制备纤维状蛋白质的方法以及使用纤维状蛋白质的治疗方法

摘要

一种用来将球状蛋白质结构改变为纤维状蛋白质结构的方法。此方法包括以下步骤：提供球状蛋白质；形成含有该球状蛋白质的溶液；向所述含有该球状蛋白质的溶液内加入洗涤剂；将该溶液加入孔道大小至少为70kDa的分子分筛管柱中；以及用含有洗涤剂的溶液洗脱。一种用来将未折叠的蛋白质结构改变为纤维状蛋白质结构的方法。此方法包括以下步骤：提供球状蛋白质；形成含有该球状蛋白质的溶液；向所述溶液内加入尿素以使该球状蛋白质展开；将该溶液加入分子分筛管柱中；以及用含有洗涤剂的溶液洗脱。一种治疗癌症的方法，此方法包括以下步骤：提供蛋白质；将该蛋白质改变为纤维状结构；以及对需要治疗的患者施用治疗有效量的纤维状结构蛋白质。一种用来生产疫苗佐剂或抗原佐剂的方法，此方法包括提供蛋白质以及将此蛋白质改变为纤维状结构的步骤。

说明书

技术领域

本发明涉及将未折叠的天然蛋白质(native protein)折叠为纤维状结构(fibrillar structure)的方法，且本发明也发现使用纤维状结构蛋白质可以诱发细胞凋亡(apoptosis)及作为疫苗佐剂(adjuvant)。

本申请要求享有于2008年4月11日提交的美国临时申请第12/082,634号、于2008年5月30日提交的英国申请第0809919.4号以及于2008年3月13日提交的美国临时申请第61/036,432号的优先权，其公开的全部内容在此通过引用的方式并入。

背景技术

先前研究已经发现在糖化(glycation)(Bouma等人发表于J Bio Chem 278(43)：41810-41819：2003)、高温培养(Sagis等人发表于Langmuir 20(3)：924-927：2004)、或超音波震荡(Stathopulos等人发表于Protein Sci 13(11)：3017-3027：2004)后，某些蛋白质会形成纤维状结构。然而，这些方法通常需要高浓度蛋白质、激烈的震荡、原纤维种粒(fibril seed)的协助，且时间很长，有时甚至需要在特定温度下孵育一个月左右。此外，除非溶液中有纤维状聚集体形成并沉淀析出，否则这些方法不能将纤维状蛋白质从非-纤维状蛋白质中分离出来。

发明内容

本发明披露了一种可以将球状蛋白质结构改变至纤维状蛋白质结构的方法。此方法包括：提供球状蛋白质；形成含有该球状蛋白质的溶液；向含该球状蛋白质的溶液中添加洗涤剂；及再将这些含有蛋白质的溶液加入孔道大小至少为约70kDa的分子分筛管柱(molecular sizing column)中等步骤。在一个方案中，此方法包括用含有洗涤剂的溶液洗脱(elute)出纤维状蛋白质的步骤。

在本发明中，同时披露了一种治疗癌症的方法。此方法包括以下步骤：提供蛋白质；将该蛋白质改变为纤维状结构；及对需要治疗的患者施用此治疗有效量的纤维状结构蛋白质。

另外，本发明也披露了一种制造佐剂的方法。此方法包括提供蛋白质以及将该蛋白质改变为纤维状结构的步骤。

附图说明

本发明前述的特征及目的由后文及配合附图详述而说明，其中相似的符号为代表相似的组件。

图1a-e为多种蛋白质的TEM照片。

图1f为图示说明硫代黄素T(ThT)相对不同浓度的BSA-S200的荧光量。

图2a为BSA-Zwit的TEM照片

图2b为BSA-HW55S的TEM照片。

图3a为图示说明细胞毒性与不同浓度的多种蛋白质的关系。

图3b为说明BSA-S200对具有不同浓度的抗α5β1抗体的Akt的作用的蛋白质印迹照片。

图3c为图示说明细胞毒性与不同浓度的BSA-S200与抗α5β1抗体的关系。

图4为长条图图示说明，细胞毒性与多种蛋白质的RGD单元与分子量的关系。

图5a-b为BHK-21细胞与多种蛋白质孵育的显微镜照片。

图5c是图示说明细胞凋亡蛋白酶(caspase-3)活性。

图6a为图示说明细胞毒性与不同浓度BSA-S200的关系。

图6b为说明整联蛋白α5β1蛋白质与BSA-S200及天然牛血清白蛋白结合的免疫转印照片。

图7a-d为用F-BSA及抗整联蛋白α5β1抗体处理的BHK-21细胞的蛋白质印迹。

图8为图示说明ThT荧光量与不同浓度的多种蛋白质的关系。

图9为图示说明细胞毒性与不同浓度的多种由Superdex-75管柱洗脱制备的蛋白质的关系。

图10a-e为显示多种蛋白质结构的TEM照片。

图10f-g为图示说明ThT荧光量与不同浓度的BSA-S200及FN-S200的关系。

图11a为说明结合抗TLR2抗体及抗FMDV抗体至源自RAW264.7细胞的溶解液的免疫转印照片。

图11b-g为牛血清白蛋白及BSA-S200的免疫荧光染色照片。

图12a-d说明用多种蛋白质处理的细胞的NFKB报导荧光酶量。

图13a-c为图示说明不同浓度的多种蛋白质孵育的RAW264.7细胞的IL-6与IL-8表达。

具体实施方式

本发明涉及生产纤维状蛋白质的方法及使用纤维状蛋白质治疗的方法，此方法具有容易控制、产物均质及能够量产等优点。此外，利用此方法生产的纤维化蛋白质不需原纤维种粒(fibril seed)的协助，即使只有微量蛋白质也可使用于此方法。如用于本文的″蛋白质″包含一种或更多蛋白质、蛋白质片段、多肽或肽。蛋白质包含合成、天然存在或用基因重组方法产生的蛋白质。

依据本发明，披露一种用来将球状蛋白质结构改变为纤维状蛋白质结构的方法。此方法以简单且快速的方式将天然蛋白质(不论其序列)转换为纤维状结构。此方法包括提供蛋白质及将上述蛋白质加入孔道大小为至少70kDa的分子分筛管柱中，并用含有洗涤剂的溶液洗脱出蛋白质等步骤。

在一说明实施例中，此方法包括提供球状蛋白质、形成含该球状蛋白质的溶液、添加洗涤剂至含该球状蛋白质的溶液以及将此溶液加入孔道大小为至少70kDa的分子分筛管柱中等步骤。

在另一说明实施例中，此方法包括提供球状蛋白质、形成含该球状蛋白质的溶液、添加洗涤剂至含该球状蛋白质的溶液以及在低浓度洗涤剂存在下将溶液加入孔道大小至少为70kDa的分子分筛管柱中的步骤。

在本发明另一方案中，披露了一种将未折叠的蛋白质结构改变为纤维状蛋白质结构的方法。此方法包括以下步骤：提供未折叠的蛋白质，并在尿素存在下将蛋白质加入分子分筛管柱中。在例示实施例中，此方法包括以下步骤：提供在大肠杆菌表达的未折叠的蛋白质溶于8M尿素中，并在洗涤剂存在下将蛋白质加入孔道大小小于70kDa的分子分筛管柱中。用以使蛋白质展开(unfold)而加入的尿素浓度不需限制至8M，其它摩尔比亦可致使蛋白质产生未折叠，其展开程度与正在进行展开的蛋白质有关。

球状蛋白质(globular proteins)，也称为球体蛋白质(spheroportein)，其结构乃属二类主要蛋白质三级结构(teritary structure)之一。球状蛋白质通常具水可溶性且在水中可形成扁球体分子，其具有复杂的二级结构，包含如α-双螺旋(α-helices)、β-片(β-sheets)及环(loop)等二级结构单元(secondary structure motif)。另一种主要三级结构的蛋白质为纤维状蛋白质或纤维蛋白质，纤维状蛋白质一般不易溶解并具有瘦长的形状，具有较简单二级结构且是由一种二级结构单元所组成。

在说明实施例中，球状蛋白质可以为白蛋白、纤连蛋白、口蹄疫病毒的重组衣壳蛋白VP1(rVP1)、口蹄疫病毒的重组衣壳蛋白VP2(rVP2)、口蹄疫病毒的重组衣壳蛋白VP3(rVP3)、或VP1、VP2、VP3及/或VP4的前体蛋白P1(precursor protein P1)。蛋白质也可以是包括VP1、VP2、VP3及/或VP4部份的嵌合蛋白质，例如VP42同时包括部分的VP2及VP4。也可使用其它球状蛋白质，包含天然存在蛋白质及合成寡肽两者。球状蛋白质一般溶解于溶液体内。在说明实施例中，球状蛋白质溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)。

表面活性剂(surfactant)，在本文中也称为洗涤剂(detergent)，是降低水的表面张力及提高有机化合物溶解性的物质。洗涤剂可以是离子性，包含阳离子、阴离子及两性离子洗涤剂，洗涤剂也可以是非离子性的。洗涤剂在蛋白质中扮演打断蛋白质内非共价键的角色，藉此使蛋白质转化，而丧失天然形状或构形。在说明实施例中，使用的洗涤剂为十二烷基硫酸钠(SDS)，自Sigma公司购得。在其它说明实施例中，亦使用自Calbiochem公司购得的洗涤剂为Zwittergent 3-14。

淀粉状蛋白(Amyloids)为纤维交错-β蛋白质聚集体。许多蛋白质能够转化为似淀粉状原纤维，具有纤维状型态、原丝次结构、交错-β绕射图案、β-结构数量增加、可与刚果红结合及可与ThT结合等性质。在说明实施例中，将球状蛋白质转换成似淀粉状原纤维(amyloid-like fibril)，被转化的蛋白质可藉由其似淀粉状性质而被辨识出来。

本发明利用色谱法(Chromatography)将纤维状蛋白质自溶液中分离，色谱法包含粒度排除、亲和力及离子交换等，一般使用管柱，亦可使用其它方法如薄层色层等。但利用管柱将球状蛋白质转换为纤维状，是比较快速、稳定、有效、且连续的方式，同时使用管柱的方法较易扩大其方法规模。

在说明实施例中使用的色谱法为分子排阻色谱法(size exclusion chromatography)，其珠体孔道大小至少为约70kDa。珠体孔道大小可依球状蛋白质的不同特性而变化，例如其大小。孔道大小控制蛋白质进入珠状基体，从而引发机械力协助蛋白质进行未折叠/折叠及增进原纤维整体性的。在说明实施例中，使用的分子分筛管柱(molecular sizing column)为Superdex 200。在其它说明实施例中，使用的分子分筛管柱为HW 55S。

管柱色谱法中，可使用含低浓度洗涤剂的缓冲溶液洗脱管柱。在某些方案中，分子分筛管柱是用含25mM Tris-HCl、pH 8.0、1mMEDTA、0.1M NaCl及0.05％SDS的缓冲溶液洗脱。在其它说明实施例中，分子分筛管柱以含25mM Tris-HCL、pH 8.0、1mM EDTA、0.1M NaCl及0.05％Zwittergent 3-14的缓冲溶液洗脱。洗脱液可以区分收集，将含有纤维状蛋白质的区分量收集在一起。此集中的区分可进一步以过滤纯化并分离出纤维状蛋白质，例如在磷酸盐缓冲液透析以移除SD S或Zwittergents等洗涤剂。

在本发明另一方案中，披露一种治疗癌症的方法。此方法包括提供蛋白质、将蛋白质改变为纤维状结构以及对需要治疗的患者施用治疗有效量的纤维状结构蛋白质等步骤。蛋白质转化为纤维状形式增加其在目标细胞的细胞毒性。

在说明实施例中，癌症是肾脏、乳房、肺、前列腺、肝、或卵巢癌症。用来治疗癌症的蛋白质为白蛋白(albumin)、纤连蛋白(fibronectin)、rVP1、rVP2、rVP3、P1、或由部分VP1、VP2、VP3及/或VP4所组成的嵌合蛋白质。在说明实施例中，纤维状蛋白质藉由调控Akt信号途径诱发癌细胞的细胞凋亡。在某些例子中，纤维状蛋白质藉由调控导致Akt失活的整联蛋白(integrin)α5β1或αvβ3。在其它例子中，纤维状白蛋白结合整联蛋白引起细胞凋亡，主要是经整联蛋白/FAK/Akt/GSK-3β/caspase-3信号途径。

在说明实施例种，此纤维状蛋白质可以以组合物的一部份来施用。此组合物可以是多种形式包含粉末、乳膏、凝胶、油膏、软膏、溶液、药片、胶囊、喷液及贴片。再利用赋形剂及载剂以递送组合物至病人。这些载体包含可溶剂、稀释剂及分散介质。这些载体为生物相容的、治疗上可接受的，且不改变纤维状蛋白质的治疗特性。辅药、佐剂及其它成份也可包含于此组合物。

组合物的施用可经由多种方法到达身体的不同部位而完成，包含静脉、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮肤(即，局部)、经黏膜、腹膜内、肿瘤内及直肠内施用。(例如，吸入)、经皮肤(即，局部)、经黏膜、腹膜内、肿瘤内及直肠内施用。

″治疗有效量″是指在合理的利害比较下，在任何药物治疗上可产生预期效应的施用量。此有效量可能因某些因子而产生不同的变化，如疾病的种类或治疗时疾病的病症、被施用的特定标的器官的构造、病人个体大小、或疾病或症状的严重性。本领域具有通常知识者不需要过度实验即可凭经验决定特定化合物的有效量。

治疗癌症的蛋白质可依于疾病的严重性及癌细胞所需的细胞毒性来选择。在说明实施例中，若要选择对癌细胞具有较高细胞毒性的，则应选择具RGD单元(motif)及/或较高分子量的蛋白质。

在本发明另一方案中，披露一种用以生产疫苗的方法。此方法包括提供蛋白质、并将蛋白质改变为纤维状结构等步骤。此纤维状结构蛋白质可以抗特定疾病的疫苗施用予患者。

在本发明另一方案中，披露一种用以生产疫苗或免疫佐剂的方法。此方法包括提供蛋白质，及改变该蛋白质为纤维状结构等步骤。佐剂本身可不具有任何特定抗原效果，但可刺激免疫系统，提高对疫苗的反应。在说明实施例中，蛋白质经由类铎受体2(toll-like receptor 2，TLR2)激活先天性免疫反应(innate immune response)。纤维状蛋白质激活TLR2以诱导细胞因子(cytokine)产生，然而在其天然蛋白质则无此功能。

在其它实施例中，抗原可转化为纤维状形式而同时具有抗原及佐剂效果，使得制造疫苗时不需要额外的佐剂就可强化免疫反应。

实施例

为了更完整的了解本发明可配合下列特定实施例及图示而获得。描述的实施例及图示仅为举例说明之用而非用于限定本发明的范围。即使实施例的说明可能有形式的改变或实质相等物的取代，这只是权宜之计，而不影响专利范围的大小。虽然在本文使用特定的词，此些词为用于合理的描述而非用于限制的目的。如在上文中说明的本发明的润饰及变化可在未偏离本发明的精神及范围下完成，且因此些限制应仅受限于后附申请专利范围所限定者。

实施例1

材料及方法

材料：Phospho-Ser⁴⁷³Akt抗体购自Cell Signaling Technology公司。Zwittergent 3-14购自Calbiochem公司。纤连蛋白(Fibronectin，FN)、抗肌动蛋白抗体(anti-actin antibody)、抗整联蛋白α5β1多克隆抗体(anti-integrin α5β1polyclonal antibody)(功能抑制抗体)、辣根过氧酶结合的抗鼠IgG二级抗体(horseradish peroxidase-coupled anti-mouse IgG secondary antibo dies)、辣根过氧酶结合的抗兔IgG二级抗体(horseradish peroxidase-coupled anti-rabbit IgG secondary antibodies)及MTT试验组购自Chemicon International公司。牛血清白蛋白(BSA)购自Bio Basic公司。硫代黄素T(Thioflavin，ThT)及十二烷基硫酸钠(soudium dodecyl sulfate，SDS)购自Sigma公司。

重组蛋白质VP1及VP3的表达及纯化。VP1及VP3为口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiease virus，FMDV)的衣壳蛋白组成成分。重组蛋白质VP1，在大肠杆菌表达后，并依前述的方法纯化及再折叠(Yang等人发表于Journal of Gene Medicine 7：708-717：2005)。VP3基因以PCR从plBSY1-P1质粒中扩增，引物为5′-CCGGGATCCA AGCTTGGGATTTTCCCCGTGGCA-3′及5′-CCGCTCGAGTTGGGTTCGGGCGTCGAC-3′，其分别于N端引入BamHl位点及于C端引入Xhol位点。在限制酶水解后，此扩增的基因连接在pET24a(+)(Novagene，WI)的BamHl及Xhol位点间并转化到DH5α感受态细胞中。可辨识的阳性克隆(positive clone)以测序方法确定后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。重组蛋白质VP3，在大肠杆菌表达后，依前述方法纯化及再折叠(Yang等人发表于Journal of Gene Medicine 7：708-717：2005)。

牛血清白蛋白纤维状蛋白质的制备。20mg牛血清白蛋白(购自Bio Basic公司)溶解于10ml磷酸盐缓冲液，接着加入SDS(10％；w/v)直至其达到最终浓度为1％。在水超音波振荡器震荡5分钟后，将此含有SDS-蛋白质溶液加入Superdex-200管柱(2.6cmx100cm，购自Amersham Biosciences公司)，其先以含25mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA、0.1M NaCl及0.05％SD S的缓冲溶液平衡。收集含牛血清白蛋白的区分。此收集的区分接着用磷酸盐缓冲液透析以除去SDS。纤连蛋白的纤维状蛋白质(Fibronection fibrillar protein)亦使用相同的程序制备。

透射电子显微镜(TEM)。以透射电子显微镜分析纤维状蛋白质，将1mg/ml蛋白质加入至200-筛目覆碳铜格网。移除过量的样本且风干该格网。蛋白质-承载格网以1％(W/V)磷钨酸(phosphotungstic acid)负染色1分钟。透射电子显微相片乃是在20,000-150,000x放大倍率，以75Kv在HitachiH-7000电子显微镜下观察得到。

硫代黄素T(T h T)荧光。硫代黄素T(ThT)为似淀粉状性质(amyloid-like properties)的标记之一。为测量荧光，将浓度渐增的蛋白质(1μM、3μM及5μM)与20μM硫代黄素T中共同孵育。在室温孵育1小时后，以Wallac VICTOR²1420多标示计数器(multilabel counter)(购自Perkin Elme rlife science公司)测量荧光，每个测试进行三重复。激发及放射波长分别为355nm与535nm。由缓冲液造成的硫代黄素T背景讯号会由对应的量测值中减去。

细胞株及治疗。BHK-21细胞(来自仓鼠肾脏)及T47D细胞株(人类乳管癌)在以10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷酰胺、100单位/ml盘尼西林及100μg/ml链霉素补充的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)中于37℃保存。细胞在单层培养基中过夜。细胞以磷酸盐缓冲液清洗两次及并以无胎牛血清的DMEM中的蛋白质处理一段时间。部分细胞接着在指定的时间点以0.2ml分解缓冲液(购自Pierce公司)溶解，并取20μl试样以蛋白质印迹法(Western blotting)分析Akt磷酸化作用(Akt phosphorylation)。

细胞存活试验。细胞存活由MTT比色试验测定。将呈指数生长的细胞(BHK-21细胞为1x10⁴；T47D细胞株为1.25x10⁴)接种于96孔板中含10％胎牛血清的DMEM内，于培养24小时后，在无胎牛血清的DMEM培养基中加入一系列浓度的纤维状蛋白质，于37℃处理8小时。处理后，MTT溶液加至每孔(0.5μg/ml)并孵育4小时。活细胞数目直接与甲潜(formazen)生成量成正比，甲潜在溶于异丙醇后，可于ELISA平板读取器内以光谱仪在560nm测定而得。

SDS-PA GE及免疫转印分析。样品在Hoefer垂直凝胶设备(购自Amersham Biosciences公司)中，以10％SDS-PAGE凝胶分离，接着以电泳传送至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride membranes)(购自Pall公司)。此膜在PBST中以含5％的脱脂奶粉阻隔处理1小时，并在阻隔缓冲液中与初级抗体(5-10μg/ml)培养。接着以PBST清洗，以辣根过氧酶结合的二级抗体(购自Chemicon公司)培养。抗体藉由曝露至Biomax ML膜(购自Eastman Kodak公司)以化学发光剂(SuperSignal West Pico，购自Pierce公司)检测。

图式

第1图。Superdex-200管柱分析而非Superdex-75管柱分析促进纤维状蛋白质的形成。透射电子显微镜照片显示BSA-S200呈纤维状结构(如图A)而BSA-S75呈球状结构(如图B)。牛血清白蛋白为对照组，亦呈现球状结构(如图C)。图D及E分别为VP1-S200及VP3-S200，两种表达于大肠杆菌的重组蛋白质且于Superdex-200管柱中再折叠，以透射电子显微镜分析呈原纤维状结构。图F为浓度渐增的BSA-S200在20μM淀粉状蛋白质-专一染料ThT中孵育，与牛血清白蛋白及BSA-S75相比，BSA-S200浓度越高会导致ThT荧光量增加。实验进行三重复，数据以平均值±S.D.(n＝3)表示。

第2图。淀粉状蛋白样原纤维的形成与洗涤剂或珠状基体无关。透射电子显微镜照片显示BSA-Zwit(如图A)及BSA-HW55S(如图B)的纤维状结构。

第3图。纤维状蛋白质诱发细胞凋亡是经由Akt信号途径。BHK-21细胞在无血清培养基中以不同浓度的牛血清白蛋白、BSA-S75、BSA-S200、BSA-Zwit、或BSA-HW55S处理8小时。处理后，利用MTT试验测定细胞存活。数据以平均值±S.D.(n＝3)表示。(图A)BHK-21细胞以或不以抗-α5β1抗体预处理30分钟，接着以3μM BSA-S200处理一段指定时间。处理后，细胞溶解液(cell lysate)藉由使用抗-磷-Akt(p-Akt)初级抗体的蛋白质印迹法分析。(图B及C)为T47D细胞株以或不以抗-α5β1抗体预处理30分钟，接着在无血清培养基中以不同浓度BSA-S200处理8小时。处理后，以MTT试验测定细胞存活率。数据以平均值±S.D.(n＝3)表示。

第4图。RGD单元与纤维状蛋白质分子量对BHK-21细胞的细胞毒性的影响。(图A)为BHK-21细胞在无血清培养基中分别以0.5μM VP1-S200、VP3-S200、BSA-S200、FN-S200、或FN处理8小时。处理后，由MTT试验测定细胞存活率。数据以平均值±S.D.(n＝3)表示。(图B)为BHK-21细胞在无血清培养基中以增加浓度的VP3-S200处理8小时。处理后，由MTT试验测定细胞存活率。数据以平均值±S.D.(n＝3)表示。

结果

管柱珠孔道大小及珠状基体对淀粉状蛋白样原纤维的形成的影响。牛血清白蛋白(BSA)为球状蛋白质。将SDS加至BSA牛血清白蛋白溶液，将其加入施用至Superdex-200管柱(孔道大小达600KDa)，接着以含25mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA、0.1M NaCl及0.05％SDS的缓冲溶液洗脱。从Superdex-200管柱(BSA-S200)取得的BSA牛血清白蛋白质以透射电子显微镜(TEM)分析呈现纤维状结构，如透射电子显微镜(TEM)分析所显示(图1A)，且以淀粉状蛋白质专一染料硫代黄素T(ThT)分析时发现荧光增加且随着剂量荧光越强依赖方式测得的淀粉状蛋白质专一染料硫代黄素T(ThT)的荧光增加(图1F)。为分析管柱珠孔道大小在原纤维的形成上的影响，在此研究中使用具有仅为3-70kDa MW范围的较小孔道大小Superdex-75管柱(表1)。透射电子显微镜TEM分析显示由Superdex75(BSA-S75)洗脱出的BSA牛血清白蛋白，似BSA牛血清白蛋白，显示球状结构(图1B及1C)且并未增强淀粉状蛋白质专一染料ThT的荧光(图1F)。重组蛋白质VP1(rVP1)及重组蛋白质VP3(rVP3)表达于大肠杆菌中，以尿素萃取并以亲和性管柱纯化，亦使用洗涤剂进行色层分析，并透过前述Superdex-S200管柱进行再折叠。透射电子显微镜TEM数据显示VP1-S200(图1D)及VP3-S200(图1E)呈现纤维状结构。同时也分析管柱珠基体大小对纤维状蛋白质的形成的影响也被检测。结果发现HW55S小珠和Superdex-200(孔道大小达700KDa)具有相似的小珠性质但基体组成成份不同，在(表1)互做比较。以TEM透射电子显微镜观察，由HW55S管柱分析(BSA-HW55S)洗脱出的BSA牛血清白蛋白呈现纤维状结构(图2B)。这些数据显示具有孔道大小大于70kDa的分子分筛管柱如Superdex-200(S200)及HW55S，可以促进似淀粉状纤维状蛋白质的形成。

表1.Superdex-200、Superdex-75及HW55S管柱分析的性质比较

洗涤剂对淀粉状蛋白样原纤维形成的影响。Zwittergent 3-14为在广pH范围中保有两性离子性质的洗涤剂，推测其并非不可逆地结合至阴离子或阳离子化合物。经由Superdex-200管柱，Zwittergent 3-14对纤维状牛血清白蛋白形成的影响也被研究。Zwittergent 3-14加至牛血清白蛋白溶液(1％Zwittergent 3-14)，藉由及/或经过Superdex-200管柱的通道进行再折叠，由含有25mMTris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA、0.1M NaCl及0.05％Zwittergent 3-14的缓冲溶液进行洗脱。结果发现经由Superdex-200管柱以Zwittergent 3-14(BSA-Zwit)洗脱取得的牛血清白蛋白在透射电子显微镜下呈现纤维状结构(图2A)。这些数据显示洗涤剂如SDS及Zwittergent 3-14与小珠的孔道大小对于形成纤维状蛋白质方面都扮演着重要的角色。

纤维状蛋白质通过使Akt失活而诱发细胞死亡。如之前已经显示的，rVP1对BHK-21细胞以及多种癌细胞株具细胞毒性。为检测由我们的方法取得的纤维状蛋白质是否对细胞具细胞毒性，BHK-21细胞在无血清培养基中以不同浓度的BSA-S200、BSA-Zwit或BSA-HW55S处理。发现BSA-S200、BSA-Zwit及BSA-HW55S在剂量依赖方式中都造成细胞死亡(图3A)。BSA-Zwit在所有的测试中呈现最强的细胞毒性，在0.5μM浓度下，BSA-Zwit诱发将近100％细胞毒性，而同样浓度下，BSA-S200诱发35％细胞毒性及BSA-HW55S诱发10％细胞毒性。BSA-Zwit、BSA-S200及BSA-HW55S的IC₅₀分别为0.2μM、0.75μM及大于10μM。如对照组，发现使用两球状蛋白质、天然牛血清白蛋白及BSA-S75对细胞毒性，即使有，也是极少(图3A)。为说明是否纤维状蛋白质诱发细胞死亡乃是经由Akt信号途径，BHK-21细胞以抗-α5β1抗体或未以抗-α5β1抗体预处理30分钟，接着在一段指定时间内以3μMBSA-S200处理。数据显示BSA-S200如rVP1-S200及rVP3-S200，在一时间依赖方式中去活化Akt。除此之外，BSA-S200对Akt的抑制效用可藉由增加抗-α5β1抗体的浓度的预处理而回复(图3B)。

此外，抗α5β1抗体对由纤维状蛋白质诱发的细胞死亡的影响也被测试。先将T47D细胞株(乳癌症细胞株)以浓度渐增的抗-α5β1抗体预处理30分钟，接着以BSA-S200在无血清培养基中孵育8小时。结果发现，以抗-α5β1抗体预处理的T47D细胞株，随着抗-α5β1抗体的浓度越高，BSA-S200对T47D细胞株的毒性越弱(图3C)。这些数据显示，纤维状蛋白藉由调控Akt信号途径对癌细胞产生细胞毒性。

RGD单元及纤维状蛋白质分子量对细胞的细胞毒性的影响。RGD单元为整联蛋白的配位基，以上实验已证实，纤维状蛋白质乃是藉由调控整联蛋白/Akt信号途径，诱发细胞死亡。纤连蛋白为具有RGD单元且450kD分子量的蛋白质，当在SDS存在下由Superdex200(FN-S200)洗脱出来时亦呈现纤维状结构(数据未显示)。比较在BHK-21细胞上的VP1-S200、FN-S200、rVP3-S200及BSA-S200四种纤维状蛋白质的细胞毒性(如图4A所示)，发现具RGD单元的纤维状蛋白质，如rVP1-S200及FN-S200，比不具RGD单元如BSA-S200及rVP3-8200更具细胞毒性。此外，具较高分子量的纤维状蛋白质比具低分子量者的更具细胞毒性。FN-S200(MW＝450kD)比VP1-S200(MW＝26kD)更具细胞毒性(图4A)。BSA-S200(MW＝66kD)比VP3-S200(MW＝26kD)更具细胞毒性(第4A图)。虽然VP3-S200在0.5μM浓度未显示任何细胞毒性如图4A所示，但较高浓度的VP3-S200则显示以剂量依赖方式诱发细胞毒性(图4B)。综合来看，具RGD单元及较高分子量的纤维状蛋白质对细胞具有比无RGD单元及较低分子量者有较高的细胞毒性。

在活体外及活体内使用纤维状蛋白质rVP1做为抗癌的研究。在活体外重组蛋白质VP1(rVP1)抑制癌细胞的生长比阿霉素(doxorubicin)及紫衫醇(taxol)更有效。使用MTT试剂评估rVP1在活体外的细胞毒性，发现rVP1的IC₅₀值远低于阿霉素在四种不同肺癌细胞株及一种卵巢癌细胞株的中的IC₅₀值，上述细胞株包括A549、H146、H23、H23/0.3及SK-OV-3细胞，以及正常的肺纤维母细胞细胞株(WI-38)。在以rVP1处理的SK-OV-3细胞亦可见到高于以阿霉素及紫衫醇处理的抑制作用。同时也发现rVP1对于BNL细胞的IC₅₀值，低于对正常鼠类肝细胞株(AML12细胞)，此说明rVP1对鼠类HCC细胞有比对正常肝细胞具有更高的细胞毒性。

以rVP1处理可抑制肿瘤生长且延长具HCC的鼠的生存。BNL细胞以皮下注入BALB/c鼠，在大约在肿瘤诱发二周后可检查到肿瘤体积为250mm³。四组鼠给予肿瘤内注射rVP1(25mg/kg、75mg/kg、或100mg/kg)或磷酸盐缓冲液，每周三次，持续3星期。以rVP1处理的老鼠的肿瘤体积远小于未处理的老鼠，rVP1剂量越高显示越好的效果。在对照组与治疗组间的肿瘤体积差异经统计分析具有显著性的差异(25mg/kg，P＜0.05；75mg/kg及100mg/kg，P＜0.001)。

在另一相似但只有二组鼠的实验中，以rVP1(75mg/kg)处理鼠的肿瘤体积亦远小于接受磷酸盐缓冲液的对照组鼠。以rVP1或磷酸盐缓冲液处理的鼠的平均存活分别为11.5及13.5周。在二组间在存活率上的差异以log-rank检定法计算，且结果经统计分析为具有显著性的差异。

rVP1的处理提高具有人类卵巢肿瘤的裸鼠的存活率。rVP1的治疗是经由2-阶段腹膜内注射进行治疗。具人类卵巢肿瘤的裸鼠在腹膜内注射SK-OV-3细胞诱发腹水后四小时接受第一次注射，且以不同剂量的rVP1(15、50、150mg/kg)注射，每48小时注射一次，共注射10次。在10天的中断后再重新开始处理，且重复rVP1的注射每48小时5次。与控制组比较，接受rVP1注射(15及50mg/kg)的老鼠具有较高存活率。

讨论

一般用于制造淀粉状蛋白质原纤维的方法需在37℃熟化一段时间。大部分的案例，熟化的时间由数天至数周。报告已经显示SDS可以加速原纤维的形成；然而其仍然需要在37℃激烈搅拌过夜、在室温孵育2天、或需要原纤维种粒的帮助。此外，所有的这些方法属于批次生产。

在本发明中，发展一种管柱方法，在洗涤剂(SDS或Zwittergent3-14)存在下，在无原纤维种粒下，仍可促进纤维状蛋白质形成(图1A、D及E；2A及B)。而且，使用管柱方法可以快速、稳定、有效及连续的将球状蛋白质转换至纤维状形式。此外，此方法也易于放大。之前的实验已经证明许多具有多样结构的蛋白质，包括疾病及非疾病相关的蛋白质，都能够形成淀粉状蛋白质。本发明发现具有不同序列及结构的不同蛋白质可用于此管柱层析方法且可转换为纤维状蛋白质，例如BSA-S200、rVP1-S200、rVP3-S200及FN-S200(图1A、D及E)。为了找到管柱-诱发原纤维形成的最佳条件，进行有关在此方法中可能影响原纤维形成的某些因子的研究。

结果建议珠的孔道大小在管柱-诱发原纤维形成扮演重要角色。Superdex-200管柱具有比Superdex-75管柱大的珠孔孔道大小(表1)。至于为何比Superdex75孔道大小小的管柱不易促进原纤维形成(图1B)，可能是因为有限的珠孔道大小限制蛋白质进入珠状基体，因此造成缺乏提供蛋白质未折叠/折叠及增进原纤维整体性的机械力。综言之，机械力与洗涤剂确实在管柱-诱发原纤维形成中扮演重要角色。

整联蛋白为组成胞膜受体家族(integral membrane receptors)，其作用如细胞粘着分子。每一整联蛋白为α-及β-次单位以非共价键键结而成的杂二聚体(heterdimer)。在哺乳类物种中，整联蛋白家族由24个不同杂二聚体(heterodimers)组成，每一个整联蛋白都分布于可区别的组织。整联蛋白参与许多作用，包括在细胞及细胞外间质(extracellar matrix)间的黏合作用及讯息传递途径的诱导作用，也调控多种过程，包含细胞增殖、型态、迁移及细胞凋亡。

之前的研究已经证明淀粉状蛋白原纤维(amyloid fibrils)对神经元细胞具细胞毒性。之的前的研究也证明α2β1及αVβ1整联蛋白信号途径作为引起由淀粉状蛋白质-β-诱发的神经毒性的媒介。在本发明中发现纤维状蛋白质藉由调控整联蛋白α5β1，激活Akt途径，而诱发癌细胞死亡(图3B及3C)。

淀粉状蛋白质，不论其来源为何，对神经元细胞具细胞毒性。淀粉状蛋白质诱发细胞毒性的机制可能和脂质膜与淀粉状蛋白的肽的互动有关。然而，纤维状蛋白质对癌细胞的细胞毒性的影响尚未被报导。我们发现SDS帮助管柱诱发的纤维状蛋白质(column-induced fibrillar protein)在人类癌细胞株中呈现细胞毒性(图3C)。BSA-S200，在T47D细胞株中于2μM浓度导致细胞存活率降低70％(图3C)。

最后，具RGD单元的纤维状蛋白质与不具RGD单元者对细胞毒性的影响。结果发现RGD单元为整联蛋白的配位基，其调控多种功能如细胞迁移、粘着、或增殖。实验结果显示具有RGD单元的纤维状蛋白质比不具RGD单元的纤维状蛋白质，对细胞呈现更多的细胞毒性(图4A)，此外亦发现纤维状蛋白质分子量对于纤维状蛋白质诱发的细胞毒性也会有影响(图4A)。

实施例2

材料及方法

材料：磷-Try^576/577FAK(phospho-Try^576/577FAK)、磷-Ser⁴⁷³Akt(phospho-Ser⁴⁷³Akt)及磷-Ser⁹GSK-3β(phospho-Ser⁹GSK-3β)的抗体购自Cell Signaling Technology公司(美国麻州比佛利市)。磷-Tyr³⁹⁷FAK(phospho--Tyr³⁹⁷FAK)的抗体购自Biosource公司(美国加州卡密里洛市)。Zwittergent 3-14购自于Calbiochem公司(美国加州圣地亚哥)。整联蛋白α5β1蛋白质(integrin α5β1protein)、抗β-肌动蛋白抗体(anti-β-actin antibody)、抗整联蛋白α5抗体(anti-integrin α5antibody)、抗-整联蛋白α5β1抗体(anti-integrinα5β1antibody)(功能抑制抗体)、辣根过氧酶结合的抗-鼠IgG二级抗体(horseradish peroxidase-coupled anti-mouse IgG secondary antibodies)、辣根过氧酶结合的抗兔IgG二级抗体(horseradish peroxidase-coupled anti-rabbit IgG secondary antibodies)及MTT试验组系购自于Chemicon公司(美国加州天美克拉市)。抗BSA抗体(anti-BSA antibody)购自Molecular Probes公司(美国奥勒冈州优琴市)。牛血清白蛋白购自Bio Basic公司(加拿大)。Aβ_25-35，购自于Sigma公司(美国密苏里州圣路易斯市)，溶解于无菌二次蒸馏水并在使用前于37℃熟化3天。硫代黄素T(ThT)、十二烷基硫酸钠(SDS)、4′，6′-二甲脒基-2-苯基吲哚二乳酸酯(4’，6’-Diamidino-2-phenylindole dilactate，DAPI)及其它化学品假如没有特别说明系Sigma公司(美国密苏里州圣路易斯市)得。Superdex-200、Superdex75购自Amersham Biosciences公司(瑞典Uppsala市)，HW55S凝胶过滤珠从TOSOH公司(日本东京都港区)取得。

纤维状牛血清白蛋白(F-BSA)的制备。20mg牛血清白蛋白(购自Bio Basic公司)溶解于10ml含1％SDS(w/v)的磷酸盐缓冲液。再将此牛血清白蛋白溶液震荡5分钟后，加入Superdex-200管柱或HWS 55管柱(2.6cmx100cm)，先以缓冲溶液(25mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA、0.1M NaCl及0.05％SDS)平衡。收集含牛血清白蛋白的区分。收集的区分接着用磷酸盐缓冲液透析以除去SDS。

透射电子显微镜(TEM)。为了以透射电子显微镜分析纤维状蛋白质，将1mg/ml蛋白质加入200-筛目覆碳铜格网。移除过量的样本且风干该格网。蛋白质-承载格网以1％(WN)磷钨酸负染色1分钟。透射电子显微相片乃是在20,000-150,000x放大倍率，以75Kv在Hitchi H-7000电子显微镜下观察得到。

硫代黄素T(ThT)荧光。为了荧光测量，浓度渐增的蛋白质(10μM、20μM及40μM)在20μM ThT中孵育。在室温孵育1小时后，以Wallac VICTOR²1420多标示计数器(Multilabel Counter)(购自Perkin Elmer life science公司)测量荧光，实验进行三重复。激发及放射波长分别为355nm及535nm。由缓冲液造成的ThT背景讯号会由对应的量测值中减去。

细胞株及处理。BHK-21细胞(获自仓鼠肾脏；ATCC CRL-1632)及T47D细胞(获自人类乳管癌；ATCC HTB-133)在以10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、2mM L-谷酰胺(L-glutamine)、100单位/ml盘尼西林(penicillin)及100μg/ml链霉素(streptomycin)补充的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(Dulbecco’s modified Eagle’smedium，DMEM)中于37℃保存。简言之，细胞接种24小时后进行处理，细胞以磷酸盐缓冲液清洗两次及并以无胎牛血清的DMEM中的蛋白质处理一段指定时间。接着细胞在指定的时间点以0.2ml溶解缓冲液(购自Pierce公司)溶解，并取30μg样品以蛋白质印迹法分析FAK、Akt及GSK-3β磷酸化作用。

细胞存活试验。细胞存活以MTT比色试验测定。将呈指数生长的细胞(BHK-21细胞为1x10⁴；T47D细胞为1.25x10⁴)置于96孔板中含10％胎牛血清的DMEM内并孵育24小时。在无血清DMEM中，以一系列浓度的纤维状蛋白质于37℃进行细胞处理8小时。处理后，MTT溶液加至每孔(0.5mg/ml)并孵育4小时。活细胞数目与甲潜(formazen)生成量成正比，甲潜在溶于异丙醇后，可于ELISA平板读取器内以光谱仪在560nm测定而得。

SDS-PAGE及免疫转印分析。细胞溶解液(cell lysate)在Hoefer垂直凝胶设备(购自Amersham Biosciences公司)中，以10％SDS-PAGE凝胶溶解，接着再以电泳传送至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride membranes)(购自Pall公司)。此膜以5％脱脂奶粉于含5mM Tris-HCl、pH 7.4、136mM NaCl、0.1％Tween-20(TBST缓冲液)溶液中阻隔处理1小时，并在阻隔缓冲液中与初级抗体(5-10μg/ml)培养。此膜接着以TBST中清洗，接着以辣根过氧酶结合的二级抗体(购自Chemicon公司)孵育。这些抗体乃是藉由曝露至Biomax ML膜(购自Eastman Kodak公可)以化学发光剂(SuperSignal West Pico，购自Pierce公司)检测。

免疫沉淀试验。将蛋白质A/G珠(购自Santa Cruz Biotechnology公司)藉由抗整联蛋白α5β1抗体涂布一层整联蛋白α5β1，取等体积(20μl)的蛋白质A/G，一组有涂布整联蛋白α5β1，一组没有。接着将这两组蛋白质珠在4℃分别与球状牛血清白蛋白(G-BSA)或纤维状牛血清白蛋白(F-BSA)孵育过夜。培养后，免疫复合物以磷酸盐缓冲液清洗三次并藉由与抗-整联蛋白α5及抗-牛血清白蛋白抗体进行免疫转印而显示出来。

细胞凋亡蛋白酶(Caspase-3)活性试验。根据制造商提供的指示，细胞凋亡蛋白酶活性的测试乃是藉由荧光物质z-DEVD-AMC(购自Upstate Biotechnology公司)断裂来分析。简言之，收获的细胞以磷酸盐缓冲液清洗二次，并在溶解缓冲液(购自Pierce公司)进行细胞溶解，该溶解缓冲液乃是补充蛋白质分解酶抑制剂混合物(购自Sigma公司)的。溶解液(cell lysate)在4℃以12,000x g离心15分钟，且上清液的蛋白质浓度用Bio-Rad蛋白质试验测定。50μg细胞溶解液的量在72μM z-DEVD-AMC中在室温孵育15分钟后分析细胞凋亡蛋白酶活性(三重复)。z-DEVD-AMC的断裂乃是以荧光平板读取器(flurescence plate reader)在380nm激发后量测在460nm放射值而决定。

图示

第5图。纤维状牛血清白蛋白的细胞凋亡作用。(图A)BHK-21细胞以1μM G-BSA(BSA)或F-BSA(BSA-S200)孵育3小时。细胞在荧光显微镜下观察，且其细胞核以DAPI染色(在所有镶板中放大倍率x400)。(图B)BHK-21细胞以40μM Aβ_25-35孵育3小时。细胞在荧光显微镜下观察，且其细胞核以DAPI染色(在所有镶板中放大倍率x400)。(图C)BHK-21细胞在无血清培养基中以0.8μM G-BSA或F-BSA孵育15小时，接着进行细胞凋亡蛋白酶活性分析。细胞凋亡蛋白酶活性以材料及方法中所提及的方法测量荧光基质(fluorogenic substrate)。数据以平均值±三重复实验的标准差表示。

第6图。纤维状牛血清白蛋白(F-BSA)及整联蛋白α5β1间的互动。(图A)T47D细胞株以或不以抗整联蛋白α5β1抗体预处理30分钟，接着在无血清培养基中以不同浓度的F-BSA(BSA-S200)处理8小时。处理后，细胞存活由MTT试验测定。数据以平均值±S.D.(n＝3)表示。(图B)整联蛋白α5β1蛋白质藉由抗-整联蛋白α5β1抗体而连接至蛋白质A/G珠，并接着以F-BSA(BSA-S200)或天然牛血清白蛋白(G-BSA)孵育过夜。免疫复合物的分离乃是藉由SDS-PAGE和以抗整联蛋白α5及抗牛血清白蛋白抗体进行免疫转印(IB)。

第7图。纤维状牛血清白蛋白(F-BSA)经整联蛋白FAK/Akt途径诱发细胞毒性。(图A)在一段指定时间内，BHK-21细胞在无血清培养基以3μM F-BSA处理，且细胞溶解液使用抗-磷-FAK(Tyr^576/577)或抗-磷-FAK(Tyr³⁹⁷)为初级抗体的蛋白质印迹法进行分析。(图B)BHK-21细胞以或不以抗-α5β1抗体预处理30分钟，接着在一段指定时间，在无血清培养基中以3μM F-BSA处理。处理后，细胞溶解液藉由使用抗-磷-Akt(p-Akt)及抗-磷-GSK-3β(p-GSK-3β为初级抗体(primary antibody)的蛋白质印迹法分析。为求标准化，以β-肌动蛋白做为内部对照组。(图C)BHK-21细胞在无血清培养基中以浓度渐增的天然牛血清白蛋白处理1小时且细胞溶解液使用抗-磷-Akt(p-Akt)为初级抗体进行蛋白质印迹法分析。(图D)BHK-21细胞在无血清培养基中以或不以抗-α5β1抗体预处理1小时，且细胞溶解液乃是以使用抗-磷-Akt(p-Akt)为初级抗体进行蛋白质印迹法分析。

结果

纤维状牛血清白蛋白诱发BHK-21细胞的细胞凋亡。为了解释F-BSA-诱发的细胞毒性是否与细胞凋亡有关，量测DAPI染色及细胞凋亡蛋白酶活性。结果显示，相较于牛血清白蛋白及淀粉状蛋白质(图5B)，纤维状牛血清白蛋白会诱发细胞核凝结(图5A)及增加细胞凋亡蛋白酶的活性(图5C)。综言之，实验结果显示F-BSA诱发细胞凋亡。

纤维状牛血清白蛋白经由整联蛋白/FAK/Akt/GSK-3β途径而诱发细胞死亡。除了对BHK-21细胞具毒性外，F-BSA亦对癌细胞如T47细胞(一种乳癌细胞株)也具有细胞毒性，如图6A所示。为了探讨F-BSA诱发的细胞凋亡是否经由整联蛋白，其已知可调控多种程序包含细胞增殖、型态、迁移及细胞凋亡。将T47D细胞以浓度渐增的抗-α5β1抗体预处理30分钟，接着在无血清培养基中以F-BSA(例如BSA-S200)孵育8小时。细胞存活率结果指出，以抗-α5β1抗体预处理的T47D细胞，F-BSA对细胞的毒性有减低的效果(图6A)。进一步以免疫沉淀法探讨F-BSA及整联蛋白的间的交互作用，由对照组或与整联蛋白α5β1蛋白质结合的小珠与牛血清白蛋白或F-BSA的孵育结果显示，F-BSA而非牛血清白蛋白结合至整联蛋白α5β1(图6B)。

接着探讨在整联蛋白信号传递途径的串阶(cascade)中有关的分子如局部黏合激酶(focal adhesion kinase，FAK)、Akt及GSK-3β，是否受F-BSA影响。结果显示F-BSA会使FAK在397干酪胺酸位置(Tyr397)进行脱磷反应，且此反应是以时间依赖方式进行，但不是在FAK的576/577(Tyr576/577)干酪胺酸的位置进行脱磷(图7A)；同时，蛋白质印迹法亦显示F-BSA，以时间依赖方式去除Akt以及GSK-3β上的磷酸根(图7B)，且F-BSA在Akt及GSK-3β磷酸化的作用也可以因浓度渐增的抗-α5β1抗体预处理细胞而回复(图7B)。相较的下，天然牛血清白蛋白和抗-α5β1抗体不影响Akt的磷酸化反应(图7C及7D)。因此，以上这些结果都说明F-BSA经由整联蛋白/FAK/Akt/GSK-3β/细胞凋亡蛋白酶途径诱发细胞凋亡。

讨论

虽然天然牛血清白蛋白不是整联蛋白的配位基(图6B)，但纤维状的牛血清白蛋白(F-BSA)却可藉由结合至整联蛋白α5β1而造成细胞凋亡(图5及6)。F-BSA藉由结合至整联蛋白α5β1造成FAK(Tyr397)、Akt及GSK-3β的去磷酸化而调控细胞凋亡。在此发明中产生的F-BSA去活化整联蛋白信号途径的机制，似乎不同于Aβ所诱发的机制。

虽然牛血清白蛋白不具有RGD单元，RGD单元是整联蛋白的独特结合单元，但纤维状牛血清白蛋白却可以结合至整联蛋白，其机制似乎与是否含有RGD的单元不具有完全相关性。甚至我们发现，虽然有些蛋白质，含有RGD单元具有细胞毒性，但其它如纤连蛋白，也具有RGD单元，但纤连蛋白不具细胞毒性(Fornaro等人发表于Journal of Biological Chemistry 278(50)：50402-504011：2003)。

实施例3

之的前实验发现牛血清白蛋白利用Superdex-75在8M尿素存在下，可诱发未折叠的牛血清白蛋白具有原纤维形式；重组蛋白质VP1也有相同的情形，有原纤维形成。此结果可由ThT的增加(图8)及细胞毒性的(图9)而证实。尿素的使用浓度并不限定于8M，其它摩尔比亦可促进蛋白质展开(unfolding)至相同或较少程度。

实施例4

材料及方法

材料：抗TLR2的抗体购自Abcam公司。抗TLR2单克隆抗体(拮抗抗体)购自eBioscience公司。对照组IgG、纤连蛋白(fibronectin，FN)及辣根过氧酶结合的抗兔IgG二级抗体购自于Chemicon公司。牛血清白蛋白(BSA)购自Bio Basic公司。抗牛血清白蛋白抗体购自Invitrogen公司。硫代黄素T(ThT)及十二烷基硫酸钠(SDS)购自于Sigma公司。

重组蛋白质VP3在大肠杆菌中的表达与纯化。VP3为口蹄疫病毒(FMDV)的衣壳蛋白组成成份。VP3基因以PCR从pIBSY1-P1质粒中扩增，引物为5′-CCGGGATCCAAGCTTGGGATTTTCCCCGTGGCA-3′及5′-CCGCTCGAGTTGGGTTCGGGCGTCGAC-3′(Yang等人发表于The Journal of Gene Medicine 7：708-717：2005)，其分别于N端引入BamHl位点及于C端引入Xhol位点。为了加速由大肠杆菌衍生的重组蛋白质的VP3纯化及分析，分别在VP3基因的N-及C-端接附T7标帜及His标帜。在限制酶水解后，将此扩增的基因接合在pET24a(+)(Novagene，WI)的BamHl及Xhol位点间并转化到DH5α感受态细胞中。可辨识的阳性克隆(positive clone)以测序方法确定。由阳性株的质粒pVP3转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。基因重组的VP3(rVP3)在于大肠杆菌中表达后，依照Wang等人发表于Vaccine 21：3721-3729：2003中的方法纯化。

以管柱层析法制备纤维状蛋白质。为了制备BSA-S200及FN-S200，以10ml磷酸盐缓冲液-溶解的蛋白质(2mg/ml)溶液，加入SDS(10％；w/v)直至其达到最终浓度为1％，震荡5分钟后，将含SDS-蛋白质溶液加入Superdex-200管柱(2.6cmx100cm，购自Amersham Biosciences公司)，先以含25mM Tris-HCl、pH 8.0、1mMEDTA、0.1M NaCl及0.05％SD S的缓冲溶液平衡，再收集含蛋白质的区分。此收集的区分接着以磷酸盐缓冲液透析4.5小时(3次；1.5小时/次)以除去SDS。

透射电子显微镜(TEM)。对于以透射电子显微镜分析以或未以管柱层析处理的蛋白质，等量蛋白质施用至200-筛目覆碳铜格网。移除过量的样本且风干该格网。蛋白质-承载格网以1％(WN)磷钨酸负染色1分钟。透射电子显微相片乃是在20,000-150,000x放大倍率，以75Kv在Hitachi H-7000电子显微镜下观察。

硫代黄素T(ThT)荧光。为了荧光测量，将浓度渐增的蛋白质于20μM ThT中孵育。在室温孵育1小时后，在Wallac VICTOR² 1420多标示计数器(购自Perkin Elmer life science公司)测量荧光，每个测试进行三重复。激发及放射波长分别为355nm与535nm。由缓冲液造成的ThT背景讯号会由对应的量测值中减去。

细胞株。小鼠巨噬细胞细胞株RAW264.7及人类胚胎肾脏细胞株(HEK 293T)保存于37℃，于添加10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷酰胺、100单位/ml盘尼西林及100μg/ml链霉素的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)中，及于含有5％CO₂潮湿空气下。

SDS-PAGE及免疫转印分析。样品在Hoefer垂直凝胶设备(购自Amersham Biosciences公司)中以10％或12％SDS-PAGE凝胶分离，接着以电泳传送至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride membrane)(购自Pall公司)。此膜在PB ST中以5％的脱脂奶粉阻隔处理1小时，并在阻隔缓冲液中与初级抗体(5-10μg/ml)培养。此膜接着以PB ST清洗，接着以辣根过氧酶结合的二级抗体(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody)(购自Chemicon公司)孵育。抗体的检测乃是藉由曝露至Biomax ML膜(购自Eastman Kodak公司)以化学发光剂检测(chemiluminescence)(SuperSignal West Pico，购自Pierce公司)。

免疫沉淀试验。RAW 264.7细胞的溶解是在补充蛋白酶抑制剂的混合物(protease inhibitor mixture)(购自Sigma-Aldrich公司)的冷细胞溶解缓冲液(购自Pierce公司)中进行。等量的蛋白质A/G珠以或未以rVP3-S200覆盖，此小珠接着与RAW 264.7细胞溶解液在4℃孵育过夜，产生的小珠以离心方式收集并以冷溶解液清洗三次。免疫复合物内的蛋白质乃是藉由在SDS试样缓冲液中沸腾而洗脱出来，并以SDS-PAGE与专一抗体免疫转印(immunoblotted)进行分析。

免疫荧光及共焦显微镜。RAW 264.7细胞的次集生单层(subconfluent monolayer)生长于24-井组织培养皿内的12-mm盖玻片上，以牛血清白蛋白或BSA-S200在4℃中处理1小时，于无胎牛血清补充的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)孵育。孵育后，以磷酸盐缓冲液清洗并以4％聚甲醛(paraformaldehyde)固定，固定后，除去聚甲醛，将此单层细胞与初级抗体在室温孵育1小时。进行双重标记(double labeling)时，细胞与两种抗体一起孵育。初级抗体的稀释比例如下：抗TLR2(1/10.0)及抗牛血清白蛋白(1/200)。再以PBST清洗三次后，将细胞在室温下与荧光共轭的二级抗体(secondary antibody)，羊抗兔IgG(goat anti-rabbit IgG)(1/500；Alexa Fluor 488；购自Molecular Probes公司)或羊抗鼠IgG(goat anti-mouse IgG)(1/500；Alexa Fluor 555；购自Molecular Probes公司)孵育30分钟。孵育后，将此盖玻片以PBST清洗三次，并放置在LSM 510META共焦显微镜上检测。

荧光酶报导基因试验。人类TLR2在人类胚胎肾细胞(HEK293T)中短暂表达并接着检测其对样品的反应。HEK293T细胞的转染是在pRK-FLAG-TLR2进行，将含有人类TLR2基因或pcDNA3.1空载体做为对照组；pNFkB-Luc含有荧光酶报导基因，受到NF-_kB结合DNA序列而调节。此荧光酶基因仅有当NF-_kB结合至DNA序列时才会表达。为使转染效率标准化，细胞以pcDNA3.1-β-gal共转染(cotransfected)。将质粒Lipofectamine2000(购自Invitrogen公司)藉由转染方式(transfection)导入至HEK293T细胞中。简言之，HEK293T细胞在96-井板中于37℃孵育过夜，浓度为2.5x 10⁴细胞/井，培养基为0.1ml以10％热去活的胎牛血清(FBS)、100单位/ml盘尼西林及100μg/ml链霉素补充的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)。培养基在即将转染前以Opti-MEMI(购自Invitrogen公司)替换。转染混合物的制备系藉由在25μl的OPTI-MEMI培养基稀释0.3μl Lipofectamine2000，在该培养基中于室温孵育20分钟后接着在25μl OPTI-MEMI加入0.1μg质粒DNA(0.01μg/井的pRK-FLAG-hTLR2或pcDNA3.1做为空载体、0.07μg/井的p5xNFkB-luc报导质粒(购自Stratagene公司)及0.02μg/井的pcDNA3.1-βgal)。DNA-Lipofectamine 2000混合物接着加至细胞并温和振荡混合。在5％CO₂于37℃孵育24小时后，细胞以样品刺激。如阳性对照组，细胞以TLR2配位基Pam3CSK4(购自InvivoGen公司)刺激6小时后，细胞溶解并使用荧光酶试验系统(购自Promega公司)检测荧光酶活性。细胞以100μl磷酸盐缓冲液清洗二次并以100μl被动细胞溶解缓冲液(passive lysis buffer)(购自Promega公司)溶解。取20μl细胞溶解液测量荧光酶活性。每一样品荧光酶活性标准化至β-半乳糖苷酶(β-galatosidase)活性。实验数据乃是以被空载体转染的未受刺激的对照细胞活性的倍数来表示。

细胞因子以ELISA定性分析。表达TLR2的短暂转染的HEK293T细胞以及小鼠巨噬细胞细胞株RAW 264.7分别以TLR2-专一配位基或纤维状蛋白质刺激6或24小时。收集细胞培养基上清液并使用细胞因子-专一性ELISA(购自Biosource International公司的IL-6、IL-8及TNF-αELISAs)进行分析。

图示

第10图。Superdex-200管柱分析促进纤维状蛋白质的形成。透射电子显微镜照片显示由superdex200管柱分析制备的BSA-S200、rVP3-S200及FN-S200的纤维状结构(图B、C及E)。做为对照组的是天然的牛血清白蛋白及FN，在透射电子显微镜照片显示呈现球状结构(图A及D)。由图F及G显示BSA-S200或FN-S200与20μM淀粉状蛋白质-专一染料ThT孵育后，与天然牛血清白蛋白或FN比较时，得到提高ThT荧光的结果。这些数值得自于三次独立量测。最终数据以平均值±S.D.(n＝3)表示。

第11图。纤维状蛋白质与TLR2交互作用。(图A)，来自RAW264.7细胞溶解液与固定于蛋白质A/G珠的rVP3-S200孵育过夜或只与蛋白质A/G珠孵育过夜；蛋白质A/G珠-整联蛋白质由SDS-PAGE分离并与抗-TLR2抗体或抗-FMDV抗体免疫转印。牛血清白蛋白或BSA-S200在4℃以0.3μM浓度吸附至RAW 264.7单层(RAW264.7monolayer)。接着如材料及方法所述进行IF染色，牛血清白蛋白或BSA-S200以抗-牛血清白蛋白抗体染色并以Alexa Fluor488(绿)显现(visualized)(图B及E)，而TLR2以抗-TLR2抗体染色并以Alexa Fluor 555(红)显现如图C及F。在合并影像(图G)中的箭号指向一些共定位区域(co-localized area)。

第12图。藉TLR2纤维状蛋白质的讯号。HEK293/TLR2细胞以(图A)0.3μM rVP1；(图B)0.2μM牛血清白蛋白、BSA-S200、FN、或FN-S200，刺激6小时后，细胞溶解，测量NF_KB报导荧光酶量(图C)，HEK293/TLR2细胞以Pam3C SK4(0.5μg/ml)或增加浓度的SDS刺激6小时后，溶解细胞，测量NF_KB报导荧光酶(NF_KB reporter luciferase)量。(图D)HEK293/TLR2细胞以10μg/ml中和的抗TLR2抗体预处理1小时，或以对照组IgG预处理1小时。细胞接着与Pam3CSK4(0.5μg/ml)、BSA-S200(0.2μM)、FN-S200、或rVP3-S200(0.2μM)孵育6小时后，溶解细胞，测量NFKB报导荧光酶量。这些数值来自于3个独立量测。最终数据以平均值±S.D.(n＝3)表示。

第13图。纤维状蛋白质-诱发细胞因子的产生是经由TLR2。(图A)RAW 264.7细胞以不同浓度的牛血清白蛋白或BSA-S200孵育24小时后，使用ELISA分析培养基的IL-6。(图B)HEK293/TLR2细胞以10μg/ml中和的抗TLR2抗体或对照组IgG预处理1小时。细胞接着以Pam3CSK4(0.5μg/ml)、BSA-S200(0.2μM)、FN-S200、或rVP3-S200(0.2μM)孵育6小时后，使用ELISA分析培养基的IL-8。(图C)RAW 264.7细胞以10μg/ml中和的抗TLR2抗体或对照组IgG预处理1小时，接着以BSA-S200(0.2μM)或FN-S200(0.2μM)孵育24小时后，使用ELISA分析培养基的IL-6。这些数值来自于3个独立测量。最终数据以平均值±S.D.(n＝3)表示。

结果

蛋白质在通过Superdex-200管柱后呈现淀粉状蛋白样纤维状性质。使用透射电子显微镜及硫代黄素T(ThT)试验分析蛋白质在经Superdex-200管柱管柱层析后的结构特性，透射电子显微镜分析显示BSA-S200、rVP3-S200及FN-S200呈现纤维状结构(图10B、10C及10E)。相反地，天然的牛血清白蛋白及FN呈现球形结构(图10A及10D)。淀粉状蛋白样原纤维的荧光发射专一染料ThT，将该染料与蛋白质孵育。数据显示BSA-S200及FN-S200以剂量依赖方式增进ThT的荧光发射(图10F及10G)。

纤维状蛋白质与TLR2交互作用。使用免疫沉淀流程进行分析rVP3-S200与RAW 264.7细胞上的TLR2结合作用。在此流程中RAW细胞溶解液会暴露于覆盖有rVP3-S200的小珠或对照珠之中。连结rVP3-S200的小珠与RAW细胞溶解液的孵育结果显示rVP3-S200会结合至TLR2，而对照组则不会(图11A)。为了更进一步探讨BSA-S200是否与TLR2共定位(colocalized)，进行免疫荧光-共焦显微镜检视。将牛血清白蛋白或BSA-S200在4℃加至RAW 264.7细胞1小时，并以共焦显微镜测定牛血清白蛋白或BSA-S200的定位。结果显示BSA-S200会与TLR2共定位，而牛血清白蛋白则不会(图11B-G)。

纤维状蛋白质激活TLR2。以rVP1-S200(0.3μM)、BSA-S200(0.2μM)或FN-S200(0.2μM)刺激使人类细胞大量表达过度表达TLR2，会导致的刺激作用造成NF_KB的显著活化作用，但牛血清白蛋白与FN的球状形式则否(图12A及12B)。为了更进一步探讨调查TLR2的专一性，将TLR2-表达细胞(之HEK293T细胞)以抗TLR2抗体预处理1小时，细胞接着以Pam3C SK4(0.5μg/ml)、BSA-S200(0.2μM)、FN-S200(0.2μM)、或rVP3-S200(0.2μM)刺激。Pam3CSK4为一已知的TLR2的配位基(ligand)，可且做为一阳性对照组。于在6小时孵育后，细胞溶解、测定NF_KB活化作用。结果发现以抗-TLR2的预处理的细胞显著降低NF_KB活性，以异型(isotype)抗体预处理的对照组则否(图12D)。另外，因为本发明中使用SDS制备纤维状蛋白质，所以也测试SDS对TLR2活化作用的影响。数据显示随着SDS增加浓度，对TLR2的活化并无影响(图12C)。需注意，以SDS处理后通过Superdex-75管柱(BSA-S75)洗脱出的牛血清白蛋白，显示会活化TLR2，但相较BSA-S200为低。

纤维状蛋白质诱发细胞因子的释放。RAW 264.7细胞以不同浓度的牛血清白蛋白或BSA-S200孵育24小时后，使用ELISA分析培养基的IL-6。发现BSA-S200而不是牛血清白蛋白，以剂量依赖方式诱发IL-6产生(图13A)。同时也利用TLR2阻断抗体(TLR2blocking antibody)评估TLR2在细胞因子产生的关系。表达TLR2的HEK293T细胞(图13B)及RAW 264.7细胞(图13C)以抗-TLR2抗体或对照组IgG预处理1小时，接着以Pam3CSK4(0.5μg/ml)、BSA-S200(0.2μM)、FN-S200(0.2μM)、或rVP3-S200(0.2μM)刺激细胞并测量IL-8及IL-6产生。结果显示BSA-S200、FN-S200及rVP3-S200的存在导致表达TLR2的HEK293T或RAW 264.7细胞产生的IL-8及IL-6量增加。另一方面，抗-TLR2抗体而非对照组IgG的预处理会显著地降低细胞因子的生产(图13B及13C)。

讨论

免疫沉淀及免疫荧光研究显示纤维状蛋白质会结合至TLR2(图11)。TLR2为类铎受体(toll-like receptors)之一，负责调节细胞对与微生物共享的保守分子模式(conserved molecular patterns)反应。TLR2可以辨识多种配位基(Miyake.发表于Seminars in Immunology 19：3-10：2007；Kaisho等人发表于Biochimica et Biophysics Acta 1589：1-13：2002)、促进巨噬细胞产生细胞因子(Tsuji等人发表于Infection and Immunity 68：6883-6890：2000；Basu等人发表于The Journal of Biological Chemistry 279：7370-7377：2004)。在此发明中发现以管柱诱发产生的纤维状蛋白质在RAW264.7细胞中以剂量依赖方式诱发IL-6产生(图13A)。RAW 264.7(图13C)或TLR2表达的HEK293T细胞(图12C及13B)以抗-TLR2抗体的预处理后，会减少由纤维状蛋白质诱发的细胞因子产生。这些数据显示以管柱诱发产生的纤维状蛋白质为TLR2的促进剂，并诱发免疫细胞释放细胞因子。

数种研究已说明类铎受体(toll-like receptors)做为佐剂受体(Hawkins等人发表于The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 300：655-661：2002)。譬如佛恩得佐剂(Freund adjuvant)诱发在鼠的肝中表达诱发TLR2表达(Lim.发表于International Immunopharmacology 3：115-118：2003)。另外TLR2可调节媒介其脂蛋白配位基-脂蛋白的佐剂活性(Ishii等人发表于Journal of clinical Immunology 27：363-371：2007)。同时TLR2及TLR4也相亦有关于BCG-CWS的免疫反应，BCG-CWS为分枝杆菌(mycobacteria)的组成成份，为一种有效的免疫佐剂(Tsuji等人发表于Infection and Immunity 68：6883-6890：2000)。本发明是此研究有关于发现纤维状蛋白质经由活化经由TLR2的活化作用而诱发细胞因子产生产的纤维状蛋白质的发现。将抗原转化为纤维状形式可增加抗原的抗原性。而且因此，不需额外佐剂。

在这些类铎受体中，TLR2辨识广泛范围的配位基，如格兰氏阳性细胞壁(Yoshimura等人发表于J Immunol 163：1-5：1999)、脂聚醣(lipopolysaccharides，LPS)(Bainbridge等人发表于Cellular Microbiology 8：120-129：2006；Reife等人发表于Cellular Microbiology 8：857-868：2006；Jotwani等人发表于European Journal of Immunology 33：2980-2986：2003)、孔蛋白(porin)(Massari等人发表于J Immunol 176：2373-2380：2006；Singleton等人发表于J Immunol 174：3545-3550：2005)、肽聚糖(peptidoglycan，PGN)(Tsuji等人发表于Infection and Immunity 68：6883-6890：2000；Uehori等人发表于Infection and Immunity 71：4238-4249：2003)、脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomannan)(Underhill等人发表于Proc Nat Acad Sci 96：14459-14463：1999；Means等人发表于J Immunol 163：3920-3927：1999；Tapping等人发表于Journal of Endotoxin Research9：264-268：2003)、酚可溶的调控蛋白(phenol-soluble modulin)(Najjar等人发表于J Immunol 166：15-19：2001)、病毒粒子(virions)(Compton等人发表于Journal of Virology 77：4588-4596：2003)、醣环己六醇磷脂质(glycoinositolphospholipids)(Campos等人发表于J Immunol 167：416-423：2001)、醣脂类(glycoli pid)(Opitz等人发表于The Journal of Biological Chemistry 276：22041-22047：2001)、脂质A(Onier等人发表于International Journal of Cancer 81：755-760：1999；Onier等人发表于Clinical & Experimental Metastasis17：299-306：1999)、醣脂蛋白(Lopez等人发表于J Immunol 170：2409-2416：2003)、脂蛋白/脂肽(Ozinsky等人发表于Proc Nat Acad Sci 97：13766-13771：2000；Hirschfeld等人发表于J Immunol 163：2382-2386：1999)、酵母聚糖(zymosan)(Underhill等人发表于Nature401：811-815：1999)、热休克蛋白质(HSP)(Ohashi等人发表于JImmunol 164：558-561：2000；Asea等人发表于The Journal of Biological Chemistry 277：15028-15034：2002)、细胞外间质(extracelluar matrix，ECM)组成成份(双多醣或玻尿酸)(Schaefer等人发表于The Journal of Clinical Investigation115：2223-2233：2005；Jiang等人发表于Nature Medicine 11：1173-1179：2005)、高移动性基匣1(high-mobility group box 1，HMGB 1)(Park等人发表于The Journal of Biological Chemistry 279：7370-7377：2004)、细菌或病毒蛋白质(Basu等人发表于The Journal of Biological Chemistry282：1039-1050：2007)、脂磷多醣(lipophosphoglycan，LPG)(Becker等人发表于Molecular and Biochemical Parasitology 130：65-74：2003)、巨噬体活化脂肽-2(MALP-2)(Takeuchi等人发表于International Immunology 13：933-940：2001；Schneider等人发表于Gut 53：355-361：2004)、热致死细菌或酵母(Flo等人发表于JImmunol 164：2064-2069：2000；Netea等人发表于J Immunol 172：3712-3718：2004；Taylor等人发表于The Journal of allergy and Clinical Immunology 117：1148-1154：2004)、外膜蛋白质A(Jeannin等人发表于Nature Immunology 1：502-509：2000)、可溶因子(Wyllie等人发表于J Immunol 165：7125-7132：2000；Henneke等人发表于J lmmunol 167：7069-7076：2001)及脂壁酸(lipoteichoic acid，LTA)(Schwandner等人发表于The Journal of Biological Chemistry274：17406-17409：1999；Han等人发表于Infection and Immunity 71：5541-5548：2003；Schroder等人发表于The Journal of Biological Chemistry 278：15587-15594：2003)。研究亦显示由TLR2辨识的多种配位基为归因于杂二聚体与其它TLR、TLR1或TLR6的形成(Bauer等人发表于Proc Nat Acad Sci 98：9237-9242：2001；Sugawara等人发表于Microbiology and Immunology 47：327-336：2003；Takeuchi等人发表于Gene 231：59-65：1999)。已建议TLR1/TLR2的杂二聚体可辨识三酰基化的脂蛋白，同时TLR2/TLR6辨识二酰基化的脂蛋白(Takeuchi等人发表于J Immunol 169：10-14：2002)。

虽然方法及试剂以依目前认为最实用及最佳实施例描述，需了解本发明的披露不限制于文中所披露的实施例，实施例可能经过熟悉技艺者润饰及转用。本发明欲涵括申请专利范围的技术思想与范畴中不同的润饰及相似配置，该范围应依最广的解释以涵括所有润饰及类似结构。本发明包含下列申请专利范围的任何及所有实施例。