聚合物、抗血管生成剂和靶向部分的缀合物及其在治疗骨相关血管生成状况中的用途

摘要

本发明公开了具有连接在其上的TNP-470和高负载量(例如，高于3mol%)的阿仑膦酸盐(ALN)的羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)衍生共聚物的缀合物和制备其的方法。本发明进一步公开了具有连接在其上的抗血管生成剂和寡聚天门冬氨酸骨靶向剂的聚合物或共聚物的缀合物及其制备方法。本发明还公开了包含这些缀合物的药物组合物及其在治疗和监测骨相关病症中的用途。

说明书

政府利益的声明

本发明是在由国立卫生研究院授予的GM069847下，由政府支持做出的。政府享有本发明的一些权利。

发明领域和背景

在某些实施方案中，本发明涉及化学缀合物及其在治疗和诊断中的用途，更特别地，但非排他性地，涉及聚合物、抗血管生成剂和靶向部分的化学缀合物，其用于例如治疗和监测骨相关疾病和病症比如骨癌和骨转移。

骨肉瘤是原发性骨癌的最常见类型，归类为其中肿瘤直接产生缺损的类骨质(未成熟骨)的恶性间质肿瘤。其是一种最通常在长骨的干骺端出现的血管多且非常有害的恶性肿瘤。在过去的二十年中，由侵袭性化疗与根治性外科切除术组成的综合治疗已经成为骨肉瘤控制的主要方式，目前没有出现转移性疾病的患者中50%至70%获得了5年存活率。提出了一些策略，比如基于免疫的治疗、肿瘤抑制剂或自杀基因治疗或通常不用于骨肉瘤的抗癌药[Quan等人，Cancer Metastasis Rev 2006; 10: 707-713]。然而，仍然有三分之一的患者死于这一毁灭性的癌症，对于患有不能切除的疾病的患者，没有治愈性全身治疗。

前列腺癌是工业化国家中最常见的男性癌症，并且是男性癌症死亡的第二个主要原因。这些患者的死亡不是由于原发肿瘤生长，而是由于向生命器官的转移引起的并发症。前列腺癌主要转移到骨骼，但是其它器官部位也受到影响，包括肺、肝和肾上腺。

乳腺癌通常也转移到骨骼。

在患有晚期转移性疾病的患者中，骨转移的发病率为约70 %。骨转移与相当大量的骨胳病症（skeletal morbidity）相关，包括严重的骨痛、病理性骨折、脊髓或神经根压迫和恶性肿瘤的高血钙症。化疗剂、激素剥夺(hormonal deprivation)和二膦酸盐是晚期转移性疾病的常见治疗方式。然而，随时间逝去，疾病发展至标准治疗不能控制该恶性肿瘤的阶段和进一步发展至高度化疗耐受性状态的阶段。

肿瘤发展和转移高度取决于新血管供应的氧和营养物，所述新血管的形成受到肿瘤本身及其环境的刺激。抗血管生成治疗剂与常规治疗的组合对于骨肉瘤控制和降低转移的危险具有极大的可能性。血管生成抑制剂，比如TNP-470[Folkman, J. Apmis 2004; 112: 496-507]，其无毒的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物-缀合形式，caplostatin[Satchi-Fainaro等人，Cancer Cell 2005; 7: 251-261], 和Avastin[Hurwitz等人，N Engl J Med 2004; 350: 2335-2342] 作为新形态的抗癌药出现。

目前存在八种批准的具有公认抗血管生成性质的抗癌治疗剂。这些试剂中断参与肿瘤血管生成和生长的关键性细胞信号传导途径，其可以分成两个主要的种类：(1) 单克隆抗体，针对特定的促血管生成因子和/或其受体；(Avastin, Erbitux, Vectibix, Herceptin)和 (2) 多种促血管生成生长因子受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKIs) (Tarveca, Nexavar, Sutent)。mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶点)的抑制剂代表第三个较小种类的抗血管生成治疗剂，具有只有一个批准的试剂(Torisel)。另外，至少两种其它批准的抗血管生成剂可以经由还未完全理解的机制间接地抑制血管生成(Velcade, Celgene)。

第一种FDA批准的血管生成抑制剂贝伐单抗(Avastin, Genentech)，一种血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体，最近被批准与标准常规化疗联合用于转移性结肠癌治疗。

阻断血管生成的最大类型的药物是靶向VEGF受体(VEGFR)的多靶点酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)。这些药物比如sunitinib (Sutent, Pfizer)、Sorafenib (Nexavar, Bayer/Onyx Pharmaceuticals)和Erlotinib (Tarveca, Gennentech/OSI/Roche)具有攻击多个靶点、方便口服给药和经济有效的优点。虽然这些药物显示出有希望的功效，它们的使用受到缺少靶特异性的限制，其导致预想不到的毒性[Cabebe等人，Curr Treat Options Oncol 2007; 8:15-27]。

因此，寻求与或不与其它抗肿瘤剂使用的新靶向血管生成抑制剂。这一努力的主要障碍是不能确定治疗效果、缺乏肿瘤血管生成的可靠代用品标记物和参与肿瘤血管生成的多个宿主细胞和恶性细胞之间相互作用的复杂性，其可能限制单个抗血管生成剂的使用。另一个显著的障碍是大多数临床使用的抗癌和抗血管生成药物是小分子，其显示出在血流中半衰期短和总清除率高。这些低分子量药物快速扩散到健康组织中，并均匀地分布在体内。因此，相对少量的药物到达靶部位，治疗的功效低且副作用严重。

TNP-470是一种烟曲霉素的低分子量合成类似物，其在体外能够选择性地抑制内皮生长。在临床试验中，发现在患有转移性癌症的许多患者中，当与常规化疗组合使用时，该药物减缓肿瘤生长，显示出有希望的功效。然而，在肿瘤消退所需的剂量下，许多患者经历神经毒性。由于其剂量限制性神经毒性，对于使用TNP-470本身，没有进行进一步的临床研究。已经推断出应当利用TNP-470与靶向肿瘤组织的试剂的临床应用，以便增加其部位特异性和减少副作用。

水溶性聚合物比如N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HPMA)是生物相容的、非免疫原性的且无毒的载体，其能够特定地递送到肿瘤组织中[Satchi-Fainaro等人，Nat Med 2004; 10: 255-261]。这些大分子不会扩散通过正常血管，而是因为提高渗透和滞留（EPR）效应，其选择性地聚集在肿瘤部位。在许多实体瘤中，对于大分子试剂和脂质，观察到经由高渗透性（hyperpermeable）新血管系统的被动扩散和定位在肿瘤间质的这一现象。抗癌药物比如TNP-470与共聚物比如HPMA的缀合将能够将这些药物选择性地靶向至肿瘤组织，因此减少了副作用。而且，与游离药物相比，通过将细胞暴露于循环中的缀合药物较长的时间，这样的共聚物-药物缀合物将限制穿过血脑屏障，延长药物的循环半衰期，因而抑制肿瘤内皮细胞和上皮细胞的生长。

Satchi-Fainaro等人在WO 03/086382中已经描述了通过将抗血管生成试剂比如TNP-470缀合至HPMA获得的有利特征的一个实例。该专利申请教导了水溶性聚合物和TNP-470的缀合物及其作为抗肿瘤剂的用途，特别是其作为TNP-470进入肿瘤血管的载体的用途，及其对于TNP-470神经毒性的作用。根据WO 03/086382的教导，与单独的TNP-470相比，一个示例性的这种缀合物HPMA-(TNP-470)缀合物(caplostatin)显示出较好的抗癌活性和降低水平的毒性。WO 03/086382进一步提出结合靶向配体比如RGD或抗体。

HPMA-TNP-470缀合物用于治疗血管生成相关状况的用途还描述在WO 03/086178中。

通过将抗肿瘤药物缀合至水溶性聚合物获得活性增加而毒性减少的另一个实例列出在美国专利No. 6,884,817中。

Meerum Terwogt等人已经描述了一种紫杉醇的HPMA共聚物缀合物[Anticancer drugs 2001; 12:315-323]。该缀合物旨在改善药物溶解性和提供紫杉醇的控制释放。在该缀合物中，紫杉醇经由酯键连接HPMA共聚物，因此，通过酯键的非组织特异性水解或酶(酯酶)降解从聚合物中释放，从而诱导通常观察到的紫杉醇毒性。

二膦酸盐(BPs)比如阿仑膦酸盐是具有类似于无机焦磷酸(PPi)的化学结构的化合物，无机焦磷酸是一种内源性的骨矿化调节剂。一些二膦酸盐被证实作为临床病症比如骨质疏松症、骨的佩吉特病、骨髓瘤、和骨转移的有效治疗剂。二膦酸盐比如唑来膦酸显示出抑制血管生成[Wood等人，J Pharmacol Exp Ther 2002; 302: 1055-1061]。在生理条件下显示出对骨矿物的强亲和力、低毒性和抗血管生成活性的二膦酸盐的药代动力学特征对于靶向至限制于骨组织的肿瘤是有利的。

阿仑膦酸盐被认为对于治疗骨相关疾病和癌症伴随的高血钙症有效。在几种体内癌症模型中，其显示出具有通过几个不同机制的抗癌作用[Tuomela等人，2008, BMC Cancer 8:81; Molinuevo等人，2007, Eur J Pharmacol 562:28-33; Hashimoto等人，2005, Cancer Res 65: 540-545]。另外，发现阿仑膦酸盐具有抗血管生成活性，其通过如下方式：(i)在卵巢癌症模型中，抑制VEGF诱导的Rho活化[Hashimoto等人，2007, Biochem Biphys Res Commun 354: 478-484]，(ii)在甲羟戊酸途径中，抑制焦磷酸法呢酯合酶[Russell RG 2007, Pediatrics 119 Suppl 2: S150-162]；和(iii) 在骨肉瘤细胞系中，调节MMP-2表达的细胞水平[Cheng等人，2004, Pediatr Blood Cancer 42;410-415]。

其它的骨靶向试剂是天门冬氨酸的寡聚肽。Wang等人描述了荧光素标记的骨靶向模型缀合物，用于在HPMA共聚物上载有1 %负载量的D-Asp₈的检测目的[Wang等人，2003 Bioconjug Chem 14:853-859]。在体外和体内测试了该缀合物的骨靶向潜能，发现其在骨组织中选择性地聚集[Wang等人，2006, Mol Pharm 3:717-725]。

WO 2004/062588教导了用于骨靶向药物递送的水溶性聚合缀合物，其具有改善的药代动力学参数和较好的负载药物的水溶解性。该申请教导的聚合药物递送系统是基于骨靶向药物比如阿仑膦酸盐和D-Asp₈与骨相关治疗剂组合的羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)缀合物。阿仑膦酸盐和D-Asp₈在HPMA共聚物上的负载量分别是0.494 mmol/gram和0.762 mmol/gram。

PK2 (FCE28069)是一种HPMA共聚物-多柔比星-半乳糖胺缀合物，其设计作为肝细胞癌或继发性肝病的治疗剂。[Seymour等人，Journal of Clinical Oncology 2002; 20:1668-1676]。多柔比星是一种在生理溶液中具有有限溶解度的蒽环类抗生素，并且是一种熟知的抗肿瘤药物。半乳糖胺结合肝脏的无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，因此充当特定的肝靶向部分。这些组分经由酶可生物降解的连接基连接HPMA聚合物，其允许在肝脏内释放游离的多柔比星，因而升高了其作用部位的药物浓度。所述酶可降解的连接基是四肽间隔基(Gly-Phe-Leu-Gly)，设计由溶酶体组织蛋白酶切割。

O'hare等人，[Journal of Drug Targeting 1993; 1:217-229]合成了包含多柔比星和作为黑素瘤特异性靶向部分的促黑素细胞激素(MSH)的HPMA共聚物。多柔比星和促黑素细胞激素都经由酶可生物降解的连接基连接HPMA聚合物。

Hruby等人，[Journal of Applied Polymer Science 2006; 101: 3192–3201]基于生物相容性HPMA共聚物制备合成了新的聚合药物递送系统，该系统设计用于骨靶向和抗肿瘤，所述相容性HPMA共聚物包含羟基二膦酸盐靶向部分和模型药物放疗剂¹²⁵I、显影剂¹¹¹In或抗癌药物多柔比星。在HPMA共聚物上负载的羟基二膦酸盐的百分数在1.3-4 mol %范围之内。

发明简述

在获得抗肿瘤活性的剂量下，用于治疗骨相关癌症及其它血管生成相关状况的目前已知试剂的特征在于毒性高，其限制了它们的应用。在改良目前已知的抗血管生成剂的模式，以便能够获得更高治疗效果和降低的副作用水平的探索中，本发明人设计并成功地制备和实践了N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物、TNP-470和骨靶向试剂阿仑膦酸盐(ALN)的新的聚合缀合物，其中所述TNP-470和阿仑膦酸盐分子经由可生物降解的连接基缀合至HPMA聚合主链的主链单元，在该HPMA聚合主链上负载的阿仑膦酸盐的百分数高于目前已知的阿仑膦酸盐聚合物缀合物(例如，大于聚合缀合物的3 mol %)。

本发明人进一步设计并成功地实践了制备本文描述的缀合物的新方法，同时获得了阿仑膦酸盐在聚合物中的高负载量以及该聚合物的均匀尺寸分布，即低多分散性。该方法可以在30℃下，以控制的方式有利地进行。

本发明人设计并成功地制备和实践了聚合物(例如N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物)、抗血管生成剂(例如TNP-470)和骨靶向试剂D-Asp₈的新缀合物。

根据本发明的某些实施方案的一个方面，提供一种包括具有连接在其上的TNP-470和阿仑膦酸盐的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)-衍生聚合主链的缀合物，其中阿仑膦酸盐在该聚合物中的负载量大于3 mol %。

根据本发明的某些实施方案，阿仑膦酸盐在所述聚合物中的负载量为大于5 mol %。

根据本发明的某些实施方案，阿仑膦酸盐在所述聚合物中的负载量为约7 mol %。

根据本发明的某些实施方案，TNP-470和阿仑膦酸盐中至少一种经由连接基连接至所述聚合物。

根据本发明的某些实施方案，TNP-470和阿仑膦酸盐中每种都经由连接基连接至所述聚合物。

根据本发明的某些实施方案，所述连接基是可生物降解的连接基。

根据本发明的某些实施方案，所述可生物降解的连接基选自pH-敏感性连接基和酶可切割的连接基。

根据本发明的某些实施方案，所述可生物降解的连接基是酶可切割的连接基。

根据本发明的某些实施方案，所述酶可切割的连接基为由在肿瘤组织中表达的酶切割的。

根据本发明的某些实施方案，所述酶可切割的连接基为由在肿瘤组织中过表达的的酶切割的。

根据本发明的某些实施方案，所述酶选自组织蛋白酶B、组织蛋白酶K、组织蛋白酶D、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、legumain、MMP-2和MMP-9。

根据本发明的某些实施方案，所述酶是组织蛋白酶K。

根据本发明的某些实施方案，所述连接基包括含有2至10个氨基酸残基的寡聚肽基团。

根据本发明的某些实施方案，所述寡聚肽是 -[Gly-Gly-Pro-Nle]-。

根据本发明的某些实施方案，TNP-470经由间隔基连接所述聚合物或所述连接基。

根据本发明的某些实施方案，所述间隔基具有式G-(CH₂)_n-K，其中n为1至4的整数，G和K各自独立地选自NH、O和S。

根据本发明的某些实施方案，G和K各自为NH，n为2。

根据本发明的某些实施方案，阿仑膦酸盐经由包括–[Gly-Gly-Pro-Nle]-的连接基连接至所述聚合物。

根据本发明的某些实施方案，所述缀合物具有如本文描述的通式II。

根据本发明的某些实施方案，所述缀合物具有结构：

根据本发明的某些实施方案，x为等于70-99.9的整数，y和w各自独立地为等于0.01-15的整数。

根据本发明的某些实施方案，所述缀合物进一步包括标记试剂。

根据本发明的某些实施方案，所述标记试剂选自荧光剂、放射性试剂、磁性试剂、生色团、生物发光剂、化学发光剂、发磷光的试剂和重金属簇。

根据本发明的某些实施方案，所述标记试剂是异硫氰酸荧光素。

这样的缀合物具有例如下述结构：

其中：

x为等于70-99.9的整数；和

y、z和w各自独立地为等于0.01-15的整数。

根据本发明的某些实施方案的一个方面，提供一种合成如上描述的缀合物的方法，该方法包括：

(a) 将阿仑膦酸盐偶合至N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺单体单元，从而得到包含阿仑膦酸盐的甲基丙烯酰胺单体单元；

(b) 共聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺单体单元,和/或((N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)寡聚或聚合单元与所述包含阿仑膦酸盐的甲基丙烯酰胺单体单元和端接第一反应基团的甲基丙烯酰胺单体单元，从而得到包括多个甲基丙烯酰胺主链单元的聚合主链，其中所述主链单元的一部分具有连接在其上的阿仑膦酸盐，所述主链单元的另一部分具有所述反应基团，第一反应基团能够偶合TNP-470；和

(c) 经由第一反应基团偶合所述TNP-470和所述聚合主链，从而得到聚合缀合物。

根据本发明的某些实施方案的另一个方面，提供一种缀合物，其包括具有连接在其上的抗血管生成剂和骨靶向部分的聚合主链，所述骨靶向部分为包括2至100个氨基酸残基的天门冬氨酸寡聚肽。

根据本发明的某些实施方案，所述寡聚肽包括2至20个氨基酸残基。

根据本发明的某些实施方案，所述寡聚肽包括8个氨基酸残基。

根据本发明的某些实施方案，所述天门冬氨酸选自D-天门冬氨酸和L-天门冬氨酸。

根据本发明的某些实施方案，所述天门冬氨酸为D-天门冬氨酸。

根据本发明的某些实施方案，抗血管生成剂和骨靶向部分中至少一种经由连接基连接至所述聚合主链。

根据本发明的某些实施方案，所述连接基是可生物降解的连接基。

根据本发明的某些实施方案，抗血管生成剂和骨靶向部分的每种都经由连接基连接至所述聚合主链。

根据本发明的某些实施方案，所述聚合主链来源于具有平均分子量为100 Da至800 kDa的聚合物。

根据本发明的某些实施方案，所述聚合主链来源于选自下述的聚合物：葡聚糖、水溶性聚氨基酸、聚乙二醇(PEG)、聚谷氨酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯) (PLA/PLGA)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚甘油、聚酰胺胺(PAMAM)和聚乙烯亚胺(PEI)。

根据本发明的某些实施方案，所述聚合物为N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)。

根据本发明的某些实施方案，所抗血管生成剂为TNP-470。

根据本发明的某些实施方案，所述可生物降解的连接基选自pH-敏感性连接基和酶可切割的连接基，如本文描述的。

根据本发明的某些实施方案的一个方面，提供一种药物组合物，其包括作为活性成分的任一种本文描述的缀合物和可药用载体。

根据本发明的某些实施方案，所述组合物包装在包装材料中，并且在所述包装材料中或其上的印刷中被鉴定用于治疗骨相关疾病或病症。

根据本发明的某些实施方案，所述缀合物包括标记试剂，所述组合物包装在包装材料中，并且在所述包装材料中或其上的印刷中被鉴定用于监测骨相关疾病或病症。

根据本发明的某些实施方案，所述骨相关疾病或病症与血管生成相关。

根据本发明的某些实施方案的一个方面，提供一种治疗需要其的受试者中骨相关疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的本文描述的任一种缀合物。

根据本发明的某些实施方案的一个方面，提供一种如上描述的缀合物作为药物的用途。

根据本发明的某些实施方案的一个方面，提供如上描述的缀合物在制备用于治疗骨相关疾病或病症的药物中的用途。

除非另有定义，本文使用的所有技术术语和/或科技术语具有与如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和物质可以用于实施或试验本发明的实施方案，如下描述了示例性的方法和/或物质。在存在冲突的情况下，本专利说明书，包括定义将有控制力。另外，材料、方法和实施例仅仅是示例性的，而不意味着必须的限制。

附图简述

本文参照附图和图像描述了本发明的某些实施方案，但这仅仅是举例说明。现在，详细地具体参照附图，强调指出特别的说明是用于举例和用于示例性讨论本发明实施方案的目的。在这点上，说明书与附图一起使得对本领域技术人员而言可以如何实施本发明的实施方案是显而易见的。

在附图中：

图1呈现图解根据本发明的某些实施方案合成HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物的方案。

图2A-B呈现显示阿仑膦酸盐和TNP-470的组合治疗对在体外的内皮细胞增殖的协同抑制作用的数据。图2A呈现显示ALN (实心的正方形)、TNP-470 (空心正方形)、ALN+TNP-470 0.01 pM (实心三角形)和ALN+TNP-470 10μm(空心三角形)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖的作用的比较曲线图，其证实了组合阿仑膦酸盐和TNP-470治疗的协同作用。图2B呈现在IC70 (实心正方形)、IC₅₀ (实心三角形)和IC30 (实心圆形)下，ALN-TNP-470组合治疗的经典等效线图（classic isobologram）。虚线的圆形代表组合ALN+TNP-470治疗的协同作用区域。该表代表每个IC的组合治疗I和II的CI值。数据代表平均值±SD 。

图3A-G呈现根据本发明的某些实施方案的荧光素标记的-HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物的2-D化学结构(图3A)；显示在选择的时间点，在存在或不存在羟基磷灰石（Hydroxyapitate）下，样品中未结合的HPMA-ALN-TNP470缀合物的FPLC检测的图(图3B)；显示结合羟基磷灰石的HPMA-ALN-TNP-470缀合物的百分数作为洗脱时间函数的曲线图(图3C)；通过经典聚合方法聚合的缀合物(聚合I缀合物；图3D)或通过RAFT聚合化聚合的缀合物(聚合II缀合物；图3E)的尺寸排阻色谱(SEC)图；显示HPMA-ALN-TNP-470聚合I缀合物和聚合II缀合物的流体动力直径尺寸分布的图（图3F）；和得到的聚合物I缀合颗粒的图像(图3G)。

图4A-S呈现根据本发明的某些实施方案的FITC-标记的HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和Saos-2人骨肉瘤细胞中的细胞内转运的共焦图像。具有PI(红色)细胞核染色的缀合物(绿色)的单XY平面图像显示缀合物的细胞质累积。HUVEC细胞对缀合物的细胞摄取分析(图4A)；28片的5.7μm Z叠层(图4B)；和XZ图像片，显示类似的缀合物和细胞核焦平面定位(图4C)； 在用ALN-TNP-470缀合物(绿色)（图4E,4I）孵育12小时后，用鬼笔环肽（红色）对于肌纤蛋白丝(图4D和和4H)染色和DAPI (蓝色)对于细胞核(图4F和4J)染色的HUVEC (图4G)和Saos-2细胞(图4K)的多通道重叠图，显示所述缀合物的细胞定位主要在细胞核周围；在HUVEC (图4M和4N)和Saos-2 (图4Q和4R)细胞中，用转铁蛋白(红色)标记的内涵蛋白包被的小泡(图4M和4Q)共区域化（colocalized）的FITC-标记缀合物(绿色) (图4L和4P)；显示在HUVEC (图4O)中缀合物/转铁蛋白的比例82 %和在Saos-2 (图4S)细胞中的比例71 %的重叠图象的直方图，指出所述缀合物经由亲溶酶体途径的细胞摄取。柱代表5μm(图4A-4K)和20μm(图 4L-4S)。

图5呈现证实当结合HPMA共聚物时，ALN和TNP-470保持其抗血管生成作用的比较曲线图。与在HUVEC细胞(空心三角形)、Saos-2细胞(空心正方形)和MAG-63-Ras (空心菱形）中在游离ALN和游离TNP-470的组合存在的情况下相比，在HUVEC细胞(实心三角形)、Saos-2细胞(实心正方形)和MG-63-Ras (实心菱形)中在聚合物-缀合ALN和TNP-470的存在下，平均细胞生长百分数类似。在组织蛋白酶K抑制剂III 的存在下，所述缀合物对内皮增殖的抑制显著地降低(IC₅₀=4200 nM)(空心圆形)。实线和虚线代表在生长因子存在(实线)或不存在(虚线)下的细胞增殖。数据代表平均值±SD。

图6A-C呈现HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物和游离ALN+游离TNP-470对HUVEC向血管内皮生长因子(VEGF)化学引诱物迁移的能力和形成毛细管样管状结构的能力的影响。图6A呈现显示游离(虚点柱)和聚合物-缀合(灰色柱) ALN和TNP-470抑制VEGF诱导的HUVEC迁移的柱形图；图6B呈现在孵育8小时之后，暴露于游离ALN +游离TNP-470的组合，和HPMA-共聚物ALN-TNP470的HUVEC图像；和图6C呈现与非处理的细胞(黑色柱)相比，显示不同浓度的游离(虚点柱)和聚合物-缀合的(灰色柱)ALN和TNP-470抑制HUVEC毛细管样管状结构的百分数的柱形图。数据代表平均值±SD。

图7A-G呈现显示根据本发明的某些实施方案的HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物降低小鼠皮肤毛细管中血管渗透性过高和抑制MG-63-Ras人骨肉瘤生长的数据。图7A呈现显示与未处理的对照组相比，用游离ALN+TNP-470或HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物处理的小鼠皮肤斑贴中偶氮蓝染色吸收减少的图。比例尺代表10 mm。图7B呈现显示从每个小鼠组的皮肤斑贴采集的和在620 nm测量定量的萃取染料含量的柱形图（n=5只小鼠/组）。图7C呈现含有mCherry-标记的MG-63-Ras肿瘤的未处理的小鼠(对照)或用游离ALN+TNP-470或HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物处理的小鼠的代表性活体内非侵入性荧光图像。图7D呈现显示出与载体处理组(实心正方形)相比，游离ALN + TNP-470 (空心三角形)或HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物(实心三角形)对MG-63-Ras人骨肉瘤肿瘤尺寸的抗肿瘤效果的比较曲线图和解剖的肿瘤图像。比例尺代表10 mm。所有的p值为两侧的(n=5只小鼠/组)。在第19天，HPMA-共聚物-ALN-TNP-470缀合物抑制肿瘤生长96 % (p=0.001)，与之相比，游离ALN + TNP-470抑制肿瘤生长45 % (p=0.012)。数据代表平均值±s.d. 与对照相比，* p<0.05，* * p<0.03，* * * p<0.05。图7E呈现来自用FITC-标记的HPMA-共聚物-ALN-TNP 470缀合物处理的小鼠解剖得到mCherry-标记的MG-63-Ras人骨肉瘤的全标本包埋共聚焦显微镜检查的代表性图像。比例尺代表25μm。图7F呈现对照、游离ALN +TNP-470组合和HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物处理的小鼠中s.c.接种的MG-63-Ras骨肉瘤的H& E和CD34免疫染色的代表性图像。图7G呈现用FITC-标记的HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物处理的小鼠的解剖器官的代表性图像，其显示出骨组织中的FITC-荧光光谱强度较大(绿色；由未混合的多光谱立方体组成的图像)，然后是脾、心脏、肺、肾和肝中。使用CRI Maestro?活体内非侵入性荧光成像系统取得图像。

图8呈现图解根据本发明的某些实施方案的两种HPMA共聚物-D-Asp₈-TNP-470缀合物(HP1和HP2)的合成的方案。

图9呈现两种HPMA共聚物-D-Asp₈-TNP-470缀合物(HP1和HP2)的尺寸排阻色谱(SEC)特征。

图10呈现显示与HPMA-D-Asp₈-TNP-470缀合物HP1 (黑色正方形)和HP2 (蓝色正方形)相比，游离TNP-470 (橙色正方形)对HUVEC生长的影响的比较曲线图，证实当结合所述HPMA共聚物时，TNP-470保持其抗血管生成作用。

图11A-B呈现显示与游离TNP-470相比，HPMA-D-Asp₈-TNP-470缀合物、HP1 (图11A)和HP2 (图11B)对HUVEC向血管内皮生长因子(VEGF)化学诱导物迁移的能力影响的柱形图，证实游离和聚合物-缀合的TNP-470以类似的程度抑制VEGF-诱导的HUVEC的迁移。

图12A-B呈现证实ALN显示出以剂量依赖性方式的抗血管生成作用的比较曲线图。图12A显示平均HUVEC细胞生长百分数作为游离ALN浓度(红色空心正方形)和缀合至HPMA的ALN浓度(1 mol %负载量；实心蓝色正方形)的函数的图。图12A显示平均侵袭性(E )型Saos-2人骨肉瘤细胞生长百分数作为游离ALN浓度(红色实心的圆)；缀合至HPMA的ALN浓度(1 mol %负载量；实心蓝色三角形)的函数的图，以及平均休眠(D)型Saos-2人骨肉瘤细胞生长百分数作为游离ALN浓度(空心实心的圆)和缀合至HPMA的ALN (1 mol %负载量；空心蓝色三角形)浓度的函数的图。实线和虚线代表在生长因子的存在(实线)或不存在(虚线)下的细胞增殖。数据代表平均值±SD。

本发明的具体实施方案的说明

在某些实施方案中，本发明涉及化学缀合物及其在治疗和诊断中的用途，更特别地，但非排他性地，涉及聚合物、抗血管生成剂和靶向部分的化学缀合物，其用于例如治疗和监测骨相关疾病和病症比如骨癌和骨转移。

参照附图和伴随的说明，可以更好地理解根据本发明的缀合物、组合物、用途、方法和工艺的原理和操作。

在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明在其应用中不限于下述说明书中列出的或由实施例示例的详细内容。本发明能够以各种方式实施或进行其他实施方案。并且，应当理解本文中采用的措辞和专有名词是为了说明的目的，而不应被视为限制。

如上讨论的，在获得抗肿瘤活性的剂量下，目前已知用于治疗骨相关癌症及其它血管生成相关状况的试剂的特征在于毒性高，其限制了它们的应用。

现在，本发明人以设计和成功地制备和实践了具有连接在其上的抗血管生成剂和骨靶向部分的共聚物的新缀合物。

更特别地，但不是排他性地，本发明人设计并成功地实施了制备这样的缀合物的新制备方法，其中骨靶向部分是阿仑膦酸盐或寡聚天冬氨酸盐（oligoaspartate）。

本发明人设计并成功地实施了制备这样的缀合物的新方法，其中阿仑膦酸盐以相对高的负载量存在于共聚物内。

本发明人令人惊奇地揭开了阿仑膦酸盐和TNP-470在抑制血管生成方面可以协同作用。因此，与阿仑膦酸盐的剂量依赖性抗血管生成活性一起，本文描述的阿仑膦酸盐高-负载的缀合物表征为用于治疗骨相关疾病和病症的高度有效的试剂。

如在随后的实施例部分证实的，本发明人成功地制备和实施了具有连接在其上的TNP-470和骨靶向试剂阿仑膦酸盐(ALN)的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物的新聚合缀合物，其中TNP-470和阿仑膦酸盐经由可生物降解的连接基缀合至HPMA-衍生的聚合主链的主链单元，在该缀合物上负载的阿仑膦酸盐的摩尔百分数高于目前已知的阿仑膦酸盐-聚合物缀合物(例如，大于该聚合缀合物的3 mol %)。

与未缀合的，即游离TNP-470和ALN相比，在同等剂量下给药，该聚合缀合物显示出对血管生成和骨癌的抑制增强。特别地，该HPMA共聚物-ALN-TNP470缀合物能够结合骨矿物质（见图3B和3C），并且与未缀合的ALN和TNP-470相比，其在抑制骨肉瘤细胞增殖(参见图5)、抑制内皮细胞增殖和迁移(分别参见，图5和6A)、抑制内皮细胞形成毛细管管状结构的能力(参见图6B-C)和降低体内血管渗透性过高和骨肉瘤肿瘤生长方面（见图7）显示出较好的活性。

本发明人进一步设计并成功地制备和实施了具有连接在其上的抗血管生成剂(例如TNP-470)和骨靶向试剂D-Asp₈的聚合物(例如N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)衍生的共聚物)的新缀合物。

因此，根据本发明的某些实施方案的一个方面，提供一种包括具有连接在其上的TNP-470和阿仑膦酸盐的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)-衍生的聚合主链的聚合缀合物，其中阿仑膦酸盐在该聚合缀合物中的负载量为大于3 mol %。

N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物是一类水溶性合成聚合载体，其已经广泛地表征为生物相容的、非免疫原性的和无毒的。HPMA聚合物可以通过相对简单的化学改性处理，以调节其相应的药物和靶向部分的含量。进一步，可以处理这些聚合物的分子量和电荷，以便肾清除和从体内排泄，或者改变生物分布，同时使其靶向肿瘤。

HPMA聚合物的肿瘤靶向能力至少部分是由于这样的聚合物的提高渗透和滞留(EPR)效应提高。因此，HPMA缀合物的特征在于通过正常血管的扩散和/或外渗有限，这是由于其分子量和流体动力直径高引起的，因此，其选择性地聚集在特征在于血管渗透的肿瘤部位，所述血管具有异常形成和结构及宽穿孔（fenestrations）、小孔和囊状空泡细胞器(VVO)。由于从肿瘤中的淋巴导流差，大分子倾向于保留在肿瘤微环境中。还预期将药物缀合至聚合物比如HPMA限制了该缀合物穿过血脑屏障，因而延长了药物的循环半衰期，消除了与许多化疗药物和抗血管生成药物相关的神经毒性。

具有分子量高于10 kDa的聚合缀合物典型地显示出如本文描述的EPR效应，而具有分子量100 kDa及以上的聚合物具有相对长的血浆半衰期和低的肾清除率，所述聚合缀合物包括具有连接在其上的TNP-470和阿仑膦酸盐的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)-衍生的聚合主链。因此，可以考虑缀合物的血浆半衰期、肾清除率、和在肿瘤中的蓄积来确定聚合缀合物的分子量。可以通过聚合(或共聚合)度至少在某种程度上控制所述聚合缀合物的分子量。

在某些实施方案中，本文描述的缀合物具有100 道尔顿至800 kDa的MW。在某些实施方案中，本文描述的缀合物具有10 kDa至800 kDa的MW。在某些实施方案中，所述缀合物具有10 kDa至60 kDa的MW。

在本发明的某些实施方案中，本文描述的缀合物包括由N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-衍生的主链单元(聚合N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺单体形成的聚合主链)组成的HPMA聚合主链，其中TNP-470分子连接至这些主链单元的一部分，阿仑膦酸盐分子连接至这些主链单元的另一部分，如本文描述的。在本文中，没有与另外的部分连接的聚合主链内的那些主链单元(例如TNP-470、阿仑膦酸盐或任何本文描述的其它部分)称为“游离”或“非官能化的”主链单元。

由于在本文描述的缀合物中的聚合主链由具有连接在其上的阿仑膦酸盐的某些主链单元、具有连接在其上的TNP-470的某些主链单元和和任选地某些游离主链单元组成，这些缀合物代表HPMA-衍生的共聚物。

如上文讨论的，TNP-470是一种有效的抗血管生成剂。其作为游离药物的应用受到其低溶解度和剂量依赖性神经毒性的限制。

术语“抗血管生成剂”，在本文中可互换地称为“抗血管生成试剂”或“血管生成抑制剂”描述了具有能够(a)抑制内皮细胞增殖或迁移；(b)杀死增殖性内皮细胞；和/或(c)抑制组织中新血管形成的能力的试剂。

如上讨论的，阿仑膦酸盐(4-氨基-1-羟基亚丁基)二膦酸)是一种在生理条件下，显示出对骨矿物质强亲和力的二膦酸盐。

本文中，术语“阿仑膦酸盐”还包括如下定义的任一种其可药用盐、溶剂化物和/或水合物。

之前已经表明，阿仑膦酸盐以剂量依赖性方式显示出抗血管生成活性。例如Cheng等人，已经表明阿仑膦酸盐以时间和剂量依赖性方式降低骨肉瘤细胞系中的mRNA水平和基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)的细胞水平[Cheng等人，2004, Pediatr Blood Cancer 42;410-415]。

如在随后的实施例部分中证实的，阿仑膦酸盐的抗血管生成活性是剂量依赖性的，如通过HUVEC和Saos-2人骨肉瘤细胞系增殖抑制的程度评价，其中抑制的程度与阿仑膦酸盐的浓度成比例，即，在较高的阿仑膦酸盐浓度下，可以观察到更强的抗血管生成活性。

将阿仑膦酸盐和抗血管生成剂缀合至聚合物对于制备特征为具有选择性和有效的治疗活性的试剂高度有利，选择性是由于归因于所述聚合物的EPR效应，和归因于阿仑膦酸盐的骨靶向作用，有效的治疗活性是由于存在有效的抗血管生成剂。

然而，如本文描述的这样的缀合物（其进一步的特征为高负载量的阿仑膦酸盐）更加有效，这是因为阿仑膦酸盐可潜在显示出的靶向和抗血管生成双重作用。

根据本发明的某些实施方案，本文描述的缀合物的特征在于阿仑膦酸盐的负载量高于3 mol %。

本文中，术语“负载量”或仅仅是“负载”及其任何语法上的转换都用于描述连接到本文描述的缀合物的聚合主链的试剂的量，其在本文中表示为该试剂在缀合物中的mol %，如下定义的。

如本文使用的术语“mol %”描述每1 mol的聚合缀合物的连接部分的摩尔数乘以100。

因此，例如阿仑膦酸盐的3 mol %负载量描述由100个主链HPMA单元组成的聚合缀合物，其中3个 HPMA主链单元具有连接在其上的含阿仑膦酸盐的单体单元，其它97 个HPMA主链单元为游离的或者具有连接在其上的其它试剂。

在本文描述的缀合物中，阿仑膦酸盐的负载量可以为例如，3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5和甚至高达10 mol %。

在某些实施方案中，阿仑膦酸盐在所述聚合物中的负载量大于5 mol %。

在某些实施方案中，阿仑膦酸盐在所述聚合物中的负载量为约7 mol %。

本文中，术语“约”描述±1%。

因此，术语“约7 mol %”描述的摩尔百分数介于6 mol %至8 mol %之间，或者介于6.5 mol %至7.5 mol %之间。例如，该术语包括6.5 mol %、6.6 mol %、6.7 mol %、6.8 mol %、6.9 mol %、7 mol %、7.1 mol%、7.2 mol %、7.3 mol %、7.4 mol %和7.5 mol %。

如在随后的实施例部分中所证实的，在这样的高负载量下，阿仑膦酸盐可以同时显示出骨靶向作用和抗血管生成作用。

如在随后的实施例部分中证实的，已经进一步令人惊奇地发现当以高浓度使用阿仑膦酸盐时，TNP-470和阿仑膦酸盐的组合治疗得到协同的抗血管生成活性。

如在随后的实施例部分中证实的，当一起给药时，如通过其对内皮细胞增殖的抑制作用所证实的，阿仑膦酸盐和TNP-470的抗血管生成活性优于当单独的给药时每种试剂的累积抗血管生成活性(参见，图2)。仅仅在高阿仑膦酸盐浓度下观察到这一协同活性，然而，在低阿仑膦酸盐浓度(低于100 nM)下，不能检测到协同活性。这些结果显示出阿仑膦酸盐和TNP-470之间的协同活性是剂量依赖性的。如在随后的实施例部分中所证实的，与给药等量浓度的游离阿仑膦酸盐和游离TNP-470 (即，未缀合的)观察到的抑制相比，当将TNP-470和阿仑膦酸盐都缀合至HPMA时，高负载量的阿仑膦酸盐显著地增强小鼠中的骨肉瘤肿瘤生长的体内抑制(参见图7D)。因此，显然可以得出结论：协同的抗血管生成活性是由缀合物内相对高浓度(负载量)的阿仑膦酸盐引起的。

因为阿仑膦酸盐显示出剂量依赖性抗血管生成活性，进一步因为本文显示出阿仑膦酸盐和TNP-470可以在抑制血管生成方面协同作用，这样的高负载量的缀合物可以有利地用于治疗骨相关疾病和病症比如与血管生成相关的那些状况中。

因此，在本发明的某些实施方案中，连接到本文描述的缀合物中的聚合物的TNP-470和阿仑膦酸盐协同作用。

如本文使用的和本领域的术语“协同作用”或“协同活性”描述两种或更多种生物活性剂组合出现的协同效应，其中当一起使用时两种试剂显示出的联合效应超过当单独使用时每种试剂的效应总和。

因此，当表示两种活性剂的组合的作用大于当单独起作用的这些试剂的每种得到的相同值的总和时，通常确定为“协同作用”或“协同活性”。

可以通过本领域众所周知方法确定两种抗血管生成剂之间的协同作用。

在本文描述的每种缀合物中，阿仑膦酸盐和TNP-470每个可以直接连接聚合主链，或者通过连接基部分(本文也称为连接基、连接基基团或连接基团)间接地连接聚合主链，其中在某些实施方案中，所述直接键/间接键设计为在表征期望的体内部位的环境（例如某些酶或pH）的条件下可裂解的，如下文详述的。

因此，根据本发明的某些实施方案，TNP-470和阿仑膦酸盐的至少一种经由连接基连接至所述聚合主链。在某些实施方案中，TNP-470和阿仑膦酸盐的每种都经由连接基连接至所述聚合主链。将TNP-470连接至所述聚合物的连接基和将阿仑膦酸盐连接至所述聚合主链的连接基可以相同或不同。

本文描述的连接基指将起偶合TNP-470和/或阿仑膦酸盐至所述聚合主链作用，而不会不利地影响阿仑膦酸盐的靶向功能或阿仑膦酸盐和/或TNP-470的治疗效果的化学部分。

在某些实施方案中，所述连接基是可生物降解的连接基。

如本文使用的术语“可生物降解的连接基”描述当暴露于生理学条件下时，能够降解或切割的连接基。这样的生理条件可以是例如pH、某一种酶等。

在某些实施方案中，连接基能够被预选择的细胞酶切割，预选择的细胞酶例如，在成骨细胞、破骨细胞、癌细胞或增殖内皮细胞的溶酶体中发现的那些。可选地，酸可水解的连接基可以包括酯或酰胺键，例如顺式-aconityl键。这样的连接基进一步通过仅仅在期望的身体部位释放抗血管生成药物和/或阿仑膦酸盐而增强了本文描述的缀合物的治疗活性，并减少了毒性。

因此，根据某些实施方案，所述可生物降解的连接基是pH-敏感性连接基或酶可切割的连接基。

pH-敏感性连接基包括只有当接受某些pH条件时切割或降解的化学部分，所述pH条件比如酸性pH (例如，低于7）、中性pH (6.5-7)或碱性pH (高于7)。

这样的连接基可以是例如设计在酸性或碱性条件下进行水解，因此，所述缀合物保持完整，不会在体内释放连接至所述聚合物的试剂，直到其到达pH分别为酸性或碱性的生理环境。

示例性的pH-敏感性连接基包括，但不限于腙键、酯(包括正酯)键、顺式-aconityl残基的酰胺键、三苯甲基、缩醛、缩酮、丙氨酸酯、Gly-酯和-[Gly-Phe-Gly]-部分。

在某些实施方案中，所述可生物降解的连接基为酶可切割的连接基。典型地设计这样的连接基，以便典型地包括化学部分，而非排他性地包括由预选择的酶识别的氨基酸序列。这样的氨基酸序列通常在本领域称为“识别基序”。在不存在预选择的酶下，包括这样的连接基的缀合物典型地基本上保持完整，因此，不会被切割或降解，使得连接到其上的试剂直到其到达其中该酶以相当大浓度存在的环境时释放。

在某些实施方案中，所述酶可切割的连接基被在肿瘤组织中表达的酶切割。包括这样的连接基的缀合物确保例如相当大量的缀合TNP-470仅仅在肿瘤组织从所述缀合物中释放，从而减少了与非选择性给药所述药物相关的副作用。

在某些实施方案中，所述酶可切割的连接基被在肿瘤组织中过表达的的酶切割。

适于应用于这些实施方案中的示例性的酶包括，但不限于组织蛋白酶B、组织蛋白酶K、组织蛋白酶D、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、legumain、MMP-2和MMP-9。

合适的连接基包括，但不限于烷基链；任选地被一个或更多个取代基取代的烷基链，其中一个或更多个碳原子任选地插入氮、氧和/或硫杂原子。

其它合适的连接基包括氨基酸和/或寡聚肽。

这样的烷基链和/或寡聚肽可以任选地被官能化，只要使其共价键合至从而连接的部分(例如，聚合主链和阿仑膦酸盐、聚合主链和TNP-470)。这样的官能化可以包括结合或产生参与这样的共价键合的活性基团。

在某些实施方案中，所述连接基是可生物降解的寡聚肽，其包含例如2至10个氨基酸残基。

在某些实施方案中，所述连接基是组织蛋白酶K-可切割的连接基。

组织蛋白酶K是一种参与骨重建和再吸收的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，其主要在破骨细胞中表达。其表达由组织损伤后和骨新生物中释放的炎症细胞因子刺激。[Pan等人，2006, J Drug Target 14:425-435; Husmann等人，2008, Mol Carcinog 47: 66-73]。一种具有组织蛋白酶K可切割部位的示例性连接基为-[Gly-Gly-Pro-Nle]-。

在某些实施方案中，所述连接基包括氨基酸序列-[Gly-Gly-Pro-Nle]-。

在某些实施方案中，所述连接基由氨基酸序列-[Gly-Gly-Pro-Nle]-组成。

其它的组织蛋白酶K可切割的部位是包括-[Gly-Pro-Nle]-部分的那些。另外的实例包括[-Gly-Gly-NH-C6-Gly-Pro-Nle]-。

如在随后的实施例部分中证实的，使用组织蛋白酶K可切割的连接基-[Gly-Gly-Pro-Nle]-，其将阿仑膦酸盐和TNP-470连接至HPMA聚合主链(参见图1)。如在随后的实施例部分中进一步证实的，包括这样的连接基部分的HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物成功地抑制内皮细胞以及Saos-2和MG-63-Ras人骨肉瘤细胞的增殖。根据当与组织蛋白酶K抑制剂一起培养时，所述缀合物的活性降低得出结论，组织蛋白酶K参与TNP-470和阿仑膦酸盐从所述聚合物的释放，其中与不存在组织蛋白酶K抑制剂III相比，在其存在下，所述缀合物以高4-logs的浓度抑制HUVEC的增殖（参见图5）。

还可以构建包含预选择的氨基酸序列(识别基序)的寡聚肽连接基，使得识别基序在所述连接基内重复几次，从而增加所连接试剂的选择性释放。还可以将相同或不同酶的各种识别基序加入到所述连接基内。类似地，所述连接基可以包括多个pH敏感性键或部分。包括这样的多种可切割部位的连接基可以增加抗血管生成剂在期望的身体部位的选择性释放，从而减少不良副作用，且进一步提高释放药物在其显示出活性的身体部位的相对浓度。

在其中TNP-470和/或阿仑膦酸盐直接键合所述聚合主链的情况下，连接这些部分的键也可以是可生物降解的，例如酶可切割的键或pH-敏感性键(例如，酸可水解的键)。当官能化所述聚合主链的主链单元、阿仑膦酸盐和/或TNP-470时，可以形成这样的键，使得包括用于形成期望的键的相容性反应基团。

在某些实施方案中，TNP-470经由间隔基连接聚合物或连接基。在某些实施方案中，阿仑膦酸盐经由间隔基连接聚合物或连接基。所述间隔基可以相同或不同。

如本文使用的术语“间隔基”描述共价连接至聚合主链和连接基、TNP-470和/或阿仑膦酸盐和插入其中间的化学部分，从而在聚合主链和连接基、TNP-470和/或阿仑膦酸盐之间形成桥连样结构。在某些实施方案中，所述间隔基没有主动参与生物过程，而是存在于所述缀合物中用于促进其合成和/或根据例如空间考虑改善其性能的目的，如下详述的。

合适的间隔基包括，但不限于亚烷基链，其任选地被一个或更多个取代基取代，且任选地插入一个或更多个氮、氧和/或硫杂原子。

其它合适的间隔基包括氨基酸和氨基酸序列，任选地被连接至聚合主链、TNP-470和/或阿仑膦酸盐的一个或更多个反应基团官能化。

在某些实施方案中，所述间隔基具有式G-(CH₂)_n-K，其中n为1至10的整数；G和K各自为如本文定义的反应基团，比如例如NH、O和S。在某些实施方案中，G和K各自为NH，n为2。

在某些实施方案中，所述间隔基为氨基酸序列，任选地为惰性氨基酸序列(即，不会影响所述缀合物的亲和力或选择性)。可以使用这样的间隔基延长或官能化连接基。

在某些情况下，使用间隔基能够根据空间考虑（使聚合主链偶合作用的部位受到的阻碍更小）或化学反应性考虑（将相容性反应基团加入到聚合主链偶合作用的部位）使阿仑膦酸盐和/或TNP-470更有效和更简单地连接至所述聚合主链或连接基。在某些情况下，间隔基可能有助于得到的缀合物的性质。例如，间隔基可以使酶可切割的连接基的空间位阻更小，因此，对酶的相互作用更敏感。

还可以使用间隔基以将其它试剂(例如标记试剂，如下文描述的)连接至所述缀合物。

间隔基的长度和组成可以不同，取决于空间和化学考虑，可用于间隔TNP-470和阿仑膦酸盐与聚合主链和/或连接基。

如在随后的实施例部分中证实的，本发明人成功地合成了缀合物，其中TNP-470经由组织蛋白酶K可切割的连接基-[Gly-Gly-Pro-Nle]-和间隔基-NH-(CH₂)₂-NH-连接HPMA聚合主链（参见图1）。

如上所述，TNP-470和阿仑膦酸盐的负载度可以以mole %表示，如本文定义的。

根据期望的缀合物的性质(例如水溶性、治疗效果、药代动力学性质、毒性和剂量要求)和合成考虑(例如可以以某一合成途径连接至主链单元的药物的含量)凭经验确定TNP-470的最佳负载度。

在某些实施方案中，TNP-470在所述聚合物中的负载量为大于1 mol %。

在某些实施方案中，TNP-470在所述缀合物中的负载量为1 mol %至90 mol %、1 mol %至50 mol %、1 mol %至20 mol %、1 mol %至10 mol %或1 mol %至5 mol %。

在具有连接在其上的TNP-470的聚合主链中的主链单元的数量在本文中定义为“y”，在具有连接在其上的阿仑膦酸盐的聚合主链中的主链单元的数量在本文中定义为“w”，在该聚合主链中的游离主链单元(其不结合另外的部分)的数量在本文中定义为“x”。

因此，在某些实施方案中，本文描述的缀合物可以由通式II表示：

其中：

x为具有使得x/(x+y+w)乘以100在0.01至99.9范围内的值的整数；

y为具有使得y/(x+y+w)乘以100在0.01至99.9范围内的值的整数；和

w为具有使得w/(x+y+w)乘以100在3至99范围内的值的整数；B为TNP-470；

D为阿仑膦酸盐；和

L₁和L₂各自独立地为如本文描述的连接基。

在某些实施方案中，所述缀合物具有下述结构：

其中x、y和z为如本文定义的。

根据本发明的某些实施方案， x为具有使得x/(x+y+w)乘以100在70至99.9范围内的值的整数； y为具有使得y/(x+y+w)乘以100在0.01至15范围内的值的整数；和 w为具有使得w/(x+y+w)乘以100在5至20范围内的值的整数。

例如，x/(x+y+w)乘以100可以为71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.9；y/(x+y+w)乘以100可以为 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；和w/(x+y+w)乘以100可以为5、5.2、5.4、5.6、5.8、6、6.2、6.4、6.6、6.8、7、7.2、7.4、7.6、7.8、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在某些实施方案中，w/(x+y+w)乘以100为7。

在某些实施方案中，本文描述的缀合物进一步包括连接在其上的标记试剂。

在某些实施方案中，所述标记试剂连接至不具有连接在其上的TNP-470或阿仑膦酸盐的主链单元的一部分。

在此情况下，具有连接在其上的标记试剂的聚合主链中主链单元的数量定义为“z”，如下文通式所示。

将标记试剂连接至缀合物能够利用这些缀合物监测骨相关疾病或病症，例如监测本文描述的缀合物显示出的治疗效果，及其生物分布。

如本文使用的术语“标记试剂”描述可检测部分或探针。在这些实施方案中适于使用的示例性的标记试剂包括，但不限于荧光剂、放射性试剂、磁性试剂、生色团、生物发光试剂、化学发光试剂、发磷光的试剂和重金属簇。

术语“放射性试剂”描述通过发射电离粒子和放射线丧失能量（衰变）的物质(即放射性核素或放射性同位素)。当所述物质衰变时，可以通过检测其发射的放射线确定其存在。为了这些目的，一种特别有用类型的放射性衰变是正电子发射。示例性的放射性试剂包括 ^99mTc、¹⁸F、¹³¹I和¹²⁵I。

术语“磁性试剂”描述吸引至外加磁场的物质。这些物质通常用作造影剂，以便在磁共振成像(MRI)中改善内体结构的可见度。用于造影增强的最常使用的化合物是基于钆的。MRI造影剂改变了其存在于的组织和体腔的弛豫时间，其根据成像权重(image weighting)，可以发出更高或更低信号。

如本文使用的术语“生色团”描述化学部分，当其连接至另外的分子时，其导致该分子变色，因此成为当应用各种分光光度测定时的可见物。

术语“生物发光试剂”描述通过生化过程发光的物质。

术语“化学发光试剂”描述作为化学反应的结果发光的物质。

术语“荧光剂”指在暴露于来自外源的放射期间以特定波长发光的化合物。

术语“发磷光的试剂”指在没有可感知的加热或外部激发下，由于磷的缓慢氧化发光的化合物。

重金属簇为例如一簇使用的金原子，例如用于在电子显微镜检查技术中标记。

在某些实施方案中，所述标记试剂为异硫氰酸荧光素。

如在随后的实施例部分中所证实的，将荧光剂异硫氰酸荧光素(FITC)缀合至具有连接在其上的TNP-470和阿仑膦酸盐的HPMA共聚主链(HPMA共聚物-ALN-TNP-470-FITC；参见，图1)。使用荧光剂评价所述缀合物的体内生物分布(参见图7G)以及研究该缀合物内在化至内皮和人骨肉瘤细胞的机制(参见图4)。这些荧光研究表明所述缀合物主要地分布到骨组织，所述缀合物的内在化机制是通过经由内涵蛋白-包被小泡进行细胞摄取的亲溶酶体途径。

在某些实施方案中，所述缀合物具有下述结构：

其中：

x为具有使得x/(x+y+w+z)乘以100在0.01至99.9范围内的值的整数，如本文描述的；

y为具有使得y/(x+y+w+z)乘以100在0.01至99.9范围内的值的整数，如本文描述的；

w为具有使得w/(x+y+w+z)乘以100在2.1至99范围内的值的整数，如本文描述的；和

z为具有使得z/(x+y+w+z)乘以100在0.01至99.9范围内的值的整数。

在某些实施方案中，z为具有使得z/(x+y+w+z)乘以100在0.01至10范围内的值的整数，取决于使用的标记试剂和监测技术。

如上文讨论的和进一步在下文中详细讨论的，本文描述的缀合物是通过设计和成功地实施其新的制备方法成功地制备的。这样的方法，除了能够获得具有高负载量的阿仑膦酸盐的缀合物之外，进一步能够获得具有低多分散指数(PDI)和小的平均尺寸分布的缀合物。

因此，在某些实施方案中，本文描述的缀合物具有的多分散指数为1至1.4。

术语“多分散指数”是在给定聚合物样品中分子量的分布的量度。PDI为由重均分子量除以数均分子量计算的值(M_w/M_n)。其指出在一批聚合物中各个分子量的分布。PDI具有的值总大于1，但是作为接近均匀链长的聚合物链，PDI接近一致(1)。与HPMA共聚物类似的基于聚合物的纳米载体通常显示出所述聚合物的内在结构非均匀性，反映为PDI值高，典型地高于1.4，甚至高于1.6。聚合物缀合物的均匀尺寸分布可有助于更确定的生物分布。

例如，PDI值可以是1.39、1.38、1.37、1.36、1.35、1.34、1.33、1.32、1.31、1.3、1.29、1.28、1.27、1.26、1.25、1.24、1.26、1.25、1.24、1.23、1.22、1.21、1.2、1.19、1.18、1.17、1.16、1.15、1.14、1.13、1.12、1.11、1.1、1.09、1.08、1.07、1.06、1.05、1.04、1.03、1.02和1.01。

在某些实施方案中，本文描述的缀合物具有的平均尺寸分布低于150 nm。

例如，平均尺寸分布可以低于  149 nm、148 nm、147 nm、146 nm、145 nm、143 nm、142 nm、141 nm、140 nm、139 nm、138 nm、137 nm、136 nm、135 nm、134 nm、133 nm、132 nm、131 nm、130 nm、129 nm、128 nm、127 nm、126 nm、125 nm、124 nm、123 nm、122 nm、121 nm、120 nm、119 nm、118 nm、117 nm、116 nm、115 nm、114 nm、113 nm、112 nm、111 nm、110 nm、109 nm、108 nm、107 nm、106 nm、105 nm、104 nm、103 nm、102 nm、101 nm、100 nm、99 nm、97 nm、95 nm、93 nm、91 nm、89 nm、87 nm、85 nm、83 nm、81 nm、79 nm、77 nm、75 nm、73 nm、71 nm、69 nm、67 nm、65、63 nm、61 nm、55 nm、50 nm、45 nm、40 nm、35 nm、30 nm、25 nm、20 nm、15 nm等。

对于合成的缀合物，由其SEC特征评价重均摩尔质量(Mw)，并根据式M_w/M_n计算多分散指数(PDI)。

当将本发明进行实施时，本发明人设计并成功地实施了制备具有连接在其上的阿仑膦酸盐、TNP-470和任选的标记试剂(例如荧光剂)的HPMA共聚物的新方法，其中阿仑膦酸盐的负载量大于将二膦酸盐和任选的其它靶向部分连接至聚合物的目前已知方法。

目前已知的方法典型地包括将靶向部分连接至已经制备的聚合物或共聚物，因此，靶向部分在得到的缀合物中的负载量有限或不是可控制的。

相反，在本文描述的方法中，首先制备阿仑膦酸盐连接的聚合主链(HPMA)的单体单元，然后将其与HPMA单体的、寡聚的和/或聚合的单元共聚。可选地，聚合包含阿仑膦酸盐的单体单元，然后，与该单体的其它单体的、寡聚的或聚合的单元共聚。在某些实施方案中，将HPMA单体、寡聚物或聚合物的至少一个预定部分转化至使得端接能够与TNP-470反应的反应基团(例如，利用加入端接期望的反应基团的间隔基)，从而使该HPMA单体官能化来实现共聚。

在某些实施方案中，将HPMA单体、寡聚物或聚合物的至少一个预定部分转化至使得端接能够与标记试剂反应的反应基团(例如，利用加入端接期望的反应基团的间隔基)来实现共聚。

在某些实施方案中，将HPMA单体、寡聚物或聚合物的至少一个预定部分转化至使得包括如本文描述的连接基，其任选地端接能够与TNP-470反应的反应基团(例如，利用加入端接期望的反应基团的间隔基)来实现共聚。

因此，根据本发明的某些实施方案的另一个方面，提供一种合成本文描述的缀合物的方法，所述方法包括：

(a) 将阿仑膦酸盐偶合至N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺单体单元，从而得到包含阿仑膦酸盐的甲基丙烯酰胺单体单元；

(b) 共聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺单体单元,和/或((N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)寡聚或聚合单元与所述包含阿仑膦酸盐的甲基丙烯酰胺单体单元和端接第一反应基团的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-衍生的单体单元，从而得到包括多个甲基丙烯酰胺主链单元的聚合主链，其中所述主链单元的一部分具有连接在其上的阿仑膦酸盐，所述主链单元的另一部分具有所述反应基团，第一反应基团能够偶合TNP-470；和

(c) 经由第一反应基团偶合所述TNP-470和所述聚合主链，从而得到聚合缀合物。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括，任选地在(b )中共聚之前，将标记试剂偶合至N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺单体单元，从而得到包含标记试剂的甲基丙烯酰胺单体单元；和(b )进一步包括共聚包含标记试剂的甲基丙烯酰胺单体单元和包含阿仑膦酸盐的甲基丙烯酰胺单体单元及端接第一反应基团的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-衍生的单体单元，从而得到具有所述反应基团、标记试剂、能够偶合TNP-470的反应基团的包含阿仑膦酸盐的共聚物。

可选地，在(b )中的共聚包括共聚包含阿仑膦酸盐的单体单元与N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺单体单元和/或((N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)寡聚或聚合单元及端接第一反应基团的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-衍生的单体单元，进一步共聚端接第二反应基团的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺衍生的单体单元，其中第二反应基团能够偶合标记试剂。

在这些实施方案中，所述方法进一步包括经由第二反应基团将标记试剂偶合至所述共聚物。这样的偶合可以在偶合TNP-470之前、同时或在其之后进行。

包含阿仑膦酸盐的HPMA单体和其它、官能化的或非官能化的HPMA单体的共聚可以通过本领域已知的任何聚合方法，使用合适的聚合引发剂和任选的链转移剂进行。这样的合适的聚合引发剂和链转移剂可以由本领域技术人员容易地确定。

如在随后的实施例部分中证实的，包含阿仑膦酸盐的HPMA-衍生的单体+ 端接反应基团(例如乙二胺)的HPMA-衍生的单体+游离HPMA单体和任选地+包括FITC的HPMA-衍生的单体(在上文描述的方法中的步骤(b ))的共聚经由两种方法进行：(1)“经典的”热聚合方法，使用作为一个实例的4,4’-偶氮基二(4-氰基戊酸)作为聚合引发剂；和  (2) “可逆的加成-裂解链转移”(RAFT)聚合技术，使用作为一个实例的2,2’-偶氮基二[ 2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸化物作为聚合引发剂和S,S’-二(α,α’-二甲基-α’’-乙酸)三硫代碳酸酯作为链转移剂(TTC)。

使用这两种合成方法，其表明可以精确地控制阿仑膦酸盐在所述缀合物中的负载量及得到的共聚物的其它参数。

使用RAFT方法进一步能够在室温下或低至30℃下进行共聚。

所述“可逆的加成-裂解链转移”(RAFT)聚合技术典型地包括使用硫代羰基硫化合物，比如二硫酯、二硫代氨基甲酸酯、三硫代碳酸酯和黄原酸酯，以便经由可逆的链转移过程调节聚合。这能够使聚合物具有低多分散性和高官能度。

如在随后的实施例部分中示例的，对于合成的缀合物，由其SEC特征确定重均摩尔质量(M_w)，并根据式M_w/M_n计算多分散指数(PDI)。已经表明通过RAFT聚合的缀合物是良好分散的，显示出为约1.2的显著低和更窄的PDI值，平均尺寸分布为100 nm (参见，图3D-G)。

因此，在某些实施方案中，经由可逆的加成-裂解链转移(RAFT)技术进行共聚。

在某些实施方案中，进行该方法，使得所述缀合物具有的多分散指数为1至1.4。

在某些实施方案中，进行该方法，使得所述缀合物具有的平均尺寸分布低于150 nm。

通常，可以利用已经存在于所述聚合物的天然分子和/或单体单元中的官能团，或者以不同的方式通过合成有机化学中不会改变试剂活性的熟知方法引入或产生的官能团，将TNP-470或阿仑膦酸盐连接至形成聚合主链的单体单元，或所述共聚物的主链单元。例如，在阿仑膦酸盐的情况下，可以在单体HPMA内产生末端羧基，以便形成具有阿仑膦酸盐的胺官能团的酰胺。例如，可以通过氧化HPMA的羟基产生羧基官能团。可选地，通过连接端接羧基的间隔基或连接基至HPMA单体产生羧基官能团(反应基团)。

类似地，为了容易地偶合TNP-470，可以在HPMA聚合主链或HPMA单体之内产生卤代烷。可以利用如本文描述的间隔基和/或连接基产生这样的卤代烷。

因此，在本文中，已经改性以便产生反应基团的HPMA单体的、寡聚的和聚合的单元称为HPMA-衍生的单元或端接反应基团的甲基丙烯酰胺单元。

因此，在某些实施方案中，所述方法进一步包括将连接基引入参与共聚的至少一些HPMA单体的、寡聚的或聚合的单元。

在某些实施方案中，在共聚之后，进行连接基的引入。

类似地，在某些实施方案中，所述方法进一步包括将间隔基引入参与共聚的至少一些HPMA单体的、寡聚的或聚合的单元。

在某些实施方案中，在共聚之后，进行间隔基的引入。

在某些实施方案中，首先制备多个官能化的HPMA单体单元。所述官能化的HPMA单体包括：包括用于连接阿仑膦酸盐的间隔基和/或连接基的HPMA单体；包括用于连接TNP-470的间隔基和/或连接基的HPMA单体；和任选地包括用于连接标记试剂的间隔基的HPMA单体。在本文中，这些官能化的HPMA单体单元称为HPMA-衍生的单元。

然后，制备包含阿仑膦酸盐的HPMA衍生的单体，并且任选地在未改性的HPMA单体(当共聚时，其形成“游离”主链单元)的存在下，与其它官能化的HPMA单体共聚。

在某些实施方案中，通过首先制备N-甲基丙烯酰基甘氨酰基甘氨酰基脯氨酰基正亮氨酸单元，接着在其上缀合阿仑膦酸盐，从而得到N-甲基丙烯酰基甘氨酰基甘氨酰基脯氨酰基正亮氨酰基-阿仑膦酸盐单体单元来制备包含阿仑膦酸盐的甲基丙烯酰胺单体。

在某些实施方案中，端接第一反应基团的HPMA-衍生的甲基丙烯酰胺单元包括N-甲基丙烯酰基甘氨酰基甘氨酰基脯氨酰基正亮氨酸单元。

在某些实施方案中，端接第二反应基团的HPMA-衍生的甲基丙烯酰胺单元包括N-甲基丙烯酰基甘氨酰基甘氨酰基单元。

因为将阿仑膦酸盐、标记试剂、间隔基和/或连接基连接至HPMA单元，或者以其它方式在HPMA单元内产生反应基团，涉及与这些单元中的2-羟丙基反应，在本文中，这样的官能化的HPMA单元也称为包含上述部分或基团的甲基丙烯酰胺单元。

如上文所述进行共聚。

然后，将TNP-470偶合至形成的共聚物。

为了保证阿仑膦酸盐的高且可控制的负载量，可以改变步骤顺序，只要在共聚这样的单元之前，将阿仑膦酸盐连接至单体的HPMA单元。

在本文中，术语“官能团”和“反应基团”可互换地使用。因此，“官能化的”单体(单体单元)、寡聚物等描述了具有反应基团的这样的单体、寡聚物等，如本文定义和描述的。

为了将另外的靶向部分引入到进一步包括治疗活性剂比如抗血管生成剂的聚合物缀合物中，本发明人使用了本文描述的一些方法。

因此，本发明人进一步设计并成功地制备和实施了聚合物(例如N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物)、抗血管生成剂(例如TNP-470)和骨靶向试剂寡聚天门冬氨酸(例如D-Asp₈)的新的缀合物。

如在随后的实施例部分中证实的，已经制备了具有连接在其上的TNP-470和D-Asp₈的HPMA共聚物(HPMA共聚物-D-Asp₈-TNP-470；参见图8)。已经通过所述缀合物抑制HUVEC的增殖(参见图10)和抑制血管内皮生长因子(VEGF)-诱导的HUVEC迁移(图11)的能力证实了所述缀合物的抗血管生成活性。

这些结果表明这些缀合物用于治疗骨和骨相关病症(比如以血管生成为特征的癌症和病症)是有利的。

因此，根据本发明的某些实施方案的另一个方面，提供一种聚合缀合物，其包括具有连接在其上的抗血管生成试剂和骨靶向部分的聚合主链，所述骨靶向部分为包括2至100个天门冬氨酸残基的寡聚肽。

术语“抗血管生成试剂”为在上文定义的。

术语“骨靶向部分”描述了在体内给药之后，具有优先聚集在硬组织(即骨组织)而不是任何其它的器官或组织的能力的化合物。

已知天门冬氨酸比如D-天门冬氨酸八肽(D-Asp₈)的寡聚肽在骨中聚集。这些寡聚肽结合羟基磷灰石(HA)，骨的主要成分，从而适于充当骨靶向部分。

如上文定义的，本文描述的天门冬氨酸的寡聚肽包括2至100个天门冬氨酸残基。因此，这样的寡聚肽可以包括 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 等的天门冬氨酸残基。

在某些实施方案中，天门冬氨酸的寡聚肽包括2至20个天门冬氨酸残基。在某些实施方案中，天门冬氨酸的寡聚肽包括8个天门冬氨酸残基(Asp₈)。在某些实施方案中，天门冬氨酸的寡聚肽由8个天门冬氨酸残基(Asp₈)组成。

所述寡聚肽可以进一步包括其它的氨基酸残基，只要其包括一个或更多个由两个或更多个天门冬氨酸残基组成的氨基酸序列。在某些实施方案中，这样的氨基酸序列由2至20个天门冬氨酸残基或8个天门冬氨酸残基组成。

所述天门冬氨酸可以是D-天门冬氨酸和/或L-天门冬氨酸。在某些实施方案中，所述天门冬氨酸是D-天门冬氨酸。

在某些实施方案中，所抗血管生成剂为TNP-470。

在本发明的这些实施方案内容中有用的其它抗血管生成剂包括，但不限于紫杉醇、2-甲氧雌二醇、普啉司他、巴马司他、BAY 12-9566、羧基酰氨基三唑（carboxyamidotriazole）、CC-1088、乙酸右美沙芬、乙酸二甲基呫吨酮、内皮他丁、IM-862、马立马司他、基质金属蛋白酶、青霉胺、PTK787/ZK 222584、RPI.4610、角鲨胺乳酸盐、SU5416、沙立度胺、考布他汀、他莫昔芬、COL-3、新伐司他、BMS-275291、SU6668、抗-VEGF抗体、Medi-522 (Vitaxin II)、CAI、白细胞介素-12、IM862、Amilloride、血管他丁蛋白质，血管他丁K1-3、血管他丁K1-5、卡托普利、DL-α-二氟甲基鸟氨酸、DL-α-二氟甲基鸟氨酸HCl、His-Tag Endostatin? Protein、烟曲霉素、除莠霉素A、维甲酰酚胺(4-hydroxyphenylretinamide)、胡桃醌、层粘连蛋白、层粘连蛋白六肽、层粘连蛋白五肽、薰草菌素A、甲羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、米诺环素、米诺环素HCl、胎盘核糖核酸酶抑制剂、苏拉明、苏拉明钠盐、人血小板凝血酶敏感蛋白、中性粒细胞、针对特异性促血管生成因子和/或其受体的单克隆抗体(例如Avastin、Erbitux、Vectibix、Herceptin)； 多种促血管生成生长因子受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂(例如Tarceva、Nexavar、Sutent、Iressa)；mTOR (雷帕霉素的哺乳动物靶点)的抑制剂(例如Torisel)；干扰素α、β和γ；IL-12；基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(例如COL3、马立马司他、巴马司他)；EMD121974 (Cilengitide) ； Vitaxin； 角鲨胺；COX-2抑制剂；PDGFR抑制剂(例如Gleevec)； NM3和 2-ME2。

在某些实施方案中，所述抗血管生成剂选自紫杉醇、针对特定促血管生成因子和/或其受体的单克隆抗体(例如Avastin、Erbitux、Vectibix、Herceptin)；多种促血管生成生长因子受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂(例如Tarceva、Nexavar、Sutent、Iressa)；mTOR (雷帕霉素的哺乳动物靶点)的抑制剂(例如Torisel)；干扰素α、β和γ；IL-12；基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(例如COL3、马立马司他、巴马司他)；EMD121974 (Cilengitide) ； Vitaxin； 角鲨胺；COX-2抑制剂；PDGFR抑制剂(例如Gleevec)； NM3； 2-ME2和二膦酸盐(例如唑来膦酸盐)。

如本文使用的术语“COX-2抑制剂”指相对抑制酶COX-2优先于COX-1的非甾体药物。COX-2抑制剂的优选的实例包括，但不限于塞来考昔、帕瑞考昔、罗非考昔、伐地考昔、美洛昔康和艾托考昔。

在某些实施方案中，本文描述的聚合缀合物由聚合主链组成，所述聚合主链由多个彼此共价连接的主链单元形成，其中多个主链单元的至少一部分具有连接在其上的如本文描述的抗血管生成剂，多个主链单元的至少另一部分具有连接在其上的骨靶向部分(如本文描述的寡聚天门冬氨酸)。

具有连接在其上的抗血管生成剂的那些主链单元和具有连接在其上的寡聚天门冬氨酸的那些主链单元可以随机地分散在聚合主链内。

所述聚合主链可以进一步包括如下所述非官能化的主链单元，其没有连接抗血管生成剂和寡聚天门冬氨酸。

在某些实施方案中，所述缀合物的聚合主链构成抗血管生成剂和骨靶向部分连接的聚合物(或共聚物)。

适于在本发明实施方案的内容中使用的聚合物优选地生物相容性的、非免疫原性的和无毒的。所述聚合物充当能够特异性递送到肿瘤组织的载体，这可能是由于上文描述的EPR效应。

如本文使用的术语“聚合物”描述由彼此共价连接的多个重复结构单元(主链单元)组成的有机物质。如本文使用的术语“聚合物”包括有机和无机聚合物，进一步包括一种或更多种均聚物、共聚物或其混合物(掺合物)。如本文使用的术语“均聚物”描述由一种类型的单体单元组成的聚合物，因此，其由同源主链单元组成。如本文使用的术语“共聚物”描述由多于一种类型的单体单元组成的聚合物，因此，其由异源主链单元组成。所述异源主链单元的侧基可以彼此不同。

所述聚合物是由聚合相应的单体单元形成的主链单元组成，其中抗血管生成剂和骨靶向部分连接至主链单元的至少一部分。某些或所有的这些主链单元典型地为在缀合之前官能化的，使得具有连接抗血管生成剂和骨靶向部分的反应基团。在本文中，非官能化的和/或没有参与抗血管生成剂和骨靶向部分缀合的那些主链单元称为“游离”主链单元。

所述聚合物可以是生物稳定的聚合物、可生物降解的聚合物或其组合。如在本发明的实施方案内容中使用的术语“生物稳定的”描述在生理条件保持完整的化合物或聚合物(例如，不会在体内降解)。

术语“可生物降解的”描述其可以在生理学条件和/或环境条件下分解成分解产物的物质。这样的生理学条件和/或环境条件包括，例如水解(经由水解裂解而分解)、酶促催化作用(酶促降解)和机械性相互作用。该术语典型地指在这些条件下分解的物质，因此50%重量的物质在短于1年的时期内分解。

如在本发明的实施方案内容中使用的术语“可生物降解的”还包括术语“可生物吸收的”，其描述了在生理条件下分解成分解产物的物质，该分解产物能够被生物吸收到宿主-生物体内，即，变成宿主-生物体的生化系统的代谢产物。

所述聚合物可以是水可溶性的或水不溶性的。在某些实施方案中，所述聚合物在室温下是水可溶性的。

所述聚合物可以进一步是带电聚合物或不带电聚合物。带电聚合物可以是阳离子聚合物，其具有带正电荷基团且在生理学pH下具有正净电荷；或阴离子聚合物，其具有带负电荷基团且在生理学pH下具有负净电荷。不带电聚合物可以具有带正电荷的和带负电荷的基团，在生理学pH下具有中性净电荷，或者可以是不带电荷的。

在某些实施方案中，所述聚合物具有的平均分子量在100 Da至800 kDa的范围内。在某些实施方案中，所述聚合物具有的平均分子量低于60 kDa。在某些实施方案中，所述聚合物的平均分子量范围为10 kDa至40 kDa。

具有分子量高于10 kDa的聚合物典型地显示出如本文描述的EPR效应，而具有分子量为100 kDa和以上的聚合物具有相对长的血浆半衰期和低效的肾清除率。因此，当考虑缀合物的血浆半衰期、肾清除率和在肿瘤中的累积时，可以确定聚合缀合物的分子量。

可以至少在某种程度上通过聚合(或共聚)度控制所述聚合物的分子量。

在本发明的这些实施方案内容中使用的聚合物可以是合成聚合物或天然存在的聚合物。在某些实施方案中，所述聚合物是合成聚合物。

本文描述的聚合物的聚合主链可以来源于例如聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚酰胺、聚氨酯、聚亚胺、多糖、多肽、聚羧酸酯及其混合物。

适用于本发明的实施方案内容中的示例性聚合物包括，但不限于由下述组成的组：葡聚糖、水溶性聚氨基酸、聚乙二醇(PEG)、聚谷氨酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯) (PLA/PLGA)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚甘油、聚酰胺胺(PAMAM)和聚乙烯亚胺(PEI)。

这些聚合物可以具有如本文描述的任何分子量。

在某些实施方案中,所述聚合主链来源于聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)或其共聚物。这样的聚合主链包括具有连接在其上的2-羟丙基基团或已经通过连接在其上(直接地或间接地)的本文描述的部分(寡聚天门冬氨酸和抗血管生成剂)改性的这样的2-羟丙基基团的甲基丙烯酰胺主链单元。

应当理解如本文讨论的聚合物描述了由同源或异源、非官能化的单体单元形成的那些聚合物，组成聚合缀合物的聚合主链对应于这样的聚合物之处在于由相同的单体单元组成，而这些聚合单元的一些是官能化的，如本文描述的。因此，所述聚合缀合物的聚合主链与本文描述的聚合物的那些类似，而与所述聚合物不同之处在于具有连接至其中一些主链单元的上述试剂。

在本文描述的每种缀合物中，骨靶向部分和抗血管生成剂可以各自直接地，或间接地经由连接基部分(在本文中也称为连接基、连接基基团或连接基团)连接到聚合主链的主链单元的相应部分，在某些实施方案中，所述直接键/间接键设计为在表征期望的体内部位的环境（例如某些酶或pH）的条件下可裂解的，如下文详述的。

因此，根据本发明的某些实施方案，抗血管生成剂和骨靶向部分中至少一个经由连接基连接至所述聚合物。在某些实施方案中，抗血管生成剂和骨靶向部分的每种都经由连接基连接至所述聚合物。将抗血管生成剂连接至所述聚合物的连接基和将骨靶向部分连接至所述聚合物的连接基可以相同或不同。

本文描述的连接基指起如下作用的化学部分，其将抗血管生成剂和/或骨靶向部分偶合至所述聚合物，而不会不利地影响骨靶向部分的靶向功能或抗血管生成剂的治疗效果。

在上文中已经详尽地描述了连接基的特征。

在某些实施方案中，抗血管生成剂和骨靶向部分的每种都经由连接基连接至所述聚合物。在这种情况下，连接抗血管生成剂的连接基和连接骨靶向部分的连接基可以相同或不同。

在某些实施方案中，仅仅抗血管生成剂经由可生物降解的连接基连接至所述聚合物，从而在期望的身体部位从该聚合物中释放。

如在随后的实施例部分中证实的，为了将TNP-470连接至所述聚合物，使用可生物降解的连接基-[Gly-Gly-Pro-Nle]-合成TNP-470和D-Asp₈的HPMA共聚物。

如在上文讨论的，一个示例性的连接基是组织蛋白酶K可切割的连接基。

因此，在某些实施方案中，所述连接基为酶可切割的连接基。在某些实施方案中，所述酶可切割的连接基被在肿瘤组织中表达的酶切割。在某些实施方案中，所述酶可切割的连接基被在肿瘤组织中过表达的酶切割。

适用于在本发明的实施方案内容中的示例性的酶包括，但不限于组织蛋白酶B、组织蛋白酶K、组织蛋白酶D、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、legumain、MMP-2和MMP-9。

如在上文讨论的，组织蛋白酶K主要在破骨细胞中表达。因此，在某些实施方案中，所述酶可切割的连接基被组织蛋白酶K切割。

在某些实施方案中，所述可生物降解的连接基包括具有2至10个氨基酸残基的寡聚肽。

如在上文讨论的，为了将TNP-470缀合至HPMA聚合物，本发明人使用了组织蛋白酶K可切割的连接基-[Gly-Gly-Pro-Nle]-(参见图8)。因此，在某些实施方案中，所述连接基包括-[Gly-Gly-Pro-Nle]-。

在某些实施方案中，在本发明的这些实施方案内容中描述的骨靶向经由生物稳定的连接基连接至所述聚合主链。

在某些实施方案中，骨靶向部分经由酶可切割的连接基例如如在上文描述的组织蛋白酶K可切割的连接基连接至所述聚合主链。

在某些情况下，本文描述的缀合物包括能够更有效和更简单地将抗血管生成剂和/或骨靶向部分连接至所述聚合主链的另外的间隔基部分。为了将标记试剂连接至所述缀合物，可以进一步使用间隔基。这样的间隔基已经在上文广泛地描述了。

如在随后的实施例部分中阐述的，为了经由-[Gly-Gly-Pro-Nle]-组织蛋白酶K可切割的连接基将TNP-470缀合至HPMA共聚物，内分散地（intradispersly）使用了包括-[NH-(CH₂)₂-NH]-基团和1-氨基己酰基的间隔基（参见图8）。为了将D-Asp₈和标记试剂FITC连接到所述聚合物，内分散地使用来源于1-氨基己酸的间隔基(参见图8)。

在某些实施方案中，所述缀合物可以进一步包括如本文定义的标记试剂。这样的标记试剂为上文详尽描述的。在某些实施方案中，标记试剂经由如本文描述的间隔基连接至所述缀合物。如在随后的实施例部分中证实的，经由常用于偶合D-Asp₈的间隔基将标记试剂异硫氰酸荧光素(FITC)缀合至HPMA共聚物-D-Asp₈-TNP-470 (参见图8)。

抗血管生成剂和骨靶向部分的负载度可以表示为mol %，如本文定义的。

因此，例如1 mol %负载量的骨靶向部分描述聚合缀合物由100个主链单元组成，其中1个主链单元具有连接在其上的靶向部分，其它99个主链单元为游离的或具有连接在其上的其它试剂。

对于给定的缀合物和给定的用途，基于所述缀合物期望的性质(例如水溶性、治疗效果、药代动力学性质、毒性和剂量要求)和任选地在选择的合成途径中可以连接至聚合主链的缀合部分的量凭经验确定抗血管生成剂和骨靶向部分的最佳负载度。

可以由本领域技术人员通过众所周知的方法测定%负载量，其中一些方法描述在下文中随后实施例部分的材料和方法中。

在某些实施方案中，抗血管生成剂在所述聚合物中的负载量为大于1 mol %。

在某些实施方案中，抗血管生成剂在所述缀合物中的负载量为1 mol %至99 mol %、1 mol %至50 mol %、1 mol %至20 mol %、1 mol %至10 mol %或1 mol %至5 mol %。

在某些实施方案中，骨靶向部分在所述聚合物中的负载量为大于1 mol %。

在某些实施方案中，骨靶向部分在所述缀合物中的负载量为1 mol %至99 mol %、1 mol %至50 mol %、1 mol %至20 mol %、1 mol %至10 mol %或1 mol %至5 mol %。

在具有在其上缀合的抗血管生成剂的聚合主链中的主链单元的数量在本文中定义为“a”，在具有在其上缀合的骨靶向部分的聚合主链中的主链单元的数量在本文中定义为“b”，在该聚合主链中的游离主链单元(其不结合另外的部分)的数量在本文中定义为“d”。

因此，在某些实施方案中，本文描述的缀合物可以由通式I表示：

其中：

a为具有使得x/(x+y+w)乘以100在0.01至99.9范围内的值的整数；

b为具有使得y/(x+y+w)乘以100在0.01至99.9范围内的值的整数；和

d为具有使得w/(x+y+w)乘以100在0.01至99.9范围内的值的整数；

A₁、A₂和A₃为彼此共价连接且形成聚合主链的每个主链单元，其中：

B为如在上文定义的抗血管生成剂；

D为如在上文定义的骨靶向部分；和

每个L1和L2独立地为如在上文定义的连接基；

使得[A₂-L₁-B]为具有连接在其上的抗血管生成剂的主链单元；和

[A₃-L₂-D]为具有连接在其上的骨靶向部分的主链单元；

其中[A₁]、[A₂-L₁-B]和[A₃-L₂-D]中的每个为连接[A₁]、[A₂-L₁-B]和[A₃-L₂-D]之一的端基主链单元，或连接[A₁]、[A₂-L₁-B]和[A₃-L₂-D]中至少两个，并且A₁、A₂和/或A₃彼此连接从而形成聚合主链。

在其中聚合缀合物来源于HPMA的实施方案中，A₁为羟基丙基甲基丙烯酰胺单元；A₂和A₃为甲基丙烯酰胺单元，如在上文讨论的。

在某些实施方案中，本文描述的缀合物可以由通式IIa表示：

其中a、b和d为如本文定义的。

在某些实施方案中，所述缀合物具有下述结构：

其中a和b各自独立地为具有使得a/(a+b+d)乘以100和/或b/(a+b+d)×100在0.01至15范围内的值的整数；d为具有使得d/(a+b+d)乘以100在70至99.9范围内的值的整数。

应当理解，可以通过选择用于形成聚合缀合物的相应单体单元的摩尔比随意地控制a、b和d。

根据本发明的某些实施方案的另一个方面，提供一种制备本文描述的缀合物的方法。根据该实施方案，所述方法包括是通过如下步骤进行的：

(a) 共聚所述聚合主链的多个单体单元，其中所述多个的一部分包括端接第一反应基团的单体单元，所述多个的另一部分包括端接第二反应基团的单体单元，从而得到包括含有多个主链单元的聚合主链的共聚物，其中所述主链单元的一部分具有所述第一反应基团，所述主链单元的另一部分具有所述第二反应基团，所述第一反应基团能够与所述抗血管生成剂反应，所述第二反应基团能够与所述骨靶向部分反应；

(b) 经由第一种反应基团将所述骨靶向部分偶合至所述共聚物，从而得到包含骨靶向部分的共聚物；和

(c) 经由第二反应基团将所述抗血管生成剂偶合至所述共聚物；从而得到所述缀合物。

如在整个本文中使用的术语“聚合物的寡聚单元”或简单的“寡聚单元”描述由2-50个主链单元组成的聚合物。因此，本文描述的缀合物的聚合主链可以通过共聚如在上文描述的官能化的单体单元和组成主链的非官能化的单体单元或寡聚单元来构建。

在某些实施方案中，可以首先聚合每种官能化的单体单元，以便形成具有多个第一反应基团的官能化的寡聚物和具有多个第二反应基团的官能化的寡聚物，这些寡聚物被相互和与非官能化的寡聚单元或单体单元共聚合。

在某些实施方案中，聚合仅仅一个官能化的单体单元以便形成官能化的寡聚物，然后，将其与其它官能化的单体单元和非官能化的单体单元或寡聚单元共聚。

如在整个本文中使用的术语“官能化的”描述端接一个或更多个反应基团的单体或寡聚物。

如在整个本文使用的“反应基团”描述能够与另外的基团反应以便形成化学键，典型地为共价键的化学基团。任选地，形成离子键或配位键。

反应基团定义为与期望连接的试剂或部分的反应基团化学相容。例如，羧基是一种适于缀合端接胺基的试剂或部分的反应基团，反之亦然。

反应基团可以固有地存在于单体单元、寡聚单元和/或骨靶向部分及抗血管生成剂中，或者是通过化学改性其中的化学基团，或利用将这些化学基团连接到端接如本文描述的期望的反应基团的间隔基或连接基上在其中产生的。

可以通过本领域已知的任何聚合方法，使用本领域已知的合适的聚合引发剂或任何其它催化剂来进行本文描述的单体或寡聚物的共聚。

如在上文讨论的，已经表明经由可逆的加成-裂解链转移(RAFT)技术共聚产生具有低多分散指数和小的平均尺寸分布的缀合物。

因此，在某些实施方案中，经由如在随后的实施例部分中示例的可逆的加成-裂解链转移(RAFT)技术进行共聚。

在某些实施方案中，在缀合骨靶向部分之前，将抗血管生成剂缀合至所述聚合物。在某些实施方案中，在缀合抗血管生成剂之前，将骨靶向部分偶合到所述聚合物。

可以在其上进行相应缀合之前，保护第一和第二反应基团的每种。在此情况下，所述方法进一步包括在相应的缀合之前使每种反应基团脱保护。

这允许将例如抗血管生成剂控制性缀合至包括可生物降解的连接基的那些主链单元。

应当理解，用于将抗血管生成剂和/或骨靶向部分偶合至所述聚合物所使用的单体单元、间隔基和连接基设计用于使平稳有效地缀合相应的部分和获得所得到缀合物的最佳性能，如在上文详尽讨论的。

因此，在某些实施方案中，所述方法进一步通过制备包括第一和第二反应基团的单体单元或寡聚单元来进行。

在某些实施方案中，制备具有连接在其上的间隔基的单体单元，所述间隔基端接保护的第一反应基团。示例性的这样的单体单元为具有连接在其上的保护的Gly-Gly基团的甲基丙烯酰胺单元(来源自HPMA，如本文定义的)。

类似地，制备具有连接在其上的连接基和任选的间隔基的单体单元，所述间隔基端接保护的第二反应基团。

形成所形成的聚合物一部分的上述单体单元和非官能化的单体单元或寡聚单元之间的比例至少部分地确定所形成的缀合物中相应骨靶向部分和抗血管生成部分的摩尔比。

共聚具有反应基团的单体单元和/或寡聚单元得到具有第一和第二反应基团(任选地用相应的保护基保护)的官能化的聚合物。

在某些实施方案中，在缀合至官能化的聚合物之前，改性骨靶向部分和/或抗血管生成部分，以便包括分别与官能化的聚合物的第一和第二反应基团相容的反应基团。

可以在将其缀合至官能化的聚合物之前，利用将间隔基和/或连接基连接至骨靶向部分和/或抗血管生成剂进行这样的改性。

因此，在某些实施方案中，所述方法进一步通过制备这样的改性的骨靶向部分和/或抗血管生成剂来进行。

设计在所述聚合主链和缀合于其的部分之间插入的连接基和/或间隔基，以便显示出与其相关的在上文详尽描述的性质。

类似地，本文描述的方法的实施方案还用于本文描述的其它方法(例如，用于制备如本文描述的HPMA-共聚物-阿仑膦酸盐-TNP-470缀合物)。

所述间隔基的长度和组成可以根据空间考虑而变化，并且可用于从聚合物间隔血管生成试剂和/或骨靶向部分，从而能够容易地合成缀合物和/或改善所形成的缀合物的性质，如在上文详述的。

在某些实施方案中所，所述方法进一步包括将如本文定义的标记试剂连接到所形成的缀合物。所述标记试剂可以连接至任一个官能化的单体单元，之后共聚或连接至所形成的共聚物。

在某些实施方案中，将所述标记试剂与骨靶向部分同时连接至所述共聚物。可选地，在连接骨靶向部分和/或抗血管生成剂之前或之后，连接所述标记试剂。

在某些实施方案中，所述方法包括一起共聚本文描述的官能化的和非官能化的单体单元或寡聚单元、端接第三反应基团的单体单元，所述第三反应基团用于将如本文描述的标记试剂或任何其它另外的部分缀合于其。

因此，在本发明的任一个实施方案中描述的每种缀合物可以进一步包括缀合在其上的另外的部分。这样的另外的部分可以缀合在所述聚合主链之内或整个所述聚合主链的单体单元，或者连接在所述聚合主链的一端或两端。

这样的另外的部分可以是如本文描述的标记试剂，或另外的靶向部分或另外的治疗活性剂，其可以改善所形成缀合物的性质。这样的另外的部分可以进一步是改善形成的缀合物的溶解性、生物利用度和/或任何其它期望特征的部分。

在上文描述的缀合物可以作为原态、或作为其可药用盐、对映异构体、非对映异构体、溶剂化物、水合物或前药制备、给药或者以其它方式用于本发明的实施方案的任一个方面中。

术语“可药用盐”指母体化合物的带电种类及其抗衡离子，其典型地用于改善母体化合物的溶解性特征和/或减少母体化合物对生物体的任何显著刺激，而不会破坏给药化合物的生物活性和性质。中性形式的化合物优选地通过如下方式再生：用碱或酸接触所述盐，并按照常规方式分离母体化合物。母体形式的化合物与各种盐形式在一些物理性质方面，比如在极性溶剂中的溶解度不同，但是在其他方面，所述盐与用于本发明的目的的母体形式的化合物相当。

术语“可药用盐”指包括用相对无毒的酸或碱制备的部分和/或缀合物的盐，其取决于在本文描述的化合物上的特定取代基。当根据本发明的实施方案的缀合物包含相对酸性的官能度时，可以通过用足量期望的碱（纯的或在合适的惰性溶剂中）接触中性(即非电离的)形式的这样的缀合物获得碱加成盐。可药用碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨盐或镁盐，或类似的盐。当根据本发明的实施方案的缀合物包含相对碱性的官能度时，可以通过用足量期望的酸（纯的或在合适的惰性溶剂中）接触中性形式的这样的缀合物获得酸加成盐。可药用酸加成盐的实例包括，但不限于来源于如下无机酸的那些，比如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸（monohydrogencarbonic）、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等，以及来源于如下相对无毒的有机酸的盐，如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、软木酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。还包括氨基酸的盐，比如精氨酸盐等，和有机酸如葡糖醛酸或galactunoric acids的盐等(参见例如 Berge等人，"Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19)。本发明的一些具体的缀合物同时包含碱性和酸性官能度，其能够使所述缀合物转变成碱或酸加成盐。

中性形式的缀合物优选地通过如下方式再生：用碱或酸接触所述盐，并按照常规方式分离母体缀合物。母体形式的缀合物与各种盐形式在一些物理性质方面，比如在极性溶剂中的溶解度不同，但是在其他方面，所述盐与用于本发明的目的的母体形式的缀合物相当。

在一个实例中，使用阿仑膦酸盐的可药用盐。一种示例性的这样的盐是阿仑膦酸钠。因此，包含阿仑膦酸盐的缀合物可以包括阿仑膦酸盐的钠盐。

在另一个实例中，使用天门冬氨酸的可药用盐。

术语“前药”指在体内转变成活性化合物(有效的母体药物)的试剂。前药典型地用于促进母体药物的给药。在药物组合物中，与母体药物相比，前药还可以具有改善的溶解度。前药还通常用于获得活性化合物在体内的持续释放。

本文描述的缀合物可以具有不对称的碳原子(光学中心)或双键；消旋体、非对映异构体、几何异构体和各个异构体都包括在本发明实施方案的范围内。

如本文使用的术语“对映异构体”描述仅仅通过彼此完全倒置/反射(镜像)与其对应物是可重合的化合物的立体异构体。对映异构体被认为具有“手性”，因为它们指彼此像左右手。除了当存在于其独立具有手性的环境比如所有的生物系统中时，对映异构体具有相同的化学及物理性质。

本文描述的缀合物可以以非溶剂化的形式和溶剂化的形式存在，包括水合形式。通常，所述溶剂化的形式相当于非溶剂化的形式，都包括在本发明的范围内。

术语“溶剂化物”指可变化学计量（例如二、三、四、五、六等）的复合物，其是由溶质(本文描述的缀合物)和溶剂形成的，其中溶剂不会干扰溶质的生物活性。合适的溶剂包括例如乙醇、乙酸等。

术语“水合物”指如在上文定义的溶剂化物，其中溶剂为水。

本发明的某些缀合物可以以多种晶形或非晶形形式存在。通常，对于本发明涉及的应用，所有的物理形式都是相等的，意图都在本发明的范围内。

如在上文讨论的，本文描述的缀合物(在整个本文中也称为聚合缀合物)包括骨靶向部分阿仑膦酸盐或天门冬氨酸的寡聚肽，其能够将所述缀合物靶向至骨和骨相关结构。由于总体上来说，连接到所述聚合物和形成的缀合物的部分显示出抗血管生成/抗增殖活性，本文描述的每种缀合物可以有利地用于治疗骨及骨相关疾病和病症。

因此，根据本发明的某些实施方案的另一个方面，提供治疗需要其的受试者中的骨相关疾病或病症的方法。这些方法是通过向受试者给药治疗有效量的本文描述的任一个缀合物来进行。

因此，根据本发明的某些实施方案的另一个方面，提供任一个本文描述的缀合物作为药物的用途。在某些实施方案中，所述药物用于治疗骨相关疾病或病症。

根据本发明的某些实施方案的另一个方面，本文描述的缀合物被鉴定用于治疗骨相关疾病或病症。

如本文使用的术语“方法”指完成给定任务的方式、手段、技术和过程，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知，或他们从已知的方式、手段、技术和过程容易开发的那些方式、手段、技术和过程。

术语“骨相关疾病或病症”描述其中骨形成、沉积或再吸收异常的疾病或病症，特别是以过度血管生成为特征的那些。术语“骨相关疾病或病症”还包括由骨相关疾病或病症发展的存在于除了骨之外的身体部位的疾病和病症，比如例如转移到另一个器官的骨癌，及在其它身体部位中发展和影响骨组织的疾病和病症。

骨相关疾病和病症包括，但不限于骨癌和骨癌转移、由于骨转移引起的骨质减少、牙周病、类风湿性关节炎中的关节周围糜烂、佩吉特病、恶性高血钙症、骨转移产生的溶骨性病变、癌症治疗引起的骨异常和骨质增生。

如本文使用的术语“治疗”包括废除(abrogation)、基本上抑制、减慢或逆转状况的发展，基本上改善状况的临床症状或美学症状，或者基本上预防状况的临床症状或美学症状的出现。当所治疗的疾病是骨癌时，该术语包括肿瘤生长或转移的任何抑制、或抑制、减慢或废除肿瘤生长或转移的任何尝试。

在本文中，应当注意经由本文描述的方法靶向抗血管生成剂，由于所述缀合物选择性针对骨组织，实质上减少了抗血管生成剂的毒性。因此，除了在临床明显的疾病中使用本文描述的缀合物任选与其它药物的组合之外，这些缀合物可以潜在地用作处于由于后遗的休眠癌症（residual dormant cancers）引起复发危险的个体的长期预防药。作为一个实例，无毒的靶向缀合物用于治疗处于骨肉瘤复发危险的无症状个体的应用可能导致癌症治疗中主要模式由目前方法的变化，其中通常未开始治疗，直到骨相关疾病比如骨肉瘤变成临床明显的。

如本文使用的术语“受试者”(可选地在本文中称为“患者“)指动物，优选哺乳动物，最优选人类，其为治疗、观察或试验的对象。

如在随后的实施例部分中证实的和在上文详尽讨论的，已经表明本文描述的缀合物抑制血管生成以及细胞增殖，因而可以用于治疗以病理性过度血管生成为特征的骨相关疾病和病症，其中抑制血管生成和/或细胞增殖是有利的。

因此，在某些实施方案中，所述骨相关疾病或病症与血管生成相关。

肿瘤生长和转移特别取决于血管生成的程度。肿瘤血管生成是渗透到癌性肿瘤的血管的网状结构增殖，从而提供营养物和氧及除去废物，因此导致肿瘤生长。肿瘤血管生成包括致癌基因的激素刺激和活化、血管生成生长因子的表达、血浆蛋白质的外渗、暂时性细胞外基质(ECM)的沉积、ECM的降解、及内皮毛细血管的迁移、增殖和延长。因此，抑制进一步的血管扩张是有效地研究癌症治疗的焦点。

因此，在某些实施方案中，所述骨相关疾病或病症选自骨癌转移和骨癌。

术语“癌症”和“肿瘤”在本文中可互换地使用，描述其中一群细胞显示出不受控制的生长(分裂超过了正常限制)的一类疾病。术语“癌症”包括恶性肿瘤和良性肿瘤以及由原发性和继发性肿瘤发展的疾病和状况。术语“恶性肿瘤”描述具有如下特征的肿瘤：其生长不受自我限制，能够侵入相邻的组织，并且可以能够扩散到远端组织(转移)。术语“良性肿瘤”描述非恶性的肿瘤(即，不会以无限、侵袭性方式生长，不会侵入周围组织和不会转移)。术语“原发性肿瘤”描述在其首先出现的原始部位的肿瘤。术语“继发性肿瘤”描述由其生长的原始(原发)部位扩散到接近或远离原发部位的另一个部位的肿瘤。

术语“骨癌”描述来源于骨组织的肿瘤。如本文使用的术语“骨癌”进一步包括位于接近骨结构的组织和与骨相关的组织比如软骨、骨腔和骨髓中的肿瘤。术语“骨癌”进一步包括由骨细胞(即原发肿瘤)以及具有从位于骨的原发肿瘤“离开”、“漏出”或“溢出”的癌细胞发展的，进入淋巴管和/或血管，在淋巴系统和/或血流中循环，在身体的另外正常组织内固定和增殖，从而发生继发性肿瘤的癌症。例如，来源于骨肉瘤的转移可以经常在肺和其它器官中发现。这些损伤产生类骨质，因此可以成为如本文描述的骨靶向部分的靶点。

骨癌通常主要在臂骨和腿骨中发现，但是其可以存在于任何骨中。

骨癌也称为肉瘤。根据其中肿瘤发展的骨组织的种类，将骨的肉瘤分为几种类型。根据本发明的实施方案可治疗的示例性类型的骨癌包括，但不限于骨肉瘤、尤因肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性巨细胞瘤和脊索瘤。

骨肉瘤是原发性骨癌的最常见类型，归类为其中肿瘤直接产生缺损的类骨质(未成熟骨)的恶性间质肿瘤。其是一种最通常在长骨的干骺端出现的血管多且非常有害的恶性肿瘤。提出了一些策略，比如基于免疫的治疗、肿瘤抑制剂或自杀基因治疗或通常不用于骨肉瘤的抗癌药[Quan等人，Cancer Metastasis Rev 2006; 10: 707-713]。然而，仍然有三分之一的患者死于这一毁灭性癌症，对于患有不能切除的疾病的患者，没有治愈性全身治疗。

术语“骨转移”描述发展于位于除了骨之外的身体部位的原发性肿瘤，但是转移至骨的癌症(即，继发性肿瘤)。通常转移或扩散到骨的癌症包括乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、前列腺癌、某些脑癌和肾脏癌。

例如,前列腺癌是工业化国家中最常见的男性癌症，并且是男性癌症死亡的第二个主要原因。前列腺癌主要转移到骨骼，但是其它器官部位也受到影响，包括肺、肝和肾上腺。在患有晚期转移性疾病的患者中，骨转移的发病率为约70 %。骨转移与相当大量的骨胳病症相关，包括严重的骨痛、病理性骨折、脊髓或神经根压迫和恶性肿瘤的高血钙症。

如在上文讨论的，可以进一步使用本文描述的缀合物监测骨相关疾病或病症。在这种情况下，所述缀合物进一步包括如本文定义的标记试剂，使用众所周知成像技术，其可用于容易地检测患者体内的缀合物。例如，在所述骨相关疾病或病症是骨癌的情况，如通过标记试剂信号的水平评价的缀合物的检测可以起检测除了骨之外的身体部位中骨癌转移的作用。

因此，根据本发明的某些实施方案的另一个方面，提供监测受试者中骨相关疾病或病症的方法。根据该本发明的这些实施方案的方法是通过如下方式进行的：向受试者给药任一种本文描述的缀合物，所述缀合物具有如本文描述的连接至所述聚合物的标记试剂，并且应用成像技术监测所述缀合物在身体或其部分内的分布。

因此，根据本发明的某些实施方案的另一个方面，提供具有如本文描述的标记试剂的任一种本文描述的缀合物作为诊断试剂和/或在制备用于监测骨相关疾病或病症的诊断试剂中的用途。

根据本发明的某些实施方案的另一个方面，包括标记试剂的本文描述的每种缀合物被鉴定用作监测骨相关病原或病症的诊断试剂。

合适的成像技术包括，但不限于正电子发射断层摄影术(PET)、γ-闪烁扫描术、磁共振成像(MRI) 、功能性磁共振成像(FMRI)、脑磁波描记术(MEG)、单光子发射计算机化断层摄影术(SPECT)、计算机控制轴向x线断层摄影术(CAT)扫描、超声、荧光检查和常规X-射线成像。合适的成像技术的选择取决于标记试剂的性质，其都在本领域技术之内。例如，如果标记试剂包括Gd离子，则合适的成像技术为MRI；如果标记试剂包括放射性核素，则合适的成像技术为γ-闪烁扫描术；如果标记试剂包括超声试剂，则超声为合适的成像技术等。

根据本发明的另一个方面，提供一种药物组合物，其包括作为活性成分的任一种本文描述的缀合物和可药用载体。

因此，在本文描述的任一种方法和用途中，任一种本文描述的缀合物可以作为本身或者作为药物组合物（其中所述缀合物与可药用载体混合）的一部分向个体提供。

如本文使用的“药物组合物”指一种或更多种本文描述的缀合物（作为活性成分）、或其生理学可接受的盐或前药，与其它化学成分的制剂，所述其它化学成分包括，但不限于生理学合适的载体、赋形剂、润滑剂、缓冲剂、抗菌剂、填充剂(例如甘露醇)、抗氧剂(例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠)、抗炎剂、抗病毒剂、化疗剂、抗组胺等。药物组合物的目的是促进向受试者给药化合物。术语“活性成分”指负责生物效应的化合物。

术语“生理学可接受的载体”和“可药用载体”可以可互换地使用，指不会引起对生物体的显著刺激且不会废除给药化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。

本文中的术语“赋形剂”指加入到药物组合物中以进一步促进给药药物的惰性物质。赋形剂的实例包括，但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

制剂和给药药物的技术可以在“Remington’s Pharmaceutical Sciences” Mack Publishing Co., Easton, PA，最新版本中找到，将其通过援引引入本文。

因此，根据本发明所用的药物组合物可以使用一种或更多种可药用载体以任何常规的方式配制，所述载体包括促进化合物加工成可药用制剂的赋形剂和助剂。合适的制剂取决于选择的给药途径。剂量可以根据应用的剂型和使用的给药途径变化。精确的制剂、给药途径和剂量可以由各个医师根据患者的情况来选择(参见，例如 Fingl等人，1975,  “The Pharmacological Basis of Therapeutics”中, Ch. 1 p.1)。

所述药物组合物可以配制成用于一种或更多种途径给药，取决于选择局部或全身治疗或给药，及待治疗的面积。可以通过口服，通过吸入，或肠胃外，例如通过静脉滴注或腹膜内、皮下、肌内或静脉注射，或局部(包括眼部、阴道、直肠、鼻内)进行给药。

用于局部给药的制剂可以包括，但不限于洗剂、软膏剂、凝胶剂、乳膏剂、栓剂、滴剂、液体剂、喷雾剂和粉剂。常规药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等都可能是必需的或期望的。

用于口服给药的组合物包括粉剂或颗粒剂、混悬剂或水溶液或非水介质、小药囊、丸剂、小胶囊、胶囊或片剂。增稠剂、稀释剂、矫味剂、分散助剂、乳化剂或粘合剂可能是期望的。

用于肠胃外给药的制剂可以包括，但不限于其还可以包含缓冲液、稀释剂及其它合适添加剂的无菌溶液。对于治疗，缓慢释放组合物也是预期的。

要给药的组合物的量当然取决于待治疗的受试者、痛苦的严重性、给药方式、开处方医师的判断等。

所述药物组合物可以进一步包括另外的药学活性或非活性试剂，比如但不限于抗菌剂、抗氧剂、缓冲剂、填充剂、表面活性剂、抗炎剂、抗病毒剂、化疗剂和抗组胺。

根据某些实施方案，本文描述的组合物包装在包装材料中，并且在所述包装材料中或其上的印刷中被鉴定用于治疗骨相关疾病或病症。

根据本发明的其它实施方案，所述药物组合物包装在包装材料中，并且在所述包装材料中或其上的印刷中被鉴定用于监测骨相关疾病或病症。

如果期望，本发明的组合物可以存在于包装或分配器装置中，比如FDA批准的试剂盒，其可以包含一种或更多种含有活性成分的单位剂型。所述包装可以例如包括金属箔或塑料箔，比如泡罩包装。所述包装或分配器可以附有给药说明。包装或分配器也可容纳有由管理药物的制备、使用或销售的政府机构规定形式的与容器相关的提示，其反映了该机构批准了组合物形式或者人或兽用给药。例如，这样的提示可以具有美国食品和药品管理局批准的处方药物标签或者是批准的产品插入物。

在任一种本文描述的方法、用途和组合物中，本文描述的缀合物可以与另外的治疗活性剂组合使用。这样的另外的试剂包括，作为非限制性实例，化疗剂、抗血管生成剂、激素、生长因子、抗生素、抗微生物剂、抗抑郁剂、免疫刺激剂和可以提高所述缀合物的治疗效果和/或待治疗受试者的状态的任何其它试剂。

术语“包括”、“包含”、“具有”及其同根词指“包括但不限于”。

术语“由...组成”指“包括且局限于”。

术语“基本上由...组成”指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部件，但是条件是另外的成分、步骤和/或部件不会实质上改变所要求组合物、方法或结构的基本特征和新特征。

如本文使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有清楚的规定。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

在本申请中，本发明的各个实施方案可以以范围形式存在。应当理解范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，其不应当被看作是本发明范围的固定限制。因此，范围的描述应当被认为是特别地公开了所有可能子范围以及该范围内的独立数值。例如，范围比如1至6的描述应当被认为是特别地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的独立数字，例如1、2、3、4、5和6。该应用与范围的宽度无关。

每当本文指定数值范围时，其意味着包括该指定范围内任何引用的数值(分数或整数)。术语“介于第一个指定数值和第二指定数值之间”及“范围从第一个指定数值至第二指定数值”在本文中可互换地使用，意味着包括第一个指定数值和第二指定数值，以及所有其中的分数和整数。

应当理解用于清楚地描述单独实施方案内容的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反地，用于简洁地描述单个实施方案内容的本发明的各种特征也可单独提供或者以任何合适的子组合提供，或合适地提供在本发明的任何其它描述的实施方案中。在各种实施方案内容中描述的某些特征不能被认为是那些实施方案的基本特征，除非在没有那些要素下所述实施方案不能起效。

如在上文描绘的和如在下述权利要求书部分中要求的本发明的各种实施方案和方面得到了下述实施例的试验支持。

实施例

现在，参考下述实施例，这些实施例与上面的描述一起，以非限定性方式阐述本发明。

材料和方法

材料：

在氩气或氮气氛下进行需要无水条件的所有反应。

化学品和溶剂为A.R.级或者通过标准技术纯化的。

薄层色谱(TLC)：硅胶板Merck 60 F₂₅₄；通过用紫外线灯照射和/或用磷钼酸溶液(在乙醇中20 % wt.)处理，接着加热显影化合物。

快速色谱(FC)：硅胶Merck 60 (粒径0.040-0.063 mm)，洗脱液在括号中给出。

组织蛋白酶K抑制剂III购自Calbiochem, Germany。

鬼笔环肽-TRITC缀合物，碘化丙啶和羟基磷灰石(HA) 购自Sigma-Aldrich, Israel。

阿仑膦酸盐购自Alcon Biosciences, India。

超纯的重蒸馏水(DDW)购自Biological Industries, Israel。

Antifade^? 封固剂来自 Biomeda。

Alexa^? Fluor 594 人转铁蛋白来自 Molecular Probes^TM。

过氧化物酶阻断剂购自Merck, Germany。原发性大鼠抗-鼠科动物CD34抗体(MEC 14.7)购自Abcam, (Cambridge, MA)。兔子抗大鼠抗体、抗兔子辣根过氧化酶-缀合抗体(ABC检测试剂盒)和ImmPACT? DAB稀释剂试剂盒购自Vector Laboratories, CA, USA。

Boyden室8μm来自Transwell-Costar Corporation.。

Hema 3染色剂系统来自Fisher Diagnostics。

EGM-2培养基来自Cambrex，USA，内皮细胞生长添加剂(ECGS)来自Zotal, Israel。

所有其它化学试剂，包括盐和溶剂，购自Sigma-Aldrich。

按照Tel Aviv University, Sackler School of Medicine指南和Institutional Animal Care and Use Committee.批准的试验设计进行所有动物程序。每周测量小鼠的体重和肿瘤尺寸三次。

mCherry-感染的MG-63-Ras人骨肉瘤细胞系的产生：

将mCherry从pART7-mCherry中亚克隆到pQCXIP (Clontech)中。用pQC-mCherry和相容性包装质粒(pMD.G.VSVG和pGag-pol.gpt)共转染人胚肾293T (HEK 293T)细胞。在转染后四十八小时，收集包含pQC-mCherry逆转录病毒颗粒的上清液。用逆转录病毒颗粒培养基感染MG-63-Ras人骨肉瘤细胞，在传染后48小时，通过嘌呤霉素耐药性选择mCherry阳性细胞。

细胞培养：

Saos-2人骨肉瘤细胞是从American Type Culture Collection（ATCC）获得的。在补充有10 %胎牛血清(FBS)、100μg/ml青霉素、100 U/ml链霉素、12.5 U/ml制霉菌素和2 mM L-谷氨酰胺(Biological Industries, Israel)的Dulbecco's改性伊格尔培养基(DMEM)中培养细胞。细胞在37℃下，在5 % CO₂中生长。如之前描述的获得原始人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分离[Larrivee等人，Methods Mol Biol 2005; 290: 315-329]。在内皮细胞培养基-2 (EGM-2培养基；Cambrex, USA)中培养细胞，并且在37℃下，在5 % CO₂中生长。

细胞增殖测定：

将HUVEC以10,000个细胞/孔平板接种在补充有5 % FBS的EBM-2中的24-孔培养板上，孵育24小时(37℃；5 % CO₂)。用补充有1 %内皮细胞生长添加剂(ECGS)的2.5 %内皮细胞基础培养基-2 (EBM-2)替换培养基。将人骨肉瘤Saos-2或MG-63-Ras细胞以2500个细胞/孔平板接种在补充有5 % FBS的DMEM中，并孵育24小时(37℃；5 % CO₂)。然后，用补充有10 % FBS的DMEM替换培养基。将细胞暴露于ALN，TNP-470和HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物，或等量浓度的游离ALN和TNP-470的组合的系列稀释液。也在有或者没有1μm的组织蛋白酶-K抑制剂III下孵育HUVEC。在存在或不存在生长因子下，生长对照细胞。在孵育72小时之后，分别通过Z1 Coulter^? Particle Counter (Beckman Coulter?)或XTT试剂计数HUVEC或Saos-2活细胞。

ALN和TNP-470药物组合处理的等效线图：

IC₅₀代表在体外50 %抑制所需药物的浓度。收集来自HUVEC增殖测定的用ALN、TNP-470及其各自的组合处理的IC₃₀、₅₀、₇₀值。将TNP-470和ALN的IC₃₀、₅₀、₇₀值标分别在X、Y轴上，在每个抑制浓度(IC)之间划出代表叠加效应的线。根据如之前描述的[Chou T.C. Pharmocol Rev 2006; 58:621-681]经典等效线图等式CI=[(D)₁/(Dx)₁]+[(D)₂/(Dx)₂] 计算每种处理的组合指数(CI) 。每个IC加合线右侧的面积代表拮抗效果，而左侧代表协同效果。

HPMA-ALN-TNP-470缀合物的特征：

(a) ALN含量的测定：

使用ALN和Fe³⁺离子在高氯酸溶液中形成的发色团复合物来通过分光光度法以分光光度测定ALN含量。简而言之，将0.1 ml的缀合物(浓度2-10 mgram/ml)与0.1 ml的4 mM FeCl₃和0.8 ml的0.2 M HClO4混合，相对于空白，测量在300 nm的吸光度。使用浓度范围0-3 mM的ALN溶液制备校正曲线。

(b) TNP-470含量的估计：

假定TNP-470结合是定量的，由HPMA-共聚物-ALN-NH₂前体(显示在图1中，中间的结构)中NH₂基团的含量估计TNP-470的含量。通过茚三酮方法，使用含胺单体(N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺)作为校准试样测定NH2基团的含量(由 Duncan, 等人，J Control Release 2001;74: 135-146修改的)。

(c) FITC含量的测定：

使用在0.1 M硼酸盐缓冲液中的 ε 80000 M-1 cm-1以分光光度测量FITC的含量。

(d) HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物分子量和多分散指数(PDI)的测定：

使用AKTA/FPLC系统(Pharmacia/GE Healthcare)，Superose 12 HR10/30柱，缓冲液0.1乙酸盐+30 %乙腈，pH 5.5，流速0.4 ml /分钟；UV和RI检测，进行尺寸排阻色谱对聚合物-药物分子量分布的测定。由SEC特征评价重均摩尔质量(Mw)，根据式M_w/M_n计算PDI。使用窄多分散性polyHPMA级分校正柱。

(e)HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物尺寸分布的定量评价

使用实时粒子分析器(NANOSIGHT LM20^TM)评价缀合物的平均流体动力直径，所述实时粒子分析器包含固态的单模激光二极管(＜20 mW，655 nm)，该单模激光二极管装配用于发射细的聚焦光束穿过500μl样品室。将HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中至最终浓度为0.5、1和2mg/mL。然后，然后通过注射器将样品注射到室中，使其平衡至单位温度(23℃) 30秒。通过电荷耦合装置(CCD)照相机以640×480分辨率按30帧/秒(fps)显影微粒动力学60秒。使用纳米微粒轨迹分析(NTA) 软件分析所述微粒随时间进行布朗运动的路径。分别测定每个微粒的扩散系数和由此的球形等效流体动力学半径，产生粒径分布图。对每个样品测量三次，一式三份，结果代表平均直径。

羟基磷灰石结合测定：

为了评价HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物结合骨矿物质的能力，评价其结合羟基磷灰石(HA)的效力。将HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS), pH 7.4 (1 mg/ml)中。用在500μlPBS, pH 7.4中的羟基磷灰石粉末(15 mg)孵育缀合溶液(500μl)。使用HPMA共聚物-Gly-Phe-Leu-Gly作为对照。以6000 RPM离心孵育的样品3分钟，在选择的时间点收集来自上层的样品（100μl）。使用 FPLC分析（使用HighTrap脱盐柱(Amersham^?）)检测样品中未结合的缀合物 (FPLC条件： AKTA? Purifier^?，流动相100 % DDW，2 ml /分钟，215 nm)。使用Unicorn^? AKTA?软件进行缀合物的羟基磷灰石结合动力学分析。在每个时间点，由色谱仪计算曲线下面积(AUC)。将每个羟基磷灰石孵育的缀合物色谱的AUC标准化至在没有用作对照的羟基磷灰石下缀合物样品的AUC %。

HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物的细胞内转运：

对于所有的试验，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和Saos-2人骨肉瘤细胞接种在35 mm培养皿中的无菌13 mm 盖玻片上，24小时之后用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物孵育，并静置达到90 %融合。然后，用10μM FITC-HPMA共聚物ALN-TNP-470缀合物孵育HUVEC和Saos-2细胞12小时。在孵育之后，用冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤几次，在室温(RT)下，用3.5 %低聚甲醛固定15分钟，并用PBS再次洗涤。为了复染法，用0.1 % Triton-X100透化细胞3分钟，并再次用PBS洗涤。为了HUVEC对FITC-标记的HPMA共聚物ALN-TNP-470缀合物的细胞摄取的共焦成像，使用碘化丙啶(10μg/ml)标记细胞核，并用Antifade^?封固剂封固盖玻片。可选地，使用鬼笔环肽-TRITC缀合物(50μg/ml，在RT下40分钟)标记肌动蛋白丝，通过包含Vectashild^? DAPI的培养基封固盖玻片。为了缀合物内体途径内在化分析，用10μM的FITC-HPMA共聚物ALN-TNP-470缀合物孵育HUVEC和 Saos-2细胞6小时。在用冷的PBS洗涤孵育的细胞几次之后，将其在37℃下的无血清培养基中受饿45分钟，并在37℃下，用40 μg/ml Alexa^? Fluor 594人转铁蛋白孵育1小时。然后，如之前描述的固定细胞并封固。将所有载玻片在4℃静置在黑暗中，直到进行共聚焦显微镜分析。

共聚焦显微镜术：

利用Zeiss Meta LSM 510和具有60X油浸物镜的Leica TCS SP5共焦成像系统监测FITC-标记的HPMA共聚物ALN-TNP-470-FITC缀合物的细胞摄取、内在化和共区域化。使用多道通道捕获采集所有的图像，以防止荧光染料之间的发射串光。获得1024×1024分辨率的单个XY、XZ平面图像。使用Huygens^? 重叠合软件将来自Z叠层捕获的图像处理成分离通道，并覆盖成单个图像。

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移测定：

使用涂有10μg/ml纤连蛋白的修饰的8μm Boyden室进行细胞迁移测定。用HPMA共聚物ALN-TNP-470缀合物或等量浓度的游离ALN +游离TNP-470的组合攻击HUVEC (15× 10⁴个细胞/100μl)，并将其加入到transwell的上室中孵育4小时。在孵育之后，在较低室中，在存在或不存在血管内皮生长因子(VEGF) (20 ng/ml)下，使细胞迁移至所述室的下侧4小时。然后，用冰冷的薄荷醇固定细胞，并使用Hema 3染色系统染色。使用装配有Nikon DS5冷CCD摄像机的Nikon TE2000E倒置显微镜，以10X物镜、亮视野照明使染色的迁移细胞成像。使用NIH图像软件计数每个膜片俘获图像的迁移的细胞。将迁移标准化至迁移%，100 %代表没有用游离或HPMA-缀合的ALN和TNP-470孵育的细胞的VEGF依赖性迁移。

毛细管样管形成测定：

用在冰上的Matrigel^?基膜(50μl/孔；10 mg/mL)涂层24-孔培养板的表面，使其在37℃下聚合30分钟。用HPMA共聚物ALN-TNP-470缀合物或等量浓度的游离ALN +游离TNP 470的组合攻击HUVEC (3×10⁴细胞)，并且在完全EGM-2培养基的存在下，将其接种在涂层的培养板上。在孵育8小时(37℃；5 %的CO₂)之后，使用装配有Nikon DS5冷CCD摄像机的Nikon TE2000E倒置显微镜，以4X物镜、亮视野照明使孔成像。使用Nikon NIS元件图像软件分析图像的总管面积。

Miles血管通透性测定：

给Balb/c雄性小鼠皮下注射(s.c.) TNP-470、HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物(30 mg/kg的TNP-470同等物)或生理盐水(n=5只小鼠/组)。三天后，如前所述进行修饰的Miles测定[Claffey等人，1996, Cancer Res 56: 172-181; Miles & Miles 1952, J Physiol 118:228-257]。简言之，将偶氮蓝染料(100μl在0.9 % NaC1中的1%溶液)注射到鼠的眶后网状组织。十分钟后，将50μl的人VEGF₁₆₅ (1 ng/μl)或 PBS皮内注射到预剃毛的(shaved)背部皮肤中。二十分钟之后，处死动物，切除包括全部注射部位的皮肤区域。通过在室温下，用甲酰胺孵育5天从所述皮肤中提取偶氮蓝染料，并在620 nm测量提取的染料的吸光度。将数据表示为平均值±平均值的标准误差(s.e.m.)。

HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物的抗肿瘤活性的评价：

给SCID雄性s.c.接种5×10⁵ mCherry-标记的MG-63-Ras人骨肉瘤。给具有70 mm³肿瘤的小鼠s.c.注射游离ALN和TNP-470 (1:1，30 mg/kg)、FITC-标记的HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物(30 mg/kg q.o.d.×3倍的TNP-470-等量剂量)或生理盐水的组合(n=5只小鼠/组)。在相对早期状态(70 mm³)开始治疗，以便模拟转移情况（scenario）和早期原发性骨肉瘤。通过卡尺测量(宽度×长度²×0.52)和CRI^? Maestro非侵入性活体成像系统监测肿瘤进展。在结束时，切开肿瘤，称重并分析。将数据表示为平均值±平均值的标准误差(s.e.m.)。

具有mCherry-标记的MG-63-Ras肿瘤的小鼠的活体非侵入性成像和FITC-标记的HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物在小鼠中的生物分布：

使用CRI Maestro? 非-侵入性荧光成像系统跟踪具有mCherry-标记的MG-63-Ras人骨肉瘤肿瘤的小鼠的肿瘤进展和FITC-标记的HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物的生物分布研究。在整个试验期间，小鼠维持非荧光饮食(Harlan)。使用氯胺酮（100 mg/kg）和甲苯噻嗪(12 mg/kg)麻醉小鼠，用脱毛剂(Veet?)处理，并将其置于成像系统内。可选地，解剖来自小鼠的所选器官，并放置在成像系统内。使用激发(575-605 nm)和发射（645 nm longpass）过滤器设置以10 nm间隔通过550-800 nm光谱范围获得多光谱图像-立方体。通过光谱分析和线性分离算法消除小鼠自身荧光和不期望的本底信号。另外，将解剖的肿瘤固定在4 % PFA中，并通过之前描述的共聚焦显微镜术作为全标本包埋(whole-mount)成像，以便评价所述缀合物在肿瘤部位的累积。

免疫组织化学：

使用5μm厚的福尔马林-固定的、埋入石蜡的组织切片进行肿瘤结的免疫组织化学。使石蜡部分脱石蜡化（deparaffinized），再水化，并通过苏木精和曙红(H & E)染色。对于CD34染色(内皮细胞标记物)，使载玻片脱石蜡化，并在蒸汽压力蒸煮器 (Decloaking Chamber, BioCare Medical, Walnut Creek, CA)中用10 mM的柠檬酸盐，pH 6.0预处理50分钟 。所有的其它步骤都是在室温下，在水合室中进行的。用过氧化物酶阻断剂（Peroxidase Block）(Merck, Germany)盖住载玻片5分钟以猝灭内源性过氧化物酶活性，接着用在50 mM Tris-HCl，pH 7.4中的10 %兔子血清孵育30分钟以阻断非特异性结合位点。在室温下，将第一大鼠抗-鼠科动物CD34抗体(MEC 14.7 1:50的稀释度；Abcam, Cambridge, MA)应用在Tris-HCl, pH 7.4的1 %兔子血清中1小时。在50 mM的TrisHCl, pH 7.4中洗涤载玻片，接着，应用兔子抗大鼠抗体(1:750的稀释度；Vector Laboratories, CA, USA) 30分钟，接着，应用抗兔子辣根过氧化酶缀合的抗体(ABC检测试剂盒，Vector Laboratories, CA, USA)。在进一步洗涤之后，按照制造商的说明，使用ImmPACT?  DAB稀释剂试剂盒(Vector Laboratories, CA ，USA)开展免疫过氧化酶染色，用甲基绿复染色。如前所述计算微血管密度(MVD)[Weidner等人，1991, N Engl J Med 324:1-8]。

统计方法：

将来自HUVEC、MG-63-Ras和Saso-2细胞的增殖测定、HUVEC的迁移和毛细管样管形成的体外数据表示为平均值±标准偏差(s.d.)。将HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物的Miles测定和抗肿瘤活性评价的体内数据表示为平均值±平均值的标准误差(s.e.m.)。使用不成对的t检验测定统计显著性。P＜0.05被认为是统计学显著的。所有的统计试验都是双侧的。

实施例1

HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物的合成

根据本发明的某些实施方案的HPMA-ALN-TNP-470缀合物的一般合成描述在图1中。

以两步合成制备HPMA-Gly-Gly-Pro-Nle-ALN-TNP-470缀合物。首先，通过共聚HPMA、ALN-甲基丙烯酰胺单体(MA-Gly-Gly-Pro-Nle-ALN)和含氨基甲基丙烯酰胺单体(MA-Gly-Gly-Pro-Nle-乙二胺)合成中间体。任选地，为了评价细胞内转运，将异硫氰酸荧光素(FITC)的可聚合的衍生物N-甲基丙烯酰基氨基丙基荧光素硫脲(MA-FITC)加入到单体混合物中。接着，通过TNP-470的末端氯的亲核取代使TNP-470连接游离氨基。

包含ALN的单体 (MA-Gly-Gly-Pro-Nle-ALN)的合成:通过固相肽合成(SPPS)和人工Fmoc/tBu策略，使用2克具有80 %负载量的2-氯三苯甲基氯珠粒合成MA-Gly-Gly-Pro-Nle，得到期望的单体(0.88克，纯度95 %)。将MA-Gly-Gly-Pro-Nle-OH (100 mg，0.24 mmol)和2-巯基噻唑啉(TT, 33 mg, 0.28 mmol) 溶于2ml的1,4-二噁烷和1 ml的四氢呋喃(THF)的混合物中，并冷却至4℃。滴加在 1 ml的1,4-二噁烷中的N,N'-二环己基碳二亚胺 (DCC；60 mg，0.29 mmol)，并在4℃下搅拌该反应混合物过夜。此后，过滤除去二环己脲(DCU)，将滤液加入到ALN水溶液中(70 mg，4 ml；通过NaHCO₃溶液调节pH至约7.4)。在室温下，搅拌该反应混合物过夜。然后，在旋转蒸发器上除去溶剂，将残余物再溶于水中，并用乙酸乙酯萃取3次以除去TT。通过制备高效液相色谱(HPLC)纯化产物，得到83 mg期望的ALN单体。

MALDI-TOF谱阴离子：m/z=640 (M – H⁺), 662 (M-单Na盐-H⁺)；阳离子：m/z=642 (M + H⁺), 664 (M-单Na盐 + H⁺), 686 (M-单Na盐 + Na⁺)。

包含胺的单体  (MA-Gly-Gly-Pro-Nle-NH(CH₂)₂NH₂)的合成: 使用1.5克的2-氯三苯甲基氯珠粒，通过SPPS合成MA-Gly-Gly-Pro-Nle-乙二胺。应用六倍过量的乙二胺的无水四氢呋喃(THF)溶液，接着是Fmoc-氨基酸，并用MA-Gly-Gly-OH覆盖。由在二氯甲烷(DCM)中的5 %三氟乙酸(TFA)切割最终的肽，得到0.85克的期望化合物，纯度89 %，如通过HPLC (缓冲液A：H₂O, 0.1 % TFA；缓冲液B：乙腈，0.1 % TFA；梯度法：缓冲液B 2-60 %/30分钟；1 ml/分钟，单峰，洗脱时间8.27分钟) 测定。

MALDI-TOF谱(Fmoc衍生物)的阳离子： m/z=697 (M+Na⁺), 713 (M+K⁺)。

包含单体N-甲基丙烯酰基氨基丙基-FITC (MA-FITC)的荧光素硫脲(FITC)的合成：将FITC (1克，2.57 mmol)和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸化物(0.92克，5.14 mmol)溶于5 ml的二甲基甲酰胺(DMF)中，将该溶液冷却至4℃。此后，滴加在2 ml DMF中的二异丙基乙胺(DIPEA) (1.79 ml, 10.3 mmol)，并在4℃下搅拌该反应混合物2天。然后，将该反应混合物倾倒到100 ml的水(pH为约4-5)中，通过6 N HCl调节pH至约4。过滤出沉淀物，用水洗涤，并经P₂O₅真空干燥。

包含ALN、游离NH₂和(任选的) FITC基团的聚合物前体(HPMA共聚物-ALN-NH₂)的合成：

尝试两种合成方法：

在第一种合成方法中，在作为共聚合引发剂的4,4’-偶氮基二(4-氰基戊酸) (VA-501)的存在下，将MA-Gly-Gly-Pro-Nle-ALN、MA-Gly-Gly-Pro-Nle-乙烯-NH₂ (用于缀合TNP-470)、HPMA和MA-FITC (任选的)溶于水中。给该溶液通入氮气10分钟，密封安瓿，在60℃下进行共聚。

各种单体单元的相对量可能随期望而变化，以便确定了所形成聚合物中阿仑膦酸盐、TNP-470和PITC (如果存在)的负载量。进一步调节反应条件，以便确定聚合度或加入其它部分比如酪氨酸基以放射性标记所述缀合物。

在一个实例中，将 MA-Gly-Gly-Pro-Nle-ALN (73 mg)、MA-Gly-Gly-Pro-Nle-乙烯-NH₂ (55 mg)、HPMA (200 mg)、MA-FITC (4 mg, 如果存在)和作为引发剂的4,4’-偶氮基二(4-氰基戊酸) (VA-501, 3 mg)溶于2 ml的水中。给该溶液通入氮气10分钟，密封安瓿，并在60℃下聚合该混合物24小时。

在另一个实例中，在4,4’-偶氮基二(4-氰基戊酸) (VA-501, 3 mg)的存在下，将 MA-Gly-Gly-Pro-Nle-ALN (73 mg)、MA-Gly-Gly-Pro-Nle-乙烯-NH₂ (55 mg)和HPMA (200 mg) 溶于2 ml的水中。给该溶液通入氮气10分钟，密封安瓿，并在60℃下聚合该混合物24小时。

在第二种合成方法中，使用可逆的加成-裂解链转移(RAFT)聚合技术。

在作为引发剂的2,2’-偶氮基二[ 2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸化物(VA-044)和作为链转移剂(TTC)的S,S’-二(α,α’-二甲基-α’’-乙酸)三硫代碳酸酯的存在下，将MA-Gly-Gly-Pro-Nle-ALN、MA-Gly-Gly-Pro-Nle-NH(CH₂)₂NH₂、HPMA和MA-FITC (任选的)溶于水中。给该溶液通入氮气30分钟，密封在安瓿中，并在30℃下进行共聚。

在一个实例中，将MA-Gly-Gly-Pro-Nle-ALN (293 mg)、MA-Gly-Gly-Pro-Nle-NH(CH₂)₂NH₂ (215 mg)、HPMA (948 mg)、MA-FITC (4 mg 如果存在) 、作为引发剂的2,2’-偶氮基二[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸化物(VA-044 1.6 mg)和作为链转移剂的S,S’-二(α,α’-二甲基-α’’-乙酸)三硫代碳酸酯(TTC 4.2mg)溶于7.5ml的水中。给该溶液通入氮气30分钟，密封在安瓿中，并在30℃下聚合该混合物48小时。

通过将两种聚合物都溶于水中，并沉淀到过量的丙酮(3次)中纯化；在每次沉淀之后，用丙酮洗涤沉淀物。最后，将聚合物溶于15 ml的水中；用1N NaOH调节pH至12，在4℃下，相对DI水透析(MWCO 12-14 kDa)除去过量的ALN单体。在透析之后，将样品冷冻干燥。

如在上文的方法部分中描述的估计ALN、FITC和胺在所述HPMA缀合物中的含量。在如在上文描述的、经由第一种合成方法合成的一个示例性的缀合物中，ALN的含量测定为0.42 mmol/克(7.0 mol %)、FITC的含量测定为0.04 mmol/克(0.6 mol %)，胺的含量(用于估计结合TNP-470的%)测定为0.24 mmol/克(4.3 mol %)。在经由第一种合成方法，但没有FITC而使用不同浓度的包含阿仑膦酸盐的单体单元合成的另一个示例性的缀合物中，ALN的含量测定为0.18 mmol/克(3.2 mol %)，胺的含量测定为0.36 mmol/克(6.4 mol %)。

在经由如在上文详述的第二种合成方法(RAFT)合成的一种示例性的缀合物中，ALN的含量测定为7.7 mol %，FITC的含量测定为0.1 mol %，胺的含量测定为6.3 mol %。

因此，表明在本文描述的任一种合成方法中，可以随意地控制阿仑膦酸盐的负载量，进一步，可以获得相对高的负载量。

HPMA-ALN-TNP-470缀合物的合成： 将HPMA共聚物-ALN-NH₂ (150 mg)溶于6 ml的二甲基甲酰胺(DMF；如有必要，加入少量水以溶解所述聚合物)中，并将该溶液冷却至4℃。然后，加入在1 ml DMF中的TNP-470 (150 mg)。在黑暗中，在4℃下，搅拌该反应混合物12小时。此后，将该缀合物沉淀到丙酮中，并通过水溶液中再沉淀(3次)到过量的丙酮中纯化。用丙酮洗涤沉淀物，将残余物溶于水中，并在4℃下相对DI水透析1天(MWCO 12-14 kDa)。通过冷冻干燥分离产物。

通过反相制备HPLC纯化和表征最终产品。如通过尺寸排阻色谱(SEC)评价时，HPMA-ALN-TNP-470缀合物作为单峰洗脱出，具有保留时间20分钟(参见，图3B)。

HPMA-ALN-TNP-470缀合物尺寸分布的定量评价： 通过SEC估计合成的两种缀合物，即，通过经典聚合方法方法聚合的缀合物(聚合I缀合物)和通过“活性聚合”RAFT聚合的缀合物(聚合II缀合物)的分子量和多分散性，显示出表观80 kDa的Mw (分别为图3D和3E)。另外，使用光学分析器测定所述HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物的流体动力直径尺寸分布。通过经典聚合方法聚合的缀合物具有的PDI为～1.62，具有的平均尺寸分布为241 nm，而通过“活性聚合”RAFT聚合的缀合物是良好分散的，显示出相当地更低且更窄的PDI～1.2，平均尺寸分布为100 nm (图3F)。通过经典聚合方法合成的第一种缀合物的平均尺寸分布的值清楚地表明在使用的实验条件下形成缔合。

实施例2

ALN和TNP-470的组合处理对体外内皮细胞增殖的作用

在ALN和TNP-470缀合至HPMA共聚物主链之前，评价作为组合治疗剂ALN和TNP-470对体外内皮细胞增殖的抑制作用的性质。用游离或组合的ALN和TNP-470攻击HUVEC。呈现在图2A中的结果表明ALN和TNP-470的组合处理降低了作为单一处理的药物的IC。ALN分别在10、50、90μM的抑制浓度IC₃₀、₅₀、₇₀下抑制细胞增殖，TNP-470分别在0.00025、0.1、1000 nM的IC₃₀、₅₀、₇₀下抑制细胞增殖。组合处理I(连续浓度的 ALN和TNP-470  0.01 pM)和II (连续浓度的TNP-470和ALN 10μM)分别在0.2、10、30μM和0.00001、0.004、40nM的 IC_30、50、70下抑制HUVEC增殖。

组合指数(CI)-等效线图等式允许定量测定药物相互作用，其中CI＜1、=1或＞1分别表明协同作用、叠加作用或拮抗作用。接着，根据CI等式计算ALN-TNP-470组合的组合处理的数据，并用于产生对HUVEC增殖的IC₃₀、₅₀、₇₀的等效线图。如图2B所示，组合处理I在IC₃₀、₅₀、₇₀下对于HUVEC具有协同抑制作用，具有的CI为0.055、0.3和0.89。组合处理II在IC_50、70下具有协同作用，具有的CI为0.23、0.121，其在IC₃₀下具有叠加效应，具有的CI为1.025。

实施例3

HPMA-ALN-TNP-470缀合物对骨矿物质羟基磷灰石的结合

除了其抗血管生成和抗肿瘤活性之外，ALN的主要特征之一是其药代动力学特征，其在生理条件下，显示出对骨矿物质的强亲和力。为了测定在聚合物缀合之后，ALN的活性是否保留，通过体外羟基磷灰石结合测定和使用Hitrap脱盐柱的FPLC分析评价所述缀合物对骨矿物质的亲和力。如图3B所示，未结合的缀合物呈单峰洗脱出，具有的保留时间为1.9分钟。AUC与羟基磷灰石的孵育时间相关地下降。在用羟基磷灰石孵育2分钟之后，使在溶液中的50 % HPMA共聚物ALN-TNP-470缀合物结合羟基磷灰石(参见，图3C)。在用结合羟基磷灰石的92 % HPMA-共聚物ALN-TNP-470缀合物孵育10分钟之后，对羟基磷灰石的快速结合速率降低，在孵育175分钟之后，其达到稳定水平。

实施例4

FITC-标记的HPMA-ALN-TNP-470缀合物在内皮细胞和Saos-2人骨肉瘤细胞中的细胞内转运

在化学表征之后，研究FITC-标记的HPMA共聚物ALN-TNP-470缀合物内在化到内皮细胞和人骨肉瘤细胞中的能力和其内在化的机制。用所述缀合物孵育HUVEC和Saos-2骨肉瘤细胞，固定，透化并用细胞核标记物碘化丙啶(PI)染色。对于PI (红色)和FITC-标记的缀合物(绿色)，通过单独的多通道跟踪进行共聚焦显微镜术。

如在图4A中所示，在孵育12小时之后，所述缀合物主要聚集在HUVEC和Saos-2细胞的细胞质中，如在单平面图像中观察到的。

为了评价缀合物细胞定位和消除光学人工假象，俘获具有28片和X、Z片的5.7μm Z-层叠，并分析。如在图4B和4C中所示，发现缀合物位于与细胞核相同的聚焦平面，证实其是细胞内摄取。

使用用于肌动蛋白丝染色的鬼笔环肽（红色）和用于细胞核染色的DAPI进行所述缀合物细胞内在化的进一步检查。如图4D-K所示，染色显示所述缀合物主要累积在HUVEC (图4D-G)和Saos-2细胞(图4H-K)的细胞核周围。

所述缀合物能够内在化到HUVAC和Saos-2细胞中，如通过82 %的该缀合物与转铁蛋白在HUVEC细胞中(图4L-O) 共区域化和在Saos-2细胞(图4P-S)中71 %的共区域化所证实的。这些高百分数的共区域化表明了细胞摄取经由内涵蛋白-包被小泡的亲溶酶体途径。

实施例5

HPMA-ALN-TNP-470缀合物对内皮细胞、Saos-2细胞和MG-63-Ras人骨肉瘤细胞增殖的作用

为了在聚合物-缀合之后，测定HPMA共聚物ALN-TNP-470缀合物在体外是否有效，和结合的药物是否保持其抗肿瘤和抗血管生成活性，检查所述缀合物对HUVEC、Saos-2和MG-63-Ras人骨肉瘤细胞增殖的抑制作用。

呈现在图5中的结果表明游离ALN +游离TNP-470的组合和等量浓度的ALN和TNP-470的HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物类似地抑制内皮细胞生长补充剂(ECGS)-诱导的HUVEC增殖，显示出的IC₅₀为0.7和1 nM，其分别在高于1和10 nM的剂量下具有细胞毒性作用。

游离和缀合的ALN和TNP-470的组合在30μM的IC₅₀下类似地抑制Saos-2人骨肉瘤细胞增殖。

游离和缀合的ALN-TNP-470在10μM的IC₅₀下类似地抑制MG-63-Ras人骨肉瘤细胞增殖。

单独的HPMA在体外和体内是惰性的(数据没有显示)，与之前公开的数据一致[Duncan等人，J Control Release 2001; 74: 135-146]。

为了证实当通过组织蛋白酶K切割机制HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物释放ALN和TNP-470时，该缀合物主要是有活性的，评价在组织蛋白酶K抑制剂III的存在下，HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物对HUVEC增殖的抑制。与不存在组织蛋白酶K抑制剂III相比，在其存在下，HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物在高4-logs的浓度下抑制HUVEC的增殖。在72小时之后，可能存在由HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物水解释放的一些游离ALN和TNP-470，其导致对HUVEC增殖的抑制浓度高于4μM ALN-当量浓度。

实施例6

HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物对内皮细胞向化学引诱物VEGF迁移的作用

检查HPMA-共聚物ALN-TNP-470缀合物对血管内皮生长因子(VEGF)-诱导的HUVEC迁移的作用。在用游离ALN +游离TNP-470的组合或缀合的HPMA-ALN-TNP-470处理4小时之后，通过计数在4小时期间，向化学引诱物VEGF迁移穿过膜的细胞数量评价迁移。

如图6A所示，用0.1、1、10 nM当量浓度的游离或缀合的ALN/TNP-470处理分别显著地抑制对VEGF的趋化性迁移反应23 % (p=0.038)、41 % (p=0.003 )、58 % (p=0.013)和18 % (p=0.037)、35 % (p=0.032)和61 % (p=0.0006)。与VEGF诱导的细胞相比，在不存在VEGF下，HUVEC的基准迁移为33 %。

实施例7

在体外，HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物对HUVEC的毛细管样管形成的作用

检查HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物抑制HUVEC的毛细管样管形成的能力。

如图6C所示，与对照(未处理的)相比，在0.01、0.1、1 nM的当量浓度下，游离ALN +游离TNP-470的组合和缀合的HPMA-ALN-TNP-470分别抑制毛细管样管长度34 % (p=0.031)、53 % (0.007)、73 % (p=0.004)和29 % (p=0.021)、54 % (p=0.008)和64 % (0.014)。

实施例8

在体内，HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物降低了血管渗透性过高

在上文描述的体外测定中，通过经典和RAFT聚合反应合成的缀合物都显示出类似的作用。因此，对于所有的体内研究，由于预期改善的生物分布，选择分散窄和直径小的RAFT-聚合的缀合物。

为了测定HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物是否能够降低微血管的渗透性过高，使用修饰的Miles测定。将偶氮蓝染料注射到眶后网状组织，此后立即将血管通透性诱导的因子VEGF注射到Balb/c小鼠的剃毛侧腹。偶氮蓝结合血浆蛋白，因此，在渗透性增加的位点一起外渗出。与赋形剂处理的小鼠相比，在用ALN和TNP-470的游离组合和HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物处理的小鼠中，显著地抑制了偶氮蓝染料的VEGF-诱导的外渗，分别抑制87 % (P=0.002)和92 % (P=0.001) (分别参见图7A和7B)。

实施例9

在体内，HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物抑制MG-63-Ras人骨肉瘤

当用游离和缀合的ALN和TNP-470 (1:1，30 mg/kg q.o.d. 3次)处理时，具有s.c. mCherry-标记的MG-63-Ras人骨肉瘤的SCID雄性小鼠显示出肿瘤生长率降低。当注射到体内时，与两种游离药物的混合物相比，给药缀合至所述聚合物的两种药物的优越性变得显而易见(图7D)。与游离ALN和TNP-470组合处理相比，HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物显示出较好的抗肿瘤活性。在第19天，当对对照小鼠处以安乐死时，与游离ALN和TNP-470的45 % (p=0.012)相比，HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物抑制肿瘤生长96 % (p=0.001) (n=5只小鼠/组；(图7C和7D)。从用FITC-标记的HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物处理的小鼠解剖的mCherry-标记的肿瘤共聚焦显微镜分析显示该缀合物高度累积在肿瘤部位(图7E)。

用游离TNP-470和ALN或用所述缀合物处理的MG-63-Ras人骨肉瘤肿瘤的肿瘤切片的H & E染色显示来自对照小鼠的肿瘤切片由侵入肌肉层的分化不良的肿瘤细胞组成，所述肌肉层具有中心钙化的区域，其成为所述具有ALN的缀合物的HA-靶点。缀合物处理的肿瘤几乎消退，表明作为消退征兆，胆固醇沉积在结缔组织和其周围的巨细胞和巨噬细胞中(图6F)。CD34染色(用作内皮细胞标记物)显示与对照组小鼠(125±16个微血管/mm²)相比，游离ALN与TNP-470的组合降低微血管密度(MVD)39 % (p=5.5×10^-11)（76±14个微血管/mm²) ，缀合物处理的肿瘤的MVD降低74 % (P=4.7×10^-19)(32±9个微血管/mm²) (n=5只小鼠/组；图6F)。

由FITC-标记的HPMA共聚物-ALN-TNP-470缀合物处理的小鼠解剖的器官的荧光图像显示在骨组织中的FITC-荧光光谱(由未混合的多谱立方体的图像组成)的强度更大，然后是在脾、心脏、肺、肾和肝中的(图6G)。由于肾排泄缀合物，某些荧光显示在肾脏中。

实施例10

具有作为骨靶向部分的八-D-天门冬氨酸的HPMA共聚物-TNP-470缀合物

本文描述了两种具有作为骨靶向部分的八-D-天门冬氨酸的HPMA共聚物-TNP-470缀合物(聚合物表示为HP1和HP2)。使用通过“热”聚合(AIBN作为引发剂；HP1)或“光”聚合(HP2)获得的不同的聚合物前体制备包含天门冬氨酸的样品。这两种聚合物的分子量分布不同。

包含八-D-天门冬氨酸骨靶向基团的HPMA共聚物-TNP-470缀合物(HPMA-Asp₈-TNP470) (HP1和HP2)的合成：

根据本发明的某些实施方案的HPMA-Asp₈-TNP470缀合物(化合物6)的一般合成描述在图8中。

包含甲基丙烯酸酯-Gly-Gly的单体的三氯苯氧基活性酯[MA-GlyGly-OTcp；(化合物1)]的合成：

将MA-Gly-Gly-OH (10克，0.05 mol)和2,4,5-三氯苯酚(12克，0.06 mol)溶于100 ml的DMF中，并冷却至(-5)-(-10)℃。慢慢地加入在50 ml DMF中的二环己基碳二亚胺(DCC；12.5克，0.06 mol)，在(-5)-(-10)℃下，搅拌该反应混合物3小时，在4℃下过夜，并在室温下4小时。然后，加入乙酸(约0.5 ml)，继续搅拌1小时。过滤除去DCU (二环己脲)，慢慢地将滤液倾倒到约800 ml的冷水中。过滤沉淀物，并在室温下真空干燥。通过从乙醇中重结晶(溶于约200 ml的沸乙醇中，然后静置冷却至室温，并放入冰箱中进行结晶)纯化产物。过滤产物(晶体)，用少量乙醇洗涤，并真空干燥，从而得到15克期望的化合物1 (79 %)。

m.p.=183-188 oC。

包含Fmoc-胺单体[MA-GlyGlyProNle-NH(CH₂)₂NH-Fmoc (化合物 2)]的合成：

将MA-Gly-Gly-Pro-Nle-乙二胺(100 mg)和二异丙基乙胺(DIPEA；77μl)溶于2ml THF中，并冷却至0℃。在搅拌下，慢慢地加入在3ml THF中的Fmoc-Cl (115 mg)。在室温下，再搅拌该反应混合物1小时。然后，真空除去溶剂，通过使用具有如下洗脱溶剂的硅胶柱的色谱法纯化残余物：CHCl₃，接着是 CHCl₃/MeOH 9/1 ，得到期望的化合物2。

包含FITC标记的D-Asp₈阻断剂(NH2-C6-GlyProNle-C6-Lys[FD8 (化合物 3)]的合成：

通过固相肽合成(SPPS)，使用1克具有50 %负载量的2-氯三苯甲基氯珠粒合成FD8。引入C6间隔基(1氨基己酸)以减小在合成及其后结合反应期间的位阻。

包含Tcp和Fmoc保护的氨基的聚合物前体HPMA[HPMA-OTcp-NH-Fmoc (化合物 4)]的合成:

将HPMA (200 mg)、MA-Gly-Gly-Pro-Nle-乙二胺-Fmoc (化合物 2; 77 mg)、MA-Gly-Gly-OTcp (化合物 1; 44 mg)和 3 mg的AIBN 溶于2.5 ml的DMSO中，给该溶液通入N2 10分钟。密封聚合安瓿，并在50℃下进行聚合24小时。将该聚合物沉淀到过量的丙酮中，并通过溶于甲醇中和沉淀到丙酮中3次纯化。真空干燥最终产品，得到260 mg期望的化合物4。

还通过光聚合合成HPMA-OTcp-NH-Fmoc，如下：使用2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPAP；40 mM)代替AIBN作为引发剂。在室温下，在光照(约1000 lm/m²)下进行聚合24小时。对于热聚合，如在上文描述的进行纯化。

FITC-D-Asp₈ (FD8) 靶向部分与HPMA聚合物[HPMA-FD8-NH-Fmoc (化合物 5)]的结合：

将HPMA-OTcp-NH-Fmoc (化合物4；200 mg)溶于2.5 ml的DMSO中。加入溶于2 ml的DMSO中的FD8 (130 mg)和DIPEA (130μl)，并在室温下搅拌该反应混合物过夜。将聚合物沉淀到丙酮中，用丙酮洗涤，并真空干燥，得到期望的化合物5。

Fmoc的脱保护和TNP-470与HPMA-D-Asp₈的结合[P-FD8-TNP470 (化合物6)]:

将HPMA-FD8-NH-Fmoc (化合物5；150 mg)溶于DMF (5 ml)中，加入哌啶(1.2 ml)。在室温下，搅拌该反应混合物1小时。然后，用乙酸酸化该反应混合物，并沉淀到丙酮中(在没有酸化下，所述聚合物不会沉淀到丙酮中)。通过如下方式纯化共聚物：用CHCl₃洗涤3次以除去哌啶-乙酸盐，从甲醇中再沉淀到丙酮中3次，并真空干燥。进一步通过FPLC(乙酸盐缓冲液，pH 5.5)纯化所述聚合物。浓缩聚合物级分，用NaHCO₃调节pH至约8，接着在4℃下相对DI水透析24小时(MWCO 6-8 kDa)以除去盐。在透析之后，冷冻干燥样品。将HPMA-FD8–NH2 (100 mg)溶于DMF (3 ml)中，并冷却至4℃。然后，加入在1 ml的DMF中的TNP-470 (100 mg)。在4℃下，在黑暗中搅拌该反应混合物12小时。此后，将缀合物沉淀到丙酮中，并通过溶于水中和在丙酮中沉淀3次纯化；在每次沉淀之后，用丙酮洗涤沉淀物。进一步通过FPLC (乙酸盐缓冲液，pH 5.5)纯化该缀合物，在4℃下透析1天(MWCO 6-8 kDa)，并冷冻干燥，得到期望的HPMA-D-Asp₈-TNP-470缀合物(化合物6)。

实施例 11

HPMA共聚物-D-Asp₈-TNP-470缀合物(P-FD8-TNP470)的表征

表1呈现了如在上文的实施例10中的描述制备的两种HPMA–D-Asp₈-TNP-470缀合物(HP1和HP2)的化学特性：Asp₈含量、Fmoc (表示TNP470含量)和MW。

通过光谱法，使用Asp₈的FITC吸光度测定Asp₈含量(使用Σ495 nm=25300 M^-1cm^-1；硼酸盐  pH 9.0；包含35 %的FD8的FITC修饰的Lys) .

通过使用在MeOH 中的消光系数Σ300 nm=6600 M^-1cm^-1 的光谱法测定Fmoc含量；假定TNP-470含量类似。

通过在AKTA/FPLC系统(Pharmacia)上的尺寸排阻色谱(SEC) (参见图9)测定所述缀合物的分子量，使用Superose 6 HR 10/30柱，缓冲液0.1 M的乙酸盐/30 %的乙腈，pH 5.5。

表1

实施例12

HP1和HP2缀合物对于HUVEC的生长抑制和迁移的作用

作为当结合HPMA共聚物时，评价TNP-470是否保持其抗血管生成作用的尝试，进行增殖和迁移测定。

游离TNP-470和缀合的TNP-470类似地抑制HUVEC的增殖(参见，图10)。检查HP1和HP2缀合物对血管内皮生长因子(VEGF)-诱导的HUVEC迁移的作用。在用游离TNP-470或缀合的TNP-470处理4小时之后，通过计数4小时期间，向化学引诱物VEGF迁移穿过膜的细胞数来评价迁移。

如图11所示，用在0.1、1和10 nM的当量浓度下的游离或缀合的TNP-470处理显著地抑制向VEGF的趋化性迁移反应(参见对于HP1的图11A和对于HP2的图11B)。与VEGF诱导的细胞相比，在不存在VEGF下，HUVEC的基准迁移为33 %。

实施例13

阿仑膦酸盐以剂量依赖性方式抑制HUVEC和Saos-2人肉瘤细胞增殖

为了确定阿仑膦酸盐的抗血管生成活性是否是剂量依赖性的，检查该药物对HUVEC和Saos-2人骨肉瘤细胞增殖的抑制作用。

呈现在图12中的结果表明游离ALN和HPMA缀合的ALN (1 mol %)以剂量依赖性方式抑制内皮细胞生长添加剂(ECGS)诱导的HUVEC (图12A)的增殖和Saos-2人骨肉瘤细胞增殖(图12B)。

虽然本发明已经结合其具体实施方案进行了描述，但很显然，许多替代、修改和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，本发明意图包括落在所附权利要求的精神和广义范围内的所有这样的替代、修改和变化。

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