间隙连接蛋白及其编码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物中的应用

摘要

本发明公开了间隙连接蛋白及其编码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物中的应用；本发明考察了肿瘤干细胞中间隙连接通讯的功能状态、间隙连接蛋白的表达情况以及其同肿瘤干细胞特殊生物学特性之间的关系，结果显示，同分化肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞中存在间隙连接通讯障碍，细胞间未见明显间隙连接样结构，多种间隙连接蛋白表达下调，尤其是间隙连接蛋白43(Cx43)；Cx43的表达下调与其编码基因GJA1启动子甲基化以及microRNA的表达相关；恢复Cx43在肿瘤干细胞中的表达，能够显著降低肿瘤干细胞的自我更新能力、成瘤能力和侵袭能力，这与间隙连接通讯功能的部分恢复、E-钙粘素表达上调以及SDF-1/CXCR4下游信号通路(AKT和ERK1/2)失活有关；提示间隙连接蛋白及其编码基因可用于制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及间隙连接蛋白及其编码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的高发病率和高致死率疾病。传统肿瘤治疗都是针对所有的肿瘤细胞，而且认为肿瘤细胞具有功能同质性。近年来，随着肿瘤干细胞(Tumour stem cells，TSC)相继在不同的肿瘤组织中分离成功，有力的证明了肿瘤干细胞的存在，为深入探讨肿瘤的发生、发展及评价预后等提供了新的理论依据，也为肿瘤治疗带来了新的思路。越来越多的证据表明，肿瘤细胞具有功能异质性，在肿瘤细胞群体中，只有肿瘤干细胞亚群才有自我更新、多向分化及成瘤能力，是肿瘤发生、进展和复发的根源。只有杀灭肿瘤干细胞，才能达到根治肿瘤的目的。因此，肿瘤治疗的关键应是针对肿瘤干细胞的治疗。

间隙连接(gap junction，GJ)是细胞间连接方式的一种，由间隙连接蛋白(connexin，Cx)构成。相邻细胞间通过间隙连接介导的间隙连接通讯(gap junction intercelluar communication，GJIC)进行信息、能量和物质的交换，对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起重要的调控作用。在间隙连接蛋白家族中，间隙连接蛋白43(Cx43)表达最为广泛，对于保持正常的间隙连接通讯功能至关重要。

大量研究表明，间隙连接通讯功能缺陷与多种肿瘤的发生和转移密切相关。在肿瘤形成过程中，间隙连接通讯功能的抑制或缺失使前肿瘤细胞或转化细胞与周围正常细胞之间的信息传递受阻，失去周围正常细胞的调控而获得自主性生长，进而发展成肿瘤细胞。肿瘤细胞之间同型间隙连接通讯被破坏在导致肿瘤细胞异质性增加的同时可导致细胞之间解离，从而促进肿瘤转移，转移能力与间隙连接通讯呈负相关。而间隙连接通讯功能缺陷与间隙连接蛋白的表达降低或消失密切相关。许多肿瘤细胞如胶质瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌细胞等均显示相应的间隙连接蛋白表达降低或缺失。应用间隙连接蛋白基因转染肿瘤细胞，可见间隙连接蛋白表达升高，间隙连接通讯功能恢复，肿瘤生长和转化表型抑制。因此，间隙连接蛋白及其基因是良好的抗肿瘤药物靶标。但是，上述研究结果均是以肿瘤细胞为研究对象，而肿瘤干细胞中，间隙连接通讯的功能状态、间隙连接蛋白的表达情况以及其同肿瘤干细胞特殊的生物学特性之间的关系尚不清楚。

发明内容

有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供间隙连接蛋白及其编码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物中的应用。

为达到此目的，在本发明的第一方面，提供了间隙连接蛋白在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物中的应用。

进一步，所述肿瘤干细胞为胶质瘤干细胞；

进一步，所述药物包括间隙连接蛋白和药学上可接受的载体；

进一步，所述间隙连接蛋白为间隙连接蛋白43。

在本发明的第二方面，提供了间隙连接蛋白编码基因在制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物中的应用。

进一步，所述肿瘤干细胞为胶质瘤干细胞；

进一步，所述药物包括间隙连接蛋白编码基因重组表达载体和药学上可接受的载体；

进一步，所述间隙连接蛋白编码基因为间隙连接蛋白43的编码基因GJA1；

进一步，所述间隙连接蛋白编码基因重组表达载体为GJA1基因重组腺病毒，所述GJA1基因重组腺病毒是将人GJA7基因表达盒插入E1区缺失的复制缺陷型腺病毒载体的E1区缺失位置而得到；

进一步，所述人GJA1基因表达盒包括启动子、人GJA1基因cDNA和终止子，所述启动子为CMV，所述终止子为PloyA。

本发明的有益效果在于：本发明考察了肿瘤干细胞中间隙连接通讯的功能状态、间隙连接蛋白的表达情况以及其同肿瘤干细胞特殊的生物学特性之间的关系。结果显示，同分化肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞中存在间隙连接通讯障碍，细胞间未见明显间隙连接样结构，多种间隙连接蛋白表达下调，尤其是间隙连接蛋白43；间隙连接蛋白43的表达下调，与其编码基因GJA1启动子甲基化以及microRNA的表达相关；恢复间隙连接蛋白43在肿瘤干细胞中的表达，能够显著降低肿瘤干细胞的自我更新和成瘤能力，同时明显降低肿瘤干细胞的侵袭能力，这与间隙连接通讯功能的部分恢复、E-钙粘素(E-Cadherin)表达上调以及SDF-1/CXCR4下游信号通路(AKT和ERK1/2)失活有关。因此，间隙连接蛋白及其编码基因可用于制备逆转肿瘤干细胞恶性表型的药物，在肿瘤治疗领域具有良好的潜在应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1显示了6例人原代恶性胶质瘤标本P1～P6的切片HE染色结果；其中：P1为男性，45岁，右侧额叶，星形细胞瘤，II级；P2为女性，37岁，左侧颞叶，星形细胞瘤，II级；P3为男性，45岁，右侧额叶，多形性胶质母细胞瘤，IV级；P4为男性，55岁，左侧额叶和颞叶，多形性胶质母细胞瘤，IV级；P5为男性，55岁，右侧额叶，多形性胶质母细胞瘤，IV级；P6为男性，60岁，左侧顶叶和颞叶，多形性胶质母细胞瘤，IV级。

图2显示了肿瘤干细胞及其分化细胞形态的显微鉴定结果；其中：A～I为不同来源的肿瘤干细胞球：A来源于恶性胶质瘤U87细胞系，B来源于乳腺癌MCF-7细胞系，C来源于结肠癌HCT116细胞系，D～I来源于P1～P6；J～O为不同来源的肿瘤干细胞球的分化细胞：J来源于U87，K来源于MCF-7，L来源于HCT116，M～O来源于P1～P3，箭头所指处为肿瘤干细胞球；光学显微镜放大倍数为200倍。

图3显示了肿瘤干细胞标志物的免疫荧光染色鉴定结果；其中：A为来源于U87的肿瘤干细胞球鉴定巢蛋白(nestin)，红色荧光，标尺为20μm；B～D为来源于P1～P3的肿瘤干细胞球鉴定nestin，红色荧光，标尺依次为50、30和70μm；E为来源于U87的肿瘤干细胞球鉴定CD133，红色荧光，标尺为75μm；F～H为来源于P1～P3的肿瘤干细胞球鉴定CD133，红色荧光，标尺依次为50、25和50μm；I为来源于U87的肿瘤干细胞球鉴定八聚体结合蛋白-4(Oct4)，绿色荧光，标尺为100μm；J为来源于U87的肿瘤干细胞球鉴定CD44s，红色荧光，标尺为25μm；K为来源于MCF-7的肿瘤干细胞球鉴定CD44s，红色荧光，标尺为25μm；L为来源于HCT116的肿瘤干细胞球鉴定CD133，红色荧光，标尺为50μm；细胞核为蓝色荧光。

图4显示了肿瘤干细胞分化标志物的免疫荧光染色鉴定结果；其中：A～E为来源于U87的肿瘤干细胞球的分化细胞：A鉴定胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，红色荧光，标尺为75μm；B鉴定髓鞘碱性蛋白(MBP)，红色荧光，标尺为75μm；C鉴定β-微管蛋白III(β-tubulin III)，绿色荧光，标尺为75μm；D鉴定nestin，红色荧光，标尺为10μm；E鉴定CD133，红色荧光，标尺为25μm；F～J为来源于P1的肿瘤干细胞球的分化细胞：F和G鉴定GFAP，绿色荧光，F标尺为500μm，G标尺为75μm；H鉴定MBP，绿色荧光，标尺为50μm；I鉴定β-tubulinIII，绿色荧光，标尺为50μm；J鉴定nestin，绿色荧光，标尺为75μm；细胞核为蓝色荧光；箭头所指处为肿瘤干细胞球。

图5显示了肿瘤干细胞成瘤能力鉴定结果；其中：A为皮下接种1×10⁵个来源于U87的肿瘤干细胞8周，B为原位接种1×10⁴个来源于U87的肿瘤干细胞6周，C为原位接种5×10³来源于P3的肿瘤干细胞6周；箭头所指处为肿瘤。

图6显示了肿瘤干细胞的荧光漂白恢复实验结果；各组数据之间进行单因素方差分析和t检验：a：F＝30.24，P＝0.000＜0.01；b：P＝0.005＜0.01；c：P＝0.013＜0.05；d：P＝0.889＞0.05；e：t＝-2.805，P＝0.038＜0.05；f：t＝-4.514，P＝0.010＜0.05；g：t＝-4.930，P＝0.003＜0.01；h：t＝-1.414，P＝0.207＞0.05。

图7显示了肿瘤干细胞间隙连接样结构的显微检测结果；其中：A为来源于U87的肿瘤干细胞球的扫描电子显微图，标尺为10μm；B为来源于U87的肿瘤干细胞球的透射电子显微图，标尺为100μm；C为来源于U87的肿瘤干细胞球的分化细胞的透射电子显微图，标尺为200μm；方框区为细胞连接区，箭头所指处为间隙连接样结构。

图8显示了肿瘤细胞干细胞中间隙连接蛋白基因表达的RT-PCR检测结果；其中：1泳道为来源于U87的贴壁未成球肿瘤细胞，2泳道为来源于U87的肿瘤干细胞球。

图9显示了肿瘤干细胞中间隙连接蛋白基因表达的实时定量RT-PCR检测结果。

图10显示了肿瘤干细胞中间隙连接蛋白43表达的Western-blot检测结果；其中：1泳道为来源于U87的贴壁未成球肿瘤细胞，2泳道为来源于U87的肿瘤干细胞球。

图11显示了肿瘤干细胞中间隙连接蛋白43表达的流式细胞术检测结果；其中：无阴影曲线为来源于U87的肿瘤干细胞球，有阴影曲线为阴性对照。

图12显示了肿瘤干细胞中间隙连接蛋白43表达的免疫荧光染色检测结果；其中：A～F为不同来源的肿瘤干细胞球，A来源于U87，B～D来源于P1～P3，E来源于MCF-7，F来源于HCT116；G和I～L为不同来源的贴壁未成球肿瘤细胞，G来源于U87，I来源于P2，J来源于P3，K来源于MCF-7，L来源于HCT116；H为来源于U87的肿瘤干细胞球的分化细胞；A和C的标尺为100μm，B和D的标尺为50μm，E～L的标尺为25μm。

图13显示了肿瘤干细胞中干细胞标志物与间隙连接蛋白43的免疫荧光双重染色检测结果；其中：→所指处为干细胞标志物，绿色荧光；所指处为间隙连接蛋白43，红色荧光，细胞核为蓝色荧光。

图14显示了肿瘤干细胞中干细胞标志物与间隙连接蛋白43的免疫组织化学双重染色检测结果；其中：间隙连接蛋白43为深红色颗粒，干细胞标志物[Oct4、Sox2、少突胶质细胞转录因子-2(Oligo2)]为深棕色颗粒(箭头所指处和圆圈内)；光学显微镜放大倍数为200倍。

图15显示了肿瘤干细胞中GJA1基因启动子甲基化水平的检测结果；其中：A为高频声波处理染色质结果，其中M泳道为DNA分子量标准，+为经高频声波处理，-为未经高频声波处理，1泳道为来源于U87的贴壁未成球肿瘤细胞，2泳道为来源于U87的肿瘤干细胞球的分化细胞，3泳道为来源于U87的肿瘤干细胞球；B为实时定量PCR扩增GJA1基因启动子区域1和区域2的示意图；C和D分别为GJA1基因启动子区域1和区域2的扩增结果，其中1为来源于U87的贴壁未成球肿瘤细胞，2为来源于U87的肿瘤干细胞球的分化细胞，3为来源于U87的肿瘤干细胞球。

图16显示了肿瘤干细胞中以GJA1基因转录本为靶点的microRNA表达情况；其中：1为来源于U87的肿瘤干细胞球，2为来源于U87的贴壁未成球肿瘤细胞。

图17显示了GJA1基因重组腺病毒的滴度测定结果；其中：A为阴性对照，B为GJA1基因重组腺病毒Ad-Cx43，C为GFP基因对照腺病毒Ad-GFP；光学显微镜放大倍数为100倍。

图18显示了转染GJA1基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞形态的显微检测结果；其中，A为荧光显微镜鉴定结果，B为倒置相差显微镜鉴定结果。

图19显示了GJA1基因重组腺病毒转染效率的流式细胞术检测结果；其中：深色部分为阴性对照，浅色部分为GJA1基因重组腺病毒Ad-Cx43。

图20显示了转染GJA1基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞中GJA1基因表达的实时定量RT-PCR检测结果。

图21显示了转染GJA1基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞中间隙连接蛋白43表达的免疫荧光染色检测结果。

图22显示了转染GJA1基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞的荧光漂白恢复实验结果；各组数据之间进行单因素方差分析：a：t＝-2.350，P＝0.05；b：t＝-1.276，P＝0.249。

图23显示了转染GJA1基因重组腺病毒后，第1代肿瘤干细胞球生长情况检测结果；各组数据之间进行单因素方差分析：a：F＝61.82，P＝0.000＜0.01；b：P＝0.934＞0.05；c：P＝0.000＜0.01；d：P＝0.000＜0.01。

图24显示了转染GJA1基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞的分化生长曲线。

图25显示了皮下接种GJA1基因重组腺病毒转染的肿瘤干细胞后，裸鼠的肿瘤生长曲线。

图26显示了皮下接种GJA1基因重组腺病毒转染的肿瘤干细胞后，裸鼠的肿瘤组织切片HE染色结果；光学显微镜放大倍数为200倍。

图27显示了原位接种GJA1基因重组腺病毒转染的肿瘤干细胞后，裸鼠的肿瘤生长情况和肿瘤组织切片HE染色结果；其中：箭头所指处为肿瘤，光学显微镜放大倍数为200倍；右下角小图为裸鼠脑组织。

图28显示了转染GJA1基因重组腺病毒后，U87细胞分化标志物GFAP和干细胞标志物CD133的实时定量RT-PCR检测结果。

图29显示了转染GJA1基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞的侵袭能力检测结果[以胎牛血清(FBS)为招引物]；各组数据之间进行单因素方差分析：a：F＝22.480，P＝0.000＜0.01；b：P＝0.975＞0.05；c：P＝0.000＜0.01；d：P＝0.009＜0.01。

图30显示了转染GJA1基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞的侵袭能力检测结果[以基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)为招引物]；各组数据之间进行单因素方差分析：a：F＝16.860，P＝0.000＜0.01；b：P＝0.783＞0.05；c：P＝0.004＜0.01；d：P＝0.016＜0.05。

图31显示了转染GJA1基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞中E-Cadherin表达的Western-blot检测结果。

图32显示了转染GJA1基因重组腺病毒后，肿瘤干细胞中E-Cadherin表达的免疫荧光染色检测结果；其中Ad-Cx43转染组的标尺为10μm，Ad-GFP转染组的标尺为50μm。

图33显示了转染GJA1基因重组腺病毒的肿瘤干细胞接受SDF-1α刺激后，磷酸化AKT和ERK1/2表达的Western-blot检测结果。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

优选实施例中的主要试剂：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自Upstate公司，表皮细胞生长因子(EGF)和胰岛素(insulin)购自Sigma公司，自血病抑制因子(LIF)购自Chemicon公司，B27添加剂购自Gibco公司；小鼠抗人nestin单克隆抗体、兔抗人MBP多克隆抗体、小鼠抗人β-tubulin III单克隆抗体、小鼠抗人Sox2单克隆抗体和小鼠抗人Oligo2单克隆抗体购自Chemicon公司，小鼠抗人CD133单克隆抗体购自Abcam公司，兔抗人Oct4多克隆抗体购自BioVision公司，小鼠抗人CD44s单克隆抗体购自Neo Markers公司，兔抗人GFAP多克隆抗体购自Dako公司，异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗兔IgG、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记山羊抗兔IgG和Cy3标记山羊抗鼠IgG购自Molecular Probes公司，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自Sigma公司，基质胶购自Sigma公司；试剂盒：TaRaKa RNAPCR kit 3.0和SYBR PrimeScript PCR kit购自TaRaKa公司，增强型化学发光试剂盒购自ECI公司，EnVision两步法免疫组化试剂盒购自Dako公司，Adenovirus titer immunoassay Kit购自Cell Biolabs公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自Dojindo公司。

优选实施例中的主要仪器：KYKY-EM3200型扫描电子显微镜购自北京中科科仪技术发展有限责任公司，JEM-2000Ex型透射电子显微镜购自日立公司，AlphaEase FC凝胶图像分析软件购自Alpha Innotech公司，Coulter Epics XL型流式细胞仪购自Beckman Coulter公司，MiRCURY^TM微阵列系统购自Exiqon公司，μQuant型酶标仪购自Bio-TEK公司。

优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、肿瘤干细胞的分离与鉴定

1、肿瘤干细胞的分离

分别从人恶性胶质瘤细胞系U87、乳腺癌细胞系MCF-7、结肠癌细胞系HCT116以及6例人原代恶性胶质瘤标本P1～P6(如图1所示)中分离肿瘤干细胞。

从U87、MCF-7或HCT116中分离肿瘤干细胞：在24孔培养板中，将U87、MCF-7或HCT116细胞以2×10⁴/孔的密度接种于500μl含有体积分数为10％的FBS的DMEM培养基中，在温度为37℃、CO₂体积分数为5％和饱和湿度的条件下培养；接种后12～18小时，加入500μl无血清干细胞培养基，之后每隔24小时半量更换新鲜无血清干细胞培养基1次；5日后，更换为完全无血清干细胞培养基；约1周后，待悬浮生长的肿瘤干细胞球增大至每球含200个细胞时，收集细胞球，吹打成单细胞悬液，再接种于无血清干细胞培养基中进行传代。

从P1～P6中分离肿瘤干细胞：将P1～P6剪成约1×1×1mm大小的碎块，接种于0.5ml FBS中，在温度为37℃、CO₂体积分数为5％和饱和湿度的条件下培养，接种4小时后，加入3ml含有体积分数为10％的FBS的DMEM培养基，待单层细胞出现后，用质量分数为0.25％的胰酶溶液消化，吹打成单细胞悬液，再接种于无血清干细胞培养基中，约1～2周后，待悬浮生长的肿瘤干细胞球增大至每球含100个细胞时，收集细胞球，吹打成单细胞悬液，再接种于无血清干细胞培养基中进行传代。

上述无血清干细胞培养基的组成如下：DMEM/F12培养基，其中含有浓度为20ng/ml的bFGF、浓度为20ng/ml的EGF、浓度为10ng/ml的LIF、浓度为4U/L的胰岛素和1×B27。

2、肿瘤干细胞的鉴定

(1)肿瘤干细胞及其分化细胞的形态鉴定

分别将U87、MCF-7、HCT116和P1～P6细胞接种于无血清干细胞培养基后，绝大多数细胞呈悬浮状态，极少数细胞贴壁分化，24～48小时后培养基中开始出现悬浮生长的肿瘤干细胞球，初始细胞球较小，由4～16个细胞组成，细胞呈圆形，大小一致，折光性强，立体饱满，此后悬浮于培养基中的细胞球逐渐增多，体积逐渐增大，形态更加规则(如图2A～I所示)。传代后，肿瘤干细胞球的生长过程及细胞形态与第一代保持一致。

分别将来源于U87、MCF-7、HCT116和P1～P3的肿瘤干细胞球用含有质量分数为10％的FBS的DMEM培养基诱导分化，6小时后球体贴壁，有少数细胞从球体迁出，24小时后球体变扁，迁出的细胞明显增多，3～5天后大量细胞从球体迁出，紧密围绕在球体周围，分化成为神经元或胶质细胞样细胞，细胞核大小不一，异质性明显(如图2J～O所示)。

(2)肿瘤干细胞及其分化细胞的标志物鉴定

采用免疫荧光染色鉴定肿瘤干细胞及其分化细胞的标记物：nestin、CD133、Oct4和CD44s(干细胞标记物)，GFAP(星形胶质细胞标记物)，MBP(少突胶质细胞标记物)，β-tubulinIII(神经元标记物)。

分别将来源于U87、MCF-7、HCT116和P1～P3的肿瘤干细胞球用PBS漂洗后，用质量分数为4％的多聚甲醛溶液于室温下固定20分钟制备细胞爬片，或用冷丙酮于4℃固定20分钟制备冰冻切片，加入一抗：小鼠抗人nestin单克隆抗体、小鼠抗人CD133单克隆抗体、兔抗人Oct4多克隆抗体或小鼠抗人CD44s单克隆抗体，4℃孵育过夜，用PBS漂洗后，再加入相应的二抗：FITC(绿色荧光)标记山羊抗兔IgG、TRITC(红色荧光)标记山羊抗兔IgG或Cy3(红色荧光)标记山羊抗鼠IgG，37℃孵育1小时，用PBS漂洗后，再用DAPI(蓝色荧光)标记细胞核，置激光共聚焦显微镜下观察。结果如图3所示，可见来源于U87的肿瘤干细胞球nestin、CD133、Oct4和CD44s表达呈阳性，来源于MCF-7和HCT116的肿瘤干细胞球CD44s表达呈阳性；来源于P1～P3的肿瘤干细胞球nestin和CD133表达呈阳性。

分别将来源于U87和P1的肿瘤干细胞球用含有质量分数为10％的FBS的DMEM培养基诱导分化2周，用PBS漂洗后，用质量分数为4％的多聚甲醛溶液于室温下固定20分钟制备细胞爬片，或用冷丙酮于4℃固定20分钟制备冰冻切片，加入一抗：兔抗人GFAP多克隆抗体、兔抗人MBP多克隆抗体、小鼠抗人β-tubulin III单克隆抗体、小鼠抗人nestin单克隆抗体或小鼠抗人CD133单克隆抗体，4℃孵育过夜，用PBS漂洗后，再加入相应的二抗：FITC(绿色荧光)标记山羊抗兔IgG、TRITC(红色荧光)标记山羊抗兔IgG或Cy3(红色荧光)标记山羊抗鼠IgG，37℃孵育1小时，用PBS漂洗后，再用DAPI(蓝色荧光)标记细胞核，置激光共聚焦显微镜下观察。结果如图4所示，可见来源于U87和P1的肿瘤干细胞球的分化细胞DFAP、MBP和β-tubulin III表达呈阳性，同时还有散在的细胞nestin和CD133表达呈阳性，提示来源于U87和P1的肿瘤干细胞具有多向分化潜能，同时，在含血清培养基中，仍有少量细胞保持其干细胞状态。

(3)肿瘤干细胞的成瘤能力鉴定

取4周龄雌性裸鼠，于皮下或原位接种来源于U87或P3的肿瘤干细胞，接种6～8周后，取肿瘤组织，用含有质量分数为4％的多聚甲醛的饱和蔗糖溶液固定，8μm切片，HE染色，置光学显微镜下观察。结果如图5所示，可见由来源于U87和P3的肿瘤干细胞形成的肿瘤具备人多形性胶质母细胞瘤的病理学特征：①坏死；②病理性核分裂相；③血管丰富，密度高；④多形性；⑤蟹爪样侵袭，肿瘤边界不清。

二、肿瘤干细胞中间隙连接通讯的功能状态及间隙连接蛋白的表达情况

1、肿瘤干细胞存在间隙连接通讯障碍

采用荧光漂白恢复(Fluorescence Recovery after Photobleaching，FRAP)实验评估肿瘤干细胞间的间隙连接通讯情况。

分别将来源于U87、MCF-7、HCT116和P2～P3的肿瘤细胞(肿瘤干细胞球、贴壁未成球肿瘤细胞、肿瘤干细胞球的分化细胞)接种于盖玻片上，用含有浓度为1.25mmol/l的CaCl₂和浓度为0.5mmol/l的MgCl₂的Hank’s液漂洗细胞3次，用浓度为10μg/ml的5(6)-羧基荧光素二乙酸盐[5(6)-CFDA]于37℃孵育15分钟，再用含有浓度为1.25mmol/l的CaCl₂和浓度为0.5mmol/l的MgCl₂的Hank’s液漂洗细胞3次，在激光共聚焦显微镜下选择至少与3个以上细胞相邻的肿瘤细胞作为实验肿瘤细胞，同时选择与其它细胞不相邻的肿瘤细胞作为对照，将实验肿瘤细胞以激光漂白至初始荧光强度的50～90％，记录4分钟内胞内荧光强度的恢复情况，按下述公式计算恢复率：恢复率％＝(恢复后荧光强度-漂白后荧光强度)/(漂白前荧光强度-漂白后荧光强度)×100，实验肿瘤细胞漂白前后和恢复后的荧光强度用对照肿瘤细胞进行校正。结果如图6和表1所示，除了来源于HCT116的肿瘤干细胞外，来源于U87、MCF-7和P2～P3的肿瘤干细胞的恢复率均明显低于相应的贴壁未成球肿瘤细胞或肿瘤干细胞球的分化细胞，提示肿瘤干细胞间的间隙连接通讯明显降低。

表1  不同来源的肿瘤细胞的荧光漂白恢复率

2、肿瘤干细胞间未检测到间隙连接样结构

将来源于U87的肿瘤干细胞球用质量分数为2.5％的戊二醛溶液于室温下固定20分钟，用PBS漂洗后，再用质量分数为1％的锇酸溶液固定20分钟，梯度乙醇溶液脱水，CO₂干燥，金离子溅射，置扫描电子显微镜下观察。结果如图7A所示，可见构成细胞球的肿瘤干细胞表面较光滑，未见明显的突起，细胞与细胞之间结合紧密。

分别将来源于U87的肿瘤干细胞球及其分化细胞用质量分数为2.5％的戊二醛溶液于4℃固定4小时，用PBS漂洗后，再用质量分数为1％的锇酸溶液固定2小时，梯度乙醇溶液脱水，再用丙酮浸泡2次(每次15分钟)，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，置透射电子显微镜下观察。结果如图7B～C所示，可见肿瘤干细胞球中的绝大部分细胞呈现较幼稚状态(细胞器稀少、核浆比大、核膜较光滑)，相邻细胞间很难找到间隙连接样结构；而来源于肿瘤干细胞球的分化细胞呈较成熟状态(细胞器丰富、核浆比小、核膜较粗糙)，相邻细胞间可以较容易地发现间隙连接样结构。

3、肿瘤干细胞中间隙连接蛋白表达下调

(1)肿瘤干细胞中多种间隙连接蛋白基因表达下调

RT-PCR检测：分别用Trizol试剂提取来源于U87的肿瘤干细胞球和贴壁未成球肿瘤细胞的总RNA，用TaRaKa RNA PCR kit 3.0进行RT-PCR，按照试剂盒说明书操作，以GAPDH为内参，引物序列、产物长度和退火温度见表2，扩增产物用质量分数为1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，目的基因相对表达量(目的基因/GAPDH)用AlphaEase FC凝胶图像分析软件进行分析。结果如图8所示，可见与贴壁未成球肿瘤细胞相比，除GJB1基因(编码Cx32，GenBank ID号为BC039198)外，多种间隙连接蛋白基因(GJB2，编码Cx26，GenBank ID号为NM_004004；GJA3，编码Cx46，GenBank ID号为NM_021954；GJA8，编码Cx50，GenBank ID号为NM_005267；GJA1，编码Cx43，GenBank ID号为AF151980)的mRNA在肿瘤干细胞球中呈低表达，而GJA1基因下调程度最为显著。

表2  RT-PCR的引物序列、产物长度和退火温度

实时定量RT-PCR检测：用Trizol试剂提取来源于U87的肿瘤干细胞球的总RNA，用SYBR PrimeScript PCR kit进行实时定量RT-PCR，按照试剂盒说明书操作，以GAPDH为内参，引物序列、产物长度和退火温度见表3，扩增产物用质量分数为1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，目的基因相对表达量(目的基因/GAPDH)用AIphaEase FC凝胶图像分析软件进行分析。结果如图9所示，可见除GJB6基因(编码Cx30，GenBank ID号为NM_006783)和GJB1基因外，多种间隙连接蛋白基因(GJB2，GJA3，GJA8和GJA1)的mRNA在肿瘤干细胞球中呈低表达，而GJA1基因下调程度最为显著。

表3  实时定量RT-PCR的引物序列、产物长度和退火温度

(2)肿瘤干细胞中间隙连接蛋白43表达下调

Western-blot检测：分别从来源于U87的肿瘤干细胞球和贴壁未成球肿瘤细胞中分离得到总蛋白，取50μg总蛋白与1×SDS凝胶上样缓冲液混合，加入β-巯基乙醇使最终体积分数为4％，煮沸10分钟，4℃、12000g离心5分钟，取上清液进行SDS-PAGE，待电泳结束后，转印至PVDF膜，用质量分数为5％的脱脂奶粉溶液室温下封闭2～4小时，加入稀释度为1∶1000～1∶2000的兔抗人Cx43多克隆抗体，4℃孵育过夜，用1×PBST洗涤后，再加入稀释度为1∶3000～1∶4000的二抗，室温下孵育4小时，用1×PBST洗涤后，用增强性化学发光试剂盒检测特异性蛋白条带，按照试剂盒说明书操作，以GAPDH为内参。结果如图10所示，可见与贴壁未成球肿瘤细胞相比，间隙连接蛋白43在肿瘤干细胞球中呈低表达。

流式细胞术检测：将来源于U87的肿瘤干细胞球吹打成单细胞悬液，加入兔抗人Cx43多克隆抗体，4℃孵育1小时，用PBS漂洗后，再加入FITC标记山羊抗兔IgG，4℃孵育1小时，用流式细胞仪检测阳性细胞数，激发光波长为488nm，发射光波长为525nm。结果如图11所示，可见间隙连接蛋白43在肿瘤干细胞球中呈低表达。

免疫荧光染色检测：分别将来源于U87、MCF-7、HCT116和P1～P3的肿瘤细胞(肿瘤干细胞球、贴壁未成球肿瘤细胞或肿瘤干细胞球的分化细胞)用PBS漂洗后，用质量分数为4％的多聚甲醛溶液于室温下固定20分钟制备细胞爬片，或用冷丙酮于4℃固定20分钟制备冰冻切片，加入兔抗人Cx43多克隆抗体，4℃孵育过夜，用PBS漂洗后，再加入二抗：FITC(绿色荧光)标记山羊抗兔IgG或TRITC(红色荧光)标记山羊抗兔IgG，37℃孵育1小时，用PBS漂洗后，再用DAPI(蓝色荧光)标记细胞核，置激光共聚焦显微镜下观察。结果如图12所示，可见与贴壁未成球肿瘤细胞或肿瘤干细胞球的分化细胞相比，不同来源的肿瘤干细胞球中间隙连接蛋白43表达均下调。

免疫荧光双重染色检测：取人原代恶性胶质瘤标本的冰冻切片，行干细胞标志物(Oct4、Oligo2或Sox2)与间隙连接蛋白43的双重标记染色：加入一抗：兔抗人Oct4多克隆抗体、小鼠抗人Sox2单克隆抗体或小鼠抗人Oligo2单克隆抗体与兔抗人Cx43多克隆抗体，4℃孵育过夜，用PBS漂洗后，加入相应的二抗：FITC(绿色荧光)标记山羊抗兔IgG、TRITC(红色荧光)标记山羊抗兔IgG或Cy3(红色荧光)标记山羊抗鼠IgG，37℃孵育1小时，用PBS漂洗后，再用DAPI(蓝色荧光)标记细胞核，置激光共聚焦显微镜下观察。结果如图13所示，可见干细胞标志物(Oct4、Oligo2或Sox2)与间隙连接蛋白43表达呈负相关：不表达干细胞标志物的分化肿瘤细胞，大多表达较强的间隙连接蛋白43；而表达干细胞标志物的肿瘤细胞，其间隙连接蛋白43染色大都较弱，部分呈阴性表达。

免疫组织化学双重染色检测：取人原代恶性胶质瘤标本的石蜡切片，脱蜡至水，高温抗原修复，用EnVision两步法免疫组化试剂盒进行检测，按照试剂盒说明书操作：阻断内源性过氧化物酶，加入一抗：兔抗人Oct4多克隆抗体、小鼠抗人Sox2单克隆抗体或小鼠抗人Oligo2单克隆抗体，37℃孵育60分钟，用PBS漂洗后，加入EnVision(山羊抗鼠IgG与碱性磷酸酶的复合物)，37℃孵育30分钟，BCIP/NBT(Histostain2Ds kit)显色液显色；用PBS漂洗后，重复内源性过氧化物酶阻断反应，加入一抗：小鼠抗人Cx43单克隆抗体，37℃孵育60分钟，再4℃孵育过夜，用PBS漂洗后，加入EnVision(山羊抗兔IgG与辣根过氧化物酶的复合物)，37℃孵育30分钟，3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色，置光学显微镜下观察。结果如图14所示，可见干细胞标志物(Oct4、Oligo2或Sox2)与间隙连接蛋白43表达呈负相关：不表达干细胞标志物的分化肿瘤细胞，大多表达较强的间隙连接蛋白43；而表达干细胞标志物的肿瘤细胞，其间隙连接蛋白43染色大都较弱，部分呈阴性表达。

4、肿瘤干细胞中GJA1基因启动子高甲基化

既往研究证实，某些特定基因启动子高甲基化在恶性肿瘤的发生中扮演一定角色，而研究者在多种实体肿瘤中发现GJA1基因启动子甲基化。

取来源于U87的肿瘤细胞(肿瘤干细胞球、贴壁未成球肿瘤细胞或肿瘤干细胞球的分化细胞)，采用甲基化DNA免疫共沉淀和实时定量PCR比较几种细胞的GJA1基因启动子甲基化水平，委托上海康成生物工程公司进行检测：提取细胞基因组DNA，经高频声波处理破碎成小片段，利用抗5′-甲基胞嘧啶的抗体富集高甲基化的DNA片段，进行实时定量PCR，以GAPDH为内参，引物序列、产物长度和退火温度见表4。结果如图15和表5所示，可见与贴壁未成球肿瘤细胞或肿瘤干细胞球的分化细胞相比，肿瘤干细胞球中GJA1基因启动子存在高甲基化，提示启动子甲基化可能在下调肿瘤干细胞间隙连接蛋白43的表达中扮演了一定角色。

表4  实时定量RT-PCR的引物序列、产物长度和退火温度

表5  GJA1基因启动子甲基化水平检测结果

5、肿瘤干细胞中以GJA1基因转录本为靶点的MicroRNA表达上调

近来研究发现，microRNA的表达也是调控基因表达的重要机制。异常的microRNA表达谱在恶性肿瘤的发生、进展中也起到了举足轻重的作用。目前共有131个推定的以GJA1基因转录本为靶点的microRNA(http://www.microrna.org，data base released on September 08，2008，Memorial Sloan-Kettering Cancer Center，Harvard Medical School，USA)。

分别取来源于U87的肿瘤干细胞球和贴壁未成球肿瘤细胞，采用MicroRNA芯片和MiRCURY^TM微阵列系统分析二者microRNA表达谱的差异，重点分析以GJA1基因转录本为靶点的microRNA表达情况，委托上海康成生物工程公司进行检测。结果如图16和表6所示，在来源于U87的肿瘤干细胞球中，有58个以GJA1基因转录本为靶点的microRNA高表达，提示microRNA可能也参与了肿瘤干细胞中间隙连接蛋白43表达的调控。

表6  肿瘤干细胞中以GJA1基因转录本为靶点的microRNA表达上调

三、恢复间隙连接蛋白43表达后，肿瘤干细胞中间隙连接通讯的功能状态、间隙连接蛋白的表达情况以及其同肿瘤干细胞特殊生物学特性之间的关系

1、GJA1基因重组腺病毒的制备

用Trizol试剂提取U87细胞总RNA，采用RT-PCR扩增GJA1 cDNA(GenBank ID号为AF151980)，引物序列、产物长度和退火温度见表7，所得GJA1 cDNA片段用限制性内切酶Hind III与BamH I双酶切后，与经同样双酶切的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV[携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因]连接，电穿孔法转化大肠杆菌JM109，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性重组子，提取质粒，得GJA1基因重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-Cx43；将pAdTrack-CMV-Cx43用限制性内切酶Pme I单酶切线性化，再与E1区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，用含有卡拉霉素的LB平板筛选阳性重组子，提取质粒，得GJA1基因重组腺病毒载体pAd-Cx43(启动子为CMV，终止子为PloyA)；同时设不含GJA1 cDNA的GFP基因重组腺病毒载体pAdEasy-GFP为对照载体；分别将pAd-Cx43和pAdEasy-GFP用脂质体法转染人胚胎肾细胞系HEK-293细胞，待细胞病变明显后，收集细胞，反复冻融4次使裂解，离心收集上清，再次转染HEK293细胞以扩增病毒，重复扩增2～4次后，用氯化铯密度梯度离心法纯化，即得GJA1基因重组腺病毒Ad-Cx43和GFP基因对照腺病毒Ad-GFP。

滴度测定：将HEK-293细胞以2.5×10⁵/孔接种于24孔培养板中，分别加入10⁴Ad-Cx43和Ad-GFP，在温度为37℃、CO₂体积分数为5％的条件下培养48小时，用Adenovirus titerimmunoassay Kit测定病毒滴度，按照试剂盒说明书操作。结果如图17所示，Ad-Cx43和Ad-GFP组均可见呈棕色的阳性细胞，病毒滴度为1～5×10⁹PFU/ml。

2、GJA1基因重组腺病毒转染肿瘤干细胞

分别将Ad-Cx43和Ad-GFP用培养基稀释至浓度为5.0μl/ml，以感染复数为10～50分别转染不同来源的肿瘤干细胞球72小时，即得Ad-Cx43和Ad-GFP转染的不同来源的肿瘤干细胞球。

Ad-Cx43和Ad-GFP转染的来源于U87和P5的肿瘤干细胞球的形态如图18所示。

取Ad-Cx43转染的来源于U87的肿瘤干细胞球，采用流式细胞术检测转染效率(激发光波长为488nm，发射光波长为525nm)，结果如图19所示，转染效率大于70％。

3、转染GJA1基因重组腺病毒后肿瘤干细胞中间隙连接蛋白43表达上调

分别取Ad-Cx43和Ad-GFP转染的来源于U87的肿瘤干细胞球，采用实时定量RT-PCR检测转染后GJA1基因在mRNA水平的表达情况，结果如图20所示，可见与Ad-GFP转染的肿瘤干细胞球相比，GJA1基因的mRNA在Ad-Cx43转染的肿瘤干细胞球中呈高表达。

分别取Ad-Cx43和Ad-GFP转染的来源于U87的肿瘤干细胞球，采用免疫荧光染色检测转染后GJA1基因在蛋白水平的表达，结果如图21所示，可见与Ad-GFP转染的肿瘤干细胞球相比，间隙连接蛋白43在Ad-Cx43转染的肿瘤干细胞球中呈高表达。

4、转染GJA1基因重组腺病毒后肿瘤干细胞中间隙连接通讯恢复

分别将Ad-Cx43和Ad-GFP转染以及未转染的来源于U87的肿瘤干细胞球接种于盖玻片上，用PBS漂洗后，加入浓度为500μg/ml的Alexa Fluo 568(红色荧光)，37℃孵育10分钟，再加入含有质量分数为10％的FBS的DMEM培养基，37℃孵育10分钟，置激光共聚焦显微镜下行荧光漂白恢复实验。结果如图22所示，可见与未转染组和Ad-GFP转染组相比，间隙连接通讯在Ad-Cx43转染的肿瘤干细胞球中有所恢复。

5、转染GJA1基因重组腺病毒后肿瘤干细胞的增殖和自我更新能力下降

分别取Ad-Cx43和Ad-GFP转染以及未转染的来源于U87的肿瘤干细胞，用无血清干细胞培养基在温度为37℃、CO₂体积分数为5％的条件下培养1周，置光学显微镜下，计数每个低倍视野内第1代肿瘤干细胞球的个数。结果如图23所示，可见Ad-Cx43转染的肿瘤干细胞形成第1代肿瘤干细胞球的数量(1.30±1.42)较未转染组(16.10±3.57)和Ad-GFP转染组(17.10±4.82)明显减少。

在分化条件下能够快速增殖是肿瘤干细胞的另一重要特性。在96孔培养板中，分别将Ad-Cx43和Ad-GFP转染的来源于U87的肿瘤干细胞球以1000/孔的密度接种于0.1ml含有质量分数为10％的FBS的EMEM培养基中，在温度为37℃、CO₂体积分数为5％的条件下培养，分别在第0、1、2、3、4、5、6、7、8天加入0.01ml CCK-8，37℃孵育1.5小时，振荡混匀，用酶标仪于波长490nm处测定吸光度，并绘制生长曲线。结果如图24所示，可见培养7天后，Ad-GFP转染组的肿瘤干细胞数增加了27.16倍，而Ad-Cx43转染组的肿瘤干细胞数仅为Ad-GFP转染组的44.50％，提示恢复间隙连接蛋白43表达后，能够显著降低肿瘤干细胞的增殖能力。

将Ad-Cx43和Ad-GFP转染的来源于U87的肿瘤干细胞球用含有质量分数为10％的FBS的DMEM培养基在温度为37℃、CO₂体积分数为5％的条件下培养10天，置光学显微镜下观察，可见Ad-GFP转染的肿瘤干细胞呈圆形，相邻细胞间未见明显空隙，排列紧密，呈多层排列；而Ad-Cx43转染的肿瘤干细胞形态多样，可见明显突起，细胞间有明显空隙，大多呈单层排列。

6、转染GJA1基因重组腺病毒后肿瘤干细胞的成瘤能力下降

取4周龄雌性裸鼠，分别于皮下接种5×10⁴个Ad-Cx43和Ad-GFP转染以及未转染的来源于U87的肿瘤干细胞球，或分别于原位接种5×10³个Ad-Cx43和Ad-GFP转染的来源于U87和P4～P6的肿瘤干细胞球，接种后6～12周，每隔3天观察肿瘤生长情况，记录皮下移植瘤的最大径和最小径，按照下述公式：最大径×最小径的平方×0.5，计算肿瘤体积；对进行原位移植的裸鼠，观察神经定位体征、体重变化等指标；获取肿瘤组织后，用含有质量分数为4％的多聚甲醛的饱和蔗糖液固定，8μm切片，HE染色，置光学显微镜下观察。结果如图25～27所示，皮下接种Ad-GFP转染的肿瘤干细胞球的裸鼠，8周后可触及明显的肿瘤，而皮下接种Ad-Cx43转染的肿瘤干细胞球的裸鼠，形成的肿瘤明显偏小，其中1只裸鼠直至10周左右才有可触及的肿瘤出现；原位接种Ad-GFP转染的肿瘤干细胞球的裸鼠，4～6周后出现明显的神经定位体征及恶液质，处死后脑组织切片可见明显的肿瘤形成，而原位接种Ad-Cx43转染的肿瘤干细胞球的裸鼠，相同时间点未见明显神经定位体征，体重、食欲正常，处死后脑组织切片难以发现明显的肿瘤灶；上述结果提示恢复肿瘤干细胞间隙连接蛋白43表达后，其成瘤能力显著下降。

采用实时定量RT-PCR(引物序列、产物长度和退火温度见表7)观察发现，当来源于U87的肿瘤干细胞球转染Ad-Cx43后，其分化标志物GFAP的mRNA表达水平明显上升；相反，干细胞标志物CD133的mRNA水平则有所下降，如图28所示。

表7  实时定量RT-PCR的引物序列、产物长度和退火温度

7、转染GJA1基因重组腺病毒后肿瘤干细胞的侵袭能力下降

取Tranwell小室，在小室的上下室之间设置孔径为12μm的微孔滤膜，膜表面铺匀10～12μl浓度为8～12mg/ml的基质胶，下室充满含有质量分数为10％的FBS或浓度为300ng/ml的SDF-1α的DMEM/F12培养基，上室加入600μl DMEM/F12培养基和4×10⁴个Ad-Cx43或Ad-GFP转染或未转染的来源于U87的肿瘤干细胞，在温度为37℃、CO₂体积分数为50％的条件下孵育24小时，弃去上室液体，取出微孔滤膜，用质量分数为4％的多聚甲醛溶液固定20分钟，结晶紫染色20分钟，擦去上表面未穿过的细胞，置光学显微镜下，计数每个高倍视野内侵袭至滤膜背面的细胞数。结果如图29～30和表8所示，可见恢复肿瘤干细胞间隙连接蛋白43表达后，能够显著降低其侵袭能力。

表8  转染GJA1基因重组腺病毒后肿瘤干细胞的侵袭能力检测结果(细胞数，个/视野，)

采用实时定量RT-PCR(引物序列、产物长度和退火温度见表9)、Western-blot和免疫荧光染色观察发现，恢复肿瘤干细胞间隙连接蛋白43表达后，其E-Cadherin的表达随之上调，如图31～32所示；同时，采用Western-blot观察发现，恢复肿瘤干细胞间隙连接蛋白43表达后，介导肿瘤迁移/侵袭的重要途径-SDF-1/CXCR4下游的信号通路AKT和ERK1/2均失活，如图33所示；以上结果提示：恢复间隙连接蛋白43表达后，肿瘤干细胞侵袭能力的下降可能与E-Cadherin表达上调以及SDF-1/CXCR4下游信号通路失活有关。

表9  实时定量RT-PCR的引物序列、产物长度和退火温度

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。