氨基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dpr)、二羟基苯丙氨酸(DOPA)、二甲基噻唑烷(DMTA)、γ-谷氨酸(γ-Glu)、高丝氨酸(Hse)、羟基脯氨酸(Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基-异亮氨酸(MeIle)、异哌啶酸(Isn)、甲基-亮氨酸(MeLeu)、甲基-赖氨酸、二甲基-赖氨酸、三甲基-赖氨酸、甲醇基脯氨酸、蛋氨酸-亚砜(Met(O))、蛋氨酸-砜(Met(O₂))、正亮氨酸(Nle)、甲基-正亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对氨基苯甲酸(PABA)、青霉胺(Pen)、甲基苯丙氨酸(MePhe)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-NO₂))、4-氰基苯丙氨酸((Phe(4-CN))、苯基甘氨酸(Phg)、哌啶丙氨酸、哌啶甘氨酸、3，4-脱氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、硒代半胱氨酸(Sec)、O-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(Sta)、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸(ACHPA)、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1，2，3，4，-四氢-异喹啉-3-羧酸(Tic)、四氢吡喃甘氨酸、噻吩基丙氨酸(Thi)、O-苄基-磷酸酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、酪氨酸硫酸酯四丁基胺、甲基-缬氨酸(MeVal)和烷基化3-巯基丙酸。

在一些实施方式中，间隔子包含总体的负电荷，例如，包含一个或两个带负电的氨基酸。在一些实施方式中，二肽不是一般结构A-B的任何二肽，其中A选自Gly、Gln、Ala、Arg、Asp、Asn、Ile、Leu、Val、Phe和Pro，其中B选自Lys、His、Trp。在一些实施方式中，二肽间隔子选自Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-氨基丁酸-γ-氨基丁酸和γ-Glu-γ-Glu。

在一些示例性实施方式中，通过间隔子的胺、羟基或巯基的酰基化使胰高血糖素肽被修饰为包含酰基，所述间隔子连接至胰高血糖素肽的位置10、20、24或29的氨基酸的侧链或C-末端氨基酸。

在更具体的实施方式中，酰基连接至胰高血糖素肽的位置10的氨基酸并且间隔子和酰基的长度是14至28个原子。在一些方面，位置10的氨基酸是式I的氨基酸，例如Lys，或与式I相关的双取代氨基酸。在更具体的实施方式中，胰高血糖素肽缺少分子内桥，例如，共价的分子内桥。胰高血糖素肽可以是例如包含一个或多个α，α-双取代氨基酸例如AIB的肽，以稳定肽的α螺旋。如本文所示，此类包含共价连接至位置10的氨基酸侧链的酰基化间隔子的肽显示出在GLP-1和胰高血糖素受体上的增强的效力。

通过胺、羟基和巯基进行肽的酰基化的适宜方法是本领域已知的。参见，例如实施例19(通过胺进行酰基化的方法)、Miller，Biochem Biophys Res Commun 218：377-382(1996)；Shimohigashi and Stammer，Int J Pept Protein Res 19：54-62(1982)；和Previero等人，Biochim Biophys Acta 263：7-13(1972)(通过羟基进行酰基化的方法)；和San and Silvius，J Pept Res 66：169-180(2005)(通过巯基进行酰基化的方法)；Bioconjugate Chem.″Chemical Modifications of Proteins：History and Applications″第1，2-12页(1990)；Hashimoto等人，Pharmacuetical Res.″Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity″Vol.6，No：2，第171-176页(1989)。

酰基化的胰高血糖素肽的酰基可以是任意大小，例如，任意长度的碳链，并且可以是线性的或支链的。在本发明的一些具体实施方式中，酰基是C4至C30的脂肪酸。例如，酰基可以是下列任意：C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸。在一些实施方式中，酰基是C8至C20脂肪酸，例如C14脂肪酸或C16脂肪酸。

在替代性实施方式中，酰基是胆汁酸。胆汁酸可以是任意合适的胆汁酸，包括但不限于胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸。

在本发明的一些实施方式中，通过胰高血糖素肽使长链烷烃酰基化从而使胰高血糖素肽被修饰为包含酰基。在具体的方面，所述长链烷烃包含胺、羟基或巯基(例如十八烷基胺、十四烷醇和十六烷硫醇)，其与胰高血糖素肽的羧基或其活化形式反应。胰高血糖素肽的羧基或其活化形式可以是胰高血糖素肽的氨基酸(例如谷氨酸、天冬氨酸)的侧链的一部分，或者可以是肽骨架的一部分。

在一些实施方式中，通过连接至胰高血糖素肽的间隔子使长链烷烃酰基化从而使胰高血糖素肽被修饰为包含酰基。在具体的方面，所述长链烷烃包含胺、羟基或巯基，其与间隔子的羧基或其活化形式反应。包含羧基或其活化形式的适宜的间隔子在本文中有描述，并且包括例如，氨基酸、二肽、三肽、亲水性双官能间隔子和疏水性双官能间隔子。

本文使用的术语“羧基的活化形式”是指通式R(C＝O)X的羧基，其中X是离去基团并且R是胰高血糖素肽或间隔子。例如，羧基的活化形式可以包括但不限于，酰基氯化物、酐和酯。在一些实施方式中，活化的羧基是与N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)离去基团形成的酯。

在本发明的这些方面中，其中通过胰高血糖素肽或间隔子使长链烷烃酰基化，所述长链烷烃可以是任意大小并且可以包含任意长度的碳链。长链烷烃可以是线性的或支链的。在一些方面，长链烷烃是C4至C30烷烃。例如，长链烷烃可以是以下任意：C4烷烃、C6烷烃、C8烷烃、C10烷烃、C12烷烃、C14烷烃、C16烷烃、C18烷烃、C20烷烃、C22烷烃、C24烷烃、C26烷烃、C28烷烃或C30烷烃。在一些实施方式中，长链烷烃包含C8至C20烷烃，例如C14烷烃、C16烷烃或C18烷烃。

同样，在一些实施方式中，以胆固醇酸将胰高血糖素肽的胺、羟基或巯基酰基化。在具体的实施方式中，胰高血糖素肽通过烷基化的去氨基Cys间隔子(即烷基化的3-巯基丙酸间隔子)连接至胆固醇酸。

本文描述的酰基化的胰高血糖素肽还可以被进一步修饰为包含亲水性部分。在一些具体实施方式中，所述亲水性部分可以包含聚乙二醇(PEG)链。可以通过任何合适的方式掺入亲水性部分，例如本文描述的任何方法。在此方面，酰基化的胰高血糖素肽可以包含SEQ ID NO：1，包括本文描述的任意修饰，其中位置10、20、24和29的至少一个氨基酸包含酰基，并且位置16、17、21、24或29、C-末端延伸内的位置上的至少一个氨基酸或C-末端氨基酸被修饰为Cys、Lys、Orn、高半胱氨酸或Ac-Phe，并且氨基酸的侧链共价结合至亲水性部分(例如PEG)。在一些实施方式中，酰基任选地通过包含Cys、Lys、Orn、高半胱氨酸或Ac-Phe的间隔子连接至位置10，并且亲水性部分掺入到位置24上的Cys残基。

或者，酰基化的胰高血糖素肽可以包含间隔子，其中所述间隔子是酰基化的并且被修饰为包含亲水性部分。合适的间隔子的非限制性例子包括：包含选自Cys、Lys、Orn、高半胱氨酸和Ac-Phe的一个或多个氨基酸的间隔子。

烷基化

根据一些实施方式，胰高血糖素肽被修饰为包含烷基，例如非天然存在于氨基酸上的烷基(例如，对于天然存在的氨基酸而言不是原始的烷基)。不被任何特殊理论所限，相信胰高血糖素肽的烷基化将获得类似于(如果不是相同的话)胰高血糖素肽的酰基化的效应，例如延长的循环中的半衰期、延迟的作用起始、延长的作用持续时间、对诸如DPP-IV的蛋白酶的改善的抗性和在GLP-1和胰高血糖素受体上的增加的效力。

可以在胰高血糖素肽内的任意位置进行烷基化，包括1-29的任意位置、C-末端延伸内的位置或C-末端氨基酸，条件是保持胰高血糖素活性。非限制性例子包括位置5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29。烷基可以直接共价连接至胰高血糖素肽的氨基酸，或通过间隔子间接连接至胰高血糖素肽的氨基酸，其中所述间隔子位于胰高血糖素肽的氨基酸和烷基之间。胰高血糖素肽可以在亲水性部分连接的相同氨基酸位置或在不同的氨基酸位置进行烷基化。非限制性例子包括在位置10进行烷基化并且在胰高血糖素肽的C-末端部分的一个或多个位置(例如位置24、28或29)、C-末端延伸内或在C-末端(例如通过添加C-末端Cys)进行聚乙二醇化。

在本发明的具体方面，通过胰高血糖素肽的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基的直接烷基化使胰高血糖素肽被修饰为包含烷基。在一些实施方式中，在位置10、20、24或29进行烷基化。在此方面，烷基化的胰高血糖素肽可以包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或其修饰的氨基酸序列，所述修饰的氨基酸序列包含一个或多个本文描述的氨基酸修饰，在位置10、20、24和29上的至少一个氨基酸被修饰为包含侧链胺、羟基或巯基的任意氨基酸。在本发明的一些具体实施方式中，通过位置10的氨基酸的侧链胺、羟基或巯基进行胰高血糖素肽的直接烷基化。

在一些实施方式中，包含侧链胺的氨基酸是式I的氨基酸。在一些示例性实施方式中，式I的氨基酸是其中n等于4(Lys)或n等于3(Orn)的氨基酸。

在其它实施方式中，包含侧链羟基的氨基酸是式II的氨基酸。在一些示例性实施方式中，式II的氨基酸是其中n等于1的氨基酸(Ser)。

在其它实施方式中，包含侧链巯基的氨基酸是式III的氨基酸。在一些示例性实施方式中，式III的氨基酸是其中n等于1的氨基酸(Cys)。

在其它实施方式中，包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸是包含式I、式II或式III的相同结构的双取代氨基酸，区别在于与式I、式II或式III的氨基酸的α碳结合的氢替换为第二个侧链。

在本发明的一个实施方式中，烷基化的胰高血糖素肽在肽和烷基之间包含间隔子。在一些实施方式中，胰高血糖素肽共价结合至间隔子，所述间隔子共价结合至烷基。在一些示例性实施方式中，通过间隔子的胺、羟基或巯基的烷基化使胰高血糖素肽被修饰为包含烷基，所述间隔子结合至胰高血糖素肽的位置10、20、24或29的氨基酸侧链。间隔子所连接的氨基酸可以是任何氨基酸(例如，单一的α-取代的氨基酸或α，α-双取代氨基酸)，其包含允许连接至间隔子的部分。例如，包含侧链NH₂、-OH或-COOH的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是适宜的。在这个方面，烷基化的胰高血糖素肽可以包含SEQ ID NO：1的的氨基酸序列，或其修饰的氨基酸序列，所述修饰的氨基酸序列包含一个或多个本文描述的氨基酸修饰，在位置10、20、24和29上的至少一个氨基酸被修饰为包含侧链胺、羟基或羧基的任意氨基酸。

在一些实施方式中，间隔子是包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸，或包含含有侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。

当通过间隔子的氨基发生烷基化时，可以通过氨基酸的α胺或侧链胺发生烷基化。在α胺发生烷基化的情况下，间隔子的氨基酸可以是任意氨基酸。例如，间隔子的氨基酸可以是疏水性氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸。或者，间隔子的氨基酸可以是酸性残基，例如Asp和Glu，条件是在酸性残基的α胺上发生烷基化。在间隔子的氨基酸的侧链胺发生烷基化的情况下，间隔子的氨基酸可以是包含侧链胺的氨基酸，例如式I的氨基酸(例如Lys或Orn)。在这种情况下，间隔子的氨基酸的α胺或侧链胺二者都可以发生烷基化，从而所述胰高血糖素肽是双烷基化的。本发明的实施方式包括此类双烷基化的分子。

当通过间隔子的羟基发生烷基化时，氨基酸或二肽或三肽的氨基酸之一可以是式II的氨基酸。在具体的示例性实施方式中，所述氨基酸是Ser。

当通过间隔子的巯基发生烷基化时，氨基酸或二肽或三肽的氨基酸之一可以是式III的氨基酸。在具体的示例性实施方式中，所述氨基酸是Cys。

在一些实施方式中，间隔子是亲水性双官能间隔子。在一些实施方式中，所述亲水性双官能间隔子包含两个或更多个反应性基团，例如，胺、羟基、巯基和羧基或其任意组合。在一些实施方式中，所述亲水性双官能间隔子包含羟基和羧酸基团。在其它实施方式中，所述亲水性双官能间隔子包含氨基和羧酸基团。在其它实施方式中，所述亲水性双官能间隔子包含巯基和羧酸基团。在具体的实施方式中，所述间隔子包含氨基聚(烷氧基)羧酸基团。在这个方面，所述间隔子可以包含例如NH₂(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_mCOOH，其中m是1至6的任意整数，n是2至12的任意整数，例如，例如，8-氨基-3，6-二氧杂辛酸，其可通过商业渠道从Peptides International，Inc.(Louisville，KY)获得。

在一些实施方式中，所述间隔子是疏水性双官能间隔子。在一些实施方式中，所述疏水性双官能间隔子包含两个或更多个反应性基团，例如，胺、羟基、巯基和羧基或其任意组合。在一些实施方式中，所述疏水性双官能间隔子包含羟基和羧酸基团。在其它实施方式中，所述疏水性双官能间隔子包含氨基和羧酸基团。在其它实施方式中，所述疏水性双官能间隔子包含巯基和羧酸基团。包含羧酸基团和羟基或巯基的适宜的疏水性双官能间隔子是本领域已知的，包括，例如，8-羟基辛酸和8-巯基辛酸。

在具体的实施方式中，间隔子(例如氨基酸、二肽、三肽、亲水性或疏水性双官能间隔子)的长度为3至10个原子(例如6至10个原子，例如6、7、8、9或10个原子)。在更具体的实施方式中，间隔子长度是大约3至10个原子(例如6至10个原子)并且烷基是C12至C18烷基，例如C14烷基、C16烷基，从而间隔子和烷基的总长度是14至28个原子，例如，大约14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个原子。在一些实施方式中，间隔子和烷基的长度是17至28个(例如，19至26、19至21个)原子。

根据一些前述的实施方式，双官能间隔子可以是合成的或非天然存在的氨基酸，所述氨基酸包含长度为3至10个原子的氨基酸骨架(例如，6-氨基己酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸和8-氨基辛酸)。或者，间隔子可以是具有长度为3至10个原子(例如6至10个原子)的肽骨架的二肽或三肽间隔子。二肽或三肽间隔子可以由天然存在的和/或非天然存在的氨基酸组成，所述氨基酸包括，例如，本文教导的任意氨基酸。在一些实施方式中，间隔子包含总体的负电荷，例如，包含一个或两个带负电的氨基酸。在一些实施方式中，二肽间隔子选自Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-氨基丁酸-γ-氨基丁酸和γ-Glu-γ-Glu。

通过胺、羟基和巯基进行肽烷基化的合适方法是本领域已知的。例如，Williamson醚合成可用于在胰高血糖素肽的羟基和烷基之间形成醚键。同样，以卤代烷基进行肽的亲和取代反应可以产生醚、硫醚或氨基键中的任一个。

烷基化的胰高血糖素肽的烷基可以是任意大小，例如，任意长度的碳链，并且可以是线性的或支链的。在本发明的一些实施方式中，烷基是C4至C30的烷基。例如，烷基可以是下列任意：C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基。在一些实施方式中，烷基是C8至C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。

在一些具体的实施方式中，烷基包含胆汁酸的甾部分，所述胆汁酸是例如，胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸和胆固醇酸。

在本发明的一些实施方式中，通过亲核的长链烷烃与胰高血糖素肽的反应使胰高血糖素肽被修饰为包含烷基，其中所述胰高血糖素肽包含适合于亲核取代的离去基团。在具体的方面，长链烷烃的亲核基团包括胺、羟基或巯基(例如十八烷基胺、十四烷醇和十六烷硫醇)。胰高血糖素肽的离去基团可以是氨基酸侧链的一部分，或者可以是肽骨架的一部分。合适的离去基团包括，例如，N-羟基琥珀酸亚胺、卤素和磺酸酯。

在一些实施方式中，通过亲核的长链烷烃与连接至胰高血糖素肽的间隔子的反应使胰高血糖素肽被修饰为包含烷基，其中所述间隔子包含离去基团。在具体的方面，长链烷烃包含胺、羟基或巯基。在一些实施方式中，包含离去基团的间隔子可以是本文讨论的任何间隔子，例如，氨基酸、二肽、三肽、进一步包含适宜的离去基团的亲水性双官能间隔子和疏水性双官能间隔子。

在本发明的这些方面中，其中通过胰高血糖素肽或间隔子使长链烷烃烷基化，所述长链烷烃可以是任意大小并且可以包含任意长度的碳链。长链烷烃可以是线性的或支链的。在一些方面，长链烷烃是C4至C30烷烃。例如，长链烷烃可以是以下任意一个：C4烷烃、C6烷烃、C8烷烃、C10烷烃、C12烷烃、C14烷烃、C16烷烃、C18烷烃、C20烷烃、C22烷烃、C24烷烃、C26烷烃、C28烷烃或C30烷烃。在一些实施方式中，长链烷烃包含C8至C20烷烃，例如C14烷烃、C16烷烃或C18烷烃。

另外，在一些实施方式中，烷基化可以发生在胰高血糖素肽和胆固醇部分之间。例如，胆固醇的羟基可以置换长链烷烃中的离去基团从而形成胆固醇-胰高血糖素肽产物。

本文描述的烷基化的胰高血糖素肽还可以被进一步修饰为包含亲水性部分。在一些具体实施方式中，所述亲水性部分可以包含聚乙二醇(PEG)链。可以通过任何合适的方式掺入亲水性部分，例如本文描述的任何方法。在此方面，烷基化的胰高血糖素肽可以包含SEQ ID NO：1或其修饰的氨基酸序列，所述修饰的氨基酸序列包含一个或多个本文描述的氨基酸修饰，其中位置10、20、24和29的至少一个氨基酸包含烷基，并且位置16、17、21、24和29、C-末端延伸内的位置上的至少一个氨基酸或C-末端氨基酸被修饰为Cys、Lys、Orn、高半胱氨酸或Ac-Phe，并且氨基酸的侧链共价结合至亲水性部分(例如PEG)。在一些实施方式中，烷基任选地通过包含Cys、Lys、Orn、高半胱氨酸或Ac-Phe的间隔子连接至位置10，并且亲水性部分掺入到位置24上的Cys残基。

或者，烷基化的胰高血糖素肽可以包含间隔子，其中所述间隔子是烷基化的并且被修饰为包含亲水性部分。合适的间隔子的非限制性例子包括：包含选自Cys、Lys、Orn、高半胱氨酸和Ac-Phe的一个或多个氨基酸的间隔子。

降低GLP-1活性的修饰

在一些实施方式中，胰高血糖素肽或其类似物包含选择性地降低GLP-1活性的氨基酸修饰。例如，酰基化或烷基化的胰高血糖素肽或其类似物包含C-末端α羧酸基团(carboxylate group)；位置7的Thr替换为缺少羟基的氨基酸，例如Abu或Ile；删除在位置27或28的氨基酸C-末端的氨基酸(例如删除位置28的氨基酸，删除位置28和29的氨基酸)以产生长度为27或28个氨基酸的肽，或其组合。

缀合物

本公开还包括其它的缀合物，其中本发明的胰高血糖素肽任选地通过共价键和任选地通过接头连接至缀合部分。可以通过共价化学键、物理力例如静电、氢、离子、范德华力或疏水或亲水性相互作用完成连接。可以使用多种非共价偶合系统，包括生物素-亲和素、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂/脂结合蛋白、细胞粘附分子伴侣；或彼此具有亲和力的其任何结合伴侣或片段。

肽可以通过直接的共价键通过肽的靶氨基酸残基与有机衍生试剂反应而连接至缀合部分，所述有机衍生试剂能够与这些靶氨基酸的选定的侧链或N-或C-末端残基反应。肽或缀合部分上的反应性基团包括，例如，醛、胺、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基。衍生试剂包括例如马来酰亚胺基苯甲酰磺酸琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或其它本领域已知的试剂。或者，缀合部分可以通过中间体载体例如多糖或多肽载体间接地连接至肽。多糖载体的例子包括氨基葡聚糖。适宜的多肽载体的例子包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物，以及这些氨基酸和其它氨基酸例如丝氨酸的混合的聚合物，以便在产生的装载的载体上赋予想要的溶解性特性。

半胱氨酰残基最常用于与α-卤代乙酸(和相应的胺)，例如氯乙酸、氯乙酰胺反应以产生羧基甲基或羧基氨基甲基衍生物。半胱氨酸残基还通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基(imidozoyl))丙酸、氯乙酰基磷酸盐、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞基苯甲酸盐、2-氯汞基-4-硝基酚、或氯-7-硝基苯-2-氧-1，3-二唑反应而衍生。

组氨酰残基通过在pH 5.5-7.0与二乙基焦碳酸盐反应而衍生，因为该试剂对于组氨酰侧链是相对特异性的。对-溴代苯甲酰甲基溴也是有用的；该反应优选在pH 6.0在0.1M的二甲胂酸钠中进行。

赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。以这些试剂衍生具有逆反赖氨酰残基的电荷的效应。用于衍生含α-氨基的残基的其它合适的试剂包括酰亚胺酯，例如甲基吡啶亚胺甲酯、吡哆醛磷酸酯、吡哆醛、chloroborohydride、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮以及与乙醛酸的转氨基酶催化的反应。

精氨酰残基通过与一个或数个常规试剂反应进行修饰，其中有苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酰残基的衍生要求反应在碱性条件下进行，因为胍官能团具有高pK_a。此外，这些试剂可以与赖氨酸基团以及精氨酸的ε-氨基反应。

酪氨酰残基的特异性修饰(特别是想向酪氨酰残基中引入光谱标签)可以通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应而获得。N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷最常用于分别形成O-乙酰基酪氨酸物质和3-硝基衍生物。

羧基侧基团(天冬氨酰或谷氨酰)通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R′)反应而进行选择性修饰，其中R和R′是不同的烷基，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-azonia-4，4-二甲基苯基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应被转化为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。

其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，79-86页(1983))，天冬酰胺或谷氨酰胺的去酰胺化，N-末端胺的乙酰化，和/或C-末端羧酸的酰胺化或酯化。

另一种类型的共价修饰涉及将糖苷化学地或酶促地偶联至肽。糖可以结合至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离的羧基，(c)游离的硫氢基，例如半胱氨酸的巯基，(d)游离的羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的羟基，(e)芳香族残基，例如酪氨酸或色氨酸的芳香族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺。这些方法描述于1987年9月11日公开的WO87/05330以及Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，259-306页(1981)。

可以连接至本文描述的任意胰高血糖素肽的示例性缀合部分包括但不限于异源肽或多肽(包括例如，血浆蛋白)、靶向试剂、免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)、诊断标记(例如放射性同位素、荧光团或酶标)、聚合物(包括水溶性聚合物)或其它治疗性或诊断性试剂。在一个实施方式中，提供了包含本发明的胰高血糖素肽和血浆蛋白的缀合物，其中所述血浆蛋白选自白蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和球蛋白。在一个实施方式中，缀合物的血浆蛋白部分是白蛋白或转铁蛋白。在一些实施方式中，接头包含长度为1至大约60或1至30个原子或更长，2至5个原子，2至10个原子，5至10个院子，或10至20个原子的原子链。在一些实施方式中，链原子都是碳原子。在一些实施方式中，接头的骨架中的链原子选自C、O、N和S。链原子和接头可以根据其想要的溶解性(亲水性)来选择，从而提供更可溶的缀合物。在一些实施方式中，接头提供官能团，所述官能团经历靶组织或器官或细胞中存在的酶或其它催化剂或水解条件的切割。在一些实施方式中，接头的长度足以减少潜在的空间位阻。如果接头是共价键或肽键并且缀合物是多肽，则整个缀合物可以是融合蛋白。此类肽接头可以是任意长度。示例性的接头长度是大约1至50个氨基酸，5至50、3至5、5至10、5至15或10至30个氨基酸的长度。此类融合蛋白可以替代性地通过本领域普通技术人员已知的重组遗传工程方法产生。

如上所述，在一些实施方式中，胰高血糖素肽是缀合的，例如，融合至免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)。已知类型的免疫球蛋白(Ig)包括IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc区是Ig重链的C-末端区域，其负责结合至具有诸如再生(导致延长的半衰期)、抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)的活性的Fc受体。

例如，根据一些定义，人类IgG重链Fc区从Cys226延展至重链的C-末端。“铰链区”一般从人类IgG1的Glu216延伸至Pro230(其它IgG同种型的铰链区可以通过比对参与半胱氨酸结合的半胱氨酸而与IgG1序列比对)。IgG的Fc区包括两个恒定结构域：CH2和CH3。人类IgG的Fc区的CH2结构域通常从氨基酸231延伸至氨基酸341。人类IgG的Fc区的CH3结构域通常从氨基酸342延伸至447。提及免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区域的氨基酸编号都是基于Kabat等人1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Public Health，Bethesda，Md。在相关的实施方式中，Fc区可以包括一个或多个来自免疫球蛋白重链的CH1之外的原始的或修饰的恒定区，例如IgG和IgA的CH2和CH3区，或者IgE的CH3和CH4区。

适宜的缀合部分包括：包含FcRn结合位点的免疫球蛋白序列的部分。FcRn是一种清道夫受体，其负责使免疫球蛋白再生并将其返回至血液循环。已经基于X-射线结晶学描述了IgG的与FcRn受体结合的部分的区域(Burmeister等人1994，Nature 372：379)。与FcRn接触的Fc的主要区域是接近CH2和CH3结构域的连接处。Fc-FcRn的接触完全处于单一的Ig重链内。主要接触位点包括CH₂结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。

一些缀合部分可以包括或不包括FcγR结合位点。FcγR负责ADCC和CDC。与FcγR直接接触的Fc区域内的位置的实例是氨基酸234-239(低铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C′/E环)和氨基酸327-332(F/G环)(Sondermann等人，Nature 406：267-273，2000)。已经暗示IgE的低铰链区参与FcRI的结合(Henry等人，Biochemistry 36，15568-15578，1997)。参与IgA受体结合的残基描述于Lewis等人，(J Immunol.175：6694-701，2005)。参与IgE受体结合的氨基酸残基描述于Sayers等人(J Biol Chem.279(34)：35320-5，2004)。

可以对免疫球蛋白的Fc区进行氨基酸修饰。此类变体Fc区包含在Fc区的CH3结构域(残基342-447)中的至少一个氨基酸修饰和/或在Fc区的CH2结构域(残基231-341)中的至少一个氨基酸修饰。相信赋予FcRn增加的亲和力的突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等人2001，J.Biol.Chem.276：6591)。其它突变可能减少Fc区与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合但不显著降低与FcRn的亲和力。例如，Fc区的位置297上的Asn替换为Ala或另一个氨基酸会除去高度保守的N-糖基化位点并产生降低的免疫原性和同时产生Fc区的延长的半衰期，以及与FcγR的减少的结合(Routledge等人1995，Transplantation 60：847；Friend等人1999，Transplantation 68：1632；Shields等人1995，J.Biol.Chem.276：6591)。已经制备了IgG1的位置233-236的氨基酸修饰，其减少与FcγR的结合(Ward and Ghetie 1995，Therapeutic Immunology 2：77；和Armour等人1999，Eur.J.Immunol.29：2613)。一些示例性的氨基酸替换描述于美国专利7,355,008和7,381,408，每篇皆通过引用全文并入本文。

本公开还包括胰高血糖素融合肽或蛋白，其中第二肽或多肽融合至胰高血糖素肽的末端，例如羧基末端。用于C-末端融合的示例性候选物包括连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO：20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：22(KRNR)。

α-螺旋结构的稳定化

在胰高血糖素肽的位置1和/或位置2的氨基酸修饰后胰高血糖素活性的降低可以通过胰高血糖素肽的C-末端部分(约氨基酸12-29)中的α-螺旋结构的稳定化来恢复。可以通过例如形成共价或非共价的分子内桥、以α-螺旋稳定性氨基酸(例如α-α-双取代氨基酸)替换位置12-29左右的氨基酸和/或在氨基酸位置12-29左右插入此类氨基酸来使α-螺旋结构稳定。

在一些实施方式中，在两个氨基酸侧链之间形成分子内桥以稳定胰高血糖素肽的羧基末端部分(例如，氨基酸12-29)的三维结构。两个氨基酸侧链可以通过非共价键(例如氢键、离子相互作用，例如形成盐桥)或通过共价键彼此连接。当两个氨基酸侧链通过一个或多个共价键彼此连接时，肽在本文中可以认为是包含共价的分子内桥。当两个氨基酸侧链通过非共价键(例如氢键、离子相互作用)彼此连接时，肽在本文中可以认为是包含非共价的分子内桥。

在一些实施方式中，在相隔3个氨基酸的两个氨基酸之间形成分子内桥，例如位置i和i+4的氨基酸，其中i是12至25的任意整数(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25)。更特别地，氨基酸对12和16、16和20、20和24、或24和28(其中i＝12、16、20或24时的氨基酸对)的氨基酸的侧链彼此连接，从而稳定胰高血糖素的α螺旋。或者，i可以是17。

在一些具体实施方式中，其中位置i和i+4的氨基酸通过分子内桥连接，接头的大小是约8个原子，或约7-9个原子。

在其它实施方式中，在间隔2个氨基酸的两个氨基酸之间形成分子内桥，例如位置j和j+3的氨基酸，其中i是12至26的任意整数(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26)。在一些具体的实施方式中，j是17。

在一些具体的实施方式中，其中位置j和j+3的氨基酸通过分子内桥连接，接头的大小是约6个原子，或约5-7个原子。

在其它实施方式中，在间隔6个氨基酸的两个氨基酸之间形成分子内桥，例如位置k和k+7的氨基酸，其中k是12至22的任意整数(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和22)。在一些具体的实施方式中，k是12、13或17。在示例性的实施方式中，k是17。

能够共价键合以形成6-原子键桥的氨基酸对的实例包括Orn和Asp；Glu和式I的氨基酸，其中n是2；以及高谷氨酸和式I的氨基酸，其中n是1；其中式I是：

其中n＝1-4

[式I]

能够共价结合以形成7-原子键桥的氨基酸对的实例包括Orn-Glu(内酰胺环)；Lys-Asp(内酰胺)；或Homoser-Homoglu(内酯)。可以形成8-原子接头的氨基酸对的实例包括Lys-Glu(内酰胺)；Homolys-Asp(内酰胺)；Orn-Homoglu(内酰胺)；4-氨基Phe-Asp(内酰胺)；或Tyr-Asp(内酯)。可以形成9-原子接头的氨基酸对的实例包括Homolys-Glu(内酰胺)；Lys-Homoglu(内酰胺)；4-氨基Phe-Glu(内酰胺)；或Tyr-Glu(内酯)。这些氨基酸的任意侧链还可以被另外的化学基团取代，只要α-螺旋的三维结构不被破坏。本领域普通技术人员能够预见替代性的配对或替代性的氨基酸类似物，包括化学修饰的衍生物，它们能够产生相似大小和想要的效应的稳定结构。例如，高半胱氨酸-高半胱氨酸二硫桥长度为6个原子，其可进一步被修饰为提供想要的效应。即使没有共价键，以上描述的氨基酸配对或本领域普通技术人员可以预见的那些类似配对也可以通过非共价键(例如通过形成盐桥或氢键相互作用)为α-螺旋提供增加的稳定性。

取决于氨基酸侧链的长度，内酰胺环的大小可以变化，在一个实施方式中，内酰胺通过赖氨酸的氨基酸侧链与谷氨酸的侧链的连接而形成。另外的示例性实施方式包括下列配对，任选具有内酰胺桥：位置12的Glu与位置16的Lys；位置12的原始Lys与位置16的Glu；位置16的Glu与位置20的Lys；位置16的Lys与位置20的Glu；位置20的Glu与位置24的Lys；位置20的Lys与位置24的Glu；位置24的Glu与位置28的Lys；位置24的Lys与位置28的Glu。或者，内酰胺环中的酰胺键的顺序可以颠倒(例如可以在Lys12和Glu16的侧链之间，或Glu12和Lys16的侧链之间形成内酰胺环)。

除了内酰胺桥之外的分子内桥可用于稳定胰高血糖素类似物肽的α-螺旋。在一个实施方式中，分子内桥是疏水桥。在这种情况下，分子内桥任选位于胰高血糖素类似物肽的α-螺旋的疏水面的一部分的两个氨基酸的侧链之间。例如，疏水桥连接的两个氨基酸之一可以是位置10、14和18的氨基酸。

在一个具体的方面，烯烃复分解用于交联胰高血糖素肽的α-螺旋的一个或两个翻转，其使用全烃交联系统。在这种情况下，胰高血糖素肽可以包含α-甲基化的氨基酸，其携带不同长度的烯烃侧链并且在i和i+4或i+7位置上具有R或S立体化学性质。例如，烯烃侧链可以包含(CH₂)n，其中n是1至6的任意整数。在一个实施方式中，对于8个原子长度的交联，n是3。形成此类分子内桥的适宜方法在本领域有描述。参见，例如Schafmeister等人，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)和Walensky等人，Science 305：1466-1470(2004)。或者，胰高血糖素肽可以包含位于邻近螺旋翻转的O-烷基丝氨酸残基，其通过钌催化的关环复分解反应桥接在一起。此类交联的程序描述于例如Blackwell等人，Angew，Chem.，Int.Ed.37：3281-3284(1998)。

在另一个具体方面，非天然硫代二丙氨酸氨基酸，羊毛硫氨酸(其已被广泛用作胱氨酸的仿肽)用于交联α-螺旋的一个翻转。基于羊毛硫氨酸的环化的适宜方法是本领域已知的。参见，例如Matteucci等人，Tetrahedron Letters 45：1399-1401(2004)；Mayer等人，J.Peptide Res.51：432-436(1998)；Polinsky等人，J.Med.Chem.35：4185-4194(1992)；Osapay等人，J.Med.Chem.40：2241-2251(1997)；Fukase等人，Bull.Chem.Soc.Jpn.65：2227-2240(1992)；Harpp等人，J.Org.Chem.36：73-80(1971)；Goodman and Shao，Pure Appl.Chem.68：1303-1308(1996)；以及Osapay and Goodman，J.Chem.Soc.Chem.Commun.1599-1600(1993)。

在一些实施方式中，α，ω-二氨基烷烃系绳(tether)，例如位置i和i+7的两个Glu残基之间的1，4-二氨基丙烷和1，5-二氨基戊烷用于稳定胰高血糖素肽的α-螺旋。此类系绳引起9-原子或更长的桥的形成，取决于二氨基烷烃系绳的长度。产生通过此类系绳进行交联的肽的适宜方法在本领域有描述。参见，例如Phelan等人，J.Am.Chem.Soc.119：455-460(1997)。

在本发明的另一个实施方式中，二硫桥用于交联胰高血糖素肽的α-螺旋的一个或两个翻转。或者，修饰的二硫桥(其中一个或两个硫原子替换为亚甲基，从而产生电子等排的大环化(isosteric macrocyclization))用于稳定胰高血糖素肽的α-螺旋。以二硫桥或基于硫的环化来修饰肽的适宜方法描述于例如Jackson等人，J.Am.Chem.Soc.113：9391-9392(1991)以及Rudinger and Jost，Experientia 20：570-571(1964)。

在另一个实施方式中，通过位置i和i+4上的两个His残基或His与Cys对和金属原子的结合来稳定胰高血糖素肽的α-螺旋。所述金属原子可以是例如Ru(III)、Cu(II)、Zn(II)或Cd(II)。此类基于金属结合的α-螺旋稳定化的方法是本领域已知的。参见，例如，Andrews and Tabor，Tetrahedron 55：11711-11743(1999)；Ghadiri等人，J.Am.Chem.Soc.112：1630-1632(1990)；以及Ghadiri等人，J.Am.Chem.Soc.119：9063-9064(1997)。

或者，可以通过其它肽环化的方式稳定胰高血糖素肽的α-螺旋，所述方式见综述Davies，J.Peptide.Sci.9：471-501(2003)。可以通过形成酰胺桥、硫醚桥、硫酯桥、脲桥、氨基甲酸酯桥、磺胺桥等稳定α-螺旋。例如，可以在C-末端和Cys残基的侧链之间形成硫酯桥。或者，可以通过具有巯基的氨基酸(Cys)的侧链和具有羧酸的氨基酸(例如Asp、Glu)的侧链形成硫酯。在另一个方法中，交联剂例如二羧酸(例如辛二酸(suberic acid，octanedioic acid))可以在氨基酸侧链的两个官能团(例如游离氨基、羟基、巯基及其组合)之间引入连接。

根据一个实施方式，通过在位置i和i+4引入疏水性氨基酸来稳定胰高血糖素肽的α-螺旋。例如，i可以是Tyr且i+4可以是Val或Leu；i可以是Phe且i+4可以是Cys或Met；i可以是Cys且i+4可以是Met；或，i可以是Phe且i+4可以是Ile。应该理解的是，为了本文的目的，上述氨基酸对可以反过来，即所述的位置i的指明的氨基酸可以替代性地位于i+4，同时i+4的氨基酸可以位于位置i。

根据本发明的其它实施方式，通过在胰高血糖素肽的C-末端部分(大约是氨基酸12-29)引入(通过氨基酸替换或插入)一个或多个α-螺旋稳定性氨基酸来稳定α-螺旋。在具体的实施方式中，所述α-螺旋稳定性氨基酸是α，α-双取代氨基酸，包括但不限于下列任意：氨基异丁酸(AIB)、以选自甲基、乙基、丙基和正丁基的相同或不同基团或以环辛烷或环庚烷双取代的氨基酸(例如，1-氨基环辛烷-1-羧酸)。在一些实施方式中，胰高血糖素肽的位置16、17、18、19、20、21、24或29中的1个、2个、3个、4个或更多个替换为α，α-双取代氨基酸。在具体的实施方式中，位置16、20、21和24中的1个、2个、3个或全部替换为AIB。例如，胰高血糖素肽可以包含位置16替换为AIB，但没有分子内桥，例如非共价分子内桥(例如盐桥)，或共价分子内桥，例如(内酰胺)。此类缺少分子内桥的肽可以很容易地制备。

根据一些实施方式，缺少分子内桥的胰高血糖素肽在氨基酸位置12-29中包含一个或多个以α，α-双取代氨基酸进行的替换，以及共价连接至胰高血糖素肽的氨基酸(例如胰高血糖素肽的位置10的氨基酸)的侧链的酰基或烷基。在具体的实施方式中，所述酰基或烷基对于天然存在的氨基酸而言不是原始的。在一些方面，所述酰基或烷基对于位置10的氨基酸而言不是原始的。与非酰基化的同类(counterpart)肽相比，此类缺少分子内桥的酰基化或烷基化的胰高血糖素肽显示出在GLP-1和胰高血糖素受体上的增强的活性。可以通过在酰基或烷基与肽的位置10的氨基酸侧链之间引入间隔子的方式，实现缺少分子内桥的酰基化的胰高血糖素肽在GLP-1和胰高血糖素受体上的活性的进一步增强。在本文中进一步描述了具有或不具有引入的间隔子的酰基化和烷基化。

在具体的实施方式中，酰基化或烷基化的胰高血糖素肽或其类似物还包含选择性地降低在GLP-1受体上的活性的修饰。例如，酰基化或烷基化的胰高血糖素肽或其类似物包含下列一项或其组合：C-末端α羧酸基团、删除在位置27或28的氨基酸的C-末端的氨基酸(例如，删除位置29的氨基酸，删除位置28和29的氨基酸)，位置7的Thr替换为缺少羟基的氨基酸例如Abu或Ile。

实施方式的实例

根据一个实施方式，SEQ ID NO：1的原始胰高血糖素肽进行以下修饰：位置28和/或29的原始氨基酸替换为带负电的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)，并任选地向肽的羧基末端添加带负电的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)。在替代性的实施方式中，SEQ ID NO：1的原始胰高血糖素肽进行以下修饰：位置29的原始氨基酸替换为带正电的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)，并任选地向肽的羧基末端添加1个或2个带正电的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)。根据一个实施方式，提供了具有改善的溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物，其中所述类似物包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列，条件是位置28或29的至少一个氨基酸替换为酸性氨基酸和/或在SEQ ID NO：34的羧基末端添加另外的酸性氨基酸。在一个实施方式中，所述酸性氨基酸独立地选自Asp、Glu、半胱氨酸和高半胱氨酸。

根据一个实施方式，提供了具有改善的溶解性和稳定性的胰高血糖素激动剂，其中所述激动剂包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列，其中位置27、28或29的至少一个氨基酸替换为非原始氨基酸残基(即类似物的位置27、28或29上存在的至少一个氨基酸是不同于SEQ ID NO：1的相应位置上存在的氨基酸的氨基酸)。根据一个实施方式，提供了胰高血糖素激动剂，其包含SEQ ID NO：33的序列，条件是当位置28的氨基酸是天冬酰胺并且位置29的氨基酸是苏氨酸时，肽还包含添加至胰高血糖素肽的羧基末端的1至2个独立地选自Lys、Arg、His、Asp或Glu的氨基酸。

已经有报道指出，可以修饰原始胰高血糖素肽的某些位置但仍然保留母体肽的至少一些活性。因此，申请人预期位于SEQ ID NO：11的肽的位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28或29的一个或多个氨基酸可以替换为与原始胰高血糖素肽中存在的那些不同的氨基酸，并仍然保持母体胰高血糖素肽的增强的效力、生理pH稳定性和生物学活性。例如，根据一个实施方式，原始肽的位置27上存在的蛋氨酸残基改变为亮氨酸或正亮氨酸以防止肽的氧化降解。

在一个实施方式中，提供了SEQ ID NO：33的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24的1至6个氨基酸不同于SEQ ID NO：1的相应氨基酸。根据另一个实施方式，提供了SEQ ID NO：33的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24的1至3个氨基酸不同于SEQ ID NO：1的相应氨基酸。在另一个实施方式中，提供了SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：34的胰高血糖素类似物，其中选自类似物的位置1、2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或24的1至2个氨基酸不同于SEQ ID NO：1的相应氨基酸，在另一个实施方式中，那些1至2个不同的氨基酸相对于原始序列(SEQ ID NO：1)中存在的氨基酸是保守性氨基酸替换。在一个实施方式中，提供了SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽在选自位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27或29的位置上还包括1个、2个或3个氨基酸替换。在一个实施方式中，位置2、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、27或29的替换是保守性氨基酸替换。

在一个实施方式中，提供了胰高血糖素激动剂，其包含SEQ ID NO：1的类似物肽，其中所述类似物与SEQ ID NO：1的区别在于位置2的氨基酸不是丝氨酸并且位置28或29的原始氨基酸替换为酸性氨基酸，或者在SEQ ID NO：1的肽的羧基末端添加酸性氨基酸。在一个实施方式中，所述酸性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。在一个实施方式中，提供了SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：32的胰高血糖素类似物，其中所述类似物与母体分子的区别在于位置2具有替换。更特别地，类似物肽的位置2替换为选自D-丝氨酸、丙氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、n-甲基丝氨酸和氨基异丁酸的氨基酸。

在另一个实施方式中，提供了胰高血糖素激动剂，其包含SEQ ID NO：1的类似物肽，其中所述类似物与SEQ ID NO：1的区别在于位置1的氨基酸不是组氨酸并且位置28或29的原始氨基酸替换为酸性氨基酸，或者在SEQ ID NO：1的肽的羧基末端添加酸性氨基酸。在一个实施方式中，所述酸性氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。在一个实施方式中，提供了SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：32的胰高血糖素类似物，其中所述类似物与母体分子的区别在于位置1具有替换。更特别地，类似物肽的位置1替换为选自DMIA、D-组氨酸、去氨基组氨酸、羟基组氨酸、乙酰基组氨酸和高组氨酸的氨基酸。

根据一个实施方式，修饰的胰高血糖素肽包含选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：32的序列。在另一个实施方式中，提供了胰高血糖素肽，其包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：32的序列，还包含添加到SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：32的C-末端的1个或2个氨基酸，其中另外的氨基酸独立地选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸或高半胱氨酸。在一个实施方式中，添加到羧基末端的另外的氨基酸选自Lys、Arg、His、Asp或Glu，或者，在另外的实施方式中，所述另外的氨基酸是Asp或Glu。

在另一个实施方式中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：7的序列或其胰高血糖素激动剂类似物。在一个实施方式中，肽包含选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列。在另一个实施方式中，肽包含选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的序列。在一个实施方式中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的序列，还包含添加到胰高血糖素肽的C-末端的选自Asp和Glu的另外的氨基酸。在一个实施方式中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的序列，在另一个实施方式中，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：11的序列。

根据一个实施方式，提供了胰高血糖素激动剂，其包含选自下列的修饰的胰高血糖素肽：

NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R  (SEQ ID NO：34)，

NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R(SEQ ID NO：11)和

NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Glu-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R(SEQ ID NO：13)，

其中位置15的Xaa是Asp、Glu、半胱氨酸、高谷氨酸或高半胱氨酸，位置28的Xaa是Asn或酸性氨基酸，并且位置29的Xaa是Thr或酸性氨基酸，并且R是酸性氨基酸、COOH或CONH₂，条件是在位置28、29或30中的一个位置上存在酸性氨基酸残基。在一个实施方式中，R是COOH，在另一个实施方式中，R是CONH₂。

本公开还包括这样的胰高血糖素肽，其中第二肽融合至所述胰高血糖素肽的C-末端以增强所述胰高血糖素肽的稳定性和溶解性。更特别地，融合胰高血糖素肽可以包含：胰高血糖素激动剂类似物，该胰高血糖素激动剂类似物包含胰高血糖素肽NH₂-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R(SEQ ID NO：34)(其中R是酸性氨基酸或键)以及连接至胰高血糖素肽的羧基末端氨基酸的SEQ ID NO：20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：22(KRNR)的氨基酸序列。在一个实施方式中，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8，其还包含连接至胰高血糖素肽的羧基末端氨基酸的SEQ ID NO：20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：22(KRNR)的氨基酸序列。在一个实施方式中，胰高血糖素融合肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或其胰高血糖素激动剂类似物，其还包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO：20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：22(KRNR)的氨基酸序列。根据一个实施方式，融合肽还包含连接至位置16、17、21、24、29的氨基酸、C-末端延伸内的氨基酸或C-末端氨基酸的PEG链，其中所述PEG链选自500至40,000道尔顿的范围。在一个实施方式中，SEQ ID NO：20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：22(KRNR)的氨基酸序列通过肽键结合至胰高血糖素肽的氨基酸29。在一个实施方式中，胰高血糖素融合肽的胰高血糖素肽部分包含选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13的序列。在一个实施方式中，胰高血糖素融合肽的胰高血糖素肽部分包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的序列，其中PEG链分别连接至位置21、24、29，C-末端延伸内，或C-末端氨基酸。

在另一个实施方式中，融合肽的胰高血糖素肽序列包含SEQ ID NO：11的序列，还包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO：20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：22(KRNR)的氨基酸序列。在一个实施方式中，胰高血糖素融合肽包含选自SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的序列。通常本发明的融合肽将含有具有包含标准羧酸基团的C-末端氨基酸。但是，实施方式中也包括这样的序列类似物，其中C-末端氨基酸的羧酸替换为酰胺。根据一个实施方式，融合胰高血糖素肽包含选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13的胰高血糖素激动剂类似物，还包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO：23(GPSSGAPPPS-CONH₂)的氨基酸序列。

本发明的胰高血糖素激动剂可以被进一步修饰以改善肽在水溶液中的溶解性和稳定性，但仍然保留胰高血糖素肽的生物学活性。根据一个实施方式，预期在SEQ ID NO：11的肽或其胰高血糖素激动剂类似物的位置16、17、20、21、24和29中的一个或多个位置上引入亲水性基团，会改善pH稳定性胰高血糖素类似物的溶解性和稳定性。更特别地，在一个实施方式中，SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：32的胰高血糖素肽被修饰为包含一个或多个共价连接至胰高血糖素肽的位置21和24的氨基酸的侧链的亲水性基团。

根据一个实施方式，SEQ ID NO：11的胰高血糖素肽被修饰为在位置16、17、20、21、24和/或29包含一个或多个氨基酸替换，其中原始氨基酸替换为具有适合与亲水性部分(包括，例如PEG)交联的侧链的氨基酸。可以以天然存在的氨基酸或合成的(非天然存在的)氨基酸替换原始肽。合成的或非天然存在的氨基酸是指不在体内天然存在的氨基酸，但是，其可以被引入到本文描述的肽结构中。

在一个实施方式中，提供了SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的胰高血糖素激动剂，其中原始胰高血糖素肽序列被修饰为在原始序列的位置16、17、21、24、29中的至少一个位置，C-末端延伸内或在C-末端氨基酸包含天然产生的或合成的氨基酸，其中氨基酸替换还包含亲水性部分。在一个实施方式中，所述替换是在位置21或24，在另一个实施方式中，所述亲水性部分是PEG链。在一个实施方式中，以至少一个半胱氨酸残基替换SEQ ID NO：11的胰高血糖素肽，其中所述半胱氨酸残基的侧链进一步被巯基反应剂修饰，所述巯基反应剂包括例如马来酰亚胺、乙烯砜、2-吡啶基巯基、卤代烷基和卤代酰基。这些巯基反应剂可以包含羧基、酮、羟基和醚基团以及其它亲水性部分，例如聚乙二醇单元。在替代性实施方式中，以赖氨酸替换原始胰高血糖素肽，并且使用胺反应剂进一步修饰所述替换性赖氨酸残基的侧链，所述胺反应剂是例如羧酸的活性酯(琥珀酰亚胺、酐等)或亲水性部分(例如聚乙二醇)的醛。在一个实施方式中，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19。

根据一个实施方式，聚乙二醇化的胰高血糖素肽包含共价结合至胰高血糖素肽的两个或更多个聚乙烯链，其中胰高血糖素链的总分子量是大约1,000至大约5,000道尔顿。在一个实施方式中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：6的肽，其中PEG链共价连接至位置21和位置24的氨基酸残基，并且其中两个PEG链的组合分子量是大约1,000至大约5,000道尔顿。在另一个实施方式中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：6的肽，其中PEG链共价连接至位置21和位置24的氨基酸残基，并且其中两个PEG链的组合分子量是大约5,000至大约20,000道尔顿。

聚乙二醇链可以是直链形式或可以是分支的。根据一个实施方式，聚乙二醇链的平均分子量为大约500至大约40,000道尔顿的范围。在一个实施方式中，聚乙二醇链的分子量为大约500至大约5,000道尔顿的范围。在另一个实施方式中，聚乙二醇链的分子量为大约20,000至大约40,000道尔顿。

以上描述的任意胰高血糖素肽还可以被进一步修饰以在胰高血糖素肽的C-末端部分(氨基酸位置12-29)内包括共价的或非共价的分子内桥或α螺旋稳定性氨基酸。根据一个实施方式，胰高血糖素肽除了在位置16、20、21或24(或其组合)上的氨基酸替换为α，α-双取代氨基酸例如AIB之外，包含任意的一个或多个上文讨论的修饰。根据另一个实施方式，胰高血糖素肽除了在胰高血糖素肽的位置16和20的氨基酸侧链之间的分子内桥例如内酰胺之外，包含任意的一个或多个上文讨论的修饰。

根据一些实施方式，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列，其中位置3的Xaa是包含结构I、II或III的侧链的氨基酸：

结构I

结构II

结构III

其中R¹是C_0-3烷基或C_0-3杂烷基；R²是NHR⁴或C_1-3烷基；R³是C_1-3烷基；R⁴是H或C_1-3烷基；X是NH、O或S；并且Y是NHR⁴、SR³或OR³。在一些实施方式中，X是NH或Y是NHR⁴。在一些实施方式中，R¹是C_0-2烷基或C₁杂烷基。在一些实施方式中，R²是NHR⁴或C₁烷基。在一些实施方式中，R⁴是H或C¹烷基。在示例性的实施方式中，提供了包含结构I的侧链的氨基酸，其中R¹是CH₂-S，X是NH，并且R²是CH₃(乙酰氨基甲基-半胱氨酸，C(Acm))；R¹是CH₂，X是NH，并且R²是CH₃(乙酰二氨基丁酸，Dab(Ac))；R¹是C₀烷基，X是NH，R²是NHR⁴，并且R⁴是H(氨基甲酰二氨基丙酸，Dap(urea))；或R¹是CH₂-CH₂，X是NH，并且R²是CH₃(乙酰鸟氨酸，Orn(Ac))。在示例性的实施方式中，提供了包含结构II的侧链的氨基酸，其中R¹是CH₂，Y是NHR⁴，并且R⁴是CH₃(甲基谷氨酰胺，Q(Me))；在示例性的实施方式中，提供了包含结构III的侧链的氨基酸，其中R¹是CH₂并且R⁴是H(蛋氨酸-亚砜，M(O))。在具体的实施方式中，位置3的氨基酸被Dab(Ac)替换。例如，胰高血糖素激动剂可以包含SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74的氨基酸序列。

在一些实施方式中，胰高血糖素肽是SEQ ID NO：77的胰高血糖素肽的类似物。在具体的方面，所述类似物包含本文描述的任意氨基酸修饰，包括但不限于：位置28的Asn替换为带电的氨基酸；位置28的Asn替换为选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的带电的氨基酸；位置28替换为Asn、Asp或Glu；位置28替换为Asp；位置28替换为Glu；位置29的Thr替换为带电的氨基酸；位置29的Thr替换为选自Lys、Arg、His、Asp、Glu、半胱氨酸和高半胱氨酸的带电的氨基酸；位置29替换为Asp、Glu或Lys；位置29替换为Glu；在位置29之后插入1-3个带电的氨基酸；在位置29之后插入Glu或Lys；在位置29之后插入Gly-Lys或Lys-Lys；及其组合。

在一些实施方式中，SEQ ID NO：77的胰高血糖素肽的类似物在位置16、20、21和24中的1个、2个、3个或全部包含α，α-双取代氨基酸例如AIB。

在一些实施方式中，SEQ ID NO：77的胰高血糖素肽的类似物包含以下一个或多个：位置1的His替换为非原始氨基酸，其降低胰高血糖素肽对于二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性；位置2的Ser替换为非原始氨基酸，其降低胰高血糖素肽对于二肽基肽酶IV(DPP-IV)切割的敏感性；位置7的Thr替换为缺少羟基的氨基酸，例如Abu或Ile；位置10的Tyr替换为Phe或Val；位置12的Lys替换为Arg；位置15的Asp替换为Glu；位置16的Ser替换为Thr或AIB；位置20的Gln替换为Ala或AIB；位置21的Asp替换为Glu；位置24的Gln替换为Ala或AIB；位置27的Met替换为Leu或Nle；删除位置27-29的氨基酸；删除位置28-29的氨基酸；删除位置29的氨基酸；向C-末端添加SEQ ID NO：20的氨基酸序列，其中位置29的氨基酸是Thr或Gly；或其组合。

根据具体的实施方式，胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：62-67和69-74的任一项的氨基酸序列。

在一些实施方式中，包含SEQ ID NO：77的胰高血糖素肽的类似物包含亲水性部分，例如PEG，所述亲水性部分共价连接至位置16、17、20、21、24和29的任意位置的氨基酸或C-末端氨基酸。

在一些实施方式中，包含SEQ ID NO：77的胰高血糖素肽的类似物包含含有任选地通过间隔子共价结合至酰基或烷基的侧链的氨基酸，所述酰基或烷基对于天然产生的氨基酸而言不是原始的。在一些实施方式中，所述酰基是C4至C30脂肪酰基。在其它实施方式中，所述烷基是C4至C30烷基。在具体的方面，所述酰基或烷基共价结合至位置10的氨基酸的侧链。在一些实施方式中，位置7的氨基酸是Ile或Abu。

用途

如实施例部分详细描述，本发明的胰高血糖素激动剂在生理pH的溶液中具有增强的生物物理稳定性和水溶性，但保持或具有相对于原始肽的增强的生物活性。因此，相信本发明的胰高血糖素激动剂适合于以前对于原始胰高血糖素肽所描述的任意用途。因此，本文描述的修饰的胰高血糖素肽可用于治疗低血糖症、用于提高血糖水平、用于引起肠道的暂时性麻痹以用于放射学目的、用于减少和维持体重、作为胰岛素的辅助治疗、或用于治疗由低血液水平的胰高血糖素引起的其它代谢疾病。

本文描述的胰高血糖素肽还预期用于减少或维持体重、或用于治疗高血糖症、或用于降低血糖水平、或用于使血糖水平正常化、和/或用于使血糖水平稳定。使血糖水平“正常化”意思是使血糖水平恢复至正常(例如，如果血糖水平比正常偏高，则使其降低；或，如果血糖水平比正常偏低，则使其升高)。使血糖水平“稳定”意思是在一段时间内，例如8小时、16小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天或1周，降低血糖水平的最大波动。例如，给予胰高血糖素肽引起血糖水平在一段时间内维持在比不给予胰高血糖素肽时更接近于葡萄糖值的正常范围。

本发明的胰高血糖素肽可以单独给药或与其它抗糖尿病或抗肥胖试剂联合给药。本领域已知的或正在研究的抗糖尿病试剂包括胰岛素；磺脲，例如甲苯磺丁脲(Orinase)、醋酸己脲(Dymelor)、妥拉磺脲(Tolinase)、氯磺丙脲(Diabinese)、格列吡嗪(Glucotrol)、格列本脲(Diabeta，Micronase，Glynase)、格列美脲(Amaryl)或格列齐特(Diamicron)；氯茴苯酸类，例如，瑞格列奈(Prandin)或那格列奈(Starlix)；双胍类，例如二甲双胍(Glucophage)或苯乙双胍；噻唑烷二酮类，例如罗格列酮(Avandia)、吡格列酮(Actos)或曲格列酮(Rezulin)；或其它PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α葡萄糖苷酶抑制剂，例如米格列醇(Glyset)、阿卡波糖(Precose/Glucobay)；艾塞那肽(Byetta)或普兰林肽；二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，例如维达列汀或西他列汀；SGLT(钠依赖性葡萄糖转运子1)抑制剂；葡萄糖激酶活化剂(GKA)；胰高血糖素受体拮抗剂(GRA)；或FBP酶(果糖，1，6-二磷酸酶)抑制剂。

本领域已知的或正在研究的抗肥胖试剂包括食欲抑制剂，包括苯乙胺类刺激剂，芬特明(任选与芬氟拉明或右芬氟拉明联合)、安非拉酮(Tenuate)、苯甲曲秦(Prelu-2Bontril)、苄非他明(Didrex)、西布曲明(MeridiaReductil)；利莫那班(Acomplia)，其它大麻类受体拮抗剂；胃泌酸调节素；盐酸氟西汀(Prozac)；Qnexa(托吡酯和芬特明)、Excalia(安非他酮和唑尼沙胺)或Contrave(安非他酮和纳曲酮)；或脂酶抑制剂，类似于赛尼可(Orlistat)或新利司他(也称作ATL-962)，或GT 389-255。

本公开的一个方面涉及本文公开的胰高血糖素激动剂的预配水溶液，其用于治疗低血糖症。本文描述的激动剂组合物的改善的稳定性和/或溶解性允许制备用于快速给药和治疗低血糖症的胰高血糖素的预配水溶液。因此，在一个实施方式中，提供了包含本发明的胰高血糖素激动剂的溶液，其用于给予至患有低血糖症的患者。在一个实施方式中，提供了包含本文公开的聚乙二醇化胰高血糖素激动剂的溶液，其用于给予至患有低血糖症的患者，其中连接至聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂的PEG链的总分子量是大约500至大约5,000道尔顿。在一个实施方式中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的肽，及其胰高血糖素激动剂类似物，其中所述胰高血糖素肽的位置16、17、21、24或29、或C-末端延伸内的氨基酸残基的侧链或C-末端氨基酸共价结合至聚乙二醇链。在一个实施方式中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：16的肽，其中肽的位置21的氨基酸残基共价连接至聚乙二醇。在一个实施方式中，聚乙二醇化的胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：17的肽，其中肽的位置24的氨基酸残基共价连接至聚乙二醇。

根据本发明的治疗方法，包括但不限于低血糖症的治疗，可以包括使用任何标准给药途经给予患者本文公开的胰高血糖素激动剂的步骤，所述给药途经包括非肠道给药，例如静脉内、腹膜内、皮下或肌内、鞘内、透皮、直肠、口腔、鼻或通过吸入。在一个实施方式中，通过皮下或肌内方式给予组合物。在一个实施方式中，非肠道地给予组合物，并且胰高血糖素组合物预包装在注射器内。在另一个实施方式中，组合物预包装在吸入器或其它雾化药物输送装置内。有利地，相对于原始胰高血糖素而言，本文公开的水中稳定的胰高血糖素类似物在用于药学目的的最宽pH范围的水性缓冲液中显示出更好的稳定性和溶解性。使用本文公开的稳定的胰高血糖素类似物允许制备并在长时间内在生理pH储存胰高血糖素激动剂溶液。

申请人发现，可以制备保留母体肽的生物活性和特异性的聚乙二醇化的胰高血糖素肽。但是，当增加PEG链的长度或将多个PEG链连接至肽以致于连接的PEG的总分子量大于5,000道尔顿时，开始延迟修饰的胰高血糖素的作用时间。根据一个实施方式，提供了SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的胰高血糖素肽或其胰高血糖素激动剂类似物，其中所述肽包含一个或多个聚乙二醇链，其中连接的PEG的总分子量大于5,000道尔顿，在一个实施方式中是大于10,000道尔顿，但是小于40,000道尔顿。此类修饰的胰高血糖素肽具有延迟的活性时间但是不损失生物活性。因此，可以预防性地给予此类化合物以延长所给予的胰高血糖素肽的效应。

被修饰为共价结合至分子量大于10,000道尔顿的PEG链的胰高血糖素肽可以与胰岛素联合给药，以缓冲胰岛素的作用并帮助维持糖尿病患者中的稳定的血糖水平。本公开的修饰的胰高血糖素肽可以与胰岛素一起作为单一组合物联合给药，作为分开的溶液同时给药，或者，胰岛素和修饰的胰高血糖素肽可以彼此在不同时间给予。在一个实施方式中，包含胰岛素的组合物和包含修饰的胰高血糖素肽的组合物可以在彼此间隔12小时内给药。修饰的胰高血糖素肽相对于给予的胰岛素的精确比例将部分取决于患者胰高血糖素水平的确定，并且可以通过常规实验加以确定。

根据一个实施方式，提供了一种组合物，其包含胰岛素和选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5的修饰的胰高血糖素肽及其胰高血糖素激动剂类似物，其中所述修饰的胰高血糖素肽还包含共价结合至位置16、17、21、24、29的氨基酸的侧链、C-末端延伸内的氨基酸的侧链或C-末端氨基酸的聚乙二醇链。在一个实施方式中，所述组合物是水溶液，其包含胰岛素和胰高血糖素类似物。在胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的序列的实施方式中，肽还可以包含共价结合至位置16、17、21、24、29的氨基酸的侧链、C-末端延伸内的氨基酸的侧链或C-末端氨基酸的聚乙二醇链。在一个实施方式中，修饰的胰高血糖素肽的PEG链的分子量大于10,000道尔顿。在一个实施方式中，聚乙二醇化的胰高血糖素肽包含选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13的肽，其中所述胰高血糖素肽的位置21或24的氨基酸残基的侧链共价结合至聚乙二醇链。在一个实施方式中，所述聚乙二醇链的分子量是大约10,000至大约40,000。

根据一个实施方式，本文公开的修饰的胰高血糖素肽用于引起肠道的暂时麻痹。这种方法用于放射学目的，其包括给予有效量的药物组合物的步骤，所述药物组合物包含聚乙二醇化的胰高血糖素肽、包含C-末端延伸的胰高血糖素肽或此类肽的二聚体。在一个实施方式中，胰高血糖素肽包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的序列。在一个实施方式中，胰高血糖素肽还包含共价结合至位置21、24或29的氨基酸残基、C-末端延伸内的氨基酸残基或C-末端氨基酸的分子量为大约1,000至40,000道尔顿的PEG链。在一个实施方式中，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。在一个实施方式中，PEG链的分子量为大约500至大约5,000道尔顿。

在另一个实施方式中，用于引起肠道的暂时麻痹的组合物包含第一修饰的胰高血糖素肽和第二修饰的胰高血糖素肽，其中所述第一修饰的肽包含选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13的序列，该序列任选连接至大约500至大约5,000道尔顿的PEG链，并且所述第二肽包含大约10,000至大约40,000道尔顿的共价连接的PEG链。在该实施方式中，每个肽的PEG链共价结合至各自的肽的位置21、24或29的氨基酸残基，C-末端延伸内的氨基酸残基或C-末端氨基酸，并彼此独立。

胃泌酸调节素(oxyntomodulin)，一种在小肠中发现的天然存在的消化激素，已经报道当向大鼠或人类给予胃泌酸调节素时，其引起体重下降(见Diabetes 2005；54：2390-2395)。胃泌酸调节素是37个氨基酸的肽，其含有胰高血糖素的29个氨基酸的序列(即SEQ ID NO：1)，后跟SEQ ID NO：23(KRNRNNIA)的8个氨基酸的羧基末端延伸。因此，申请人相信通过以本文公开的修饰的胰高血糖素肽替换胃泌酸调节素的胰高血糖素肽部分，可以保留胃泌酸调节素的生物活性(即食欲抑制和引起体重下降/体重维持)，但改善化合物的溶解性和稳定性并改善药代动力学。此外，申请人还相信，包含本发明的胰高血糖素肽的截短的胃泌酸调节素分子(除掉胃泌酸调节素的末端的4个氨基酸)将会有效抑制食欲并引起体重下降/体重维持。

因此，本发明还包括本发明的修饰的胰高血糖素肽，其具有SEQ ID NO：21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：22的羧基末端延伸。根据一个实施方式，向个体给予SEQ ID NO：33的胰高血糖素激动剂类似物以引起体重下降或防止体重增加，所述胰高血糖素激动剂类似物还包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO：21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：22的氨基酸序列。根据一个实施方式，向个体给予SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的胰高血糖素激动剂类似物以引起体重下降或防止体重增加，所述胰高血糖素激动剂类似物还包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO：21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：22的氨基酸序列。在另一个实施方式中，在个体中减少体重增加或引起体重下降的方法包括给予有效量的包含胰高血糖素激动剂的组合物，所述胰高血糖素激动剂包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽的氨基酸29通过肽键结合至第二肽，并且所述第二肽包含SEQ ID NO：24(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：25的序列，并且其中大约1,000至40,000道尔顿的PEG链共价结合至位置21和/或24的氨基酸残基。在一个实施方式中，胰高血糖素激动剂的胰高血糖素肽段选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19，并且大约1,000至40,000道尔顿的PEG链共价结合至位置16、17、21、24或29的氨基酸残基，C-末端延伸内的氨基酸残基或C-末端氨基酸。

Exendin-4是由39个氨基酸组成的肽。其是被称作GLP-1的受体的强有力的刺激剂。已经报道该肽抑制食欲并引起体重下降。申请人发现，当把Exendin-4的末端序列添加到胰高血糖素的羧基末端时会改善胰高血糖素的溶解性和稳定性，但不削弱胰高血糖素的生物活性。在一个实施方式中，Exendin-4的末端的10个氨基酸(即SEQ ID NO：20(GPSSGAPPPS)的序列)连接至本公开的胰高血糖素肽的羧基末端。在具体的方面，SEQ ID NO：20的序列连接至胰高血糖素肽的C-末端并且位置29的氨基酸是Thr或Gly。预期这些融合蛋白具有抑制食欲和引起体重下降/维持体重的药理学活性。在一个实施方式中，SEQ ID NO：20延伸的末端氨基酸在羧基的位置包含酰胺基团(即SEQ ID NO：23)并且该序列连接至本公开的胰高血糖素肽的羧基末端。

在一个实施方式中，在个体中降低体重或引起体重下降的方法包括给予有效量的包含胰高血糖素激动剂的组合物，所述胰高血糖素激动剂包含SEQ ID NO：33的胰高血糖素肽，其中所述胰高血糖素肽的氨基酸29通过肽键结合至第二肽，并且所述第二肽包含SEQ ID NO：20(GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO：23的序列。在一个实施方式中，胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13，其中胰高血糖素肽的氨基酸29通过肽键结合至第二肽，并且所述第二肽包含SEQ ID NO：20(GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO：23的序列。在一个实施方式中，胰高血糖素激动剂的胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13。在一个实施方式中，融合肽的胰高血糖素肽段选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，其中PEG链的分子量介于500至40,000道尔顿的范围内。更特别地，在一个实施方式中，融合肽的胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，其中PEG链的分子量介于1,000至5,000的范围内。

在另一个实施方式中，给予患者组合物以抑制食欲、预防体重增加和/或引起体重下降：通过给予包含第一聚乙二醇化的胰高血糖素肽和第二聚乙二醇化的胰高血糖素肽的药物组合物来进行，其中所述第一和第二肽是包含C-末端肽延伸的融合肽，所述C-末端肽延伸包含SEQ ID NO：20(GPSSGAPPPS)或SEQ ID NO：23。所述第一聚乙二醇化的胰高血糖素肽包含共价连接的大约500至大约10,000道尔顿的PEG，所述第二聚乙二醇化的胰高血糖素肽包含共价连接的大约10,000至大约40,000道尔顿的PEG链。

本公开还包括本文公开的修饰的胰高血糖素肽的多聚体。可以使用本领域技术人员已知的标准的连接剂和程序将两个或更多个修饰的胰高血糖素肽连接起来。例如，可以通过使用双官能的巯基交联剂和双官能的胺交联剂在两个修饰的胰高血糖素肽之间形成二聚体，尤其是以半胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基替换的胰高血糖素肽(例如SEQID NO：4和SEQ ID NO：5)。二聚体可以是同型二聚体或者可以是异型二聚体。在一个实施方式中，二聚体包含胰高血糖素融合肽的同型二聚体，其中胰高血糖素肽部分包含SEQ ID NO：11的激动剂类似物和连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO：20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：22(KRNR)的氨基酸序列。在另一个实施方式中，二聚体包含SEQ ID NO：11的胰高血糖素激动剂类似物的同型二聚体，其中胰高血糖素肽还包含共价结合至胰高血糖素肽的位置21、24、29，C-末端延伸内，或C-末端氨基酸的聚乙二醇链。

根据一个实施方式，提供了二聚体，其包含通过接头共价结合至第二胰高血糖素肽的第一胰高血糖素肽，其中所述第一胰高血糖素肽包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的肽，并且所述第二胰高血糖素肽包含SEQ ID NO：33。此外，关于第二胰高血糖素肽，当位置28的氨基酸是天冬酰胺并且位置29的氨基酸是苏氨酸时，所述第二胰高血糖素肽还包含添加到所述第二胰高血糖素肽的羧基末端的1个至2个氨基酸(独立地选自Lys、Arg、His、Asp或Glu)，和所述胰高血糖素多肽的药学上可接受的盐。

根据另一个实施方式，提供了二聚体，其包含通过接头共价结合至第二胰高血糖素肽的第一胰高血糖素肽，和所述胰高血糖素多肽的药学上可接受的盐，其中所述第一胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13，并且所述第二胰高血糖素肽独立地选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13。在一个实施方式中，第一胰高血糖素肽选自SEQ ID NO：7，并且第二胰高血糖素肽独立地选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。在一个实施方式中，在两个肽之间形成二聚体，其中每个肽包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

根据一个实施方式，提供了药物组合物，其中所述组合物包含本公开的胰高血糖素激动剂类似物，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。药物组合物可以包含任意的药学上可接受的成分，包括，例如，酸化剂、添加剂、吸附剂、气雾推进剂、空气置换剂、烷基化试剂、抗结剂、抗凝剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、抗菌剂、基底、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、涂层剂、着色剂、干燥剂、去污剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、溶解加强剂、染料、润肤剂、乳化剂、乳液稳定剂、填料、薄膜成型剂、增味剂、调味剂、流动促进剂、胶凝剂、造粒剂、保湿剂、润滑剂、粘膜粘合剂、软膏基底、膏、油性介质、有机基底、锭剂基底、颜料、增塑剂、抛光剂、防腐剂、螯合剂、皮肤渗透剂、溶解剂、溶剂、稳定剂、栓剂基底、表面活性试剂、表面活性剂、悬浮剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、强壮剂、毒性剂、粘性增加剂、吸水剂、水溶性助溶剂、水软化剂或润湿剂。

在一些实施方式中，药物组合物包含下列成分的任一项或组合：阿拉伯树胶、乙酰磺胺酸钾、乙酰柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、琼脂、白蛋白、酒精、无水酒精、变性酒精、稀酒精、紫胶酮酸、藻酸、脂肪族聚酯、氧化铝、氢氧化铝、硬脂酸铝、支链淀粉、α-淀粉、抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、天冬酰苯丙氨酸甲酯、用于注射的抗菌剂、膨润土、膨润土乳浆剂、苯扎氯铵、苄索氯胺、苯甲酸、苯甲醇、苯甲酸苄酯、溴硝醇、丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、尼泊金丁酯、尼泊金丁酯钠、海藻酸钙、抗坏血酸钙、碳酸钙、环己基氨基磺酸钙、二碱式无水磷酸钙、二碱式脱水磷酸钙、三碱式磷酸钙、丙酸钙、硅酸钙、山梨酸钙、硬脂酸钙、硫酸钙、半水硫酸钙、菜籽油、卡波姆、二氧化碳、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、β-胡萝卜素、角叉菜胶、蓖麻油、氢化蓖麻油、阳离子乳化蜡、醋酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、纤维素粉、硅化微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、十六十八醇、溴棕三甲胺、十六醇、洗必泰、氯丁醇、氯甲酚、胆固醇、醋酸氯己定、葡萄糖酸氯己定、盐酸氯己定、氯二氟乙烷(HCFC)、氯二氟甲烷、氯氟碳化物、氯苯氧基乙醇、氯二甲苯、玉米糖浆固体、无水柠檬酸、一水柠檬酸、可可脂、着色剂、玉米油、棉籽油、甲酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、环拉酸、环糊精、葡萄糖结合剂、糊精、葡萄糖、无水葡萄糖、二咪唑烷基脲、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、二乙醇胺、邻苯二甲酸二乙酯、二氟乙烷(HFC)、二甲基-β-环糊精、环糊精类化合物如Captisol二甲醚、邻苯二甲酸二甲酯、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、多库酯钙、多库酯钾、多库酯钠、没食子酸月桂酯、十二烷基三甲基溴化铵、乙二胺四乙酸二钠钙、乙二胺四乙酸酸、eglumine、乙醇、乙基纤维素、没食子酸乙酯、月桂酸乙酯、乙基麦芽酚、油酸乙酯、尼泊金乙酯、尼泊金乙酯钾、尼泊金乙酯钠、乙基香兰素、果糖、果糖液、粉碎的果糖、无热原果糖、粉状果糖、富马酸、明胶、葡萄糖、液体葡萄糖、蔬菜的饱和脂肪酸甘油酯混合物、甘油、山嵛酸甘油酯、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、自乳化单硬脂酸甘油酯、硬脂酸棕榈酸甘油酯、甘氨酸、乙二醇、四氢呋喃聚乙二醇醚、瓜尔胶、七氟丙烷(HFC)、十六烷基三甲基溴化铵、高果糖浆、人血清白蛋白、碳氢化合物(HC)、稀盐酸、氢化植物油II型、羟乙基纤维素、2-羟乙基-β-环糊精、羟丙基纤维素、低取代的羟丙基纤维素、2-羟丙基-β-环糊精、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、咪唑烷脲、靛蓝胭脂红、离子交换剂、氧化铁、异丙醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、等渗盐水、高岭土、乳酸、乳糖醇、乳糖、羊毛脂、羊毛脂醇、无水羊毛脂、卵磷脂、硅酸镁铝、碳酸镁、正常碳酸镁、无水碳酸镁、碳酸镁氢氧化镁、氢氧化镁、十二烷基硫酸镁、氧化镁、硅酸镁、硬脂酸镁、三硅酸镁、无水三硅酸镁、苹果酸、麦芽、麦芽糖醇、麦芽糖醇液、麦芽糊精、麦芽酚、麦芽糖、甘露醇、中级链甘油三酯、葡甲胺、薄荷醇、甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯、油酸甲酯、尼泊金甲酯、尼泊金甲酯钾、尼泊金甲酯钠、微晶纤维素和羧甲基纤维素钠、矿物油、轻矿物油、矿物油和羊毛脂醇、油、橄榄油、单乙醇胺、蒙脱石、没食子酸辛酯、油酸、棕榈酸、石蜡、花生油、凡士林、凡士林和羊毛脂醇、医药釉、苯酚、液化苯酚、苯氧乙醇、苯氧丙醇、苯乙醇、醋酸苯汞、硼酸苯汞、硝酸苯汞、聚克利林、聚克利林钾、泊洛沙姆、聚葡萄糖、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚丙烯酸酯、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钾、苯甲酸钾、碳酸氢钾、硫酸氢钾、氯化钾、柠檬酸钾、无水柠檬酸钾、磷酸氢钾、焦亚硫酸钾、磷酸二氢钾、丙酸钾、山梨酸钾、聚维酮、丙醇、丙酸、碳酸丙烯酯、丙二醇、丙二醇海藻酸钠、没食子酸丙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丙酯钾、尼泊金丙酯钠、硫酸钾、菜籽油、林格溶液、糖精、糖精铵、糖精钙、糖精钠、红花油、皂石、血清蛋白、芝麻油、胶体硅、胶体二氧化硅、海藻酸钠、抗坏血酸钠、苯甲酸钠、碳酸氢钠、亚硫酸氢钠、氯化钠、无水柠檬酸钠、脱水柠檬酸钠、氯化钠、环己基氨基磺酸钙、乙二胺四乙酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、焦亚硫酸钠、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三碱式、无水丙酸钠、丙酸钠、山梨酸钠、淀粉乙醇酸钠、硬脂富马酸钠、亚硫酸钠、山梨酸、山梨糖醇酐酯(山梨糖醇酐肪酸酯)、山梨醇、70％的山梨醇液、大豆油、鲸蜡、淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、预糊化淀粉、消毒玉米淀粉、硬脂酸、纯化硬脂酸、硬脂醇、蔗糖、糖、可压缩糖、糖果的糖、糖球、转化糖、Sugartab、日落黄FCF、合成石蜡、滑石、酒石酸、酒石黄、四氟乙烷(HFC)、可可油、硫柳汞、二氧化钛、α生育酚、维生素E醋酸酯、琥珀酸α-生育酚酯、β-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚、黄芪胶、醋精、柠檬酸三丁酯、三乙醇胺、柠檬酸三乙酯、三甲基-β-环糊精、十四烷基三甲基溴化铵、Tris缓冲液、乙二胺四乙酸三钠、香兰素、I型氢化植物油、水、软水、硬水、无二氧化碳的水、无热原水、注射用水、吸入用无菌水、注射用无菌水、冲洗用无菌水、蜡、阴离子乳化蜡、巴西棕榈蜡、阳离子乳化蜡、鲸蜡酯蜡、微晶蜡、非离子乳化蜡、栓剂蜡、白蜡、黄蜡、白凡士林、羊毛脂肪、黄原胶、木糖醇、玉米蛋白、丙酸锌、锌盐、硬脂酸锌，或Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，A.H.Kibbe (Pharmaceutical Press，London，UK，2000)中的任何赋形剂，该文献通过引用全文并入。Remington ’s Pharmaceutical Sciences，第16版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980)公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种成分和用于制备其的已知技术，该文献通过引用全文并入。除了与药物组合物不相容的任何常规试剂之外，考虑到其在药物组合物中的应用。还可以向组合物中掺入补充性的活性成分。

本文公开的药物组合物可以设计为短效的、速释的、长效的或持续释放的，如下文所述。药物制剂还可以配制为即释、控释或缓慢释放。本发明的组合物还可以包含，例如微团或脂质体，或一些其它胶囊形式，或可以以延长释放的形式给药以提供延长的储存和/或输送效果。公开的药物组合物可以根据任何方案给药，包括，例如每天(1天1次、1天2次、1天3次、1天4次、1天5次、1天6次)、每两天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每2周、每3周、每月、每两月。

在一些实施方式中，前述的成分可以以任意浓度存在于药物组合物中，例如，例如，至少是A，其中A是0.0001％w/v、0.001％w/v、0.01％w/v、0.1％w/v、1％w/v、2％w/v、5％w/v、10％w/v、20％w/v、30％w/v、40％w/v、50％w/v、60％w/v、70％w/v、80％w/v或90％w/v。在一些实施方式中，前述的成分可以以任意浓度存在于药物组合物中，例如，例如，至多是B，其中B是90％w/v、80％w/v、70％w/v、60％w/v、50％w/v、40％w/v、30％w/v、20％w/v、10％w/v、5％w/v、2％w/v、1％w/v、0.1％w/v、0.001％w/v或0.0001％。在其它实施方式中，前述的成分可以以任意浓度范围存在于药物组合物中，例如，例如，从大约A至大约B。在一些实施方式中，A是0.0001％并且B是90％。

药物组合物可以配制为达到生理相容性pH。在一些实施方式中，药物组合物的pH可以是至少5、至少5.5、至少6、至少6.5、至少7、至少7.5、至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10或至少10.5直至11且包括11，这取决于制剂和给药途径。在一些实施方式中，药物组合物可以包含一种或多种缓冲剂以达到生理相容性pH。所述缓冲剂可以包括任何能够在想要的pH进行缓冲的化合物，例如，例如，磷酸盐缓冲剂(例如PBS)、三乙胺、Tris、N-二(羟乙基)甘氨酸、TAPS、三(羟甲基)甲基甘氨酸、HEPES、TES、MOPS、PIPES、甲次砷酸盐、MES和其它的。在一些实施方式中，缓冲剂的强度是至少0.5mM、至少1mM、至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少60mM、至少70mM、至少80mM、至少90mM、至少100mM、至少120mM、至少150mM或至少200mM。在一些实施方式中，缓冲剂的强度不超过300mM(例如至多200mM、至多100mM、至多90mM、至多80mM、至多70mM、至多60mM、至多50mM、至多40mM、至多30mM、至多20mM、至多10mM、至多5mM、至多1mM)。

在一个实施方式中，药物组合物包含浓度为1mg/ml的胰高血糖素激动剂类似物和10-50mM三乙胺，pH为7.0-8.5或6-9或7-9。在一个实施方式中，药物组合物包含浓度为1mg/ml的胰高血糖素激动剂类似物和20mM三乙胺，pH为8.5。

根据一个实施方式，可以以药盒的一部分的形式提供本发明的修饰的胰高血糖素肽。在一个实施方式中，提供了向有此需要的患者给予胰高血糖素激动剂的药盒，其中所述药盒包含处于水溶液中的任意的本发明的胰高血糖素肽。包括在此类药盒中的示例性胰高血糖素肽包括选自以下的胰高血糖素肽：1)包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：33的序列的胰高血糖素肽；2)胰高血糖素融合肽，其包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：33的胰高血糖素激动剂类似物，和连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO：20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：22(KRNR)的氨基酸序列；和3)SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：33的聚乙二醇化的胰高血糖素肽，还包含连接至胰高血糖素肽的氨基酸29的SEQ ID NO：20(GPSSGAPPPS)、SEQ ID NO：21(KRNRNNIA)或SEQ ID NO：22(KRNR)的氨基酸序列，其中分子量为大约500至大约40,000道尔顿的PEG链共价连接至位置16、17、24或29，C-末端延伸内或C-末端氨基酸。在一个实施方式中，药盒提供了用于给予患者胰高血糖素组合物的装置，例如，注射器针、笔式装置、喷射器或其它无针注射器。或者，或另外，药盒可以包括一个或多个种类繁多的容器，例如小瓶、管、瓶子、单膛或多膛的预装的注射器、药筒、输注泵(外用的或可植入的)、喷射器、预装的笔式装置等，任选含有冻干形式的或处于水溶液中的胰高血糖素肽。优选地，药盒还包括使用说明书。根据一个实施方式，药盒的装置是气雾剂分散装置，其中组合物预先包装在气雾剂装置内。在另一个实施方式中，药盒包含注射器和针，在一个实施方式中，无菌的胰高血糖素组合物预先包装在注射器内。

本发明的组合物可以通过标准合成方法、重组DNA技术或任何其它制备肽和融合蛋白的方法来制备。虽然某些非天然氨基酸不能通过标准的重组DNA技术表达，但是其制备技术是本领域已知的。除了标准的肽化学反应之外，必要时也通过标准的有机化学反应来合成本发明的包含非肽部分的化合物。

实施例

一般合成程序：

在改进的Applied Biosystem 430A肽合成器上，使用HBTU-活化的“Fast Boc”单一偶联，从0.2mmole的Boc Thr(OBzl)Pam树脂开始，合成胰高血糖素类似物。Boc氨基酸和HBTU获自Midwest Biotech(Fishers，IN)。使用的侧链保护基是：Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(pMeBzl)、His(Bom)、Lys(2Cl-Z)、Ser(OBzl)、Thr(OBzl)、Tyr(2Br-Z)和Trp(CHO)。N-末端组氨酸的侧链保护基是Boc。

使用二甲基甲酰胺中的20％哌啶溶液处理每个完成的肽基树脂，以从色氨酸上除去甲酰基。在存在对甲酚和二甲硫的情况下进行液态氟化氢切割。使用HF设备(Penninsula Labs)在冰浴中进行1个小时的切割。HF蒸发后，将残余物悬浮于二乙醚中并过滤固体材料。将每个肽提取进入30-70ml的水性乙酸，通过HPLC[Beckman System Gold，0.46x5cm Zorbax C8，1ml/分钟，45C，214nm，A缓冲液＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/90％乙腈，10％至80％B的梯度，在10分钟内]分析稀释的等分试样。

在2.2x 25cm Kromasil C18柱上通过FPLC进行纯化，在214nm监视UV并收集5分钟级份。合并匀质的级份并冻干以产生纯度＞95％的产物。使用MALDI-质谱分析法确定正确的分子量和纯度。

一般的聚乙二醇化程序：(Cys-马来酰亚胺)

通常，将胰高血糖素Cys类似物溶解于磷酸盐缓冲液(5-10mg/ml)并加入0.01M乙烯二胺四乙酸(总体积的10-15％)。加入过量的(2倍)马来酰亚胺甲氧基PEG反应剂(Nektar)并在室温搅拌反应物，同时通过HPLC监视反应进程。8-24小时后，将反应混合物酸化并装载至制备型反相柱，使用0.1％TFA/乙腈梯度进行纯化。合并适当的级份并冻干以产生想要的聚乙二醇化类似物。

实施例1

胰高血糖素Cys¹⁷(1-29)和类似的MonoCys类似物的合成

在改进的Applied Biosystem 430A肽合成器上输入处于60ml反应管中的0.2mmole Boc Thr(OBzl)Pam树脂(SynChem Inc)和以下序列，使用FastBoc HBTU-活化的单一偶联进行合成。

HSQGTFTSDYSKYLDSCRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO：27)

使用下列侧链保护基：Arg(Tos)、Asp(OcHex)、Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、Lys(2Cl-Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)和Tyr(Br-Z)。使用20％哌啶/二甲基甲酰胺处理完成的肽基树脂，以除去Trp甲酰基保护，然后转移至HF反应管中并在真空中干燥。加入1.0ml对甲酚和0.5ml二甲硫以及磁性搅拌子。将试管连接至HF设备(Pennisula Labs)，在干冰/甲醇浴中冷却、抽空，缩合进入大约10ml液态氟化氢。在冰浴上搅拌反应物1个小时，然后在真空中除去HF。将残余物悬浮于乙醚中；过滤固体，以乙醚洗涤，将肽提取进入50ml水性乙酸。在[0.46x5cm Zorbax C8，1ml/分钟，45C，214nm，A缓冲液为0.1％TFA，B缓冲液为0.1％TFA/90％ACN，梯度＝10％B至80％B，在10分钟内]上以切割提取物的小样品运行分析型HPLC。将其余提取物装载到2.2x 25cm Kromasil C18制备型反相柱上，使用PharmaciaFPLC系统运行乙腈梯度。收集5分钟级份，同时在214nm(2.0A)监视UV。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％乙腈。梯度＝30％B至100％B，在450分钟内。

合并含有最纯的产物的级份(48-52)，冷冻、冻干以产生30.1mg。产物的HPLC分析证明纯度为＞90％，MALDI质谱分析证明了想要的分子量3429.7。类似地制备了胰高血糖素Cys²¹、胰高血糖素Cys²⁴和胰高血糖素Cys²⁹。

实施例2

胰高血糖素-Cex和其它C-末端延伸的类似物的合成

将285mg(0.2mmole)甲氧基二苯甲胺树脂(Midwest Biotech)置于60ml的反应管中，输入以下序列，在改进的Applied Biosystem 430A肽合成器上，使用Fast Boc HBTU-活化的单一偶联进行合成。

HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTGPSSGAPPPS (SEQ ID NO：28)

使用下列侧链保护基：Arg(Tos)、Asp(OcHex)、Asn(Xan)、Cys(pMeBzl)、Glu(OcHex)、His(Boc)、Lys(2Cl-Z)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)和Tyr(Br-Z)。使用20％哌啶/二甲基甲酰胺处理完成的肽基树脂，以除去Trp甲酰基保护，然后转移至HF反应管中并在真空中干燥。加入1.0ml对甲酚和0.5ml二甲硫以及磁性搅拌子。将试管连接至HF设备(Pennisula Labs)，在干冰/甲醇浴中冷却、抽空，缩合进入大约10ml液态氟化氢。在冰浴上搅拌反应物1个小时，然后在真空中除去HF。将残余物悬浮于乙醚中；过滤固体，以乙醚洗涤，将肽提取进入50ml水性乙酸。在[0.46 x 5cm Zorbax C8，1ml/分钟，45C，214nm，A缓冲液为0.1％TFA，B缓冲液为0.1％TFA/90％ACN，梯度＝10％B至80％B，在10分钟内]上以切割提取物的等分试样运行分析型HPLC。将提取物装载到2.2 x 25cm Kromasil C18制备型反相柱上，使用Pharmacia FPLC系统运行乙腈梯度。收集5分钟级份，同时在214nm(2.0A)监视UV。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％乙腈。梯度＝30％B至100％B，在450分钟内。合并级份58-65，冷冻、冻干以产生198.1mg。

产物的HPLC分析显示纯度大于95％，MALDI质谱分析显示了想要的理论分子量4316.7的存在且产物为C-末端酰胺。类似地以从适当装载的PAM树脂起始，以C-末端羧酸的形式制备了胃泌酸调节素和胃泌酸调节素-KRNR。

实施例3

胰高血糖素Cys¹⁷ Mal-PEG-5K

将15.1mg的胰高血糖素Cys¹⁷(1-29)和27.3mg甲氧基聚(乙二醇)马来酰亚胺(平均分子量为5000)(mPEG-Mal-5000，Nektar Therapeutics)溶解于3.5ml磷酸盐缓冲液(PBS)并加入0.5ml 0.01M乙烯二胺四乙酸(EDTA)。在室温搅拌反应物并通过HPLC分析[0.46 x 5cm Zorbax C8，1ml/分钟，45C，214nm(0.5A)，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/90％ACN，梯度＝10％B至80％B，在10分钟内]监视反应进程。

5小时后，将反应混合物装载到2.2 x 25cm Kromasil C18制备型反相柱上。在Pharmacia FPLC上运行已经梯度，同时在214nm监视UV波长，收集5分钟级份。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％乙腈，梯度＝30％B至100％B，在450钟内。合并对应于产物的级份，冷冻并冻干以产生25.9mg。

在HPLC[0.46 x 5cm Zorbax C8，1ml/分钟，45C，214nm(0.5A)，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/90％ACN，梯度＝10％B至80％B，在10分钟内]分析该产物，其显示纯度是大约90％。MALDI(介质辅助镭射脱附离子化)质谱分析显示8700至9500的宽分子量范围(典型的PEG衍生物)。这说明向起始胰高血糖素肽(3429)上添加了大约5,000a.m.u的分子量。

实施例4

胰高血糖素Cys²¹ Mal-PEG-5K

将21.6mg的胰高血糖素Cys²¹(1-29)和24mg mPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)溶解于3.5ml磷酸盐缓冲液(PBS)并加入0.5ml 0.01M乙烯二胺四乙酸(EDTA)。在室温搅拌反应物。24小时后，再加入12.7mg的mPEG-MAL-5000。8小时后，将反应混合物装载到2.2 x 25cm Vydac C18制备型反相柱，在Pharmacia FPLC上以4ml/分钟运行乙腈梯度，同时收集5分钟级份。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。梯度＝20％至80％B，在450分钟内。

合并对应于产物外观的级份，冷冻并冻干以产生34mg。通过分析型HPLC[0.46 x 5cm Zorbax C8，1ml/分钟，45C，214nm(0.5A)，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/90％ACN，梯度＝10％B至80％B，10分钟内]分析该产物，其显示不同于起始胰高血糖素肽的匀质产物。MALDI(介质辅助镭射脱附离子化)质谱分析显示8700至9700的宽分子量范围(典型的PEG类似物)。这说明向起始胰高血糖素肽(3470)上添加了大约5,000a.m.u的分子量。

实施例5

胰高血糖素Cys²⁴ Mal-PEG-5K

将20.1mg的胰高血糖素C²⁴(1-29)和39.5mg mPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)溶解于3.5ml PBS，搅拌，并加入0.5ml 0.01M EDTA。在室温搅拌反应物7个小时，然后加入另外40mg的mPEG-MAL-5000。大约15个小时后，将反应混合物装载到2.2x 25cm Vydac C18制备型反相柱，在Pharmacia FPLC上运行乙腈梯度，收集5分钟级份，同时在214nm(2.0A)监视UV。A缓冲液＝0.1％TFA，B缓冲液＝0.1％TFA/50％ACN。梯度＝30％B至100％B，在450分钟内。合并对应于产物的级份，冷冻并冻干以产生45.8mg。MALDI质谱分析显示典型的PEG宽信号，最大值为9175.2，比胰高血糖素肽C²⁴(3457.8)高大约5,000a.m.u。

实施例6

胰高血糖素Cys²⁴ Mal-PEG-20K

将25.7mg的胰高血糖素C²⁴(1-29)和40.7mg mPEG-Mal-20K(Nektar Therapeutics)溶解于3.5ml PBS并在室温搅拌，加入0.5ml 0.01M EDTA。6个小时后，通过HPLC确定了起始物质与产物的比例是大约60∶40。再加入25.1mg的mPEG-MAL-20K，再搅拌反应物16个小时。产物比例没有显著改善，所以将反应混合物装载到2.2 x 25cm Kromasil C18制备型反相柱，在Pharmacia FPLC上使用30％B至100％B的梯度纯化450分钟。A缓冲液＝0.1％TFA，B缓冲液＝0.1％TFA/50％ACN，流速＝4ml/分钟，收集5分钟级份，同时在214nm(2.0A)监视UV。合并含有匀质产物的级份，冷冻并冻干以产生25.7mg。通过分析型HPLC确定纯度是～90％。MALDI质谱分析显示从23,000至27,000的宽信号，比起始胰高血糖素肽C²⁴(3457.8)高大约20,000a.m.u。

实施例7

胰高血糖素Cys²⁹ Mal-PEG-5K

将20.0mg的胰高血糖素Cys²⁹(1-29)和24.7mg mPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)溶解于3.5ml PBS并在室温搅拌，加入0.5ml 0.01M EDTA。4个小时后，再加入15.6mg mPEG-Mal-5000以驱使反应完成。8个小时后，将反应混合物装载到2.2x 25cm Vydac C18制备型反相柱，在Pharmacia FPLC系统上运行乙腈梯度。收集5分钟级份，同时在214nm(2.0A)监视UV。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。合并级份75-97，冷冻并冻干以产生40.0mg产物，其不同于HPLC上回收的起始物质(级份58-63)。通过分析型HPLC[0.46x 5cm Zorbax C8，1ml/分钟，45C，214nm(0.5A)，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/90％ACN，梯度＝10％B至80％B，在10分钟内]分析该产物，显示纯度大于95％。MALDI质谱分析显示存在分子量范围是8,000至10,000的PEG成分(最大值为9025.3)，其比起始物质(3484.8)高大约5,540a.m.u。

实施例8

胰高血糖素Cys²⁴(2-丁内酯)

向24.7mg的胰高血糖素Cys²⁴(1-29)中加入4ml 0.05M碳酸氢铵/50％乙腈和5.5μl 2-溴-4-羟基丁酸-γ-内酯的溶液(100μl处于900μl乙腈中)。在室温搅拌3个小时后，向反应混合物中再加入105μl内酯溶液，再搅拌15个小时。以10％的水性乙酸将反应混合物稀释到10ml并装载到2.2x 25cmKromasil C18制备型反相柱。在Pharmacia FPLC上运行乙腈梯度(20％B至80％B，在450分钟内)，同时收集5分钟级份，并在214nm(2.0A)监视UV。流速＝4ml/分钟，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。合并级份74-77，冷冻并冻干以产生7.5mg。分析型HPLC显示纯度是95％，MALDI质谱分析显示分子量为3540.7或比起始物质高84个质量单位。该结果与添加单个丁内酯部分是一致的。

实施例9

胰高血糖素Cys²⁴(S-羧基甲基)

将18.1mg的胰高血糖素Cys²⁴(1-29)溶解在9.4ml 0.1M磷酸钠缓冲液(pH＝9.2)中，并加入0.6ml溴乙酸溶液(1.3mg/ml，处于乙腈中)。在室温搅拌反应物，通过分析型HPLC监视反应进程。1小时后，再加入0.1ml溴乙酸溶液。将反应物再搅拌60分钟，然后以水性乙酸酸化并装载到2.2x 25cmKromasil C18制备型反相柱上，以进行纯化。在Pharmacia FPLC上运行乙腈梯度(流速＝4ml/分钟)，同时收集5分钟级份，并在214nm(2.0A)监视UV。A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。合并级份26-29，冷冻并冻干以产生几毫克产物。分析型HPLC显示纯度为90％，MALDI质谱分析确认了想要的产物的3515的分子量。

分子量＝3515.87                    SEQIDNO：30

预期质量＝3512

分子式＝C153H224N42O50S2

实施例10

胰高血糖素Cys²⁴马来酰亚胺，PEG-3.4K-二聚体

将16mg的胰高血糖素Cys²⁴和1.02mg Mal-PEG-Mal-3400，聚(乙二醇)-双-马来酰亚胺(平均分子量为3400)(Nektar Therapeutics)溶解于3.5ml磷酸盐缓冲液和0.5ml 0.01M EDTA中，在室温搅拌反应物。16个小时后，再加入16mg胰高血糖素Cys²⁴，并继续搅拌。大约40个小时后，将反应混合物装载到Pharmcia PepRPC 16/10柱，在Pharmacia FPLC上运行乙腈梯度，同时收集2分钟级份，在214nm(2.0A)监视UV。流速＝2ml/分钟，A＝0.1％TFA，B＝0.1％TFA/50％ACN。合并级份69-74，冷冻并冻干以产生10.4mg。分析型HPLC显示纯度是90％，MALDI质谱分析显示存在9500至11,000范围内的成分，其与想要的二聚体是一致的。

实施例11

胰高血糖素肽溶解性测试：

在0.01N HCl中制备胰高血糖素(或类似物)的溶液(1mg/ml或3mg/ml)。使用0.01N HCl将100μl贮液稀释至1ml，确定UV吸收值(276nm)。使用200-250μl 0.1M Na₂HPO₄(pH9.2)将剩余贮液的pH调节至pH7。使该溶液在4℃静置过夜，然后离心。然后使用0.01N HCl将100μl上清液稀释至1ml，确定UV吸收值(一式两份)。

就体积的增加补偿最初的吸收值读数，使用下列计算建立百分比溶解性：

结果显示于表1，其中胰高血糖素-Cex代表野生型胰高血糖素(SEQ ID NO：1)+SEQ ID NO：20的羧基末端添加；胰高血糖素-Cex R¹²代表SEQ ID NO：1，其中位置12的Lys替换为Arg，并且SEQ ID NO：20的肽添加到羧基末端。

表1胰高血糖素类似物的溶解性数据

类似物                        百分率可溶

胰高血糖素                    16

胰高血糖素-Cex，R12           104

胰高血糖素-Cex                87

胃泌酸调节素                  104

胰高血糖素，Cys17PEG5K        94

胰高血糖素，Cys21PEG5K        105

胰高血糖素，Cys24PEG5K        133

使用与表1中所列的化合物相同的测定法研究胰高血糖素激动剂类似物D28、E29、E30、E15D28、D28E30、D28E29的溶解性。数据(显示于图3和4)显示：在5.5至7.0的pH值，D28、E29、E30、E15D28、D28E30、D28E29类似物比原始胰高血糖素的溶解性更好。图3中的数据代表在25℃在60小时后测定的溶解性，而图4中的数据代表在25℃在24小时后、然后在4℃在24小时后测定测定的溶解性。图5代表关于胰高血糖素类似物D28、D28E30和E15D28的最大溶解性的数据。

实施例12

胰高血糖素受体结合测定

使用闪烁接近检验技术，在竞争性结合检验中测定肽与胰高血糖素受体的亲和力。将在闪烁接近检验缓冲液(0.05M Tris-HCl，pH 7.5，0.15M NaCl，0.1％w/v牛血清白蛋白)中制备的3倍系列稀释的肽在96孔白色/清晰底的平板(Corning Inc.，Acton，MA)中与下列物质混合：0.05nM(3-[¹²⁵I]-碘酪氨酰)Tyr10胰高血糖素(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，每孔1-6微克；从过表达人胰高血糖素受体的细胞制备而来的质膜片段；和1mg/孔聚乙烯亚胺处理的小麦种子凝集素A型闪烁接近检验珠子(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。在回转摇床上以800rpm摇动5分钟后，将平板在室温温育12小时，然后在MicroBeta1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)上读数。在含有比测试样品中的最高浓度高四倍的浓度的“冷的”原始配体的孔中测定非特异性结合(NSB)的放射活性，在没有竞争者的孔中检测总的结合放射活性。按照如下计算百分比特异性结合：％特异性结合＝(结合-NSB)/(总结合-NSB)X100。使用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)确定IC₅₀值。

实施例13

功能性测定-cAMP合成

在基于萤火虫荧光素酶的报道分子测定法中测定胰高血糖素类似物诱导cAMP的能力。通过在补充了0.25％牛生长血清(HyClone，Logan，UT)的DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养16个小时，将使用胰高血糖素-或GLP-1受体和连接至cAMP响应元件的荧光素酶基因共转染的HER293细胞进行血清剥夺，然后在37℃、5％CO₂中，在96孔聚-D-赖氨酸包被的“Biocoat”平板(BD Biosciences，San Jose，CA)中以系列稀释的胰高血糖素、GLP-1或新型胰高血糖素类似物温育5个小时。在温育结束时，向每个孔加入100微升的LucLite发光底物试剂(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)。将平板稍微摇动，在黑暗中温育10分钟，在MicroBeta-1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)中测定光输出量。发光的光输出量指示荧光素酶报道分子基因的活化，荧光素酶报道分子基因的活化继而又是受体活化的度量。使用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)计算有效的50％浓度(“EC50”)。结果显示于表2和3。EC50是指：在指明的受体上产生50％的肽的最大活化响应时的肽浓度。相对较低的EC50表示肽在该受体上的效力相对较强，而较高的EC50表示该肽效力较弱。

表2具有C-末端延伸的胰高血糖素类似物诱导的cAMP

^*-实验次数

表3聚乙二醇化的胰高血糖素类似物诱导的cAMP

^*-实验次数

其它胰高血糖类似物的数据显示于图6-9和表4

表4在过表达胰高血糖素受体的细胞中观察到的EC₅₀(nM)

图11显示了具有下列修饰的胰高血糖素类似物在胰高血糖素和GLP-1受体上的cAMP诱导的数据：T16、A20、E21、A24、Nle27、D28和E29(SEQID NO：56)。数据显示：含有多个修饰(7个替换)的胰高血糖素类似物基本上保留了胰高血糖素活性。

实施例14

胰高血糖素Cys-马来酰亚胺PEG类似物的稳定性测定

将每种胰高血糖素类似物溶解于水或PBS中，进行最初的HPLC分析。调节pH之后(4、5、6、7)，将样品在37℃温育一段指定的时间，重新进行HPLC分析以确定肽的完整性。测定特异性目标肽的浓度，并计算相对于最初分析的剩余完整度百分率。胰高血糖素Cys²¹-马来酰亚胺PEG_5K的结果显示于图1和2。

实施例15

胰高血糖素内酰胺的合成

将285mg(0.2mmole)甲氧基二苯甲胺树脂(Midwest Biotech)加入到60ml的反应管中，使用Boc DEPBT-活化的单一偶联将以下序列装配到改进的Applied Biosystem 430A肽合成器上。

使用下列侧链保护基：Arg(Tos)、Asp(OcHx)、Asn(Xan)、Glu(OFm)、His(BOM)、Lys(Fmoc)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)、Tyr(Br-Z)。举例而言，如果从16-20、20-24或24-28构建内酰胺的话，则Lys(Cl-Z)用于保护位置12的原始Lys。使用20％哌啶/二甲基甲酰胺将完成的肽基树脂处理1个小时，同时摇动以除去Trp甲酰基并从Lys12和Glu16除去Fmoc和OFm保护。通过阳性茚三酮测试确认已经除去之后，以二甲基甲酰胺洗涤树脂，然后以二氯甲烷洗涤，然后再以二甲基甲酰胺洗涤。使用二甲基甲酰胺和二异丙基乙胺(DIEA)中的520mg(1mmole)的六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基膦(PyBOP)处理树脂。反应进行8-10个小时，通过阴性茚三酮反应确认环化。以二甲基甲酰胺洗涤树脂，然后以二氯甲烷洗涤，然后以三氟乙酸处理10分钟。通过阳性茚三酮反应确认已经除去Boc基团。以二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤树脂并干燥，然后转移至氢氟酸(HF)反应管中。加入500μl对甲酚以及磁性搅拌子。将试管连接至HF设备(Pennisula Labs)，在干冰/甲醇浴中冷却、抽空，缩合进入大约10ml液态氢氟酸。在冰浴上搅拌反应物1个小时，然后在真空中除去HF。将残余物悬浮于乙醚中；过滤固体，以乙醚洗涤，将肽溶解进入150ml 20％乙腈/1％乙酸。

在下列条件下进行粗制溶解肽的分析型HPLC分析[4.6X 30mm Xterra C8，1.50mL/分钟，220nm，A缓冲液为0.1％TFA/10％ACN，B缓冲液为0.1％TFA/100％ACN，梯度为5-95％B，在15分钟内]。用水将提取物稀释2倍并装载到2.2x 25cm Vydac C4制备型反相柱上，使用乙腈梯度在Waters HPLC系统(A缓冲液为0.1％TFA/10％ACN，B缓冲液为0.1％TFA/10％CAN，梯度为0-100％B，在120分钟内，流速为15.00ml/分钟)中洗脱。纯化肽的HPLC分析证明纯度大于95％，电喷射离子化质谱分析确认12-16内酰胺的分子量为3506Da。类似地制备了从16-20、20-24和24-28构建的内酰胺。

实施例16

示例性的肽

大体上按照本文的描述构建具有以下序列的胰高血糖素肽：

XSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVC^*WLMNT(内酰胺位于16-20)(SEQ ID NO：40)

其中X＝DMIA，C^*是连接至PEG的Cys

XSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVAWLMNC^*(内酰胺位于16-20)(SEQ ID NO：41)

其中X＝DMIA，Q24A，C^*是连接至PEG的Cys

X1SQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVC^*WLX2NT(内酰胺位于16-20)(SEQ ID NO：42)

其中X1＝DMIA，X2是Nle或Leu，C^*是连接至PEG的Cys

X1SQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVAWLX2NC^*(内酰胺位于16-20)(SEQ ID NO：43)

其中X1＝DMIA，Q24A，X2是Nle或Leu，C^*是连接至PEG的Cys。

大体上按照本文的描述构建具有以下修饰的来自SEQ ID NO：1的胰高血糖素肽：

A20、A24、Nle27、D28(SEQ ID NO：44)

A20、A24、Nle27、D28、E29(SEQ ID NO：45)

A20、A24、Nle27、D28、E30(SEQ ID NO：46)

A20、A24、Nle27、E28、E29(SEQ ID NO：47)

A20、A24、Nle27、E28、E30(SEQ ID NO：48)

A20、A24、Nle27、E29、E30(SEQ ID NO：49)

A20、E21、A24、Nle27、D28(SEQ ID NO：50)

A20、E21、A24、Nle27、D28、E29(SEQ ID NO：51)

A20、E21、A24、Nle27、D28、E30(SEQ ID NO：52)

A20、E21、A24、Nle27、E28、E29(SEQ ID NO：53)

A20、E21、A24、Nle27、E28、E30(SEQ ID NO：54)

A20、E21、A24、Nle27、E29、E30(SEQ ID NO：55)

或者，这些肽中的任一个可以包含AIB20和/或AIB24而不是A20和/或A24替换。

这些肽中的任一个还可以包含T16或AIB 16氨基酸替换。例如，构建了T16、A20、E21、A24、Nle27、D28、E29(SEQ ID NO：56)。

大体上按照本文的描述构建具有以下修饰的来自SEQ ID NO：1的胰高血糖素肽：DMIA1、E16、K20-胰高血糖素-COOH(C24-PEG，E16至K20内酰胺)。其序列如下所示：

DMIA-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Cys^*-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH，其中位置24的Cys^*是连接至分子量为大约40,000道尔顿的PEG的Cys，并且其中位置16的Glu和位置20的Lys通过内酰胺桥连接(SEQ ID NO：40)。大体上根据实施例13测试该肽在胰高血糖素和GLP-1受体上的活性。该肽显示出27.7％的原始胰高血糖素的效力和1.1％的原始GLP-1的效力。

实施例17

乙酰化和/或聚乙二醇化的肽的制备

按照如下描述制备乙酰化和/或聚乙二醇化的肽。使用CS Bio 4886肽合成器或Applied Biosystems 430A肽合成器在固体载体树脂上合成肽。使用Schnolzer等人，Int.J.Peptide Protein Res.40：180-193(1992)描述的原位中和化学技术。对于酰基化的肽，待酰基化的目标氨基酸残基(例如位置10)替换为Nε-FMOC赖氨酸残基。使用DMF中的20％哌啶将完成的N-末端BOC保护的肽处理30分钟以除去FMOC/甲酰基。通过偶联10倍摩尔过量的FMOC-保护的间隔子氨基酸(例如FMOC-(N-BOC)-色氨酸-OH)或酰基链(例如C17-COOH)和PyBOP或DEPBT偶联试剂(处于DMF/DIEA中)实现向游离的ε-氨基Lys残基的偶联。然后，除去间隔子氨基酸的FMOC基团，然后重复以酰基链进行偶联。最后以100％TFA处理，除去任何侧链保护基和N-末端BOC基团。使用5％DIEA/DMF将肽树脂中和，干燥，然后在0℃使用95∶5的HF/对甲酚进行1个小时切割，从载体上切下来。乙醚提取之后，使用5％HOAc溶液溶解粗肽。然后通过ESI-MS确认溶液的样品包含正确的分子量的肽。使用10％CH3CN/0.1％TFA至0.1％TFA/100％CH3CN的线性梯度通过RP-HPLC纯化正确的肽。使用Vydac C18 22mm x 250mm蛋白柱进行纯化。酰基化的肽类似物一般以20∶80的缓冲液比例完成洗脱。将各部分合并并通过分析型RP-HPLC检测纯度。将纯的级份冷冻干燥，产生白色的固体肽。

如果肽包含内酰胺桥和待酰基化的目标残基，在向肽骨架添加该氨基酸之后按照上文所述进行酰基化。

对于肽的聚乙二醇化，使40kDa的甲氧基聚(乙二醇)马来酰亚胺-丙酰胺(Chirotech Technology Ltd.)与等摩尔的肽在7M的尿素、50mM Tris-HCl缓冲液中反应(使用将两种肽和PEG溶解成澄清溶液所需的最小量的溶剂，对于使用2-3mg的肽而言，该量一般小于2mL)。在室温剧烈搅拌4-6个小时，通过分析型RP-HPLC分析反应物。随着保留时间的减少，聚乙二醇的产物清楚地从起始物质中出现。在Vydac C4柱上以类似于最初肽纯化所用的条件进行纯化。洗脱通常发生于大约50∶50的缓冲液比例。收集纯的聚乙二醇化的肽的级份并冻干。

按照上文实施例13的描述测试肽的生物学活性。

实施例18

给予胰高血糖素类似物之后比格犬(Beagle Dog)中血清葡萄糖浓度的变化

8-12kg、8-16个月大且健康状况良好的犬/比格犬用于确定胰高血糖素作用的药代动力学和药效学。将每只动物禁食过夜，并在每次给药后的下列时间点取血：0小时(给药前)，给药后5、10、20、30、45、60、90、120、240分钟。每个剂量组使用6只动物，在每个时间点取大约1-2ml全血。将大约1.0ml全血加至含有足量的特斯乐(抑肽酶)的K₂EDTA管中，以产生至少500KIU/mL的全血。将样品在冷却离心机中在大约1,500-3,000xg离心10-15分钟后收集到大约500μL血浆。将样品转移至塑料瓶并储存于-70℃或之下。通过将血液样品置于空管中、使其在常温静置15-20分钟、然后在冷却离心机中在1,500-3,000xg离心10-15分钟，使剩余的1.0mL全血转化为血清。将样品转移至塑料瓶并储存于-70℃或之下。将胰高血糖素和类似物以0.1667mg/ml的浓度溶解于0.01N HCl，以0.03ml/kg的剂量向动物给药。

通过肌内方式向动物给予剂量为0.005mg/kg的胰高血糖素、包含具有连接至胰高血糖素的羧基末端的SEQ ID NO：31的序列的胰高血糖素的胰高血糖素类似物(胰高血糖素-CEX)、或在氨基酸28包含天冬氨酸替换的胰高血糖素类似物(胰高血糖素-Asp28)(SEQ ID NO：11)。产生的数据显示于图10。

实施例19

基本上按照上文的描述制备以下的肽：

(A)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列、其中位置16的氨基酸替换为AIB的肽(“AIB 16胰高血糖素”)；

(B)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列、其中位置19的氨基酸替换为AIB的肽(“AIB 16胰高血糖素”)；

(C)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列、其中位置20的氨基酸替换为AIB的肽(“AIB 20胰高血糖素”)；

(D)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列、其中位置21的氨基酸替换为AIB的肽(“AIB 21胰高血糖素”)；

(E)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列、其中位置24的氨基酸替换为AIB的肽(“AIB 24胰高血糖素”)；

(F)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列、其中位置16和20的氨基酸替换为AIB的肽(“AIB 16，20胰高血糖素”)；

(G)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列、其中位置16和24的氨基酸替换为AIB的肽(“AIB 16，24胰高血糖素”)；

(H)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列、其中位置20和24的氨基酸替换为AIB的肽(“AIB 20，24胰高血糖素”)；

(I)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列、其中位置16、20和24的氨基酸替换为AIB的肽(“AIB 16，20，24胰高血糖素”)。

基本上按照实施例13的描述测试这些肽，结果显示于表5。

表5

实施例20

基本上按照本文的描述制备以下的胰高血糖素类似物肽：

包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列、修饰为在位置28包含Asp并在位置29包含Glu的“D28/E29胰高血糖素”：

HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMDE(SEQ ID NO：75)；和

包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列、进一步修饰为在位置16包含Aib的“AIB16/D28/E29胰高血糖素”：

HSQGTFTSDYSKYLDAibRRAQDFVQWLMDE(SEQ ID NO：76)。

按照实施例13的描述测试每种肽在胰高血糖素受体上的体外活性。D28/E29胰高血糖素的EC50值是0.06nM，AIB16/D28/E29胰高血糖素的EC50值是0.08nM。

实施例21

基本上按照本文的描述制备集合A的肽，每种肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，并具有表6所列的修饰。

表6

制备与集合A的肽具有相同结构的第二个集合(集合B)的肽，但是集合B的肽在位置24包含Cys，其中所述Cys残基共价结合至40kDa PEG。

基本上按照实施例13的描述测试集合A和集合B的肽在胰高血糖素受体上的体外活性。

实施例22

基本上按照本文的描述，通过固相肽合成技术制备以下胰高血糖素类似物肽，其包含肽J

HS-X-GTFTSDYSKYLDTRRAAEFVAWL(Nle)DE(SEQ ID NO：59)或肽KHS-X-GTFTSDYSKYLD(Aib)RRAADFVAWLMDE(SEQ ID NO：60)的骨架，在位置3具有另外的修饰。基本上按照实施例13的描述测试这些肽在胰高血糖素受体上的体外活性。每种肽的EC50(nM)显示于表7。

表7

Q＝谷氨酰胺；C(Acm)＝乙酰氨基甲基-半胱氨酸；Dab(Ac)＝乙酰基二氨基丁酸；Dap(urea)＝氨甲酰基二氨基丙酸；Q(Me)＝甲基谷氨酰胺；M(O)＝蛋氨酸-亚砜；Orn(Ac)＝乙酰基鸟氨酸。

如表7所示，可以在位置3放置多种氨基酸而不显著损失在胰高血糖素受体上的活性，并且在一些情况下，该修饰实际上增加了所述活性，例如肽K骨架上的Dab(Ac)和Q(Me)。

实施例23

基本上按照本文的描述，制备了在不同胰高血糖素类似物骨架的位置3包含Dab(Ac)的胰高血糖素类似物肽，并且测试了在胰高血糖素受体上的体外活性。每种肽的结构和活性显示于表8。

表8

实施例24

基本上按照本文的描述，制备了包含具有如表9所示的修饰的SEQ ID NO：1的氨基酸的第一集合(集合A)的肽：

表9

基本上按照本文的描述，制备了包含集合A的相同结构的肽，不同之处在于酰基是C16或C18脂肪酰基。包含C16脂肪酰基的肽是集合B的肽，而包含C18脂肪酰基的肽是集合C的肽。

按照本文的描述，制备了包含集合A、B和C的相同结构的肽，不同之处在于脂肪酰基通过下列间隔子之一共价连接至指明位置上的Lys残基的侧链：γ-Glu-γ-Glu、β-Ala-β-Ala、Ala-Ala、6-氨基己酸、Leu-Leu和Pro-Pro。

按照实施例13的描述测试集合A-D的肽在胰高血糖素受体上的体外活性，将每种肽的EC50与原始胰高血糖素在胰高血糖素受体上的活性进行比较。

实施例25

基本上按照本文的描述，制备了几种这样的胰高血糖素类似物，其缺少共价分子内桥并且在位置2包含AIB、在位置16包含AIB，且包含通过间隔子连接至位置10的Lys残基的脂肪酰基。酰基化的胰高血糖素类似物的区别在于间隔子的种类、是否存在聚乙二醇化、和/或酰基的大小。基本上按照实施例13的描述测试酰基化的胰高血糖素类似物在胰高血糖素受体和GLP-1受体上的体外活性。每种肽的结构以及在胰高血糖素和GLP-1受体上的体外活性总结于表10和11。

表10

^*代表该肽在位置24包含Cys残基(替换Gln)，所述Cys共价结合至40kDa PEG基团。

表11

^**肽在位置24包含Cys(替换Gln)，所述Cys不共价结合至PEG分子。

如表10和11所示，相对于包含直接连接至肽骨架的脂肪酰基的肽，包含通过间隔子连接的脂肪酰基的肽的效力显著增加。

实施例26

测定了SEQ ID NO：71、76和78的胰高血糖素类似物肽的稳定性。所有的肽在位置28包含Asp，SEQ ID NO：71和76的肽在位置29还包含Glu。虽然SEQ ID NO：78的肽不包含任何另外的修饰，但SEQ ID NO：71和76的肽都在位置16包含AIB。SEQ ID NO：71的肽还在位置3包含Dab(Ac)、在位置20和24包含Ala，在位置27包含Leu。

以1mg/mL的肽浓度将这些肽配制在溶液中。将肽溶液中的一种注入注射器，并调节为与空气的接触最小。将注射器维持在4、25、30或40摄氏度。使用分析型RP-HPLC(反相高效液相色谱)，以UV检测器在280nm监视0、1、2、4和6个月时的潜在化学降解。使用SEC(尺寸排阻色谱)，以UV检测器在280nm评估0、1、2、4和6个月时的任何聚集物的形成。

图12-14分别显示了基于SEQ ID NO：71、76和78的肽的UV吸收值的峰的整合面积作为时间的函数。如这些图中所示，SEQ ID NO：71的肽的肽稳定性最高，SEQ ID NO：78的肽的稳定性最低，虽然在2个月后在30摄氏度检测到90％的肽。没有观察到SEQ ID NO：71的峰面积的显著降低，这表明该肽的良好的化学和生物物理稳定性。

实施例27

将平均体重为48.7g的DIO小鼠(每组8只)每日皮下注射仅载体、30nmol/kg或100nmol/kg的酰基化胰高血糖素类似物肽、或长效GLP-1类似物利拉鲁肽(Novo Nordisk，Denmark)，注射7天。酰基化的胰高血糖素类似物如下：

“(C16)胰高血糖素酰胺”包含野生型胰高血糖素的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，其中位置10的Tyr修饰为酰基化的Lys残基，其中所述酰基化的Lys包含C16脂肪酰基，并且C-末端羧酸基团替换为酰胺；

“γE-γE-C16胰高血糖素酰胺”包含与C16胰高血糖素酰胺相同的结构，只不过C16脂肪酰基通过γ-Glu-γ-Glu二肽间隔子连接至位置10的Lys(参见以下酰基化的Lys的结构)：

“AA-C16胰高血糖素酰胺”包含与C16胰高血糖素酰胺相同的结构，只不过C16脂肪酰基通过Ala-Ala二肽间隔子连接至位置10的Lys；和

“βAβA-C16胰高血糖素酰胺”包含与C16胰高血糖素酰胺相同的结构，只不过C16脂肪酰基通过β-Ala-β-Ala二肽间隔子连接至位置10的Lys。

每日监视小鼠的体重，体重的总体变化(％)显示于图15。如图15所示，在每个剂量，多数酰基化胰高血糖素肽引起体重下降。利拉鲁肽引起体重下降大约12％，胰高血糖素类似物肽γE-γE-C16胰高血糖素酰胺在匹配的剂量显示出最大的引起小鼠体重下降的能力。即使较低剂量的γE-γE-C16胰高血糖素酰胺也引起体重的实质性下降。

在研究的第7天测定小鼠的脂肪质量。如图16所示，接受100nmol/kgγE-γE-C16胰高血糖素酰胺的小鼠显示出最低的脂肪质量。

在测定过程中还监视了小鼠的血糖水平。如图17所示，较高剂量的胰高血糖素类似物肽γE-γE-C16胰高血糖素酰胺与利拉鲁肽在降低小鼠血糖水平方面一样有效。

实施例28

按照本文的描述通过固相肽合成技术制备了在肽的位置10或30进行酰基化的胰高血糖素类似物肽。肽及其结构如下：

“肽dS2E16K20K30-C14 Gluc酰胺”包含氨基酸序列HXQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVQWLMNTK-酰胺(SEQ ID NO：79)，其中位置2的X是d-Ser，其中位置30的Lys被C14脂肪酰基酰基化，并且C-末端羧酸基团替换为酰胺；

“肽dS2K10(C14)E16K20-Gluc酰胺”包含氨基酸序列HXQGTFTSDKSKYLDERRAKDFVQWLMNT-酰胺(SEQ ID NO：80)，其中位置2的X是d-Ser，其中位置10的Lys被C14脂肪酰基酰基化，并且C-末端羧酸基团替换为酰胺；

“肽dS2E16K20K30-C16 Gluc酰胺”包含氨基酸序列HXQGTFTSDYSKYLDERRAKDFVQWLMNTK-酰胺(SEQ ID NO：81)，其中位置2的X是d-Ser，其中位置30的Lys被C16脂肪酰基酰基化，并且C-末端羧酸基团替换为酰胺；

“肽dS2K10(C16)E16K20-Gluc酰胺”包含氨基酸序列HXQGTFTSDKSKYLDERRAKDFVQWLMNT-酰胺(SEQ ID NO：82)，其中位置2的X是d-Ser，其中位置10的Lys被C16脂肪酰基酰基化，并且C-末端羧酸基团替换为酰胺；

“肽杂合体2-AIB2-K10-酰基化”包含氨基酸序列HXQGTFTSDKSKYLDEQAAKEFICWLMNT-酰胺(SEQ ID NO：83)，其中位置2的X是AIB，位置10的K被C18脂肪酰基酰基化，位置24的Cys包含40kDa PEG分子，并且C-末端羧酸基团替换为酰胺；和

“肽杂合体2-AIB2-K30-酰基化”包含氨基酸序列HXQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNTK-酰胺(SEQ ID NO：84)，其中位置2的X是AIB，位置30的K被C18脂肪酰基酰基化，位置24的Cys包含40kDa PEG分子，并且C-末端羧酸基团替换为酰胺。

基本上按照实施例13的描述测试每种肽在GLP-1受体和胰高血糖素受体上的体外活性。结果显示于表12。

表12

本文引用的所有参考文献，包括公开物、专利申请和专利，皆通过引用并入本文，达到每篇参考文献皆单独地且具体地指明通过引用并入并以其全部内容显示在本文中一样的程度。

除非本文另有指明或与上下文明显抵触，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求书的上下文中)，术语″一个(a)″、″一种(an)″和″该(the)″及类似指称的使用应理解为既包括单数也包括复数。除非另有指明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应被理解为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。

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本文描述了本发明的优选实施方式，包括本发明人知道的实施本发明的最佳模式。在阅读了前述描述之后，这些优选实施方式的变体对于本领域普通技术人员可以是显而易见的。本发明人预期技术人员按照需要应用此类变体，并且本发明人考虑到不按照本文具体描述的那样来实施本发明。因此，本发明包括所适用的法律允许的随附的权利要求书中提及的主题的所有修饰和等价物。此外，除非本文另有指明或与上下文明显抵触，否则上述元件的所有可能变体的任意组合包括在本发明中。