鱼类卵巢生殖细胞染色体的制备方法

摘要

本发明公开一种鱼类卵巢生殖细胞染色体的制备方法，是取活体成熟卵巢并用生理盐水清洗；将卵巢置于含有1μg/ml雌激素的生理盐水中且将卵巢切成小段，置于摇床上室温避光培养1～3h；在培养皿底部涂一层1％琼脂并盛入4％冰醋酸溶液，从所培养的卵巢中取出几粒卵放入4％冰醋酸溶液中，待卵核移动到动物极后将卵核剥离出来，再将卵核周围的卵黄剥掉，将卵核放入装有预冷的卡诺固定液中冷冻过夜，所述卡诺固定液是由甲醇和冰醋酸混合而成，甲醇与冰醋酸的体积比为3∶1；再取出冷冻过夜的3～5粒卵核于载玻片上放置10～20秒；然后再将载有卵核的载玻片放入装有染色剂的染缸中避光染色30～45min，纯水避光浸泡载玻片30min后，将盖玻片盖在载玻片上。

说明书

技术领域：

本发明属于细胞遗传学技术领域，特别是一种操作方法简单、快捷，可在荧光显微镜下清晰地观察鱼类卵核减数分裂时期染色体的数目及联会情况的鱼类卵巢生殖细胞染色体的制备方法。

背景技术：

鱼类中存在自然多倍体现象。自然多倍体鱼类具有生长快、抗病、营养价值高等特点，在遗传育种上有着重要的种质价值；自然四倍体鱼和二倍体鱼之间杂交可以得到100％三倍体，三倍体鱼的不育性对控制养殖鱼类的过度繁殖和保护天然种质资源也具有极其重要的意义；同时也可利用染色体操作诱导产生更高倍数的鱼(五倍体等)，用经过紫外线照射遗传上失活的精子与自然四倍体卵授精也可产生能存活的二倍体雌核鱼，不但是细胞克隆的好材料，还可以作为主要的养殖品种，成为养殖企业新的经济增长点。为了更好的开发及利用鱼类自然多倍体，首先要研究鱼类自然多倍体的起源。而通过观察鱼类生殖细胞染色体数目及联会情况，可以研究鱼类自然多倍体的起源及形成机制，从而为鱼类多倍体育种提供新途径，对脊椎动物的进化理论和它们在生产上的应用都具有重要的意义。目前关于用鱼类生殖腺制备生殖细胞染色体已有报道，但多数用的是精巢，显微镜下观察所得到的减数分裂染色体的质量不是很好。也有少数采用早期发育的卵巢，但由于大多数卵原细胞主要是有丝分裂，很难观察到减数分裂相；而成熟的卵巢又受卵黄及其它附属结构的干扰，给卵母细胞染色体制片带来很大困难。迄今为止，还没有从卵细胞中摘取卵核来制备染色体分裂相的相关报道。

发明内容：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作方法简单、快捷，可在荧光显微镜下清晰地观察鱼类卵核减数分裂时期染色体的数目及联会情况的鱼类卵巢生殖细胞染色体的制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种鱼类卵巢生殖细胞染色体的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a.取活体成熟卵巢并用生理盐水清洗；

b.将卵巢置于含有1μg/ml雌激素的生理盐水中且将卵巢切成小段，置于摇床上室温避光培养1～3h；

c.在培养皿底部涂一层1％琼脂并盛入4％冰醋酸溶液，从所培养的卵巢中取出几粒卵放入4％冰醋酸溶液中，待卵核移动到动物极后将卵核剥离出来，再将卵核周围的卵黄剥掉，将卵核放入装有预冷的卡诺固定液中冷冻过夜，所述卡诺固定液是由甲醇和冰醋酸混合而成，甲醇与冰醋酸的体积比为3∶1；

d.再取出冷冻过夜的3～5粒卵核于载玻片上放置10～20秒；然后再将载有卵核的载玻片放入装有染色剂的染缸中避光染色30～45min，纯水避光浸泡载玻片30min后，将盖玻片盖在载玻片上。

所述生理盐水的配制方法是：7.3g NaCl、0.18g KCl、0.07g MgSO4·7H₂O、0.168g MgCl₂·6H₂O、0.35g CaCl₂·2H₂O、0.95g Hepes及1L双蒸水混合而成。

所述雌激素是将17α，20β-二羟黄体酮溶于100％酒精中，4℃避光冷藏保存，所述17α，20β-二羟黄体酮与100％酒精的比例是1mg∶1ml。

所述染色剂是将4′，6-二脒基-2-苯基吲哚溶在蒸馏水中制成母液，所述4′，6-二脒基-2-苯基吲哚溶与蒸馏水的比例是1mg∶100ml，再将母液与缓冲液混合，母液与缓冲液的体积比为1∶200。

所述缓冲液的制备方法是将0.12414gTris、0.37225g EDTA-2Na及0.5844gNaCl溶于100ml蒸馏水中。

本发明取活体成熟卵巢，在第一极体还未释放时，通过卵巢体外培养在雌激素的诱导下促使卵的发育，使其卵核向动物极移动，进行第一极体释放，确保了生殖细胞处于第一次减数分裂时期，解决了用早期卵巢制备染色体制片取材难的问题；使用4％的冰醋酸可以使卵粒透明，清楚的看见卵核，快速的剥取单个卵核制备染色体，避免了成熟性腺受卵黄及其它附属结构干扰的影响；操作方法简单、快捷，可制备出图像清晰，杂质少的染色体，便于在荧光显微镜下清晰地观察鱼类卵核减数分裂时期的染色体并且适合减数分裂染色体的细胞学研究，在探讨多倍体鱼的发生及鱼类遗传育种方面具有重要意义。

附图说明：

图1是本发明实施例1所制备的二倍体泥鳅卵母细胞减数分裂终变期染色体及荧光染色效果图。

图2是本发明实施例2所制备的四倍体泥鳅卵母细胞减数分裂终变期染色体及荧光染色效果图。

具体实施方式：

实施例1：

a.通过流式细胞仪对泥鳅进行倍性检测，取繁殖季节性腺发育成熟二倍体泥鳅，活体解剖后立刻将体内的活体成熟卵巢取出并放入生理盐水中，生理盐水是用7.3gNaCl、0.18g KCl、0.07g MgSO4·7H₂O、0.168g MgCl₂·6H₂O、0.35gCaCl₂·2H₂O、0.95g Hepes及1L双蒸水混合而成，亦、可根据用量按照此组分比例配制；

b.将卵巢置于含有1μg/ml雌激素的生理盐水中且用镊子和剪刀将卵巢切成小段，置于摇床上室温避光培养1～3h，所述雌激素是将17α，20β-二羟黄体酮溶于100％酒精中，4℃避光冷藏保存，所述17α，20β-二羟黄体酮与100％酒精的比例是1mg∶1ml；

c.在培养皿底部涂一层1％琼脂并盛入少许4％冰醋酸溶液，用滴管从所培养的卵巢中取出几粒卵放入4％冰醋酸溶液中，观察，待卵核移动到动物极后镊子和解剖针轻轻将卵核剥离出来，如带有卵黄，再将卵核周围的卵黄剥掉，用移液枪将卵核放入装有事先预冷的卡诺固定液中冷冻过夜，所述卡诺固定液是由甲醇和冰醋酸混合而成，甲醇与冰醋酸的体积比为3∶1；

d.再用移液枪取出冷冻过夜的3～5粒卵核于载玻片上放置10～20秒；然后再将载有卵核的载玻片放入装有染色剂的染缸中避光染色30～45min，纯水避光浸泡载玻片30min后，将盖玻片盖在载玻片上，染色剂是将4′，6-二脒基-2-苯基吲哚溶在蒸馏水中制成母液，所述4′，6-二脒基-2-苯基吲哚溶与蒸馏水的比例是1mg∶100ml，再将母液与缓冲液混合，母液与缓冲液的体积比为1∶200；所述缓冲液的制备方法是将0.12414gTris、0.37225g EDTA-2Na及0.5844g NaCl溶于100ml蒸馏水中。

将实施例1所制备的染色体置于荧光显微镜下观察(观察波长330～400nm)，染色体及荧光染色效果如图1所示，标尺示为20μm。

实施例2：

基本步骤同实施例1，只是通过流式细胞仪对泥鳅进行倍性检测，取繁殖季节性腺发育成熟四倍体泥鳅。

将实施例2所制备的染色体置于荧光显微镜下观察(观察波长330～400nm)，染色体及荧光染色效果如图2所示，标尺示为20μm，箭头所示为四价体。