一种从脂肪组织中分离纯化许旺细胞的方法

摘要

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种从利用脂肪组织分离、纯化许旺细胞的方法及其应用。该方法步骤包括：(1)无菌情况下剥离脂肪组织，切碎并清洗；(2)用3-20倍组织量的消化酶溶液消化脂肪组织碎块；所述的消化酶是酵素酶、胶原酶NB4或者两者的混合液；(3)将得到的混悬液用吸管反复吹打3～5分钟；(4)对解离的细胞在600-1500g离心3-10分钟，得到细胞团块；(5)用许旺细胞培养液重悬步骤(4)得到的细胞接种于纤维粘连蛋白包被的培养皿。许旺细胞的纯度就可以接近95％。利用本发明能够低成本、高效率的获得大量高纯度的优质许旺细胞。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种从脂肪组织中利用胶原酶和酵素酶分离、纯化许旺细胞的方法及其应用。

背景技术

许旺细胞(Schwann cells，SCs)是周围神经系统中重要的一种神经胶质细胞，由Schwann(1939)首先发现，在有髓神经纤维髓鞘化，损伤神经修复中起到重要的作用。也是神经营养因子的重要来源，能够分泌神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、睫状神经生长因子(CNTF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。成年哺乳动物中枢神经损伤的轴突欠缺再生能力，但周围神经损伤后，轴突再生能力较为强大，有学者认为，这种轴突再生能力的差异是因为中枢神经自身的微环境不适宜轴突再生。进一步研究表明，将周围神经移植至中枢神经后，轴突能再生长入周围神经内，而起关键作用的成分正是SCs.说明SCs不仅在周围神经损伤后，促进轴突生长，髓鞘化起到关键的作用，再中枢神经的损伤修复中也有重要的作用。

目前组织工程神经构建所需的许旺细胞的组织来源以坐骨神经和臂丛神经的许旺细胞，一下原因限制了其应用：一，供体神经来源有限，往往带来新的创伤，且效果不是很理想；二所得细胞为终末分化细胞，扩增能力有限，不能满足组织工程对种子细胞数量的要求。新生乳鼠和胚胎鼠来源的神经细小，柔嫩，脆而易断，且剥离外膜困难，束膜更是无法剥离。出生6天后至成年鼠神经来源的施万细胞增殖能力较弱，采用体外体内预变性处理比较耗时，且增殖能力仍然不是很理想。我们在试验中发现皮下脂肪组织中也可以分离出许旺细胞，且许旺细胞和脂肪干细胞共培养增殖能力更强，采用专利(申请号200910195924.0)纯化方法就可以获得高纯度的许旺细胞。故我们设计采用从脂肪组织中利用混合酶分步消化法获得许旺细胞，不会给供区或供体带来感觉或运动障碍，且操作简单，分离彻底，获得原代许旺细胞的纯度就可以达到60％以上。

进行人工神经的研究需要大量的许旺细胞，所以如何高效、高纯度的培养许旺细胞成为学者们关注的要点。但在体外培养和纯化过程中无法避免成纤维细胞的生长，在长有大量成纤维细胞的环境中，雪旺细胞生长呈渐进式的衰减和死亡，而夹杂有少量成纤维细胞生长的环境中，雪旺细胞的生长和增殖良好。成纤维细胞的生长繁殖速度远超于许旺细胞，要在接种之前把成纤维细胞清除，传统的许旺细胞纯化方法有多种：应用抗体，抗有丝分裂剂抑制成纤维细胞的生长，其细胞毒性可能对许旺增殖有影响；组织块差速贴壁法纯化纯度不高；无血清培养法，成本较高。工程化的许旺细胞数量上至少应达到1×107个/ml才能保证其所产生的神经营养因子、层黏蛋白等起到保护神经元、促进神经再生的作用，虽然用以上几种方法已经能够较好的取得大量且纯度相对较高的许旺细胞，但临床应用需要在尽量短的时间内获取足够量的细胞进行移植，从而减少许旺细胞在体外的凋亡及失神经所致的肌肉萎缩的发生。因此，寻找更方便有效的分离纯化许旺细胞的方法就成了学术界研究的热点。我们采用专利(申请号200910195924.0)纯化方法纯化许旺细胞，也是利用了许旺细胞和成纤维细胞贴壁能力不同，许旺细胞在胶原酶的作用下首先从培养瓶壁脱落，从而可达到去除成纤维细胞的目的。我们从脂肪组织中分离许旺细胞，并使用复合胶原酶和酵素酶分离纯化。利用差速消化法，经过第一次纯化后，许旺细胞的纯度就可达到80％。再次纯化扩增后，许旺细胞的纯度就可以接近95％。采用复合胶原酶NB4纯化优点是操作简便，所需作用时间短，纯化步骤简单，价格比较适中。

由于脂肪组织具有取材方便，操作简单，分离彻底，不会给供区或供体带来感觉或运动障碍。从脂肪组织中分离纯化的许旺细胞，可在体外长期培养和遗传背景稳定等特点，且避免了异体移植所造成的免疫排斥反应，因此从脂肪组织中分离的许旺细胞是周围神经组织工程的理想种子细胞，具有广阔的应用前景和临床价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种从脂肪组织中简易、高效的分离、纯化许旺细胞的方法。尤其涉及一种从脂肪组织中利用胶原酶和酵素酶分离、纯化许旺细胞的方法及其应用。

具体而言，本发明提供了一种从脂肪组织中分离、纯化许旺细胞的方法，步骤包括：

(1)无菌情况下剥离脂肪组织，切碎并清洗；

(2)用3-20倍组织量的质量体积比为0.05～0.3％的消化酶溶液消化脂肪组织碎块45～90分钟；所述的消化酶是酵素酶、胶原酶NB4或者两者的混合液；

(3)将步骤(2)得到的混悬液用吸管反复吹打3～5分钟；

(4)对步骤(3)中解离的细胞在600-1500g离心3-10分钟，弃上清，得到细胞团块；

(5)用许旺细胞培养液重悬步骤(4)得到的细胞，以1x10⁴-5x10⁴个/cm²接种于纤维粘连蛋白包被的培养皿。

该方法还可以包括检测分离获得的许旺细胞的标志物p75、s100和GFAP。

所述的消化酶溶液中胶原酶NB4的浓度可以为0.1～0.2％。

所述的消化酶溶液中酵素酶的浓度可以为0.1～0.2％。

所述的消化酶可以是胶原酶NB4和酵素酶。

所述的溶剂是DMEM培养基。

所得的许旺细胞依次经过下述步骤可以进行扩增：

A.将所得的许旺细胞种植于培养瓶，培养48～72小时；

B.消化细胞，收集细胞混悬液，以600g离心5～10分钟，弃去上清；

C.用许旺细胞培养液重悬步骤B得到的细胞，培养48～72小时即可；

D.细胞种植于培养瓶的密度为2～4×10⁴细胞/cm²。

所述的消化细胞的过程是：吸去培养液，加入2～3ml质量体积比为0.06～0.1％的酵素酶，置37℃、5％CO₂培养箱作用15～30分钟；然后水平轻轻振荡所得细胞。

分离得到的许旺细胞可以作为神经种子细胞。也可以作为神经移植物中的营养。

上述方法中，所述的组织为人或动物的脂肪组织，脂肪组织碎块体积为0.5-10mm³。例如，本发明的一个实施例中神经碎块体积平均为1mm³。

上述方法中，步骤(1)的DMEM培养基体积是脂肪组织体积的5-10倍。

上述方法中，步骤(2)中消化酶可以使用酵素酶和胶原酶NB4的混合液。混合液中，胶原酶NB4的浓度较好为0.1～0.3％，例如0.1％、0.2％、0.3％；酵素酶的浓度较好为0.05～0.2％。

上述方法中，步骤(2)中消化酶混合酶的溶液是DMEM培养基，可含胎牛血清。

DMEM培养基是一种在MEM培养基的基础上研制的，含各种氨基酸和葡萄糖的细胞培养基。与MEM相比，增加了各种成分用量，同时根据其D(+)-葡萄糖的含量又分为高糖型(低于4.5g/L)和低糖型(低于1.0g/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。克隆培养用高糖效果较好，常用于杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞培养。DMEM培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养；如A9、3T6、BALB/3T3、COS-1、COS-3、COS-7、L6、WEHI-3b等细胞系的培养。如GIBCO，SIGMA等公司都有售。

本发明中，酵素酶即dispase，购自sigma公司。dispase又被称为分散酶、中性蛋白酶。

本发明中，许旺细胞培养液是指含2μM forskolin，10ng/ml heregulin-β-1的DMEM培养基。其中，毛喉萜(Forskolin)是多种组织细胞腺苷环化酶的特异性激动剂，具有抗肿瘤作用。

鉴定细胞种类和纯度通常可以采用免疫荧光法和流式细胞仪。可以采用常规的操作方法或者按照下面的方法进行。

免疫荧光法：将经过第一次纯化的许旺细胞种植在6孔板中，12小时待细胞贴壁后，用4％多聚甲醛固定20分钟，然后PBS洗三次，每次5分钟；再加入羊血清封闭30分钟，然后弃掉羊血清加入兔抗鼠P75多克隆抗体37℃孵育2小时，然后用PBS清洗三遍，每次5分钟，再加入PE表记的羊抗兔单克隆抗体常温孵育1小时后PBS清洗三遍，每次5分钟，然后加入DAPI染细胞核10秒钟，然后加入PBS 1ml荧光显微镜拍照。随机取6个100倍视野计数，计算许旺细胞纯度。相同方法鉴定经过第二次纯化的许旺细胞，计算许旺细胞纯度。

流式细胞仪鉴定许旺细胞纯度：将纯化后的许旺细胞，收集到离心管中，加入0.25％胰酶2分钟进一步分散，加入适量10％血清的培养液中和胰酶，然后用单细胞滤器过滤，用含4％血清的PBS即Buffer液清洗两边，然后加入一抗，37度孵育30分钟，然后用4％FCS清洗三遍，在加入二抗常温孵育30分钟，然后清洗三遍，重悬于0.5ml4％FCS中，流式细胞仪检测。

许旺细胞是重要的外周神经胶质，能够分泌多种神经生长营养神经，形成髓鞘支持神经，加快有髓神经的信号传导，另外在外周和中枢神经损伤后修复中也起到重要的作用，能够促进外周神经的轴突生长延长，保持损伤神经元活性及重新建立突触连接。近年来组织工程神经研究不断深入，由单纯生物导管到复合种子细胞的仿生神经导管，但是许旺细胞来源有限必须要损伤自体神经，造成供体感觉障碍，带来新的创伤，而且许旺细胞在体外培养中容易和成纤维细胞混杂且增殖比较慢。而神经在损失后，必须在尽量短的时间内修复，才能最大限度的恢复其支配区感觉及运动功能，否则容易造成不可逆的关节僵硬，肌肉萎缩。

本发明是从脂肪组织中分离许旺细胞，并使用复合胶原酶和酵素酶分离纯化。利用差速消化法，经过第一次纯化后，许旺细胞的纯度就可达到80％。再次纯化扩增后，许旺细胞的纯度就可以接近95％。此外，许旺细胞因为是终末分化细胞体外增殖能力差，目前大多采用培养液增加生长因子以促进许旺细胞的增殖，但是仅仅增加神经生长因子，许旺细胞的增殖仍然不够理想，因为许旺细胞可以分泌因子促进自身的分裂增殖，所以本发明设计许旺细胞和脂肪干细胞共培养，以促进许旺细胞的增殖，取得非常好的效果。利用本发明能够为损伤神经修复提供大量无杂质的许旺细胞。

经过第一次纯化后，许旺细胞的纯度就可达到80％。再次纯化扩增后，许旺细胞的纯度就可以接近95％。形态学和细胞免疫荧光证明了纯化后的细胞具有成熟许旺细胞的表型，利用本发明能够低成本、高效率的获得大量高纯度的许旺细胞，而且没有损伤神经，提供一种组织工程学中获得种子细胞的新方法，为损伤神经修复提供丰富优质许旺细胞。

附图说明

图1：原代混合细胞。

图2：荧光显微镜下的原代细胞。

图3：加0.1％复合胶原酶NB4作用10分钟后，见许旺细胞变亮变圆，部分漂起；轻轻振荡后，可见许旺细胞漂起，而脂肪干胞仍然贴附完好。

图4：荧光显微镜下的图3。

图5：经过二次纯化后，许旺细胞的纯度明显提高而脂肪干细胞的比例明显降低。

图6：荧光显微镜下的图5(40x)。

图7：相差显微镜下普通照片，其中显示有脂肪来源的其它细胞。

图8荧光显微镜下的照片。

图9P75染色后，许旺细胞呈红色。

图10：荧光显微镜下细胞核呈蓝色。

图11是8图、9图和10图的组合，许旺细胞呈黄色，而脂肪来源的细胞呈绿色(100x)。

具体实施方式

实施例1分离纯化许旺细胞

新生6天SD小鼠，脱臼处死后，放入75％酒精中，浸泡5-10分钟。无菌情况下取双侧腹股沟脂肪。

1.无菌情况下取小鼠的脂肪，用剪刀剪碎至1mm³大小，置于其3-10倍量的DMEM培养基中清洗，离心弃上清。

2.用5-20倍组织量的质量体积比为0.1～0.2％的复合胶原酶NB4和0.05～0.1％的dispase混合酶DMEM溶液消化神经碎块30～60分钟。

3.将步骤2得到的混悬液用吸管反复吹打3～5分种。

4.将步骤3得到的混悬液以600g离心5～10分钟，弃上清，得到细胞团块。

5.用许旺细胞培养液(含2μM forskolin，10ng/ml heregulin-β-1的DMEM培养基)重悬步骤4得到的细胞，计数，按2～4×10⁴细胞/ml种植于25cm²培养瓶，置37℃，5％CO²培养箱培养。

显微镜下可以看到脂肪干细胞和许旺细胞的典型形态。

实施例2扩增许旺细胞

a.待48～72小时，吸去实施例1中步骤5所述培养瓶中的培养液，加入2～3ml 37℃温浴的质量体积比为0.06～0.1％的dispase，置37℃，5％CO²培养箱作用15～30分钟。

b.水平轻轻振荡步骤a所述培养瓶3～5分钟，收集细胞混悬液。

c.将步骤b得到的细胞混悬液以600g，离心5～10分钟，弃去上清。

d.用实施例1中步骤5所述培养液重悬步骤c得到的细胞，计数，按2～4×10⁴细胞/ml种植于25cm²培养瓶，置37℃，5％CO²培养箱培养。

e.待48～72小时，重复步骤b-d，即得到大量高纯度的许旺细胞。

显微镜和免疫组化结果显示，细胞生长状态较好，纯度很高。

实施例3两种消化酶体系消化结果比较

一)取原代细胞

二、新生6天C57BL6小鼠6只，脱臼处死后，放入75％酒精中，浸泡5～10分钟

三、无菌情况下取双侧腹股沟脂肪组织，用剪刀剪碎至1mm³大小，置于其3-10倍量的DMEM培养基中清洗，离心弃上清。

四、将脂肪组织碎块分别放入盛有5ml 2％复合胶原酶NB415ml离心管A和盛有5ml 2％复合胶原酶NB4和2ml 0.1％dispaseII  15ml离心管B中。

五、放入含5％CO2，37℃培养箱中，每隔五分钟振荡一次，消化约1个半小时。

六、将管A和管B 600g离心5分钟，收集细胞，计数种植到培养瓶中，每瓶0.5min。

二)许旺细胞的纯化

待原代细胞培养48小时后，细胞接近融合状态：然后将所获得细胞分成两组，一组用0.05％复合胶原酶纯化，一组用dispase纯化。

将培养液吸除后，将A组加入2ml 0.05％胶原酶NB4将B组加入0.06％dispase然后放入培养箱中，孵育约15～30min然后轻轻振荡约5min然后离心收集细胞计数按1∶1计数传代。

96小时后重复上述步骤近一步纯化一次，计数。

三)纯度鉴定

1免疫荧光法

将经过第一次纯化的许旺细胞种植在6孔板中，12小时待细胞贴壁后，用4％多聚甲醛固定20分钟，然后PBS洗三次，每次5分钟；再加入羊血清封闭30分钟，然后弃掉羊血清加入兔抗鼠P75多克隆抗体37℃孵育2小时，然后用PBS清洗三遍，每次5分钟，再加入PE表记的羊抗兔单克隆抗体常温孵育1小时后PBS清洗三遍，每次5分钟，然后加入DAPI染细胞核10秒钟，然后加入PBS 1ml荧光显微镜拍照。随机取6个100倍视野计数，计算许旺细胞纯度。相同方法鉴定经过第二次纯化的许旺细胞，计算许旺细胞纯度。

表1.许旺细胞的纯度

^＊组间比较(P＜0.05)

2流式细胞仪鉴定许旺细胞纯度

将第一次纯化后的许旺细胞，收集到离心管中，加入0.25％胰酶2分钟进一步分散，加入适量10％血清的培养液中和胰酶，然后用单细胞滤器过滤，用含4％血清的PBS即Buffer液清洗两边，然后加入一抗，37度孵育30分钟，然后用4％FCS清洗三遍，在加入二抗常温孵育30分钟，然后清洗三遍，重悬于0.5ml 4％FCS中，流式细胞仪检测。

结果显示，两种体系的消化酶都能够获得相对较纯的许旺细胞。但是使用胶原酶和酵素酶的混合消化酶体系，细胞的产量和纯度更高。