一种分离、纯化许旺细胞的方法

摘要

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种分离、纯化许旺细胞的方法。该方法依次由下述步骤组成：首先，无菌情况下取神经段，去除神经外膜；然后用复合胶原酶NB4和dispase混合消化酶溶液消化神经束，弃溶液；再置于胰蛋白酶和EDTA中作用5～10分钟，得到去除神经束膜的神经纤维；随后将得到的神经纤维置于混合酶溶液中，振荡得到细胞混悬液；最后离心，重悬。利用本发明能够低成本、高效率的获得大量高纯度的许旺细胞，为损伤神经修复提供丰富优质许旺细胞。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种分离、纯化许旺细胞的方法。

背景技术

许旺细胞(Schwann cells，SCs)是周围神经系统中重要的一种神经胶质细胞，由Schwann(1939)首先发现，在有髓神经纤维髓鞘化，损伤神经修复中起到重要的作用。也是神经营养因子的重要来源，能够分泌神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、睫状神经生长因子(CNTF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。成年哺乳动物中枢神经损伤的轴突欠缺再生能力，但周围神经损伤后，轴突再生能力较为强大，有学者认为，这种轴突再生能力的差异是因为中枢神经自身的微环境不适宜轴突再生。进一步研究表明，将周围神经移植至中枢神经后，轴突能再生长入周围神经内，而起关键作用的成分正是SCs.说明SCs不仅在周围神经损伤后，促进轴突生长，髓鞘化起到关键的作用，再中枢神经的损伤修复中也有重要的作用。

体外培养许旺细胞的组织来源以坐骨神经和臂丛神经最为常用。3-5天内的新生乳鼠和胚胎鼠来源的神经细小，柔嫩，脆而易断，且剥离外膜困难，束膜更是无法剥离。出生6天后至成年鼠神经来源的施万细胞增殖能力较弱，采用体外体内预变处理比较耗时，且增殖能力仍然不是很理想。出生3～5天的SD乳鼠，取材容易，且许旺细胞增殖能力较强，我们设计采用混合酶分步消化法剥脱神经外膜和束膜，操作简单，剥离彻底，获得原代许旺细胞的纯度就可以达到80％以上。

在体外培养许旺细胞扩增传代的过程中，成纤维细胞污染仍然是主要问题，且当在体外培养48小时后，成纤维细胞的增殖速度明显快于许旺细胞，如果不进行纯化，成纤维细胞将成为主要的细胞挤占许旺细胞的生长空间，影响许旺细胞的增殖。目前纯化施万细胞的方法主要有：差速贴壁法、抗有丝分裂法和免疫溶解法等。差速贴壁法是利用在预铺多聚赖氨酸的培养瓶中，成纤维细胞比施万细胞更易贴壁的特点，来达到纯化的目的，不会损伤施万细胞。抗有丝分裂法用抗有丝分裂剂，如Ara2c，G 2418等杀死增殖迅速的成纤维细胞，但同时也对施万细胞有毒性作用，而且操作过程也比较繁琐。免疫溶解法是通过使用成纤维细胞所特有的抗原抗体，如Thy-1等，结合使用补体，以消除成纤维细胞。但由于补体的非特异性作用可损伤细胞，且该试剂昂贵，不适宜做大量细胞的培养，另外还有免疫磁珠，流式细胞仪分选法等，但是以上方法普遍存在，耗时，费力，步骤繁琐或需要大型设备且纯化效果不理想等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种简易、高效的分离、纯化许旺细胞的方法。

本发明提供了一种分离、纯化许旺细胞的方法，依次由下述步骤组成：

(1)无菌情况下取神经段，去除神经外膜；

(2)用3～5倍组织量的复合胶原酶NB4和dispase混合消化酶溶液消化神经束10～20分钟，弃溶液；

(3)将步骤(2)得到的神经束，置于37℃温浴的质量体积比0.1～0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA作用5～10分钟，得到去除神经束膜的神经纤维；

(4)将步骤(3)得到的神经纤维置于步骤(2)中所述混合酶溶液中，置于37℃，摇床中振荡3060分钟，得到细胞混悬液；

(5)以600g离心5～10分钟，弃去上清，用许旺细胞培养液重悬。

上述方法中，细胞种植于培养瓶的密度最好达到2～4×10⁴细胞/ml。

上述方法中，步骤(2)中消化酶可以使用酵素酶和胶原酶NB4的混合液。混合液中，胶原酶NB4的浓度较好为0.1～0.2％，例如0.1、0.15％、0.18％、0.2％；酵素酶的浓度较好为0.05～0.1％。

上述方法中，将步骤(4)得到的细胞混悬液用吸管反复吹打3～5分钟后进行步骤(5)。

上述方法中，步骤(2)中消化酶混合酶的溶液是DMEM培养基。

DMEM培养基是一种在MEM培养基的基础上研制的，含各种氨基酸和葡萄糖的细胞培养基。与MEM相比，增加了各种成分用量，同时根据其D(+)-葡萄糖的含量又分为高糖型(低于4.5g/L)和低糖型(低于1.0g/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。克隆培养用高糖效果较好，常用于杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞培养。DMEM培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养；如A9、3T6、BALB/3T3、COS-1、COS-3、COS-7、L6、WEHI-3b等细胞系的培养。如GIBCO，SIGMA等公司都有售。

本发明中，酵素酶即dispase，购自sigma公司。dispase又被称为分散酶、中性蛋白酶。

本发明中，许旺细胞培养液是指含2μM forskolin，10ng/mlheregulin-β-1的DMEM培养基。其中，毛喉萜(Forskolin)是多种组织细胞腺苷环化酶的特异性激动剂，具有抗肿瘤作用。

上述方法中，将所得的许旺细胞培养48～72小时，置于15～20℃环境中3～5分钟，收集细胞混悬液，离心弃上清，用许旺细胞培养液重悬，可以达到进一步纯化。

上述纯化过程中，收集细胞混悬液前，先水平轻轻振荡所得细胞。

上述方法中，将所得的许旺细胞培养48～72小时，置于15～20℃环境中3～5分钟后传代，重复该步骤即可得到大量高纯度的许旺细胞。

鉴定细胞种类和纯度通常可以采用免疫荧光法和流式细胞仪。可以采用常规的操作方法或者按照下面的方法进行。

免疫荧光法：将经过第一次纯化的许旺细胞种植在6孔板中，12小时待细胞贴壁后，用4％多聚甲醛固定20分钟，然后PBS洗三次，每次5分钟；再加入羊血清封闭30分钟，然后弃掉羊血清加入兔抗鼠P75多克隆抗体37℃孵育2小时，然后用PBS清洗三遍，每次5分钟，再加入PE表记的羊抗兔单克隆抗体常温孵育1小时后PBS清洗三遍，每次5分钟，然后加入DAPI染细胞核10秒钟，然后加入PBS 1ml荧光显微镜拍照。随机取6个100倍视野计数，计算许旺细胞纯度。相同方法鉴定经过第二次纯化的许旺细胞，计算许旺细胞纯度。

流式细胞仪鉴定许旺细胞纯度：将纯化后的许旺细胞，收集到离心管中，加入0.25％胰酶2分钟进一步分散，加入适量10％血清的培养液中和胰酶，然后用单细胞滤器过滤，用含4％血清的PBS即Buffer液清洗两边，然后加入一抗，37度孵育30分钟，然后用4％FCS清洗三遍，在加入二抗常温孵育30分钟，然后清洗三遍，重悬于0.5ml 4％FCS中，流式细胞仪检测。

许旺细胞是重要的外周神经胶质，能够分泌多种神经生长营养神经，形成髓鞘支持神经，加快有髓神经的信号传导，另外在外周和中枢神经损伤后修复中也起到重要的作用，能够促进外周神经的轴突生长延长，保持损伤神经元活性及重新建立突触连接。近年来组织工程神经研究不断深入，由单纯生物导管到复合种子细胞的仿生神经导管，但是许旺细胞在体外培养中容易和成纤维细胞混杂且增殖比较慢。而神经在损失后，必须在尽量短的时间内修复，才能最大限度的恢复其支配区感觉及运动功能，否则容易造成不可逆的关节僵硬，肌肉萎缩。

本发明使用和复合胶原酶和酵素酶分离纯化许旺细胞。利用差速消化法，经过第一次纯化后，许旺细胞的纯度就可达到98％。再次纯化扩增后，许旺细胞的纯度就可以接近100％。此外，许旺细胞和成纤维细胞在收到冷刺激后，都发生收缩，但是在18-25℃范围内，许旺细胞发生明显收缩，但是成纤维收缩不是很明显，以此可以纯化许旺细胞。这种方法纯化许旺细胞步骤简单，且经济实惠，效果也非常的明显。利用本发明能够低成本、高效率的为损伤神经修复提供大量无杂质的许旺细胞。

附图说明

图1是原代许旺细胞图。

图2是经过纯化的许旺细胞图。

图3是SD乳鼠神经段第二次纯化后胶原酶消化的许旺细胞图。

图4是图3相应的免疫组化图。

图5是SD乳鼠神经段第二次纯化后酵素酶消化的许旺细胞图。

图6是图5相应的免疫组化图。

图7是原代许旺细胞生长96小时后的细胞图。发现如果不经纯化，96小时后，许旺细胞的生存空间被成纤维细胞占据，许旺细胞在成纤维细胞上面聚集。

图8是图7的免疫组化图。

图9是经过纯化许旺细胞生长96小时后的细胞图。对比发现，经纯化后，许旺细胞达到较高浓度，即使有少量成纤维细胞残留，其增殖能力下降，几乎不再增殖，处于静止状态。

图10是图9的免疫组化图。

具体实施方式

实施例1分离纯化许旺细胞

实验材料：15ml离心管，SD小鼠，50ml培养瓶，复合胶原酶、dispaseII兔抗鼠多克隆S100抗体(一抗A)、兔抗鼠P75抗体(一抗)羊抗兔PE标记抗体(二抗)等。如非特别说明，本发明的试剂均购自Sigma公司。

新生6天SD小鼠，脱臼处死后，放入75％酒精中，浸泡5-10分钟。无菌情况下取双侧坐骨神经长约1cm。

(1)无菌情况下取人或动物的神经段，显微镜下剥离去除神经外膜。

(2)用3～5倍组织量的质量体积比为0.1～0.2％的复合胶原酶NB4和0.05～0.1％的dispase混合酶DMEM溶液消化神经束10～20分钟。待神经束自然下沉，小心弃去上部液体。

(3)将步骤2得到的神经束，置于37℃温浴的质量体积比0.1～0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA作用5～10分钟，加入血清中和胰酶。得到去除神经束膜的神经纤维。

(4)将步骤步骤(3)得到的神经纤维置于步骤(2)中所述混合酶溶液中，置于37℃，摇床中振荡30～60分钟。得到细胞混悬液1

(5)将步骤(4)得到的细胞混悬液1用吸管反复吹打3～5分钟，得到细胞悬液2.

(6)将步骤(5)得到的细胞悬液2，以600g，离心5～10分钟，弃去上清。

(7)用许旺细胞培养液(含2μM forskolin，10ng/ml heregulin-β-1的DMEM培养基)重悬步骤(6)得到的细胞，计数，按2～4×10⁴细胞/ml种植于25cm²培养瓶，置37℃，5％CO²培养箱培养。

(8)待48～72小时，将培养瓶置于15～20℃环境中3～5分钟，水平方向轻轻拍打培养瓶瓶壁3～5分钟，收集培养液，以600g，离心5～10分钟，弃去上清。

(9)用步骤(7)所述培养液重悬步骤(8)得到的细胞，计数，按2～4×10⁴细胞/ml种植于25cm²培养瓶，置37℃，5％CO²培养箱培养。

(10)待48～72小时，重复步骤(8、9)一次，即得到大量高纯度的许旺细胞。

显微镜和免疫组化结果显示，细胞生长状态较好，纯度很高。详见图3-图6。

实施例2两种消化酶体系消化结果比较

实验方法：

一)取原代细胞

1新生6天C57BL6小鼠6只，脱臼处死后，放入75％酒精中，浸泡5～10分钟

2无菌情况下取双侧坐骨神经长约1cm

3将12段神经分别放入承有3ml 2％复合胶原酶NB415ml离心管A和乘有2ml 2％复合胶原酶NB4和1ml 0.1％dispaseII  15ml离心管B中。

4放入含5％CO2，37℃培养箱中，每隔五分钟振荡一次，消化约1个半小时。

5将管A和管B 600g离心5分钟，收集细胞，计数种植到培养瓶中，每瓶0.5min。

二)许旺细胞的纯化

待原代细胞培养48小时后，细胞接近融合状态：然后将所获得细胞分成两组，一组用0.05％复合胶原酶纯化，一组用dispase纯化。

将培养液吸除后，将A组加入2ml 0.05％胶原酶NB4将B组加入0.06％dispase然后放入培养箱中，孵育约15～30min然后轻轻振荡约5min然后离心收集细胞计数按1∶1计数传代。

96小时后重复上述步骤近一步纯化一次，计数。

三)纯度鉴定

1免疫荧光法

将经过第一次纯化的许旺细胞种植在6孔板中，12小时待细胞贴壁后，用4％多聚甲醛固定20分钟，然后PBS洗三次，每次5分钟；再加入羊血清封闭30分钟，然后弃掉羊血清加入兔抗鼠P75多克隆抗体37℃孵育2小时，然后用PBS清洗三遍，每次5分钟，再加入PE表记的羊抗兔单克隆抗体常温孵育1小时后PBS清洗三遍，每次5分钟，然后加入DAPI染细胞核10秒钟，然后加入PBS 1ml荧光显微镜拍照。随机取6个100倍视野计数，计算许旺细胞纯度。相同方法鉴定经过第二次纯化的许旺细胞，计算许旺细胞纯度；

2流式细胞仪鉴定许旺细胞纯度

将第一次纯化后的许旺细胞，收集到离心管中，加入0.25％胰酶2分钟进一步分散，加入适量10％血清的培养液中和胰酶，然后用单细胞滤器过滤，用含4％血清的PBS即Buffer液清洗两边，然后加入一抗，37度孵育30分钟，然后用4％FCS清洗三遍，在加入二抗常温孵育30分钟，然后清洗三遍，重悬于0.5ml4％FCS中，流式细胞仪检测。

结果显示，两种体系的消化酶都能够获得相对较纯的许旺细胞。但是使用胶原酶和酵素酶的混合消化酶体系，细胞的产量和纯度略高。