用于在大豆中提高种子贮藏油脂的生成和改变脂肪酸谱的来自解脂耶氏酵母的DGAT基因

摘要

本文描述了总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量相比高出至少10％的转基因大豆种子。来自解脂耶氏酵母的DGAT基因被用于实现种子贮藏油脂的提高。

说明书

本申请要求申请日为2007年5月24日、申请号为60/939872和申请日为2007年12月13日、申请号为61/013406的美国临时专利申请的优先权，上述两个申请的全部公开内容特此并入本申请中。

发明领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及编码二酰基甘油酰基转移酶基因的多核苷酸序列以及利用此类酰基转移酶在大豆中提高种子贮藏油脂的生成和改变脂肪酸谱。

发明背景

植物油脂在工业上和营养学方面具有多种用途，并且对植物膜功能的实现和气候适应性起着重要作用。这些油脂表现出大量的化学结构，这些结构决定着上述油脂的生理学和工业特性。大量的上述结构直接或间接地产生自令上述油脂的不饱和度改变的代谢过程。不同植物的不同代谢模式产生出这些改变的油脂，而要大量、经济地生产所期望的油脂，则通常需要对外来植物物种进行驯化或者对已适应的农作物加以改良。

利用诱变方式来改变脂肪酸的组成和含量存在严重的局限性。筛选法很难发现以下情形的突变：a)导致显性(功能获得性)表型，b)位于植物生长所必需的基因中，以及c)位于非限速酶和由一种以上基因编码的酶的编码基因中。在获得了具有所期望表型的突变玉米品系的实例中，由于所期望的油脂成分很可能是若干隐性基因的产物，通过传统育种技术对原种品系进行的基因渗入既耗时又昂贵。

近来的分子和细胞生物学技术提供了克服诱变方法的某些局限的潜在可能，包括能满足大范围育种的需要。一些特别有用的技术包括在转基因植物中对外来基因进行种子特异性的表达(参见Goldberg等人(1989)Cell 56：149-160)，以及利用反义RNA以显性或组织特异性方式对植物靶基因进行抑制(参见van der Krol等人(1988)Gene72：45-50)。其他进展包括向工业油料作物的商品化品种原种中转入外来基因，例如大豆(Chee等人(1989)Plant Physiol.91：1212-1218；Christou等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：7500-7504；Hinchee等人(1988)Bio/Technology 6：915-922；欧洲专利公布0 301749 A2)，卡诺拉(De Block等人(1989)Plant Physiol.91：694-701)，和向日葵(Everett等人(1987)Bio/Technology 5：1201-1204)，以及在育种程序中利用一些基因作为限制性片段长度多态性(RFLP)标记，从而令隐性性状向原种品系的基因渗入既快速又花费较少(Tanksley等人(1989)Bio/Technology 7：257-264)。然而，上述各种技术的应用，需要对具有重要商业意义的基因进行鉴定和分离。

大多数的游离脂肪酸被酯化为辅酶A(CoA)，以产生酰基辅酶A。然后这些分子在细胞内质网内作为甘油脂类合成的底物，产生磷脂酸和二酰甘油(DAG)。这些代谢中间产物中任何一种都可被用于形成膜磷脂(例如磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱)，或者DAG可被用于形成三酰基甘油(TAG)，后者是真核细胞中所储存的类脂类主要储备物。

在植物、真菌和哺乳动物中，二酰基甘油酰基转移酶(“DGAT”)是一种在三酰基甘油生成反应中催化最后一个酶促步骤的整合膜蛋白。该酶负责将一个酰基基团从酰基-辅酶A上转移到1，2-二酰基甘油(“DAG”)的sn-3位上，以形成三酰基甘油(“TAG”)。在植物和真菌中，DGAT与膜和脂质体片段相联，尤其在油料种子中，其参与组成用作能量储备的碳贮藏库。TAG被认为是细胞中用于储存能量的一种重要化学物质。已知DGAT可调控TAG的结构并指导TAG的合成。此外，已知DGAT反应为油脂合成所特有。

在植物中，TAG是植物油的基本成分，种子将其作为供萌芽期使用的能量的一种贮藏形式。

已鉴定出的DGAT蛋白包括两个不同的家族。DGAT蛋白的第一个家族(“DGAT1”)与酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(“ACAT”)相关，描述于美国专利6,100,077和6,344,548。DGAT蛋白的第二个家族(“DGAT2”)与上述DGAT1家族不相关，描述于2004年2月5日公布的PCT专利公布WO 2004/011671。关于DGAT基因及其在植物中的使用的其他参考文献包括PCT专利公布WO2004/011,671、WO1998/055,631和WO2000/001,713，以及美国专利公布20030115632。

申请人之受让人的已公布的共同待决专利申请US 2006-0094088描述了植物和真菌中的DGAT基因，并且描述了它们的用途是在食用油中调节多不饱和脂肪酸(“PUFA”)的水平。

申请人之受让人的已公布的国际专利申请WO 2005/003322描述了对用于改变含油酵母中PUFA和油脂含量的磷脂酰胆碱二酰基甘油酰基转移酶以及DGAT2的克隆。

发明概述

本发明涉及一种转基因大豆种子，所述转基因大豆种子的总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量相比高出至少10％。

在第二种实施方案中，本发明涉及一种提高大豆种子的总脂肪酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；

(b)选择总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量相比高出至少10％的步骤(a)中的转化的大豆细胞。

在第三种实施方案中，本发明涉及转基因玉米谷粒，所述转基因玉米谷粒的总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子玉米谷粒的总脂肪酸含量相比高出至少10％。

在第四种实施方案中，本发明涉及提高玉米谷粒的总脂肪酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个玉米谷粒；

(b)选择总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子玉米谷粒的总脂肪酸含量相比高出至少10％的步骤(a)中的转化的玉米谷粒。

在第五种实施方案中，本发明涉及转基因大豆种子，与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的对应含量相比，所述转基因大豆种子的总脂肪酸含量高出至少10％并且油酸含量高出至少25％。

在另一个实施方案中，本发明涉及转基因大豆种子，与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的对应含量相比，所述转基因大豆种子的总脂肪酸含量高出至少10％，并且具有至少一种下列特征：i)油酸含量高出至少25％；ii)亚麻酸含量降低至少25％；iii)亚油酸含量降低至少4％；iv)棕榈酸含量降低至少8％；以及v)硬脂酸含量高出至少14％。

在第六种实施方案中，本发明涉及提高大豆种子的总脂肪酸含量和油酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；

(b)选择总脂肪酸含量和油酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量和油酸含量相比分别高出至少10％和至少25％的步骤(a)中的转化的大豆细胞。

在第七种实施方案中，本发明涉及提高大豆种子的总脂肪酸含量并降低其亚麻酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；

(b)选择总脂肪酸含量和亚麻酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量和亚麻酸含量相比分别高出至少10％和降低至少25％的步骤(a)中的转化的大豆细胞。

在第八种实施方案中，本发明涉及提高大豆种子的总脂肪酸含量并降低其亚油酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；

(b)选择总脂肪酸含量和亚油酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量和亚油酸含量相比分别高出至少10％和降低至少4％的步骤(a)中的转化的大豆细胞。

在第九种实施方案中，本发明涉及提高大豆种子的总脂肪酸含量并降低其棕榈酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；

(b)选择总脂肪酸含量和棕榈酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量和棕榈酸含量相比分别高出至少10％和降低至少8％的步骤(a)中的转化的大豆细胞。

在第十种实施方案中，本发明涉及提高大豆种子的总脂肪酸含量和硬脂酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；

(b)选择总脂肪酸含量和硬脂酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量和硬脂酸含量相比分别高出至少10％和至少14％的步骤(a)中的转化的大豆细胞。

本发明的任何一种转基因种子可以包含具有至少一种DGAT序列的重组构建体，所述DGAT序列可以选自DGAT1、DGAT2和DGAT1与DGAT2的组合。此外，所述DGAT序列可以是一种耶氏酵母的序列。

从本发明的转基因大豆种子获得的产品和/或副产品同样属于本发明的范围。

耶氏酵母DGAT基因保持了其功能的突变型也同样属于本发明的范围。特定的例子包括但不限于一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码具有二酰基甘油酰基转移酶活性的多肽的序列，其中所述多肽如SEQ ID：83、88或93所示。所述核苷酸序列的互补序列，包含所述核苷酸序列的重组DNA构建体，以及掺入了所述重组DNA构建体的细胞也同样属于本发明的范围。产生油料种子的植物适用于包含所述重组构建体。

附图和序列表的简要说明

根据以下的详细描述和附图以及序列清单，可以更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列清单形成本申请的一部分。

图1显示了pFBAIn-YLDGAT1、pFBAIn-YLDGAT2和pFBAIn-MOD1的质粒图谱。

图2显示了KS352和KS332的质粒图谱。

图3显示了KS349、KS362和KS364的质粒图谱。

图4显示了携带KS349的体细胞胚油酸含量和总酯化脂肪酸含量之间的强相关性(R²≥0.59)。

图5显示了单独携带KS362或同时携带KS362与KS349和KS364其中之一的体细胞胚油酸含量和总酯化脂肪酸含量之间的强相关性(R²≥0.67)。

图6显示了通过共转化质粒KS349和KS362得到的转基因大豆种子(T1世代)油酸含量和油脂含量之间的相关性(R²≥0.45)。

图7显示了通过共转化质粒KS349和KS362(A)和单独转化质粒KS362(B)得到的T1种子的油脂含量和种子重量。

图8显示了来自基因组DNA印迹的杂交结果。基因组DNA分离自来自事件AFS4818.1.2、AFS4818.1.3、AFS4818.1.5、AFS48182.6和AFS4818.1.9(参见实施例6)的转基因大豆。用限制酶EcoRI或HindIII消化DNA，然后在一块凝胶上跑出并与尼龙滤膜杂交(泳道1和2为AFS4818.1.2，泳道3和4为AFS4818.1.3，泳道5和6为AFS4818.1.5，泳道7和8为AFS48182.6，泳道9和10为AFS4818.1.9，泳道11和12为同样用EcoRI和HindIII消化后的非转基因的野生型DNA)。上方的印迹(A)所用的杂交探针为一种耶氏酵母DGAT1特异性探针，下方的印迹所用的则为一种耶氏酵母DGAT2特异性探针。

图9显示了来自基因组DNA印迹的杂交结果。图中的印迹与图8中所描述的相似，不同之处在于DNA全部用限制酶BstXI消化并且印迹利用一种耶氏酵母DGAT2特异性探针进行探测。

序列描述概要说明了后附的序列列表。此序列列表中以单个字母表示核苷酸，以单独的3字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Research13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(2)：345-373(1984)所描述的IUPAC-IUB标准中所规定的。

核酸和蛋白质SEQ ID Number摘要

SEQ ID NO：7-8为PCR引物oYLDGAT2-1(SEQ IOD NO：7)和oYLDGAT2-2(SEQ IOD NO：8)的对应序列，上述引物用于从一份酵母溶菌液中扩增解脂耶氏酵母二酰基甘油酰基转移酶2(YL DGAT2)基因(详见实施例1)。

SEQ ID NO：12-15为用于从解脂耶氏酵母基因组DNA中扩增YL DGAT1(YDGAT1-F和YDGAT1-R，SEQ ID NO分别为12和13)和YL DGAT2(YDGAT2-F和YDGAT2-R，SEQ ID NO分别为14和15)编码区域的寡核苷酸引物的对应序列。

SEQ ID NO：23(oCal-15)和SEQ ID NO：24(oCal-6)为用于从如PCT专利公布WO 02/008269中所述的模板质粒CalFad2-2中扩增DNA片段ca1 a24-4(SEQ ID NO：22)的寡核苷酸引物的对应序列。

SEQ ID NO：28(oKR85-1)和SEQ ID NO：29(oKR85-2)为用于从质粒pKR85(SEQ ID NO：27)中扩增β-大豆伴球蛋白启动子-(NotI克隆位点)-云扁豆蛋白3′终止子区域的引物的对应序列。

SEQ ID NO：37(oGy1-1)和SEQ ID NO：38(oGy1-2)为用于扩增大豆的大豆球蛋白1启动子(SEQ ID NO：36)，并在5′和3′端分别插入了BamHI和NcoI位点的引物的对应序列。

SEQ ID NO：54(oP34-1)和SEQ ID NO：55(oP34-2)为用于扩增大豆P34启动子(SEQ ID NO：53)，并在5′和3′端分别插入了BamHI和NcoI位点的引物的对应序列。

SEQ ID NO：69(oSGly-2)和SEQ ID NO：70(oSGly-3)为用于扩增大豆球蛋白GY1启动子的引物的对应序列。

SEQ ID Nos：76(oYDG2-1)和SEQ ID NO：77(oYDG2-2)为用于扩增解脂耶氏酵母DGAT2(SEQ ID NO：10)的引物的对应序列，所述解脂耶氏酵母DGAT2随后被插入pKR1254(SEQ ID NO：78)。

SEQ ID NO：79(Y1D2_Y326F-5)和SEQ ID NO：80(Y1D2_Y326F-3)为用于使解脂耶氏酵母DGAT2(SEQ ID NO：10)326位点的氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸的引物的对应序列。

SEQ ID NO：84(Y1D2_Y326L-5)和SEQ ID NO：85(Y1D2_Y326L-3)为用于使解脂耶氏酵母DGAT2(SEQ ID NO：10)326位点的氨基酸由酪氨酸突变为亮氨酸的引物的对应序列。

SEQ ID NO：89(Y1D2_Y327K-5)和SEQ ID NO：90(Y1D2_Y327K-3)为用于使解脂耶氏酵母DGAT2(SEQ ID NO：10)327位点的氨基酸由精氨酸突变为赖氨酸的引物的对应序列。

SEQ ID NO：108至111(分别为GmTE25-1、GmTE23-1、GmTE25-2和GmTE23-2)为用于扩增大豆硫酯酶2基因的引物的对应序列。

SEQ ID NO：115至118(分别为GmFad2-15-1、GmFad2-13-1、GmFad2-1 5-2和GmFad2-1 3-2)为用于扩增大豆脂肪酸去饱和酶2-1基因的引物的对应序列。

发明详述

藉此将本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文以引用的方式并入本文。

如本文所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株此类植物，“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。

在本公开内容的上下文中，使用了若干术语和缩写。给出了如下定义。

“开放阅读框”缩写为ORF。

“聚合酶链式反应”缩写为PCR。

“美国典型培养物保藏中心”缩写为ATCC。

“酰基-辅酶A：固醇-酰基转移酶”缩写为ARE2。

“磷脂：二酰基甘油酰基转移酶”缩写为PDAT。

“二酰基甘油酰基转移酶”缩写为DAG AT或DGAT。

“二酰基甘油”缩写为DAG。

“三酰基甘油”缩写为TAG。

“辅酶A”缩写为CoA。

术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为约C₁₂至C₂₂(尽管更长和更短链长的酸两者都是已知的)。主要的链长介于C₁₆和C₂₂之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳(C)原子的总数，而Y表示双键的数目。

总的来说，脂肪酸被分为饱和的和不饱和的两类。术语“饱和脂肪酸”是指其碳主链不含“双键”的脂肪酸。相对的，“不饱和脂肪酸”的碳主链(通常为顺式构型)则含有“双键”。“单不饱和脂肪酸”的碳主链含有一个“双键”(例如，在棕榈油酸(16:1)和油酸(18:1)中通常位于第9号和第10号碳原子之间。)，而“多不饱和脂肪酸”(或者叫“PUFA”)的碳主链则含有至少两个双键(例如，在亚油酸(18:2)中位于第9号和第10号以及第12号和第13号碳原子之间；在α-亚麻酸(18:3)中位于第9号和第10号、第12号和第13号以及第15号和第16号碳原子之间)。

“微生物油脂”或者“单细胞油脂”是由微生物(例如藻类、含油酵母和丝状真菌)在其生命周期中自然产生的油脂。术语“油脂”是指在25℃时为液体且通常为多不饱和的脂类物质。相对的，术语“脂肪”是指在25℃时为固体且通常为饱和的脂类物质。

“脂质体”是指通常以特异性蛋白质和一层磷脂单分子层为界的脂类小滴。此类细胞器是多数生物转运/贮藏中性脂类的位点。脂质体被认为来源于包含TAG-生物合成酶类的内质网的微结构域，并且它们的合成和大小似乎受特异性蛋白质组分的控制。

“中性脂类”是指通常发现于细胞的脂质体内，作为储存性脂肪或油脂的那些脂类，其之所以得名是由于在胞内的pH值下，此类脂类不含带电基团。总而言之，它们完全没有极性，与水没有亲和力。中性脂类通常是指与脂肪酸相连的甘油单酯、二酯和/或三酯，分别也被称为单酰基甘油、二酰基甘油或者TAG(或者总称为酰基甘油)。要将脂肪酸从酰基甘油上释放出来，必须发生水解反应。

术语“三酰基甘油”、“油”和“TAG”指由与甘油分子酯化的三个脂肪酰残基组成的中性脂质(并且这些术语在本公开内容中将可以互换使用)。这些油可含有长链PUFA以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸以及较长链的饱和脂肪酸。因此，“油的生物合成”一般指细胞中TAG的合成。

术语“DAG AT”是指一种二酰基甘油酰基转移酶(也叫酰基-辅酶A-二酰基甘油酰基转移酶或二酰基甘油O-酰基转移酶)(EC2.3.1.20)。该酶负责酰基-辅酶A和1，2-二酰基甘油向TAG和CoA的转化(由此涉及TAG生物合成的最后步骤)。存在两个家族的DAGAT酶：DGAT1和DGAT2。前一家族同酰基-辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT)基因家族具有同源性，而后一家族与之无关(Lardizabal等人，J.Biol.Chem.276(42)：38862-28869(2001))。

术语“PDAT”是指一种磷脂：二酰基甘油酰基转移酶(EC2.3.1.158)。该酶负责将一个酰基基团从磷脂的sn-2位上转移到1，2-二酰基甘油的sn-3位上，从而产生溶血磷脂和TAG(由此涉及TAG生物合成的最后步骤)。该酶与DGAT(EC 2.3.1.20)不同的是，其合成TAG时通过的是一种不依赖于酰基-辅酶A的机制。

术语“ARE2”是指一种酰基-辅酶A：固醇-酰基转移酶(EC2.3.1.26；也叫固醇-酯合酶2)，该酶催化下列反应：酰基-辅酶A+胆固醇＝辅酶A+胆固醇酯。

本文所用的“核酸”意指多核苷酸，并包括单链或双链的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基聚合物。核酸也可以包括片段和经修饰的核苷酸。因此，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用，并且是作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)可以用如下它们的单字母名称指代：“A”表示腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别针对RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，“N”表示任何核苷酸。

术语“具有相当功能的亚片段”和“功能上相当的亚片段”在本文中可互换使用。这些术语是指一种分离的核酸片段的一个部分或亚序列，其中无论所述片段或亚片段是否编码有活性的酶，其都保留着改变基因表达或导致某种表型的能力。例如，所述片段或亚片段可以被用于设计嵌合基因，以在一种转化的植物中产生所期望的表型。可以通过将一种核酸片段或亚片段以相对于一种植物启动子序列有义或反义的方向与所属启动子序列连接，从而设计出用于抑制的嵌合基因，其中所述核酸片段或亚片段无论是否编码有活性的酶均可。

术语“保守结构域”或“基序”指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其它位置的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表示对蛋白质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。因为它们可通过它们在蛋白质同源物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标记或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。

术语“同源性”、“同源的”、“基本上类似的”和“基本上对应的”本文可互换使用。它们指其中一个或多个核苷酸碱基的变化不会影响核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力的核酸片段。这些术语也指本发明的核酸片段的修饰(例如缺失或插入一个或多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此，正如本领域技术人员应该理解的，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。

此外，技术人员认识到，本发明所涵盖的基本上类似的核苷酸序列也由它们在中等严格条件(如0.5×SSC，0.1％SDS，60℃)下，与本文所示例的序列杂交的能力，或杂交至本文所公开的核苷酸序列的任何部分以及杂交至与本文所公开的任何核苷酸序列功能相当的序列的能力所限定。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段例如来自远缘生物的同源序列，到筛选高度相似的片段例如从近缘生物复制功能性酶的基因。杂交后的洗涤确定严格性条件。

术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下，核酸序列与特定核酸靶序列以比其与非靶核酸序列的杂交更高的可检测程度(例如至少两倍于背景)杂交，并指基本排除了非靶核酸。选择性杂交的序列通常彼此具有约至少80％的序列同一性，或90％的序列同一性，最多并包括100％的序列同一性(即完全互补)。

术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针将选择性杂交至其靶序列的条件。严格条件是序列依赖性的，并将因不同的环境而异。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。作为另一种选择，可调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度少于约1000个核苷酸，任选长度少于500个核苷酸。

一般地，严格条件将是如下那些条件：在pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.5M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，而对于长的探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可以通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。示例性的低严格条件包括在37℃于含有30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中杂交，以及在50至55℃用1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃于40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在55至60℃下用0.5×至1×SSC洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃于50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在60至65℃用0.1×SSC洗涤。

特异性通常取决于杂交后洗涤，最后的洗涤溶液的离子强度和温度是关键因素。对于DNA-DNA杂交，可以从Meinkoth等人，Anal.Biochem.138：267-284(1984)中的公计算出近似的T_m∶T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L是以碱基对表示的杂交体的长度。T_m是(在确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。每出现1％的错配，T_m降低约1℃；因此，可调节T_m杂交和/或洗涤条件以与具有期望同一性的序列杂交。例如，如果要寻求具有≥90％同一性的序列，则可将T_m降低10℃。通常，在确定的离子强度和pH下，严格条件选择为比特定序列及其互补序列的熔解温度(T_m)低约5℃。然而，极严格条件可采用在比熔解温度(T_m)低1、2、3或4℃的温度下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在比熔解温度(T_m)低6、7、8、9或10℃的温度下杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在比熔解温度(T_m)低11、12、13、14、15或20℃温度下杂交和/或洗涤。利用所述等式、杂交和洗涤组合物以及理想的T_m，本领域技术人员将会理解，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化已经在本质上得以描述。如果所需的错配程度导致T_m低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC的浓度以便能使用更高的温度。对于核酸杂交的详尽指导可在以下文献中找到：Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”，Elsevier，New York(1993)；and Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等人，编辑，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。杂交和/或洗涤条件可进行至少10、30、60、90、120或240分钟。

“序列一致性”或“一致性”当涉及核酸或多肽序列时，是指两段序列中的核酸碱基或氨基酸残基当在一个指定的比对窗口上进行最大对应性匹配时是相同的。

因此，“序列一致性百分比”是指通过在一个比对窗口上比较两段最大化匹配的序列所决定的值，其中在所述比对窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分与(不包含附加或缺失)的参考序列相比可以包含附加或缺失(即间隙)，以获得两段序列之间的最大匹配。所述百分比的计算方法是，统计相同的核酸碱基或氨基酸残基在两段序列中同时出现的位点的数量以得到匹配位点数，将此匹配位点数除以比对窗口中的总位点数，再将结果乘以100，从而得到序列一致性百分比。序列一致性百分比的可用的例子包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％，或者从50％至100％的任意整数百分比。上述一致性可以利用本文所述的任意程序来确定。

序列对比和百分比同一性或类似性可以用设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定，这些方法包括(但不限于)LASERGENE生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlig^TM程序。在本专利申请案的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。在此所用的“默认值”是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

“Clustal V序列比对方法”对应于Clustal V标记的比对方法(描述于Higgins and Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人(1992)Comput.Appl.Biosci.8：189-191)并且存在于the MegAlign^TM program of the LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.，Madison，WI).对于多重比对，默认值对应于缺口罚分(GAP PENALTY)＝10和缺口长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、空位罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5和DIAGONALS SAVED＝5。而对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4和DIAGONALS SAVED＝4。用Clustal V程序比对序列后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。

“BLASTN比对方法”是由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)提供的用以采用默认参数比较核苷酸序列的算法。

本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其它物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的可用的实例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％、或50％至100％之间的任何整数百分比。实际上，50％至100％之间的任何整数氨基酸同一性可用于描述本发明，诸如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。此分离核苷酸片段的任何全长或部分互补的序列也是有用的。

“基因”是指能够表达特定蛋白质的核酸片段，其包括编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编码序列)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是通过转化方法导入基因组内的基因。

在应用于植物细胞时，术语“基因组”不仅包括在细胞核内发现的染色体DNA，并且还包括在细胞的亚细胞成分(例如线粒体、质体)内发现的细胞器DNA。

“经密码子最优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。

“等位基因”是染色体上占据给定位点的基因的几种供选择替代形式的其中一种。当染色体上给定位点处存在的所有等位基因相同时，植物在该位点是纯合子。如果染色体上给定位点处存在的等位基因不同的话，植物在该位点是杂合子。

“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括，但不限于：启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。启动子序列由近侧和较远端上游元件组成，后者经常指增强子。因此，“增强子”是能刺激启动子活性的DNA序列，它可以是启动子的天然元件，或插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。还应认识到，由于在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，一些变型的DNA片段可能具有相同的启动子活性。在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。目前不断在发现可用于植物细胞中的不同类型的新启动子；在以下文献中可以发现多个实例：Okamuro，J.K.and Goldberg，R.B.编辑的Biochemistry of Plants，15：1-82(1989).

“翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列之间的多核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全加工后的mRNA上游。翻译前导序列可影响mRNA的初级转录过程、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的实例已经有所描述(Turner，R.and Foster，G.D.，Mol.Biotechnol.3：225-236(1995))。

“3′非编码序列”，“转录终止子”或“终止序列”是指位于编码序列下游，且包括能够影响mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化识别序列和其他序列编码调节信号的DNA序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。Ingelbrecht，I.L.等人例示了不同3′非编码序列的用途Plant Cell 1：671-680(1989)。

“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所产生的产物。当RNA转录物与DNA序列拷贝完全互补时，它指初级转录物。当RNA转录物是来源于转录后加工的初级转录物的RNA序列时，它指成熟的RNA。“信使RNA”或“mRNA”指无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA模板互补并用反转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链，或使用DNA聚合酶I的Klenow片段转化成双链。“有义”RNA指包括mRNA和在细胞内或体外能被翻译成蛋白质的RNA在内的RNA转录物。“反义RNA”指与全部或部分靶初级转录物或mRNA互补，并阻止靶基因表达的RNA(美国专利5,107,065)。反义RNA可以与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子、或编码序列互补。“功能性RNA”指反义RNA、核酶RNA或其它不能翻译但是对细胞过程有影响作用的RNA。术语“互补的”和“反向互补的”对mRNA转录来说可互换使用，并且用以定义信使反义RNA。

术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的调控。例如，当启动子能够调节编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。在另一个例子中，本发明的互补RNA区域，无论直接或间接连接、5′端与目标mRNA或3′端与目标mRNA连接、或者位于目标mRNA内、或者第一互补区域以5′端而其互补序列以3′端与目标mRNA连接，均可构成可用的连接。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)。转化方法为本领域的技术人员所熟知，并描述于下文。

“PCR”或“聚合酶链式反应”是一种用于合成大量的特定DNA片段的技术，其包括一系列重复的循环(Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，CT)。通常，双链DNA被热变性，两种与目标片段的3′端区域互补的引物在较低温度下与之退火，然后在中间温度下得到延伸。一组的上述三个连续的步骤被称为一个“循环”。

术语“重组”指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。

术语“质粒”、“载体”和“框”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序列一起引入细胞中。“转化框”指含有外来基因并且除了该外来基因外还含有有利于转化特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达框”是指包含一种外来基因，并具有能令所述基因在一种宿主中增强表达的所述基因以外的元件的一种特定载体(即指可将一种核酸序列或片段移入其中的不连续的核酸片段)。

术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”本文可互换使用。重组构建体包括人造的核酸片段组合，例如天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。例如嵌合构造可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于用以转化宿主细胞的方法，该宿主细胞是本领域的技术人员所熟知的。例如可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁殖包括本发明任何分离的核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗传元件。技术人员也将认识到不同的独立转化事件将导致不同水平和不同模式的表达(Jones等人，EMBO J.4：2411-2418(1985)；De Almeida等人，Mol.Gen.Genetics 218：78-86(1989))，因此，必须筛选多次事件以获得显示期望表达水平和模式的品系。这样的筛选可以通过DNA的Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、蛋白表达的免疫印迹分析或表型分析等完成。

本文所用术语“表达”是指功能性终产物(例如，一种mRNA或一种蛋白质(既可以是前体也可以是成熟形式))的生产。

术语“导入”是指将核酸(例如表达构建体)或蛋白提供至细胞中。导入包括指将核酸整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸可以整合进细胞的基因组内，以及包括指将核酸或蛋白暂时提供给细胞。导入包括指稳定的或暂时性的转化方法以及有性杂交。因此，将核酸片段(例如重组DNA构建体/表达构建体)插入细胞内的情况下的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内、转变成自主的复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。

“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽(即已经去除了存在于初始翻译产物中的任何前肽或肽原的多肽)。“前体”蛋白质指mRNA的初级翻译产物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和肽原可以是(但不限于)细胞内定位信号。

“稳定转化”指将核酸片段转入宿主生物的基因组以产生稳定的遗传特性，该基因组包括核基因组和细胞器基因组。相反“瞬时转化”指将核酸片段转入宿主生物的核中或包含DNA的细胞器中，在无整合或无稳定的遗传特性的情况下引起基因表达。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”生物体。

如本文所用的“转基因”是指其基因组内含有异源多核苷酸的植物或细胞。优选的是，异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸能传递至连续的世代。异源多核苷酸可以单独地或作为表达构建体的部分整合进基因组中。本文所用的转基因包括因异源核酸存在而已经改变了基因型的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括初始进行此类改变的转基因以及从初始的转基因通过有性杂交或无性繁殖产生的那些转基因。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。

“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。“共抑制”是指产生能抑制相同的或充分相似的外来或内源性基因表达的有义RNA转录本(美国专利5,231,020)。以前已经通过集中正向过表达具有与内源mRNA同源性的核酸序列设计出了植物中的共抑制构建体，它导致所有与过表达序列具有同源性的RNA减少(Vaucheret等人，Plant J.16：651-659(1998)；Gura，Nature 404：804-808(2000))。该现象的总体效率较低，并且RNA减少的程度变化较大。更为近期的工作描述了以互补的方向与一种mRNA编码序列的部分或全部结合，从而使表达的RNA产生一种潜在的“茎-环”结构的“发夹”结构的使用(PCT专利公布WO 99/53050，公布于1999年10月21日；PCT专利公布WO 02/00904，公布于2002年1月3日)。这在获得的转基因植物中提高了共抑制的频率。另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制，或“沉默”，(于1998年8月20日公开的PCT专利公布WO 98/36083)。这些共抑制现象均未从机制上得到阐明，但遗传证据已经开始揭示这种复杂的情况(Elmayan等人，Plant Cell，10：1747-1757(1998))。

术语“含油的”指那些趋于以脂质形式贮存它们的能源的生物(Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第二版，Plenum，1980)。FungalLipid Biochemistry，第二版，Plenum，1980)。一类被鉴定为含油的植物通常被称为“油料种子”植物。油料种子植物的例子包括但不限于：大豆(大豆属)、亚麻(亚麻属)、卡诺拉(芸苔属)、玉米、棉花、红花(红花属)和向日葵(向日葵属)。

通常，含油微生物的细胞油脂或TAG含量符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至在晚对数培育生长期或早稳定培育生长期时它达到最高浓度，随后在晚稳定培育生长期和死亡期期间逐渐下降(Yongrmanitchai and Ward，Appl.Environ.Microbiol.57：419-25(1991))。

术语“含油酵母”指那些产油并被归类为酵母的微生物。含油微生物积累油脂超过它们的干细胞重量的约25％的情形并不鲜见。含油酵母的实例包括但不限于如下属：解脂耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。

术语“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞，种子以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

“子代”包括植物的任何后续世代。

“非转基因的、无转基因分离子(null segregant)大豆种子”是指缺少所转基因的近等基因植物或种子，和/或用于转化过程以获得转基因事件的父母本植物。无转基因分离子可以是由杂合的转基因植物在繁殖中经正常的遗传分离而产生的不含转基因性状的植物或种子。

“谷粒”是玉米的颖果，由一个成熟的胚胎和作为双受精产物的胚乳组成。术语“玉米”指玉米(Zea mays L.)的任何变种、栽培种或种群。

“谷物”包括由商业种植者生产、出于除栽种或繁殖该物种以外的目的而用于农用或售予消费者的成熟的玉米谷粒。“种子”是出于繁殖该物种的目的并用于售予商业种植者而生产的成熟的玉米谷粒。本文所用术语种子、谷粒和谷物可以互换使用。术语“胚胎”或者“胚”是指快速生长期(种子萌芽)开始之前的孢子体植物幼体。玉米的胚胎(胚)包含了谷粒中所发现的绝大多数油脂。谷物类胚胎的结构包括胚轴和盾片。“盾片”是谷物类胚胎中专门吸收胚乳的单个子叶。“糊粉”是蛋白质性质的物质，通常以小颗粒的形式存在，产生于玉米以及其他谷物的胚乳的最外层细胞。

本发明涉及一种转基因大豆种子，所述转基因大豆种子的总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量相比高出至少10％。当然，转基因相对于非转基因的、无转基因分离子在总脂肪酸含量方面的任何可测量的提高都是有用的。所述总脂肪酸含量方面的提高包括但不限于至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％。

本发明的一种转基因油料种子可以包含具有至少一种DGAT序列的重组构建体。所述DGAT序列可以选自DGAT1、DGAT2和DGAT1与DGAT2的组合。此外，至少一种DGAT序列可以来自解脂耶氏酵母。可用于实施本发明的适当的DGAT序列的例子论述于下文的实施例中。包括本发明中以下SEQ ID NO的序列：1、9、64、66、82、87和92。本领域的技术人员将认识到，本发明包括但不限于本文所公开的DGAT序列。

所述重组构建体启动子包括不同的元件，例如一个是一种DNA序列的启动子，其能指导一种植物的胞内装置从该启动子下游(3′)临近的编码序列产生RNA。所述启动子区域影响着基因的RNA转录本合成的速率、合成时的发育阶段和细胞类型。所述RNA转录物被加工为mRNA，后者作为用于将RNA序列翻译为所编码多肽的氨基酸序列的模板。5′端非翻译前导序列是mRNA上位于蛋白质编码区域上游的区域，其可能对mRNA翻译的起始和进行发挥作用。3′转录终止/多聚腺苷酸化信号是位于蛋白质编码区域下游的非翻译区域，其在植物细胞中的作用是导致RNA转录的终止和多聚腺苷酸向RNA3′端的添加。

用于驱动DGAT编码序列表达的启动子的来源并不重要，只要它具有足够的转录活性以通过在适当的时间、在所期望的宿主组织内表达所期望的核酸片段的可翻译的mRNA，从而达到本发明的目的即可。异种的或非异种的(即内源的)启动子均可用于实施本发明。例如，适当的启动子包括但不限于：β大豆伴球蛋白启动子的α引发亚单位、库尼兹(Kunitz)胰蛋白酶抑制剂3启动子、膜联蛋白启动子、大豆球蛋白Gy1启动子、β大豆伴球蛋白启动子的β亚单位、P34/Gly Bd m 30K启动子、白蛋白启动子、Leg A1启动子和Leg A2启动子。

上述膜联蛋白或P34启动子描述于PCT专利公布WO2004/071178(公布于2004年8月26日)。上述膜联蛋白启动子的活性水平与任何已知的强启动子相当，所述强启动子如：(1)CaMV35S启动子(Atanassova等人，Plant Mol.Biol.37：275-285(1998)；Battraw and Hall，Plant Mol.Biol.15：527-538(1990)；Holtorf等人，Plant Mol.Biol.29：637-646(1995)；Jefferson等人，EMBO J.6：3901-3907(1987)；Wilmink等人，Plant Mol.Biol.28：949-955(1995))；(2)拟南芥油质蛋白(oleosin)启动子(Plant等人，Plant Mol.Biol.25：193-205(1994)；Li，Texas A&M University Ph.D.dissertation，第107-128页(1997))；(3)拟南芥泛素延伸蛋白启动子(Callis等人，J Biol.265(21)：12486-93(1990))；(4)一种番茄泛素基因启动子(Rollfinke等人，Gene.211(2)：267-76(1998))；(5)一种大豆热激蛋白启动子(Schoffl等人，Mol Gen Genet.217(2-3)：246-53(1989))；以及(6)一种玉米H3组蛋白基因启动子(Atanassova等人，Plant Mol Biol.37(2)：275-85(1989))。

上述膜联蛋白启动子的另一有用特性是其在发育种子中的表达谱。上述膜联蛋白启动子在早期(授粉后10天以内)的发育中种子中最为活跃，而在随后的时期基本保持沉默。上述膜联蛋白启动子的表达谱与许多种子特异性启动子的都不同，后者如通常在发育后期表现出最高活性的种子贮藏蛋白启动子(Chen等人，Dev.Genet.10：112-122(1989)；Ellerstrom等人，Plant Mol.Biol.32：1019-1027(1996)；Keddie等人，Plant Mol.Biol.24：327-340(1994)；Plant等人，(supra)；Li，(supra))。上述膜联蛋白启动子具有更加常规的表达谱，不过仍与其他已知的种子特异性启动子不同。因此，当希望在早期发育阶段过表达或抑制一个基因时，上述膜联蛋白启动子是一个很有吸引力的选择。例如，可能希望过表达一个调控早期胚胎发育的基因或一个在种子成熟之前参与代谢的基因。

在鉴定出适合表达特异性的DGAT编码序列的适当启动子之后，利用为本领域的技术人员所熟知的传统方法，将所述启动子以有义方向进行可操作地连接。

本文所用的标准的重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并且Sambrook，J.等人在Molecular Cloning：A Laboratory Manual；2nded.；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，New York，1989(以下简称“Sambrook等人，1989”)或Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.and Struhl，K.，编辑，；在Current Protocols in Molecular Biology；John Wiley and Sons：New York，1990(以下简称“Ausubel等人，1990”)中有更加详尽的描述。

另一方面，本发明涉及一种提高大豆种子的总脂肪酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；

(b)选择总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量相比高出至少10％的步骤(a)中的转化的大豆细胞。

在构建了重组构建体之后，可以通过为本领域的普通技术人员所熟知的方法(例如转染、转化和电穿孔)，将其导入一种植物细胞。优选的植物细胞为油料种子植物细胞。然后在允许对总脂肪酸含量比非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量高出至少10％的转化的大豆细胞进行选择的适当条件下，对转化的植物细胞进行人工培养和再生。

此类重组构建体可以被导入至一个植物细胞；或者也可将每一重组构建体导入至不同的植物细胞。

如前所述，在植物细胞中的表达方式可以是暂时性的也可以是稳定的。

从此类转化的植物获得的种子或植物部分也属于本发明的范围。

植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于下列部分：根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和多种形式的细胞和培养物(例如单个细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可存在于植株或植物器官、组织或细胞培养物中。

术语“植物器官”是指构成植株的形态和功能不同部分的植物组织或组织群。术语“基因组”是指：(1)存在于生物体的每一个细胞或者病毒或细胞器中的全套遗传物质(基因和非编码序列)；和/或(2)作为(单倍体)单位从一个亲本遗传的全套染色体。

用于转化双子叶植物(主要利用根癌农杆菌)并获得转基因植物的方法，已与其他方法一起公布于下列文献：棉花(美国专利5,004,863；美国专利5,159,135)；大豆(美国专利5,569,834；美国专利5,416,011)；芸苔属植物(美国专利5,463,174)；花生(Cheng等人.Plant Cell Rep.15：653-657(1996)；McKently等人.Plant Cell Rep.14：699-703(1995))；番木瓜果(Ling，K.等人Bio/technology 9：752-758(1991))；以及豌豆(Grant等人.Plant Cell Rep.15：254-258(1995))。对植物转化的其他常用方法的综述参见Newell，C.A.(Mol.Biotechnol.16：53-65(2000))。这些转化方法之一利用了发根农杆菌(Tepfler，M.and Casse-Delbart，F.Microbiol.Sci.4：24-28(1987))。已公布的利用直接输送DNA进行的大豆转化，有利用PEG融合(PCT专利公布WO 92/17598)、利用电穿孔(Chowrira，G.M.等人，Mol.Biotechnol.3：17-23(1995)；Christou，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：3962-3966(1987))、利用显微注射和利用基因枪轰击(McCabe，D.E.等人，Bio/Technology 6：923(1988)；Christou等人，Plant Physiol.87：671-674(1988))进行的。

存在多种用于从植物组织再生植物的方法。再生的具体方法将取决于起始植物组织以及待再生的具体植物物种。从单植物原生质体转化体或从多种经转化的外植体再生、发育和培育植物是本领域所熟知的(Weissbach和Weissbach(编辑)，载于：Methods for Plant Molecular Biology，(Eds.)，Academic：San Diego，CA(1988))。该再生和生长方法通常包括如下步骤：选择转化的细胞和培养这些单独化的细胞通过胚发育的通常阶段以及通过生根小植株阶段。转基因胚以及种子以类似的方式再生。随后将所得的转基因的生根小苗种植在诸如土壤之类的合适植物生长培养基中。优选地，将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。相反，将来自这些重要品系的植物用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。

除以上所讨论的程序以外，专业人员亦熟悉描述了用于下列目的特定条件和程序的标准源资料：大分子的构建、操作和分离(例如DNA分子、质粒等等)；重组DNA片段和重组表达体的构建；以及克隆的筛选和分离。例如参见：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor：NY(1989)；Maliga等人，Methods in Plant Molecular Biology，Cold Spring Harbor：NY(1995)；Birren等人，Genome Analysis：Detecting Genes，第1卷，Cold Spring Harbor：NY(1998)；Birren等人，Genome Analysis：Analyzing DNA，第2卷，Cold Spring Harbor：NY(1998)；Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual，编辑，Clark，Springer：NY(1997)。

油料种子植物的例子包括但不限于：大豆、芸苔属植物、向日葵、玉米、棉花、亚麻和红花。

另一方面，本发明涉及一种转基因玉米谷粒，所述转基因玉米谷粒的总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子玉米谷粒的总脂肪酸含量相比高出至少10％。所述转基因玉米谷粒可以包含具有至少一种DGAT序列的重组构建体。所述DGAT序列可以选自DGAT1、DGAT2和DGAT1与DGAT2的组合。

在另一方面，本发明涉及一种提高玉米谷粒的总脂肪酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个玉米谷粒；

(b)选择总脂肪酸含量与非转基因的、无转基因分离子玉米谷粒的总脂肪酸含量相比高出至少10％的步骤(a)中的转化的玉米谷粒。

本发明还涉及一种转基因大豆种子，与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的对应含量相比，所述转基因大豆种子的总脂肪酸含量高出至少10％并且油酸含量高出至少25％。并且，本发明还涉及一种转基因大豆种子，与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的对应含量相比，所述转基因大豆种子的总脂肪酸含量高出至少10％，并且具有至少一种下列特征：i)油酸含量高出至少25％；ii)亚麻酸含量降低至少25％；iii)亚油酸含量降低至少4％；iv)棕榈酸含量降低至少8％；以及v)硬脂酸含量高出至少14％。

此外的另一方面，本发明还涉及一种提高大豆种子的总脂肪酸含量和油酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；

(b)选择总脂肪酸含量和油酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量和油酸含量相比分别高出至少10％和至少25％的步骤(a)中的转化的大豆细胞。

另一方面，本发明还涉及一种提高大豆种子的总脂肪酸含量并降低其亚麻酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；

(b)选择总脂肪酸含量和亚麻酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量和亚麻酸含量相比分别高出至少10％和降低至少25％的步骤(a)中的转化的大豆细胞。

再一方面，本发明还涉及一种提高大豆种子的总脂肪酸含量并降低其亚油酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；

(b)选择总脂肪酸含量和亚油酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量和亚油酸含量相比分别高出至少10％和降低至少4％的步骤(a)中的转化的大豆细胞。

再一方面，本发明还涉及一种提高大豆种子的总脂肪酸含量并降低其棕榈酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；

(b)选择总脂肪酸含量和棕榈酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量和棕榈酸含量相比分别高出至少10％和降低至少8％的步骤(a)中的转化的大豆细胞。

再一方面，本发明涉及一种提高大豆种子的总脂肪酸含量和硬脂酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用具有至少一种DGAT序列的重组构建体转化至少一个大豆细胞；

(b)选择总脂肪酸含量和硬脂酸含量与非转基因的、无转基因分离子大豆种子的总脂肪酸含量和硬脂酸含量相比分别高出至少10％和至少14％的步骤(a)中的转化的大豆细胞。

如前文所论及，本文所述的任何一种转基因油料种子均可包含具有至少一种DGAT序列的重组构建体。所述DGAT序列可以选自DGAT1、DGAT2和DGAT1与DGAT2的组合。此外，至少一种DGAT序列来自解脂耶氏酵母。

利用电穿孔、基因枪轰击和农杆菌对单子叶植物进行的转化已有报道。已实现转化和植物再生的包括：芦笋(Bytebier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84：5354，(1987))；大麦(Wan and Lemaux，Plant Physiol 104：37(1994))；玉米(Rhodes等人，Science 240：204(1988)，Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2：603-618(1990)，Fromm等人，BiolTechnology 8：833(1990)，Koziel等人，BiolTechnology 11：194，(1993)，Armstrong等人，Crop Science 35：550-557(1995))；燕麦(Somers等人，BiolTechnology 10：1589(1992))；鸭茅(Horn等人，Plant Cell Rep.7：469(1988))；水稻(Toriyama等人，TheorAppl.Genet.205：34，(1986)；Part等人，Plant Mol.Biol.32：1135-1148，(1996)；Abedinia等人，Aust.J.Plant Physiol.24：133-141(1997)；Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.76：835(1988)；Zhang等人Plant Cell Rep.7：379，(1988)；Battraw和Hall，Plant Sci.86：191-202(1992)；Christou等人，Bio/Technology9：957(1991))；裸麦(De la Pena等人，Nature 325：274(1987))；甘蔗(Bower和Birch，Plant J.2：409(1992))；高羊茅(Wang等人，BiolTechnology 10：691(1992))，和小麦(Vasil等人，Bio/Technology10：667(1992)；美国专利5,631,152)。

通过利用聚乙二醇处理、电穿孔或基因枪轰击将核酸分子导入植物细胞，已发展出基于克隆核酸构造的短暂表达的基因表达分析法(Marcotte等人，Nature 335：454-457(1988)；Marcotte等人，Plant Cell1：523-532(1989)；McCarty等人，Cell 66：895-905(1991)；Hattori等人，Genes Dev.6：609-618(1992)；Goff等人，EMBO J.9：2517-2522(1990))。

短暂表达体系可用于对基因结构进行功能性剖析(参见Maliga等人，Methods in Plant Molecular Biology，Cold Spring Harbor Press(1995))。当然，本发明的任何核酸分子都能以永久性或暂时性的方式与其他遗传元件，如载体、启动子、增强子等一起，被导入至植物细胞。

除以上所讨论的程序以外，专业人员亦熟悉描述了用于大分子的构建、操作和分离(例如DNA分子、质粒等等)、重组生物体的构建以及克隆的筛选和分离的特定条件和程序的标准源资料(例如参见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press(1989)；Maliga等人，Methods in Plant Molecular Biology，Cold Spring Harbor Press(1995)；Birren等人，Genome Analysis：Detecting Genes，1，Cold Spring Harbor，New York(1998)；Birren等人，Genome Analysis：Analyzing DNA，2，Cold Spring Harbor，New York(1998)；Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual，编辑，Clark，Springer，New York(1997))。

本发明的转基因大豆种子可用于加工生产大豆油脂、大豆产品和/或大豆副产品。

“大豆产品”可以包括但不限于表1A所列的项目。

表1A

由大豆种子获得的大豆蛋白产品^a

a  参见Soy蛋白质Products：Characteristics，Nutritional Aspects and Utilization(1987).大豆蛋白委员会。

“加工”是指用以获得表1A中所列产品的任何物理和化学方法，所述方法包括但不限于对完整种子或种子局部进行的热处理、去皮与碾磨、挤压、溶剂萃取或水浸萃取。此外，“加工”还包括用以从完整种子或种子局部浓缩和提取大豆蛋白质的方法，以及东方国家制作大豆发酵食物产品的各种传统方法。关于建立起多种上述产品的贸易标准和规格(参见National油脂种子Processors Association Yearbook and Trading Rules 1991-1992)。当指某种产品为“高蛋白的”或“低蛋白的”时，此产品如上述标准规格所述。“NSI”是指如如美国油脂化学家协会方法Ac4 41所定义的氮溶解指数。“KOH氮溶解度”是豆粕质量的一个指标，其是指在如Araba和Dale((1990)Poult.Sci.69：76-83)所述的条件下，溶解于0.036M KOH中的氮的量。“低变性”豆粕是指在控制湿热以令NSI为约85至90的条件下经过处理并脱脂的、脱壳去皮的大豆子叶。此术语亦可指被碾磨至能通过100号美国标准筛尺寸的、具有相似NSI的大豆粉。“煮熟的”是指NSI为约20至60的大豆蛋白产品，典型地为一种大豆粉。“烤的”是指NSI低于20的大豆蛋白产品，典型地为一种大豆粉。“粗磨粉”是指在10号和80号美国标准筛尺寸之间的脱脂去壳的子叶。“大豆蛋白浓缩物”是指脱脂去壳的大豆经以下三个基本步骤所获得的产品：酸浸(pH约为4.5)，酒精(约55％至80％)萃取，以及在水萃取之前用湿热处理令蛋白质变性。用于制备大豆蛋白浓缩物的典型条件描述于Pass((1975)美国专利3,897,574和Campbell等人，(1985)in New Protein Foods，由Altschul and Wilcke编辑，Academic Press，第5卷，第10章，Seed Storage Proteins，第302-338页)。“挤压”是指令原料(粗磨粉、粉或浓缩物)在高温高压下通过一种带外壳的螺旋输送机，作为一种改变所述原料构造的方法的过程。“质构化”和“构造化”是指用以改变所述原料物理性状的挤压过程。包括热塑挤压在内的上述过程的特征此前已有描述(Atkinson(1970)美国专利3,488,770，Horan(1985)In New Protein Foods，ed.by Altschul and Wilcke，Academic Press，第1A卷，第八章，第367-414页]。此外，包含大豆蛋白产品的复合食品混合物的挤压过程所使用的条件此前也已有描述(Rokey(1983)Feed Manufacturing Technology III，222-237；McCulloch，美国专利4,454,804)。

表1B

大豆油脂和副产品生产的一般步骤

更准确地说，大豆种子经清洁、回火、脱壳和去皮从而提高了油脂萃取的效率。油脂的萃取通常利用溶剂(例如己烷)萃取来完成，但也可以通过联合使用物理压榨和/或溶剂萃取而实现。所得到的油脂称为原油。可以通过使磷脂以及其他极性和中性的脂类复合物发生水合反应从而促进它们与非水合的甘油三酯部分(大豆油脂)分离，而令上述原油脱胶。所得到的卵磷脂胶可以被深加工为作为乳化剂和脱模(即抗粘结)剂用于多种食品和工业品中的具有重要商业意义的卵磷脂产品。脱胶油可以进一步精炼以除去杂质(主要是游离脂肪酸、色素和残留胶)。通过添加一种与游离脂肪酸反应形成皂并使上述原油中的磷脂和蛋白质发生水合反应的腐蚀剂而实现精炼。用水洗去精炼过程所形成的皂类痕迹。上述皂脚副产品可直接用于动物饲料或将其酸化以回收游离脂肪酸。利用一种漂白土的吸附作用除去大部分的叶绿素和类胡萝卜素复合物而实现脱色。精炼的油脂可以是氢化的，从而得到具有不同熔解性质和构造的脂肪。可以通过在精细控制的冷却条件下结晶，从而利用冷凝(分馏)从氢化油脂中除去硬脂。脱臭(主要通过真空蒸汽蒸馏)是最后一个步骤，目的是除去那些令油脂具有臭味或气味的复合物。脱臭过程中还可以除去其他有价值的副产品，如生育酚和甾醇类。包含这些副产品的脱臭馏出液可以出售，其可用于生产天然维生素E以及其他高价值的药品。经精炼、漂白、(氢化、分馏)以及脱臭的油脂和脂肪可以直接包装出售，或深加工为更加专门化的产品。关于大豆种子加工、大豆油脂生产以及副产品利用的更加详尽的参考文献参见Erickson，Practical Handbook of Soybean Processing and Utilization，The American  油脂Chemists’Society and United Soybean Board(1995)。大豆油脂同椰子、棕榈、棕榈仁以及可可等的油脂相比饱和脂肪酸含量相对较低，因此其在室温下为液态。

包含经精炼和/或纯化的PUFA的植物和微生物油脂可以被氢化，从而得到具有不同熔解性质和构造的脂肪。多种经加工的脂肪(包括涂抹油、糖果脂肪、硬质脂肪、人造黄油、烤酥油等)要求在室温下具有的硬度各不相同，而它们只能通过改变原料油脂的物理特性而制得。通常通过催化氢化实现这点。

氢化作用是在催化剂，如镍的催化下，将氢加到不饱和脂肪酸双键上的化学反应。例如，高油酸大豆油脂包含不饱和的油酸、亚油酸和亚麻酸，而上述每种脂肪酸都能被氢化。氢化作用有两个主要的效应。第一，由于不饱和脂肪酸含量的减少，油脂的氧化稳定性得到提高。第二，由于脂肪酸的修饰提高了熔点，改变了油脂的物理性质，从而得到在室温下为半液态或固态的脂肪。

影响氢化反应的参数有很多，它们进而又影响着终产品的组成。包括压力、温度、催化剂的类型和浓度、搅拌以及反应器设计在内的操作条件属于可控的重要参数范畴。可以利用选择性的氢化反应条件来实现对不饱和程度较高的脂肪酸相对于不饱和程度较低的脂肪酸的优先氢化。轻微或涂刷氢化(brush hydrogenation)常被用于提高液态油脂的稳定性。进一步的氢化则使得液态油脂转化为一种物理上的固态脂肪。氢化的程度依赖于针对特定的终产物所期望的性能和熔解性质。通过氢化可以获得无数种可能的油脂和脂肪产品，包括液态酥油(用于制作焙烤产品，用于商业化的油炸和烘烤操作的固态脂肪和酥油)以及用于制造人造黄油的基础油。对氢化作用和氢化产品的更加详尽的描述参见Patterson，H.B.W.，Hydrogenation of Fats and油脂s：Theory and Practice.The American油脂Chemists’Society(1994)。

由于氢化过程中会产生反式的脂肪酸同分异构体，关于氢化油脂已存在一些争议。摄食大量的反式同分异构体被认为与一些有害健康的效应存在联系，包括血浆中低密度脂蛋白对高密度脂蛋白的比率的升高，以及罹患冠心病的风险升高。

本发明的另一方面涉及一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括：

(a)编码具有二酰基甘油酰基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽如SEQ ID：83、88或93所示；

(b)(a)中的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列与所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。

以及，包含与至少一种调控序列可操作地连接的所述分离的核酸片段的重组DNA构建体。以及，在其基因组中包含所述重组DNA构建体的细胞。

所述细胞可以是一种油料种子植物的一部分，例如但不限于，大豆、玉米、卡诺拉(canola)、向日葵、亚麻、棉花和红花。

最后，本发明涉及一种提高油料种子的总脂肪酸含量的方法，所述方法包括：

(a)用上述重组构建体转化至少一个油料种子细胞；

(b)选择总脂肪酸含量高于非转基因的、无转基因分离子油料种子的总脂肪酸含量的步骤(a)中的转化的油料种子细胞。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步限定，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员能确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对本发明做出多种改变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在属于附加的权利要求书的范围内。

缩写的含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔浓度，“mM”表示毫摩尔浓度，“M”表示摩尔浓度，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对而“kB”表示千碱基对。

实施例1

解脂耶氏酵母DGAT基因在酿酒酵母中的表达

通过限制酶NcoI和NotI的消化，将解脂耶氏酵母DGAT1基因(SEQ ID NO：1)自质粒载体pYDA1(SEQ ID NO：2)上切下。用T4DNA聚合酶(Promega，Madison，WI，USA)将DNA片段的末端补平，并连接到pY75(SEQ ID NO：3)上惟一的NotI位点。在用于克隆之前，先将pY75载体用NotI线性化，用T4DNA聚合酶补平，并用虾碱性磷酸酶((NEB，Beverly，MA，USA))去磷酸化。利用标准方法分离质粒DNA，并用EcoRI进行限制性消化，以鉴定出起始密码子邻近pY75中GPD启动子3′端的质粒克隆(DGAT1基因的有义方向)。鉴定出的阳性克隆质粒称为pY75 YL DGAT1(SEQ ID NO：4)。pYDA1的构建描述于PCT专利公布WO 2006/052914，此公布在此引入本文以供参考。

酵母附加体质粒(YEp)型载体pRS425(SEQ ID NO：5)(Christianson等人，Gene 110：119-122(1992))包含来自酿酒酵母2微米内源性质粒的序列、一个LEU2选择性标记以及基于一种多功能噬菌粒，pBluescript II SK(+)的序列。酿酒酵母组成型的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)强启动子按照如Jia等人(Physiol.Genomics 3：83-92(2000))to produce pGPD-425(SEQ ID NO：6)所述的相同方式被克隆至pRS425的SacII和SpeI位点之间，从而得到pGPD-425(SEQ ID NO：6)。一个NotI位点被引入至pGPD-425的BamHI位点，从而得到两侧为BamHI位点的一个NotI位点，该质粒称为pY75(SEQ ID NO：3)。

DGAT2基因按下述方法PCR扩增至解脂耶氏酵母(ATCC登录号20362)基因组。酵母细胞在固体YPD培养基上生长72h。将细胞悬浮于200μL的DNA提取缓冲液(100mM Tris pH 7.5，10mMEDTA，100mM NaCl，0.1％Triton X-100)并加入2至5个玻璃珠(直径3mm)和约0.1g的玻璃珠(直径0.5mm)。用旋涡混合器将酵母细胞悬液剧烈振荡混匀，75℃孵育25min。将溶菌液冷却至室温并离心澄清。

利用下列两种寡核苷酸引物以产生一种约1600bp的PCR片段：

oYLDGAT2-1：

GCGGCCGCATGACTATCGACTCACAATACTACAAGT(SEQ IDNO：7)，和

oYLDGAT2-2：

GCGGCCGCTTACTCAATCATTCGGAACTCTGGGGCT(SEQ IDNO：8)。

简言之，制备了一种包含2.5mM MgCl₂、2mM dNTPs、10mMTris/HCl(pH 8.8)、50mM KCl、0.08％Nonidet P40、1μM oYLDGAT2-1(SEQ ID NO：7)和oYLDGAT2-2(SEQ ID NO：8)、10U Taq聚合酶(Fermentas，Hanover，MD)以及2μL酵母溶菌液的PCR反应混合液(100μL)。将上述PCR混合液分为四份25μL的等份，进行35个循环的扩增，每一循环包括94℃45sec，各退火温度45sec，以及72℃1min。将PCR产物进行凝胶纯化，并按生产商的说明书克隆至pGEM T-easy(Promega)。

对十个独立的质粒克隆进行了完整测序。该分析的共有序列如SEQ ID NO：9所示。该DNA序列在两个不同的核苷酸位点与PCT专利公布WO 2005/003322所公开的DGAT2序列不一致。DNA序列的差异影响了DGAT2开放阅读框的nt448和nt672。前一个nt差异改变了预测的DGAT蛋白氨基酸序列。它将PCT专利公布WO2005/003322所公开的DGAT序列中的一个丝氨酸替换为苏氨酸残基。第二个序列差异并未改变PCT专利公布WO 2005/003322所公开的氨基酸序列。本文所公开的解脂耶氏酵母DGAT2序列和PCT专利公布WO 2005/003322所公开的解脂耶氏酵母DGAT2序列之间的差异可以归因于用于分离DGAT2基因的解脂耶氏酵母菌株之间的差异。菌株ATCC登录号20362的DGAT蛋白所预测的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

将DGAT基因(SEQ ID NO：9)作为NotI限制性片段自pGEMT-easy载体上切下，并连接到经NotI线性化并去磷酸化的pY75(SEQ ID NO：3)DNA上。从重组构建体克隆分离质粒DNA，并用SacI和PacI进行限制性消化，以鉴定出DGAT2的起始密码子邻近pY75中GPD启动子3′端的克隆(DGAT2基因的有义方向)。鉴定出的阳性克隆质粒称为pY75 YL DGAT2(SEQ ID NO：11)。

利用标准方法(Gietz，R.Daniel；Woods，Robin A.，Meth.Enzymol.350：87-96(2002))将pY75YL DGAT1(SEQ ID NO：4)质粒DNA和pY75空载体转入酿酒酵母菌株INVSC1(Invitrogen，USA)。在添加了CSM-leu(Qbiogene，Carlsbad，CA)的DOBA培养基上对重组酵母克隆进行选择。将五个独立生长的克隆分别接种到五份50mL的添加了CSM-leu的DOBA培养基中，并在30℃培养72h。离心收集细胞，并重悬于除去除了作为氮源的硫酸铵以外同上述DOBA培养基相同的培养基中。将培养物再培养60h，离心收集细胞。将细胞在干冰上冷冻并冻干。

将每一酵母细胞样品分为一式三份测定其总脂肪酸含量如下。约5至15毫克的酵母粉末被称重并置于一个带有旋盖和特氟隆密封件的13x 100mm的玻璃培养管底部。加入5μL 17:0TAG(10mg/mL，溶于甲苯)储备液，再加入500μL溶于(无水)甲醇的5％硫酸。将样品在95℃孵育1.5h。待玻璃管冷却至室温后加入1mL 1M的氯化钠并混匀。加入1mL庚烷，混匀玻璃管内容物并将样品短暂旋转以实现相分离。将约500μL的有机相转入一个气相色谱小瓶。用气相色谱法分析脂肪酸甲基酯。在配套了Omegawax 320熔融石英毛细管柱(Supelco Inc.，Catalog No.24152)的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪上分析4μL的庚烷萃取液。设定炉温程序如下：220℃保持2.7分钟，然后以20℃/分钟的速度升温至240℃并再保持2.3分钟。载气通过Whatman氢气发生器供应。保留时间与那些可商购获得的标准甲酯比较(Nu-Chek Prep，Inc.catalog#U-99-A)。

如前所述，将pY75YL DGAT2(SEQ ID NO：11)质粒DNA和pY75空载体转入酿酒酵母菌株INVSC1，并分析重组酵母培养物的总脂肪酸含量。与在酵母中过表达两种DGAT基因相关的结果总结于表2中。

表2

酿酒酵母培养物的总脂肪酸含量

表2显示，同仅携带pY75空质粒的细胞相比，携带pY75YLDGAT1(SEQ ID NO：4)的酵母细胞中总脂肪酸含量有显著提高。在相同的培养条件下，五个独立培养物平均的脂肪酸细胞干重(DCW)百分比为11.9％，而空载体对照组为9.3％。总而言之，总脂肪酸产量提高了28％。此外，脂肪酸谱还发生了同YL DGAT1的表达相关的轻微变化，表现为棕榈酸的增加。

与相同条件下培养的空载体对照组相比，在氮饥饿培养条件下YL DGAT2的组成型表达令总脂肪酸含量提高了110％。空载体对照组的总脂肪酸含量为6.6％，而YL DGAT2转化体的平均脂肪酸含量为14.2％。YL DGAT2的表达导致了脂肪酸谱的改变。棕榈酸含量显著提高，与之相伴的是棕榈油酸含量发生中等程度的降低。此外，伴随着油酸含量的明显降低，硬脂酸含量发生了显著提高。上述结果总体上显示，在提高了碳/氮比率的条件下，YL DGAT在酵母中的过表达导致了脂肪酸累积的增加。YL DGAT酶类的过表达能够在酿酒酵母中提高内源性DGAT活性。两种DGAT基因的类似实验均重复了两次以上。每次均能在YL DGAT培养物和空载体对照组之间观察到脂肪酸含量的差异，所述差异就YL DGAT1(SEQ ID NO：1)而言为至少8％，就YL DGAT2(SEQ ID NO：9)而言为至少14.3％。

实施例2

解脂耶氏酵母DGAT1和DGAT2基因向解脂耶氏酵母表达载体中的克隆

本实施例描述了分别包含FBAINm::YDGAT1::PEX20嵌合基因和FBAINm::YDGAT2::PEX20嵌合基因的pFBAIN-YDG1和pFBAIN-YDG2的制备。上述质粒被设计用于DGAT1和DGAT2在解脂耶氏酵母中的过表达。

设计并合成用以从解脂耶氏酵母基因组DNA(分离自ATCC登录号20362菌株，购自American Type Culture Collection(Rockville，MD))扩增DGAT1ORF的寡核苷酸YDGAT1-F(SEQ ID NO：12)和YDGAT-R(SEQ ID NO：13)，同时设计并合成用以扩增DGAT2ORF的寡核苷酸YDGAT2-F(SEQ ID NO：14)和YDGAT2-R(SEQ IDNO：15)。

用解脂耶氏酵母基因组DNA作为模板的PCR反应，每一反应总体积为50μL，包括：20μM的正向和反向引物各1μL，1μL基因组DNA(100ng)，10μL 5X PCR缓冲液，1μL dNTP混合液(每种10μM)，35μL水以及1μL Phusion聚合酶(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。扩增程序为：98℃1min；98℃10sec、55℃10sec、72℃30sec共30个循环；最终延伸步骤为72℃5min。得到分别包含DGAT1 ORF和DGAT2ORF的1603bp DNA片段(SEQ ID NO：16)和1567bp DNA片段(SEQ ID NO：17)。

按生产商的说明书用Qiagen PCR Purification试剂盒纯化上述PCR片段。用NcoI和NotI消化纯化后的DNA样品，继而用Qiagen reaction clean-up试剂盒纯化，然后定向连接至NcoI/NotI消化后的pFBAIN-MOD-1(图1C；SEQ ID NO：18)。具体而言，上述连接反应包含：10μL 2X连接缓冲液，1μL T4DNA连接酶(Promega)，1600bp片段(即DGAT1；SEQ ID NO：16)或1564bp片段(即DGAT2；SEQ ID NO：17)4μL(约300ng)以及1μL pFBAIN-MOD-1(约150ng)。将反应混合液在室温孵育2h，并用其转化E.coli Top10感受态细胞(Invitrogen)。用Qiagen Miniprep试剂盒回收转化体中的质粒DNA。通过限制梅切作图鉴定出正确的克隆，最终的质粒构造分别命名为“pFBAIN-YDG 1”和“pFBAIN-YDG2”。

由此，pFBAIN-YDG1(图1A；SEQ ID NO：19)包含下述组分：

表3

质粒pFBAIN-YDG1(SEO ID NO：19)的组分

质粒pFBAIN-YDG2(图1B；SEQ ID NO：20)所包含的组分与pFBAIN-YDG1所包含的基本一致，不同之处在于解脂耶氏酵母DGAT2ORF(SEQ ID NO：17；图1B中标记为YDG2)取代了pFBAIN-YDG1中的解脂耶氏酵母DGAT1ORF。

术语“FBAINm启动子”或“FBAINm启动子区域”是指FBAIN启动子(参见下文)的一个经修饰的版本，其中FBAINm在ATG翻译起始密码子和FBAIN启动子的内含子之间有52bp的缺失(从而仅包括N-端的22个氨基酸)，并且在上述内含子之后有一种新的翻译共有基序。此外，当上述FBAIN启动子与一个待表达的基因的编码区融合时会产生一种融合蛋白质，而上述FBAINm启动子则并不产生这样的融合蛋白质。上述FBAIN启动子是指为表达所必需的、位于由fba1基因编码的解脂耶氏酵母果糖-二磷酸醛缩酶(E.C.4.1.2.13)“ATG”翻译起始密码子之前的5′上游非翻译区域，加上含有fba1基因一个内含子的5′编码区的一个部分。对上述启动子的描述详见PCT专利公布WO 2005/049805和美国专利7,202,356，上述专利均全文引入本文以供参考。

实施例3

解脂耶氏酵母DGAT1和DGAT2基因在解脂耶氏酵母菌株Y2224中的过表达

本实施例描述了在经过转化从而共表达解脂耶氏酵母DGAT1(SEQ ID NO：16)或解脂耶氏酵母DGAT2(SEQ ID NO：17)的解脂耶氏酵母菌株Y2224中，脂肪酸含量的提高和每种脂肪酸相对丰度的改变。Y2224菌株是由ATCC登录号为20362的野生型解脂耶氏酵母菌株经Ura3基因自发突变而来的一种FOA抗性突变体。

菌株Y2224的产生：以如下方式分离菌株Y2224：将来自一块YPD琼脂平板(1％酵母抽提物，2％细菌用蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)的ATCC登录号为20362的解脂耶氏酵母细胞，划线接种至一块包含250mg/L 5-FOA(5-氟乳清酸；Zymo Research)基本培养基平板(含尿嘧啶和尿苷各75mg/L，含硫酸铵不含氨基酸的酵母氮源(YNB)6.7g/L以及葡萄糖20g/L)。将平板在28℃下孵育并将四个得到的菌落分别贴在含有200mg/mL 5-FOA的基本培养基(MM)平板上和无尿嘧啶和尿苷的MM平板上以确定尿嘧啶Ura3营养缺陷型。

Y2224菌株的转化：如下所述，将一个pFBAIn-YDG1克隆、一个pFBAIn-YDG2克隆和对照组质粒pFBAIN-MOD-1转入解脂耶氏酵母Y2224菌株。

除非另外说明，否则解脂解脂耶氏酵母的转化根据Chen，D.C.等人(Appl.Microbiol Biotechnol.48(2)：232-235(1997))的方法。简而言之，将解脂耶氏酵母划线到YPD琼脂平板上，并在30℃生长大约18小时。从平板上刮掉几大环量的细胞并将其重悬浮于含有下面成分的1mL转化缓冲液中：2.25mL 50％PEG，平均分子量为3350；0.125mL 2M醋酸锂，pH6.0；0.125mL 2M DTT，以及50μg经剪切的鲑精DNA。然后，将大约500ng线性化的质粒DNA在100μL重悬浮的细胞中孵育，并将其在39℃下维持1小时，每间隔15分钟进行涡旋混合。

将每种转化的细胞接种至缺乏尿嘧啶的基本培养基(MM)平板(0.17％不含硫酸铵和氨基酸的酵母氮源(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)，2％葡萄糖，0.1％脯氨酸，pH 6.1，20g/L琼脂)，并在30℃培养2天。将来自各转化平板的三种转化体分别接种至25mL的MM培养基(0.17％不含硫酸铵和氨基酸的酵母氮源(DIFCOLaboratories)，2％葡萄糖，0.1％脯氨酸，pH 6.1)。每一培养物在30℃培养2天，然后转入25mL的高葡萄糖培养基(“HG培养基”，包含80g/L葡萄糖，27g/L K₂HPO₄，6.3g/L KH₂PO₄，pH约7.5)在30℃继续培养5天。

脂质分析：提取总脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲基酯(FAMEs)，并随后用Hewlett-Packard 6890GC分析。

更具体地讲，为了进行脂肪酸分析，将细胞通过离心收集并提取脂质，如Bligh，E.G.&Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.37：911-917(1959))中描述的那样。脂肪酸甲基酯通过脂质提取物和甲醇钠之间的酯交换反应进行制备(Roughan，G.，和Nishida I.，Arch.Biochem Biophys.276(1)：38-46(1990))，然后用配备30-m X 0.25mm(i.d.)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard6890GC进行分析。炉温以3.5℃/分钟从170℃(保持25分钟)升到185℃。

为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获解脂耶氏酵母培养物(3mL)，在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5至10分钟。将甲醇钠(100μL，浓度为1％)加入样本中，然后将样本涡旋振荡20分钟。在加入3滴1M氯化钠和400μL己烷后，涡旋并离心样本。移出上层并如上所述的用GC进行分析。

基于上述分析，测定了分别包含pFBAIn-YDG1、pFBAIn-YDG2和pFBAIN-MOD-1(对照组)的Y2224转化体菌株的脂质含量和组分，显示于下列表4中。对每种菌株的三个独立的转化体进行了分析，平均结果显示于突出表示为灰色的行中。各种脂肪酸分别表示为16:0(棕榈酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0、18:1(油酸)和18:2(LA)；并且每种组分用占总脂肪酸的百分比表示。

“％FAME/DCW”表示脂肪酸甲基酯/细胞干重的百分比。通过从10mL培养物中离心收集细胞、用水清洗上述细胞一次以除去残留的培养基、在真空烘箱中80℃过夜烘干上述细胞以及称量烘干后细胞的重量，测定出细胞干重。通过将GC谱中所有峰的面积与加入的一种已知量的C15:0脂肪酸内标物的峰的面积进行比较，测定出一份样品中脂肪酸甲基酯的总量。

表4

过表达YDGAT1和YDGAT2的解脂耶氏酵母Y2224菌株中的脂质含量A\和组成

GC分析显示，与携带pFBAIn-MOD-1的细胞相比，携带pFBAIn-YDG1的细胞中的总脂肪酸有显著的增加。平均脂肪酸由对照组的21.39％FAME/DCW增加至表达YDGAT1的细胞的23.70％FAME/DCW(即提高了10.8％)。此外，还发生了C16:1和C18:1脂肪酸量的提高和C18:2脂肪酸量的降低(表4)。

与对照组相比，携带pFBAIn-YDG2的细胞的总脂肪酸含量同样有了大幅增加，其平均为27.32％FAME/DCW(即提高了27.7％)。脂肪酸重量的分布也同样发生了显著的改变。具体而言，C18:0和C18:1的量提高了，而C16:0、C16:1和C18:2的量降低了。

总而言之，上述结果说明解脂耶氏酵母DGAT1或DGAT2的过表达既影响总脂肪酸含量，又影响各种脂肪酸的相对丰度。

实施例4

解脂耶氏酵母DGAT基因在拟南芥种子中的表达

如下所述，制备了一种适用于农杆菌介导的转化的二元载体。通过若干克隆步骤，将多个限制性位点添加到来自KS123(SEQ ID NO：21)的Bcon/NotI/Phas3′框的末端，其中所述KS123质粒已描述于PCT专利公布WO 02/008269中(该专利的内容特此引入本文以供参考)。简而言之，利用引物oCal-15(SEQ ID NO：23)和oCal-6(SEQ ID NO：24)，自质粒CalFad2-2(描述于PCT专利公布WO 01/12800)扩增出DNA片段(ca1a24-4；SEQ ID NO：22)。用BgIII和BamHI消化DNA片段ca1a24-4(SEQ ID NO：22)，并克隆至pKS123的BamHI位点以构建出pKR53B(SEQ ID NO：25)。将包含Bcon/NotI/Phas3框的pKR53B XbaI/SbfI片段，克隆至包含细菌潮霉素磷酸转移酶基因的pKR72(ATCC登录号PTA-6019；SEQ ID NO：26)XbaI/SbfI片段，以构建出pKR85(SEQ ID NO：27)。pKR72的特征如下所述。作为起始质粒的pKR72(ATCC登录号PTA-6019；SEQ ID NO：26)，是此前已描述于PCT专利公布WO 02/008269(该专利的内容特此引入本文以供参考)的pKS123的一种衍生质粒，其包含两翼分别与T7启动子和转录终止子相接的潮霉素B磷酸转移酶(HPT)基因(Gritz，L.and Davies，J.，Gene 25：179-188(1983))(T7启动子/hpt/T7终止子框)，以及一个用于在细菌(例如E.coli)中选择和复制的细菌复制起点(ori)。此外，pKR72还包含两翼分别与35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))和NOS 3′转录终止子(Depicker等人，J.Mol.Appl.Genet.1：561-570(1982))相接(35S/hpt/NOS3′框)，从而可用于在植物，例如大豆中进行选择的潮霉素B磷酸转移酶基因。pKR72还包含一个两翼分别与β-大豆伴球蛋白(Beachy等人，EMBO J.4：3047-3053(1985))的α’亚单位和云扁豆蛋白(Doyle等人，J.Biol.Chem.261：9228-9238(1986))的3′转录终止区域相接的NotI限制性位点，从而允许克隆至所述NotI位点的基因在大豆种子中强烈的组织特异性表达。

利用引物oKR85-1(SEQ ID NO：28)和oKR85-2(SEQ ID NO：29)从质粒pKR85(SEQ ID NO：27)中扩增出Bcon/NotI/Phas3框，并按照生产商的说明书将得到的DNA片段克隆至(Stratgene)，以构建出pPCR85(SEQ ID NO：30)。

将包含Bcon/NotI/Phas3框的pPCR85EcoRI/BglII片段，克隆至包含拟南芥二元载体主链的pZS199质粒(PCT专利公布WO93/11245；以及公布于1993年6月10日的美国专利5,952,544；此二专利的公开内容特此引入本文以供参考)EcoRI/BamHI片段，以构建出pKR91(SEQ ID NO：31)。

通过AscI消化将上述Bcon/NotI/Phas3框从pKR91上切下，制备出包含惟一AscI克隆位点的重连后的二元载体，称之为pKR92(SEQ ID NO：32)。

pKR92 YL DGAT2的构建：

表达质粒KS362的构建描述于实施例5。

将包含与β-大豆伴球蛋白启动子和云扁豆蛋白终止子融合的YL DGAT2基因，以及与Kti启动子和终止子序列融合的DsRed基因的一个表达框，作为6.4kb的AscI片段自KS362上切下。将上述DNA与经AscI线性化的去磷酸化pKR92载体DNA连接，以构建出pKR92 YL DGAT2(SEQ ID NO：33)。

pKR92 YL DGAT1/YL DGAT2的构建：

表达质粒KS364的构建描述于实施例5。将YL DGAT1(SEQ IDNO：1)和YL DGAT2(SEQ ID NO：9)基因分别与大豆球蛋白1和β-大豆伴球蛋白启动子以及相同的云扁豆蛋白终止子序列融合所构成的一个表达框，作为7kb的AscI片段自KS364上切下。将上述DNA与经AscI线性化的去磷酸化pKR92载体DNA连接，以构建出pKR92YL DGAT1/YL DGAT2(SEQ ID NO：34)。

转基因拟南芥品系的获得与分析：

通过电穿孔将pKR92YL DGAT2和pKR92YL DGAT1/YLDGAT2质粒DNA导入根癌农杆菌NTL4(Luo等人，Molecular Plant-Microbe Interactions 14(1)：98-103(2001))。简言之，将1μg质粒DNA与100μL电转感受态细胞在冰上混合。将上述细胞悬液转入一个100μL电穿孔杯(间隙宽度为1mm)，并用参数调至1kV、400Ω和25μF的BIORAD电穿孔仪进行电穿孔。将细胞转入1mLLB培养基，并在30℃孵育2h。将细胞铺板于包含50μg/mL卡那霉素的LB培养基上。将平板在30℃培养60h。从转染的农杆菌细胞单克隆接种出重组的农杆菌培养物(500mL LB，50μg/mL卡那霉素)，并在30℃培养60h。离心(5000xg，10min)收集细胞，并重悬于包含0.05％(V/V)Silwet的1L 5％(W/V)蔗糖中。在metromix 360土壤混合物上以每100cm²30植株的密度将拟南芥盆栽培养4周(22℃，持续光照，100μE m^-2s^-1)。将拟南芥植株反复浸入携带上述二元载体的农杆菌悬液，并置于黑暗、高湿度环境24h。植株在如前所述的标准植物生长条件下培养四至五周，然后收集植物材料并置于纸袋中在环境温度下干燥一周。用0.425mm筛眼的黄铜筛收集种子。

将干净的拟南芥种子(2g，相当于约100,000粒种子)依次用下列溶液清洗消毒：45mL 80％酒精，0.01％triton X-100，45mL 30％(V/V)溶于水的家用漂白剂，0.01％triton X-100，最后用无菌水反复冲洗。将含20,000粒种子的等份转入包含150mL无菌的植物生长培养基的方板(20x 20cm)中，所述培养基包含固化于10g/L琼脂中的0.5x MS盐、1.0％(W/V)蔗糖、0.05MES/KOH(pH 5.8)、200μg/mL特美汀，以及50μg/mL卡那霉素。通过将悬于水中的种子悬液与等体积融化熔化的植物生长培养基混匀，将上述种子均匀分散于上述培养基中。平板在标准生长条件下孵育十天。将卡那霉素抗性幼苗转入不含选择剂的植物生长培养基中，经8至10周发育至成熟(22℃，固定光照，100-200μE m^-2s^-1)。植株种植于包含36个插孔的培养盆中。在每一培养盆中，将至少6株非转化的野生型对照组植株与约三十株T2植株相邻种植。从植株个体收集种子，并通过NMR测量种子的油脂含量。

基于NMR的种子油脂含量分析：

种子油脂含量用Maran Ultra NMR分析仪(Resonance Instruments Ltd，Whitney，Oxfordshire，UK)测定。将样品(单粒的大豆种子或每批重量为5至200mg之间的拟南芥种子)置入事先称重并用区别的条形码标识符标记过的2mL聚丙烯管(Corning Inc，Corning NY，USA；Part no.430917)。然后将样品置入96孔载样皿并用Adept Cobra 600SCARA机器人系统按下列步骤操作。

1.拾起聚丙烯管(机器人臂配有一个真空捡拾装置)

2.读取条形码

3.用防静电装置处理聚丙烯管(以保证拟南芥种子不会粘附在管壁上)

4.称量聚丙烯管重量(包括样品)，精确度至0.0001g

5.NMR读数；测量为将22.95MHz信号照射样品1msec后的质子自旋回波强度(收集对每份样品进行的32次NMR扫描数据)

6.将管放回架上

7.对下一管重复以上过程

条形码、聚丙烯管重量和NMR读数用一台与上述系统相连的计算机进行记录。通过用包含样品的聚丙烯管重量减去聚丙烯管自身重量，得到样品的重量。

大豆种子的油脂含量计算方法如下：

通过精确称量Corning管(见上)中大豆油脂样品(重量范围自0.0050至0.0700g，间隔约0.0050g，称量至0.0001g精确度)重量并进行NMR分析，测定出校正参数。建立起油脂含量(％种子基准重量；假定一粒标准种子的重量为0.1500g)对NMR值的校正曲线。

用NMR测量出的种子油脂含量和用传统的分析化学方法测得的绝对油脂含量之间的相关性测定如下。将五十粒经挑选以涵盖一定范围油脂含量的大豆种子，置于强制通风的烘箱内40℃烘干48h。如上所述，将单粒种子分别进行NMR分析，然后用GenoGrinder研磨仪(SPEX Centriprep(Metuchen，N.J.，U.S.A.)；振动频率为1500次/分钟，时间1分钟)研磨为细粉。称取70至100mg之间的等分试样(精确至0.0001g)，置入配有内衬的旋盖的13x 100mm玻璃管中；。将每粒大豆的残余粉末置于强制通风的烘箱内105℃烘干18h，通过烘干前后的重量差异测定出水分含量向上述含有粉末的玻璃管中加入庚烷(3mL)，振荡混匀后将样品置入直立圆筒搅拌器，室温萃取1h。将萃取物1500x g离心10min，将上清轻轻倒入一个干净管子，沉淀用1mL庚烷再萃取两次(每次1h)。合并三次萃取的上清并加入50μL内标物(三十七烷酸；10mg/mL甲苯)，然后在氮气流下室温蒸发至干燥状态；分别在5mL庚烷中包含0、0.0050、0.0100、0.0150、0.0200和0.0300g大豆油脂的标准物也以相同方式制备。向上述干燥后的团块加入1mL 5％硫酸(v∶v.，溶于无水甲醇)，然后将混合物80℃加热30min并不时振荡混匀，从而使脂肪转变为脂肪酸甲基酯(FAMEs)。令上述样品冷却至室温，然后依次加入1mL 25％氯化钠水溶液和0.8mL庚烷。振荡混匀后令各相分离，将上层有机相转入一个样品瓶并进行GC分析。

将NMR测定的油脂含量与GC测定的油脂含量进行比较，得到油脂介于9.66和26.27％之间(GC值；％种子基准重量)、斜率为1.0225、R²为0.9744的线性关系；所基于的种子水分含量为平均2.6+/-0.8％。

拟南芥种子的油脂含量计算方法如下：

mg油脂＝(NMR信号-2.1112)/37.514

％油脂(％基准重量)＝(mg油脂/1000)/样本重量)*100

在引入此方程式计算之前，先按下述方法萃取拟南芥种子油脂。用研钵和研杵将约5g成熟的拟南芥种子(哥伦比亚生态型)研磨为细粉。将上述细粉置入一个33×94mm的纸壳筒(Ahlstrom#7100-3394；Ahlstrom，Mount Holly Springs，PA，USA)，在索氏抽提器中用石油醚(BP 39.9至51.7℃)经约40个萃取循环萃取出油脂。使萃取物冷却，然后通过在旋转式蒸发器中真空除去溶剂而回收得到原油。通过精确称取11份部分纯化的拟南芥油脂标准样品(样品分别包含3.6、6.3、7.9、9.6、12.8、16.3、20.3、28.2、32.1、39.9和60mg部分纯化的拟南芥油脂；称量精确度为0.0001g)至2mL聚丙烯管(Corning Inc，Corning NY，USA；Part no.430917)并对其进行NMR分析，测定出校正参数。建立起油脂含量(％种子基准重量)对NMR值的校正曲线。

用于培植pKR92 YL DGAT2 T2的种子共计种植293个独立的事件，同时种植75个野生型对照。YL DGAT2转基因植株的油脂含量范围为27.9至47.3％。平均油脂含量为43.7％。野生型对照的油脂含量范围为39.5至49.6％。野生型对照的平均油脂含量为44.8％。

用于培植pKR92 YL DGAT1/YL DGAT2 T2的种子共计种植295个独立的植株，同时种植77个野生型对照。YL DGAT1/YLDGAT2转基因植株的油脂含量范围为34.5至47.6％。平均油脂含量为44％。野生型对照的油脂含量范围为41.3至46.6％。野生型对照的平均油脂含量为45％。总而言之，上述结果表明，YL DGAT基因的种子特异性表达并未提高拟南芥种子的油脂含量。

单独表达YL DGAT2或同时还表达YL DGAT1的拟南芥种子的脂肪酸谱分析：

利用对FAME进行的GC分析，研究YL DGAT的表达是否会改变拟南芥种子的脂肪酸谱。将约100粒F2种子分配至96孔八联管的各孔中。向每一联排管中加入50μL三甲基氢氧化硫(TMSH)和0.5mL己烷，并在室温下摇动孵育30min以进行酯交换反应。分离脂肪酸甲基酯(1μL注射自己烷层)并用配套了Omegawax 320熔融石英毛细管柱(Supelco Inc.，Catalog No.24152)的Hewlett-Packard6890气相色谱仪定量。炉温程序设定为220℃保持2.6min，然后以20℃/min速率升温至240℃并维持2.4min。载气通过Whatman氢气发生器供应。将保留时间与市售标准物的甲基酯的保留时间进行比较。结果总结于表5。

表5

结果清楚地表明，YL DAGT2在拟南芥种子中的表达导致了种子脂质中油酸的增加，并且共表达YL DGAT1和YL DGAT2所得出的结果还要更为明显，这提供了YL DGAT1和YL DGAT2活性蛋白可以在转基因种子中得到合成的第一个指征。

实施例5

解脂耶氏酵母DGAT基因在大豆体细胞胚中的表达

用于构建在种子中特异性过表达YL DGAT基因的质粒的启动子和终止子序列列于表6和表7中。

表6

种子特异性启动子

表7

转录终止子

 转录终止子  生物  参照序列 云扁豆蛋白3’  菜豆  WO 2004/071467 库尼兹胰蛋白酶抑制剂3’  大豆  WO 2004/071467

构建一种用于在大豆球蛋白Gy1启动子控制下表达YL DGAT1基因的质粒构造(KS349)(图3)。

大豆的大豆球蛋白Gy1启动子的分离按下述过程进行。基于NCBI数据库中的大豆的大豆球蛋白Gy1基因序列(GenBank登录号X15121；SEQ ID NO：35)，设计了两条5′端带有BamHI或NcoI位点的寡核苷酸，用以扩增大豆的大豆球蛋白Gy1启动子(SEQ ID NO：36)。上述两条寡核苷酸的序列如下：

SEQ ID NO：37(oGy1-1)：CGCGGATCCTAGCCTAAGTACGTACTC AAAATGCCA

SEQ ID NO：38(oGy1-2)：GAATTCCCATGGGGTGATGACTGATGA GTGTTTAAGGAC

质粒pKS349由若干不同的中间载体经多个步骤构建而成。用BamHI和NcoI消化上述扩增后的大豆的大豆球蛋白Gy1启动子片段并纯化，然后克隆至p24K-G4G-@SalI(PCT专利公布WO98/59062)的BamHI和NcoI位点，以构建出pZBL114(SEQ ID NO：39)。用包含一种大豆GY1基因(SEQ ID NO：40)和合成的大麦高赖氨酸8(BHL8)基因(US 6800726 B1)(SEQ ID NO：41；)的融合产物的NcoI/KpnI片段，替换包含GUS的NcoI/KpnI片段，以构建出pZBL133(SEQ ID NO：43)。大豆GY1基因和BHL8基因的融合产物的DNA序列如SEQ ID NO：42所示。将云扁豆蛋白终止子从pZBL133(XbaI/插入)上切除，并代之以pKS123(PCT专利公布WO02/08269)(平末端)中的云扁豆蛋白终止子，以构建出pKS238(SEQID NO：44)。按下述步骤用天然的GY1序列替换上述GY1-BHL8融合物。用KpnI/BglI消化pKS238，将残余的载体条带(5.1kb)与天然GY1基因(SEQ ID NO：40)的一个DNA片段(BglI/KpnI)连接，以构建出pKS240(SEQ ID NO：45)。将包含Gy1/GM-GY1/Phas3′的BamHI/SalI片段自pKS240上切下，并连接至pKS120(SEQ ID NO：46)的BamHI/SalI位点，以构建出pKS242(SEQ ID NO：47)。质粒pKS120上已被移除了包含Bcon/NotI/Phas3′框的HindIII片段，除此以外与(上述)pKS 123相同。用包含来自pYDA1的YL-DGAT1的NcoI/NotI片段替换包含GM-GY1的NcoI/NotI片段，以构建出pKS349(SEQ ID NO：48)。

一种用于在β-大豆伴球蛋白启动子控制下表达YL DGAT2基因的质粒(KS362)的构建(图3)：

质粒pKS362由若干不同的中间载体经多个步骤构建而成。将包含来自pKS121(PCT专利公布WO 02/00904)的Kti/NotI/Kti3′的AscI框平末端连接至pBluescript II SK+(Stratagene)上的NotI(插入)位点，以构建出pKS121/BS。将来自pDsRed-表达载体(Clontech)的NcoI/NotI片段平末端连接至pKS121/BS的NotI(插入)位点，以构建出包含pDS-RED的KS121/BS(SEQ ID NO：49)。将包含Kti/DsRed/Kti3′的BamHI框(SEQ ID NO：50)连接至pKS123(PCT专利公布WO 02/08269)的BamHI位点，以构建出pKS332(SEQ ID NO：51)，其中所述Kti/DsRed/Kti3′位于包含pDS-RED的KS121/BS中。用引物通过PCR将NotI位点引入YL-DGAT2基因的两端，从而合成出用于表达YL-DGAT2的基因(参见实施例1)。所得到的PCR产物用NotI限制酶消化，然后连接至pKS332的NotI位点，以构建出pKS362(SEQ ID NO：52)。

对照组质粒(KS352)的构建(图2)：

根据所克隆的大豆P34启动子(WO 2004/071467)(SEQ ID NO：53)序列，设计两条5′端带有BamHI或NotI位点的寡核苷酸，用以重扩增上述P34启动子。上述两条寡核苷酸的序列如下：

SEQ ID NO：54(oP34-1)：

CGCGGATCCAACTAAAAAAAGCTCTCAAATTACATTTTGAG

SEQ ID NO：55(oP34-2)：

GAATTCGCGGCCGCAACTTGGTGGAAGAATTTTATGATTTGAAA

用BamHI和NotI消化重扩增的P34启动子片段并纯化，然后克隆至质粒pZBL115(SEQ ID NO：56)的BamHI和NotI位点，以构建出pJS89(SEQ ID NO：57)。用包含来自pRB322的复制起点、由T7启动子和T7终止子驱动的细菌HPT潮霉素抗性基因，以及一个35S启动子-HPT-Nos3′基因的pZBL115质粒，作为潮霉素抗性植株的一种选择标记。将高山被孢霉Δ-6脱氢酶基因(美国5,968,809)(SEQID NO：58)按有义方向克隆至pJS89(SEQ ID NO：57)的NotI位点，以构建出植物表达框和pJS93(SEQ ID NO：59)。

用SalI NotI双酶切将P34启动子从pJS93(SEQ ID NO：59)上切下，并连接至经SalI/NotI线性化的pKS127载体(US Pat.App.No.11/476,510)(SEQ ID NO：60)，以构建出pKS343(SEQ ID NO：61)。将包含Kti/DsRed/Kti3′的BamHI框末端填平并连接至pKS343的HindIII(插入)位点，以构建出pKS352(SEQ ID NO：62)，其中所述Kti/DsRed/Kti3′位于包含pDS-RED的KS121/BS中。

一种用于共表达YL DGAT1和YL DGAT2的质粒(KS364)的构建：

通过将来自pKS362(SEQ ID NO：52)的包含Bcongl PRO/YL-DGAT2/Phas TER的3.3kb HindIII框，连接至在pKS349(SEQ IDNO：48)中位于Gy1启动子下游的惟一HindIII位点，构建出质粒pKS364(SEQ ID NO：63)。

转基因体细胞胚的生成：

如下所述，将大豆组织与KS349和KS362的混合物共轰击，以实现在YL DGAT1和YL DGAT2在大豆体细胞胚中的共表达。简言之，用限制酶PstI、XhoI消化KS349的DNA，以灭活选择性标记基因框(CaMV35S PRO/HPT/CaMV NOS TER)。将所述DNA与经Sall线性化的KS362质粒DNA按10∶1的比例混合，并用于如下文所述的大豆转化过程。或者如下文所述，将用于生成大豆体细胞胚的大豆组织，与同时包含YL DGAT1和YL DGAT2功能性表达框的完整的KS364质粒DNA共轰击。对于YL DGAT1的单独表达，则用未经切割的KS349质粒DNA来进行胚胎组织的基因枪轰击。类似地，对于YL DGAT2的单独表达，则用未经切割的KS362质粒DNA来进行胚胎组织的基因枪轰击。此外，仅包含选择性标记的质粒DNA(KS352)也被以相同方式用于大豆组织的转化。

培养条件：

大豆胚胎生成悬浮培养物(cv.Jack)培养于35mL液体SB 196培养基(参见下文)，培养条件为150rpm摇床培养、26℃和按16∶8h昼/夜光周期以60-85μE/m2/s光强用白色冷光荧光灯照射。每7天至两周，通过将约35mg的组织接种至35mL新鲜的液体SB196，对培养物进行传代培养(优选的传代培养间隔时间为7天)。

用大豆表达质粒对大豆胚胎生成悬浮培养物进行的转化，通过的是基因枪轰击的方法(Klein等人，Nature 327：70(1987))，所有转化均用一台DuPont Biolistic PDS1000/HE设备(氦气型)进行。

大豆胚胎生成悬浮培养物的诱导：

每月诱导大豆培养物两次，每次诱导之间相隔5至7天。将种植45至55天后的存活大豆植株的带有未成熟种子的豆英摘下，将其去壳后置入一个灭菌后的Magenta盒子中。将大豆种子置于加入了1滴象牙皂的5％次氯酸钠溶液(即95mL灭菌蒸馏水加上5mL次氯酸钠和1滴象牙皂，混匀)中摇动消毒15min。用2瓶1升瓶子的无菌蒸馏水清洗种子，将小于4mm的种子分别置于显微镜载片上。将上述种子的较小一端切开，将子叶从种皮中挤出。子叶被转入含SB199培养基的平版(每板25至30个子叶)培养2周，然后转入SB 1培养2至4周。用纤维带包裹平板。此次之后，将次级胚切下，并置于SB196液体培养基7天。

用于轰击的DNA的准备：

采用包含所感兴趣的基因和选择性标记基因的完整质粒或质粒DNA片段进行轰击。

将一份包含1mg金颗粒的50μg灭菌水等份加入5μL的1μg/μL DNA溶液(完整质粒或如前所述制备的DNA片段)、50μL的2.5M CaCl₂和20μL的0.1M亚精胺中。将混合物用调至4档的旋涡振荡器脉冲振荡5次，然后用台式微量离心机离心5sec。用150μL 100％酒精洗一次，然后在85μL 100％酒精中超声处理使沉淀块悬浮。向上述Biolistic PDS 1000/HE设备的每个飞盘中装入5μLDNA悬液。每一轰击反应(即每个盘)的5μL等份中包含约0.058mg金颗粒。

组织制备和用DNA轰击：

将约100至150mg 7天的胚胎悬浮培养物置于一个空的60×15mm无菌皮氏培养皿中，并将所述培养皿置入一个空的150×25mm皮氏培养皿。组织在每个盘轰击一次，膜破裂压力设为650PSI，小室抽真空至27至28英寸汞柱。组织置于距维持/终止屏约2.5英寸处。

转化胚的选择：

用潮霉素作为选择性标记，进行转化胚的选择。具体而言，轰击后的组织被置入新鲜的SB196培养基，如前所述进行培养。轰击后6至8天，将上述SB196替换为包含30mg/L潮霉素的新鲜SB196。选择性培养基每周更新一次。选择后四至六周，观察到绿色的转化组织从坏死的未转化胚胎发生块中长出。将绿色组织分离，接种至多孔板，以产生新的、克隆繁殖的转化的胚胎生成悬浮培养物。

胚胎的成熟：

转化的胚胎生成块在白色冷荧光灯(Phillips cool white EconowattF40/CW/RS/EW)和农用灯泡(Phillips F40Agro)(40瓦)以16∶8h光周期和90至120μE/m²s光强照射下，用SB196于26℃培养一至三周。然后将胚胎块移入一种固体琼脂培养基SB 166培养1周。然后用SB103培养基传代培养3周。或者，将胚胎块移入盛于250mL锥形瓶中的35mL SB228(ShaM)液体培养基，培养2至3周。组织于SB228中的培养条件为，130rpm摇床培养、26℃和按16∶8h昼/夜光周期以60至85μE/m2/s光强用白色冷光荧光灯照射。在此期间，将胚胎个体自培养块移出，并如上文所述筛选其脂肪酸组成的变化。

培养基配方：

SB 196-FN Lite液体增殖培养基(每升)

MS FeEDTA-100x储备液1               10mL

MS硫酸盐-100x储备液2                10mL

FN Lite卤化物-100x储备液3           10mL

FN Lite P，B，Mo-100x储备液4        10mL

B5维生素(1mL/L)                     1.0mL

2，4-D(10mg/L终浓度)                1.0mL

KNO₃                                2.83gm

(NH₄)₂SO₄                        0.463gm

天冬酰胺                         1.0gm

蔗糖(1％)                        10gm

pH 5.8

FN Lite储备液

储备液编号                          1000mL    500mL

1            MS Fe EDTA 100x储备液

             Na₂EDTA^*               3.724g    1.862g

             FeSO₄-7H₂O             2.784g    1.392g

^*首先添加，搅拌溶解于深色瓶中

2            MS硫酸盐100x储备液

             MgSO₄-7H₂O             37.0g     18.5g

             MnSO₄-H₂O              1.69g     0.845g

             ZnSO₄-7H₂O             0.86g     0.43g

             CuSO₄-5H₂O             0.0025g   0.00125g

3            FN Lite卤化物100x储备液

             CaCl₂-2H₂O             30.0g     15.0g

             KI                     0.083g    0.0715g

             CoCl₂-6H₂O             0.0025g   0.00125g

4            FN Lite P，B，Mo 100x储备液

             KH₂PO₄                 18.5g     9.25g

             H₃BO₃                  0.62g     0.31g

             Na₂MoO₄-2H₂O           0.025g    0.0125g

SB1固体培养基(每升)

1个包装的MS盐(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)

1mL B5维生素1000X储备液

31.5g葡萄糖

2mL 2，4-D(20mg/L终浓度)

pH 5.7

8g TC琼脂

SB199固体培养基(每升)

1个包装的MS盐(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)

1mL B5维生素1000X储备液

30g蔗糖

4mL 2，4-D(40mg/L终浓度)

pH 7.0

2gm固化剂

SB 166体培养基(每升)

1个包装的MS盐(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)

1mL B5维生素1000X储备液

60g麦芽糖

750mg MgCl₂六水合物

5g活性炭

pH 5.7

2g固化剂

SB 103固体培养基(每升)

1个包装的MS盐(Gibco/BRL-Cat.No.11117-066)

1mL B5维生素1000X储备液

60g麦芽糖

750mg MgCl2六水合物

pH 5.7

2g固化剂

SB 71-4固体培养基(每升)

1瓶Gamborg′s B5盐w/蔗糖(Gibco/BRL-Cat.No.21153-036)

pH 5.7

5g TC琼脂

2，4-D储备液

Phytotech Cat.No.D 295预配液-浓度1mg/mL

B5维生素储备液(每100mL)

分装保存于-20℃

10g肌肌醇

100mg尼克酸

100mg吡哆醇HCl

1g硫胺

若溶解不够迅速，可将溶液用热搅拌器加以微热。

SB 228-大豆组织分化和成熟培养基(SHaM)(每升)

DDI H2O                           600mL

用于ShaM的FN-Lite Macro盐10X      100mL

MS Micro盐1000x                   1mL

MS FeEDTA 100x                    10mL

CaCl 100x                         6.82mL

B5维生素1000x                     1mL

L-甲硫氨酸                        0.149g

蔗糖                              30g

山梨醇                            30g

调整体积至900mL

pH 5.8

高压灭菌

向冷却后的培养基(≤30C)加入：

*谷氨酰胺(Final conc.30mM)4％110mL

*注意：加入谷氨酰胺后，终体积将变为1010mL。

因谷氨酰胺降解相对迅速，可能最好在即将使用前加入培养基。培养基在谷氨酰胺加入后2周过期；不含谷氨酰胺的基本培养基可存放更长时间。

用于SHAM的FN-lite Macro 10X-储备液#1(每升)

(NH₄)2SO₄(硫酸铵)                4.63g

KNO₃(硝酸钾)                     28.3g

MgSO₄*7H₂O(七水硫酸镁)           3.7g

KH₂PO₄(磷酸二氢钾)               1.85g

加水至终体积

高压灭菌

MS Micro 1000X-储备液#2(每升)

H₃BO₃(硼酸)                      6.2g

MnSO₄*H₂O(一水硫酸锰)            16.9g

ZnSO4*7H2O(七水硫酸锌)           8.6g

Na₂MoO₄*2H2O(二水钼酸钠)         0.25g

CuSO₄*5H₂O(无水硫酸铜)_          0.025g

CoCl₂*6H₂O(六水氯化钴)           0.025g

KI(碘化钾)_                      0.8300g

加水至终体积

高压灭菌

FeEDTA 100X-储备液#3(per liter)

Na₂EDTA*(EDTA钠盐)_              3.73g

FeSO₄*7H₂O(七水硫酸铁)           2.78g

*在加入铁离子前EDTA必须完全溶解。

加水至终体积

此溶液对光敏感。盛装的瓶子应以铝箔包裹以避光。

高压灭菌

Ca 100X-储备液#4(每升)

CaCl₂*2H₂O(二水氯化钙)           44g

加水至终体积

高压灭菌

B5维生素1000X-储备液#5(每升)

硫胺素*HCl                    10g

尼克酸_                       1g

吡哆醇*HCl                    1g

肌肌醇                        100g

加水至终体积

冷冻保存

4％谷氨酰胺-储备液#6(每升)

DDI水加热至30℃               900mL

L-谷氨酰胺_                   40g

边搅拌边逐渐加入并施以微热。

温度勿超过35℃。

加水至终体积

过滤除菌

冷冻保存*

*注意：在31℃水浴中热解冻储备液以令结晶完全溶解。

油脂分析：

在液体成熟培养基SB228(SHaM)中培养两周后收集体细胞胚。在用KS352、KS349/KS362，以及KS362和KS364进行的转化终制造了约30个植株系。一个特定植株系中产生的所有胚胎均批量收集，并处理如下。将胚胎置于干冰上或-80℃冰箱中冷冻两小时，然后冷冻干燥48h。

用一个genogrinder瓶(1/2″X2″聚碳酸酯)和一粒钢珠(SPEXCentriprep(Metuchen，N.J.，U.S.A.)将干燥后的胚胎研磨为细粉。研磨时间为30sec，振动频率为1450次/分钟。对于每一事件，称取约10mg的组织一式三份置入Eppendorf管中。上述组织在室温下用200μL庚烷持续摇动萃取2h。离心令庚烷萃取物澄清，取25μL萃取物用于制备脂肪酸甲基酯衍生物如下。将1mL的25％甲醇钠储备液加入24mL HPLC级甲醇。甲醇钠保存于惰性气体中。

将5μL的17:0TAG(Nu-Chek Prep，Elysian，MN，USA)储备液(10mg/mL)同25μL的庚烷组织萃取物一起加入至一个玻璃培养管，并加入500μL的1％甲醇钠。样品在50℃水浴中反应15min。令样品冷却至室温，加入1mL 1M NaCl，然后短暂混匀。FAME被萃取至1mL的庚烷中，通过GC分析对4μL样品进行定量。

通过求油酸含量(％总FAME)对总FAME含量(％DW)的函数，进行数据分析。表8显示，所生成的携带对照组载体(KS352)的体细胞胚，其油酸含量几乎没有波动，油脂含量表现出一些波动但很可能是由于再生过程中引入的生物学变异所致。例如，在收获时胚胎所处的发育阶段就经常表现出变异。在用对照组质粒制备的胚胎中，在油酸含量和油脂含量之间没有观察到相关性(R2＝0.1142)(表8)。在用在种子特异性强启动子控制下分别单独表达YL DGAT1和YL DGAT2基因的质粒KS349和KS362，或同时表达YL DGAT1和DGAT2基因的质粒(KS349/KS362，KS364)制备的胚胎中，油酸含量和总的酯化脂肪酸含量均表现出大幅波动。此外，如图4和5所示，在分别单独用KS349和KS362，或组合使用KS349和KS362，或用包含YL DGAT1和YL DAT2基因表达框的转化质粒KS364制备的体细胞胚中，均观察到油酸含量和总酯化脂肪酸含量之间存在强相关(R2≥0.59)。

表8

大豆体细胞胚的酯化脂肪酸和油酸含量

总之，上述数据显示，与拟南芥种子相似，在大豆体细胞胚中YLDGAT基因的表达与总酯化脂肪酸组分中油酸的增加相关。然而，与拟南芥中的情况相反的是，在大豆体细胞胚中增加的油酸含量与酯化脂肪酸总量的累积密切相关。换句话说，在大豆体细胞胚中，YLDGAT2的单独表达，或YL DGAT1和YL DAGT2的共表达均导致脂肪酸生物合成和向总酯化脂肪酸组分的整合的增加。上述发现总体上有力地说明，YL DGAT基因的表达提供了在大豆种子中实现总油脂含量提高的一种有效策略。

实施例6

解脂耶氏酵母DGAT基因在大豆种子中的表达

仅包含CaMV 35S PRO/HPT/NOS TER和Kti PRO/DsRed/Kti TER表达框的对照组质粒(KS332)(图2)的构建描述于实施例5中。其序列如SEQ ID NO：51所示。

通过基因枪轰击的方法(Klein等人，Nature(London)327：70-73(1987)；美国专利4,945,050)，利用KS332、KS362以及如实施例3中所述制备的10∶1的KS349和KS362的混合物，用一台BIORADBiolistic PDS1000/He设备制备出转基因大豆品系。大豆植株的转化和再生利用了下列储备液和培养基：

储备液：

100X硫酸盐储备液：

37.0g MgSO₄.7H₂O，1.69g MnSO₄.H₂O，0.86g ZnSO₄.7H₂O，0.0025gCuSO₄.5H₂O

100X卤化物储备液：

30.0g CaCl₂.2H₂O，0.083g KI，0.0025g CoCl₂.6H₂O

100X P，B，Mo储备液：

18.5g KH₂PO₄，0.62g H₃BO₃，0.025g Na₂MoO₄.2H₂O

100X Fe EDTA储备液：

3.724g Na₂EDTA，2.784g FeSO₄.7H₂O

2，4-D储备液：

10mg/mL维生素B51000X储备液：10.0g肌肌醇，0.10g尼克酸，0.10g吡哆醇HCl，1g硫胺。

培养基(每升)：

SB196：上述储备液各10mL，B5维生素储备液1mL，0.463g(NH4)2SO4，2.83g KNO3，1mL 2，4-D储备液，1g天门冬酰胺，10g蔗糖，pH 5.7。

SB103：

1个包装Murashige&Skoog盐混合物，1mL B5维生素储备液，750mg MgCl2六水合物，60g麦芽糖，2g固化剂，pH 5.7。

SB166：

向SB103添加5g/L的活性炭而成。

SB71-4：

Gamborg′s B5盐，1mL B5维生素储备液，30g蔗糖，5g TC琼脂，pH 5.7。

将大豆胚胎生成悬浮培养物培养于35mL液体培养基(SB196)，以制备用于转化的组织，培养条件为摇床(150rpm)培养、28℃，并按16h昼/8h夜的周期提供荧光。通过将约35mg组织接种至35mL的新鲜液体培养基，培养物每两周传代培养一次。

在基因枪轰击过程中，可以使用纯化的1)完整质粒DNA；或2)仅包含所感兴趣的重组DNA表达框的DNA片段。对于每十七次轰击转化，每种DNA质粒制备包含每碱基对1至90皮克(pg)的质粒DNA的85μL悬液。如下所述，两种重组DNA质粒均共沉淀至金颗粒上。将悬液中的DNA加入50μL 20至60mg/mL 0.6μm的金颗粒悬液，然后与50μL CaCl2(2.5M)和20μL亚精胺(0.1M)合并。混合物振荡混匀5sec，用微离心机离心5sec，去除上清。用150μL 100％酒精清洗包被了DNA的金颗粒一次，再次振荡并用微离心机离心，然后重悬于85μL无水酒精。然后将5μL DNA包被的金颗粒上样至每一大载物盘。

将约150至250mg已培养两周的悬浮培养物置入一个空的60mmX 15mm皮氏培养皿，并用移液器将残留的液体自上述组织吸走。将上述组织置于距维持屏约3.5英寸处，每一盘组织轰击一次。膜破裂压力设为650PSI，小室抽真空至-28英寸汞柱。对三个盘进行了轰击，轰击之后将来自每一盘的组织分为两份，放回含液体培养基的瓶中，并如上文所述进行培养。

轰击后7天，将上述液体培养基替换为含30至50mg/L潮霉素的新鲜SB196培养基。上述选择性培养基随后每周或每两周更新一次。轰击后七周，观察到鲜绿色的转化组织从坏死或萎黄的未转化胚胎生成块中长出。将绿色组织分离，接种至6孔培养皿的各个孔中，以产生新的、克隆繁殖的转化的胚胎生成悬浮培养物。由此，将每一新的品系处理为一个单独培养孔中的独立转化事件。然后，可以通过传代培养将上述悬液作为集中处于未成熟发育阶段的胚胎进行悬浮培养，或者也可以通过各个体细胞胚的熟化和萌发，再生为整株的植物。

在各细胞培养孔中培养两周后，将转化的胚胎生成块自液体培养基中移出，并置于不含激素或抗生素的固体培养基(SB166)上培养一周。胚胎于26℃在荧光和白炽光以16h昼/8h夜周期混合照射下培养。一周后，将培养物转入SB103培养基，并在相同的生长条件下再培养3周。

如此培养四周后，体细胞胚变得适宜萌发，此时将其从成熟培养基中移出，并置于空的皮氏培养皿中干燥一至五天。然后将干燥的胚胎种植于SB71-4培养基中，胚胎可在上述相同的光照和温度条件下于其中萌发。萌发的胚胎被转入无菌土壤中生长至成熟，以产生种子。

以每次金颗粒制备使用15pg/bp质粒DNA的浓度，用完整的KS362质粒DNA共计产生了29个带有种子的转基因品系。对于每一事件，就DS标记基因的存在对20粒种子进行了评分。简言之，在一台采用UV光源的体视显微镜(Leica MZ Fluo III)下对种子进行了观察。使用了具有下列特性的一组用于观察与DsRed表达相关的荧光的滤光镜：激发波长λ＝540至580nm/发射波长λ≥570nm。在所获得的种子数量少于20粒的情况下，则将所有种子以上述方式进行评分。然后如实施例3所述通过NMR对大豆种子油脂含量进行了测量。用KS362产生的十九个事件中包含了DsRed阳性的种子。其中，11个事件表现出在DsRed阳性的转基因分离子的油脂含量和DsRed阴性的无转基因分离子的油脂含量之间存在可检测的差异。结果总结于表9。

表9

用KS362产生的T1大豆种子的油脂含量

用KS332的DNA共计产生了10个带有种子的转基因品系。如上所述，对于每一事件，就DS标记基因的存在对20粒种子进行了评分。在所获得的种子数量少于20粒的情况下，则将所有种子以上述方式进行评分。然后如实施例4所述通过NMR对大豆种子油脂含量进行了测量。用KS332产生的七个事件中包含了DsRed阳性的种子。结果总结于表10。

表10

用KS332产生的T1大豆种子的油脂含量

与用KS362产生的种子相反，用KS332产生的转基因种子中，没有能与DsRed标记在T1分离子中的存在相关联的稳定的油脂含量升高。

对用KS362产生的四个事件进行了DsRed状态的分析和所有获得的T1种子的油脂NMR测量。结果总结于表11。

表11

用KS362产生的T1大豆种子的油脂含量

总之，上述各表中的数据和图7显示，种子特异性的YL DAGT2表达会导致大豆种子成熟期油脂生物合成的增加，从而提供了用于提高大豆中油脂积累的一种有效的代谢工程工具。

用按10∶1比例混合的KS349和KS362 DNA共轰击(参见实施例4)共计产生了16个带有种子的转基因品系。上述DNA混合物以每次金颗粒制备使用15pg/bp质粒DNA的终浓度用于大豆的转化。简言之，在轰击之前，先用PstI和XhoI消化KS349 DNA，以令该质粒上的选择性标记基因失活。KS362的DNA用SalI线性化。有理由假定，由于上述对DNA的预处理，所有转化的限制性标记基因均来自于以较低的DNA浓度接受轰击的上述质粒(KS362)。在荧光立体式显微镜下对种子进行的初步检查显示，此次转化只有极少的事件包含DsRed标记基因阳性的T1种子。这种结果可能是由于DsRed表达框与用于大豆转化的KS362的SaII限制性片段的末端位置接近。这可能导致了不包含功能性的DsRed表达框的KS362DNA片段的整合。出于此原因，通过检测种子的脂肪酸组成，对不含转基因来源的YL DGAT的T1种子进行了筛选。对于每一事件，用GC对20粒种子进行了分析。50粒未转化的大豆种子也以相同方式进行了处理。用剃须刀片避开胚轴将大豆种子切开，得到种子切片。将约2mg的种子切片置入一个包含50μL三甲基氢氧化硫和0.5mL己烷的小瓶。上述切片一边摇动一边在室温下孵育30min。将5μL的上述己烷层注入配套了Omegawax 320熔融石英毛细管柱(Supelco Cat.No.24152)的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪。炉内条件如下：维持220℃起始温度2.7分钟，用1分钟升温至240℃并维持于240℃。总运行时间为6min将保留时间与市售标准物(Nu-Chek Prep，Inc.Cat.No.U-99-A)进行比较。通过在0.5mL H₂SO₄甲醇(2.5％)中对各标准物直接进行转酯化反应，测定出脂肪酸含量。加入等体积的水后，将脂肪酸甲基酯从上述甲醇溶液中萃取至己烷。

鉴定出包含的T1种子具有≥25％油酸含量的十个事件。由于在未转化的大豆种子中并未观察到这样的油酸含量(参见图6和表12)，并且在拟南芥种子和大豆体细胞中，均已发现油酸含量的增加与YL DGAT2的单独表达和YL DGAT1与YL DGAT2的共表达相联系，相信油酸以≥25％水平的存在提供了鉴定YL DGAT阳性T1种子的有效方法。在通过GC分析进行YL DGAT基因分型之后，如前所述(参见实施例3)通过NMR对种子进行了油脂测量。求油酸含量对总油脂含量的函数，结果在10个T1种子油酸≥25％的事件中，有七个表现为油脂和油酸含量之间具有R²≥0.3的相关性。这些事件的性质详细描述于表12中。

表12

用KS349/KS362产生的T1大豆种子的油脂含量

在与用于产生T1种子的条件相似的条件下培育Jack野生型种子，并通过GC和NMR进行分析。观察到油酸含量和油脂含量分别在7.6至20.5％和18.6至25.2％范围内波动。在未转化的大豆种子中没有观察到油酸含量和油脂含量之间存在相关性。

将用KS349/KS362产生的四个事件的所有获得的T1种子用GC和NMR进行分析。结果总结于表13。

表13

用KS349/KS362产生的T1大豆种子的油脂含量

此结果以及前述各表和图6和7中的数据有力支持了YL DGAT1和YL DGAT2基因的共表达，如同YL DGAT2基因的单独表达一样，提供了在大豆种子中实现总油脂含量提高的一种有效策略这一结论。此外，应当注意到在所筛选的少数转基因事件中，有大量的事件可以被鉴定为在无转基因分离子和转基因分离子之间具有≥2％分数的油脂差异。

实施例7

解脂耶氏酵母DGAT基因在玉米中的表达

基于本申请的实施例4、5和6中所公开的结果，YL DGAT1和YL DGAT2基因可以在玉米的种子胚胎中得到表达，以提高该组织中的油脂含量。如下所述，可以通过用表达框转化玉米实现此结果，其中所述表达框由胚胎偏好的启动子，例如玉米16kDa油体蛋白基因(Lee，K.and Huang，A.H.，Plant Mol.Biol.26：1981-1987(1984))的启动子和玉米胚胎早期高丰度启动子(EAP1)、来自解脂耶氏酵母并在其5′端与上述启动子可操作地连接的DGAT1和DGAT2的开放阅读框以及终止子(US 2006272058A1)组成。

用本领域所知的方法和技术，构建了由来自玉米16kDa油体蛋白基因的启动子(OLE PRO)、YL DGAT2基因的编码序列(SEQ ID NO：9)和来自根癌农杆菌胭脂碱合酶(NOS)基因的多聚腺苷酸信号序列/终止子组成的一个表达框。第二个表达框包括处于玉米胚胎高丰度蛋白(EAP1)启动子和终止子转录控制下的YL DGAT1基因，以及插入至上述启动子和编码序列之间以增强表达的玉米ADH1内含子1。将上述两个表达框以及一个编码选择性标记的基因，连接于一个适用于农杆菌介导的玉米转化的二元载体中。

一种基于农杆菌的方法可用于玉米的转化(见下)。将所得到的二元载体引入农杆菌LBA4404(PHP10523)细胞，优选通过电穿孔。通过体内重组，在所引入的二元载体和寄宿于农杆菌细胞的vir质粒(PHP10523)之间形成了一种共整合质粒。所得到的农杆菌细胞被用于转化玉米。

农杆菌介导的玉米的转化：

将新鲜分离的授粉后约十天(DAP)的未成熟玉米胚胎，与上述农杆菌共同孵育。优选的用于转化的基因型为高度可转化的基因型Hi-II(Armstrong，Maize Gen.Coop.Newsletter，65：92-93(1991))。也可以使用通过将Hi-II与一种自交原种杂交得到的F1杂种。未成熟的胚胎在用农杆菌处理后，可培养于包含毒性水平的除草剂的培养基上。只有获得了除草剂抗性基因以及与之连接的基因的细胞，才能生长于选择性培养基上。如此选择后的转基因事件可以得到增殖并再生为整株植物、制造种子并将转基因传递给后代。

农杆菌的制备：

经过改造的根癌农杆菌LBA4404可被构建为包含用于种子偏好地表达YL DGAT1和YL DGAT2基因的质粒，如美国专利5,591,616中所公开(该专利的内容特此引入本文以供参考)。通过将上述细菌在基本AB培养基上孵育并允许其于28℃孵育约三天，可制备出用于种子偏好地表达YL DGAT1和YL DGAT2基因的质粒转化的一块单菌落原始平板，以将改造后的构建物用于植物转化。基本AB培养基的组成和制备已描述于PCT专利公布WO 02/009040中(该专利的内容特此引入本文以供参考)。然后可通过将转化的农杆菌划线接种至包含50μg/mL奇放线菌素的YP培养基(0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)氯化钠，1.5％(w/v)琼脂)，制备出工作平板。

此后，可以在进行玉米转化的前一天制备用于植物转染和共培养的转化的农杆菌。将50mg/mL奇放线菌素、100mM乙酰丁香酮和来自一至二天工作平板的约1/8环量的农杆菌加入至一个包含30mL基本A培养基(如PCT专利公布WO 02/009040中所述进行制备)的烧瓶。接下来将上述农杆菌于28℃200rpm摇床培养约14h。在对数生长中期，可使用标准的微生物学技术收集上述农杆菌，并以3至5X 108CFU/mL密度重悬于包含100mM乙酰丁香酮的561Q培养基中。561Q培养基的组成和制备描述于PCT专利公布WO02/009040。

未成熟胚芽制备：

在对玉米植株进行人工授粉后九至十天，发育中的未成熟胚胎为不透明的，长约1至1.5mm。这样的长度是用PHP18749转化的农杆菌进行转染的最佳大小。可将去壳的穗在50％的市售漂白剂和一滴Tween-20中灭菌30分钟，然后用灭菌水清洗两遍。此时可将未成熟的胚胎从颖果上无菌地剥离，并置入2mL由包含100μM乙酰丁香酮的561Q培养基组成的灭菌的维持溶液。

农杆菌对胚胎的感染和共培养：

将维持溶液自离体的未成熟胚胎缓缓倒走，代之以转化的农杆菌。在温和混匀并孵育约5分钟后，可将农杆菌自上述未成熟胚胎缓缓倒走。然后将未成熟胚胎移至一块562P培养基平板，所述平板的组成已描述于PCT专利公布WO 02/009040。将上述未成熟胚胎按盾片表面向上的方式置于上述培养基上，于20℃暗培养三天。此步骤之后可继之以在包含100μg/mL羧苄青霉素的562P培养基上于28℃暗培养三天，如美国专利5,981,840中所述。

转基因事件的选择：

将培养后的未成熟胚胎转入5630培养基，该培养基可按PCT专利公布WO 02/009040中所述进行制备。所述培养基包含用于选择转基因植物细胞的双丙氨膦，与大麦HGGT表达框相连的BAR基因可赋予转基因植物细胞抗性。间隔十至十四天后，将胚胎转入5630培养基。在5630培养基上培养六至八周后，可观察到推定的转基因胚胎生成组织的活跃生长。

T₀植株的再生：

将转基因的胚胎生成组织转入288W培养基，并于28℃暗培养至体细胞胚成熟，或约十至十八天。将具有明显的盾片和胚芽鞘的各成熟的体细胞胚转入272胚萌发培养基，并于28℃进行光培养。当芽和根出现之后，将植株个体于土壤中盆栽，并利用典型的园艺方法进行耐寒锻炼。

288W培养基包含下列成分：950mL去离子水；4.3g MS盐(Gibco)；0.1g肌肌醇；5mL MS维生素储备液(Gibco)；1mL玉米素(5mg/mL溶液)；60g蔗糖；8g琼脂(Sigma A-7049，Purified)；2mL吲哚乙酸(0.5mg/mL溶液*)；1mL 0.1mM ABA*；3mL双丙氨膦(1mg/mL solution*)；以及2mL羧苄青霉素(50mg/mL溶液)。上述溶液的pH调节至pH 5.6将上述溶液高压灭菌。标以星号(*)的成分在培养基冷却至60℃之后加入。

272培养基包含下列成分：950mL去离子水；4.3g MS盐(Gibco)；0.1g肌肌醇；5mL MS维生素储备液(Gibco)；40g蔗糖；以及1.5g固化剂。将此溶液调节为pH 5.6然后高压灭菌。

实施例8

种仁油含量分析

核磁共振(NMR)分析：

种子于4℃在蒸馏水中浸泡12至24小时。将胚胎切下并保存于一块48孔板中。用Virtis 24x48冻干器将样品过夜冻干。NMR(Process Control Technologies-PCT(Ft.Collins，CO))按照生产商的说明书进行设置。用一系列包含精确量的玉米油(Mazola)的5mm NMR管对NMR进行校准。校准标准物为3、6、9、12、15、18、21、27、33和40mg。

实施例9

YL DGAT1和YL DGAT2基因的合成

设计编码YL DGAT1和YL DGAT2的核苷酸序列，以令其在大豆种子中的表达最优化，所用的方法与下列文献中所描述的相似：Wu，G等人，Nucleic Acids Research(2007)，35：D76-D79；Villalobos，A.等人，BMC Bioinformatics(2006)，7No pp.given；Wu，G.等人蛋白质Expression and Purification(2006)，47：441-445；Richardson，S.M.等人Genome Research(2006)，16：550-556；Jayaraj，S.等人Nucleic Acids Research(2005)33：3011-3016。DNA分子用DNA 2.0(Menlo Park，CA，USA)进行合成。表达最优化的YL DGAT1和YL DGAT2DNA序列分别如SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：66所示。大豆最优化的YLDGAT酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：65(YL DGAT1)和SEQ ID NO：67(YL DGAT2)所示，其分别与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：9的翻译产物序列一致。

实施例10

表达YL DGAT基因的大豆体细胞胚的脂肪酸组成

利用KS352、KS349、KS362和KS364质粒构造制备了转基因体细胞胚。上述DNA构造的构建和转化过程详细描述于实施例5。通过对脂肪酸甲基酯的GC分析测定出脂肪酸组成，其中所述脂肪酸甲基酯通过对庚烷萃取物的甲醇钠衍生作用而生成。结果总结于表14。表14将用缺少YL DGAT基因的一种对照组质粒产生的100个事件的脂肪酸组成，与用分别包含YL DGAT1(KS349)和YL DGAT2(KS362)或同时包含此二基因(KS364)的质粒产生的事件的脂肪酸组成进行了比较。对于用包含YL DGAT的DNA构造产生的事件，列出了所有油酸大于30％的事件的平均脂肪酸组成。

表14

用KS 352、349、362、349和362以及364制备的大豆体细胞胚的脂肪酸组成

表14显示，单独表达YL DGAT1或YL DGAT2基因以及共表达此二基因均改变了大豆体细胞胚的脂肪酸谱。最显著的改变是油酸的升高和亚麻酸的降低，所测试的全部DNA构造均被观察到伴随有此现象。并且，YL DGAT基因的表达还导致了棕榈酸和亚油酸的降低和硬脂酸的升高。

实施例11

表达YL DGAT基因的大豆种子的脂肪酸组成

如实施例6中所述，利用KS362质粒DNA产生了事件AFS4822.1.13.1。转基因T1种子与来自相同T1植物的无转基因分离子种子相比，表现出油脂含量提高了24.6％。这一现象有力地支持了该事件中表达了YL DGAT2这一结论。令含有或不含YL DGAT2转基因的AFS4822.1.13.1的T1种子萌发，并在生长室中培养三个月。令事件AFS4703.1.6的DS-red阳性的T1种子萌发，并栽培于上述YL DGAT2事件旁边。AFS4703.1.6系利用KS332而产生，KS332为一种包含DS-red标记基因但不含YL DGAT2的质粒载体(参见实施例5)。

有几个T1分离子被鉴定为仅产生DS-red阳性的T2种子，表明这些品系相应的转基因为纯合的。从无转基因分离子后代收集的T2种子为DS-red阴性的，这证实了这些品系很可能不含功能性的转基因。

对于每一选择，将六粒种子切开，通过TMSH衍生作用并继之以气相色谱，分析了种子切片的脂肪酸组成，如实施例6中所述。表15A将AFS4822.1.13.1的DS-red阳性分离子的六粒种子切片的平均脂肪酸组成，与来自一无转基因分离子植株的种子切片的平均脂肪酸组成和仅包含DS-red标记基因的事件AFS4703.1.6的种子切片的平均脂肪酸组成进行了比较。结果证明YL DGAT2的表达改变了大豆种子的脂肪酸谱。最显著的改变是油酸的升高和亚麻酸的降低。并且，YL DGAT基因的表达还导致了棕榈酸和亚油酸的降低和硬脂酸的升高。

表15A

利用KS362产生的T2大豆种子的脂肪酸组成

表15B

通过共转化KS349和KS362产生的T2大豆种子的脂肪酸组成

事件AFS4818.1.9和AFS4818.1.3系利用来自质粒KS349(YLDGAT1)和KS362(YL DGAT2)的DNA片段的混合物而产生，如实施例5中所述。此二事件的转基因T1种子与来自相同T1植物的无转基因分离子种子相比，分别表现出油脂含量提高了22.9％和16.2％。尽管上述现象有力地支持了两个事件均表达转基因来源的YL DGAT这一结论，但并不清楚此二事件究竟包含用于转化的DNA混合物中存在的全部两种DGAT基因的完整拷贝，还是仅包含其中一种。对事件AFS4818.1.2、AFS4818.1.3、AFS4818.1.5、AFS48182.6和AFS4818.1.9油脂和油酸含量升高的T1种子(参加实施例6)进行了种植。分离了DNA，用EcoRI和HindIII两种限制酶消化并用标准操作方法转至尼龙膜。制备两份印迹，并分别与对应于YL DGAT1基因的一种1.21kb限制性片段(通过用NcoI/EcoRI消化KS349产生)和完整的YL DGAT2基因(通过用NotI消化KS 362产生)的探针杂交。基于KS 349(SEQ ID NO：48)和KS 362(SEQ ID NO：52)的序列，大小为≥1.908和≥3.335kb的限制性片段的强杂交信号，可分别指示YL DGAT1和YL DGAT2基因完整拷贝向大豆基因组中的插入。与此相符的是，当使用一种YL DGAT1探针时，所有事件均表现出≥1.908kb的强杂交条带(图8A)。而当使用来自未经改造的大豆的DNA时，并未观察到杂交信号。(泳道11和12，图8A和B)。这表明所有受测的事件均含有存在于KS349上的完整YLDGAT1表达框的至少一个拷贝的插入。不过，当将YL DGAT2的DNA用于杂交实验时，事件4818.1.9仅表现出一条非常弱的高分子量杂交条带，而受测的其他事件全部表现出≥3.335kb的强杂交条带(泳道9，图8B)。接下来将全部五个事件的基因组DNA用BstXI消化，转至尼龙膜并用如前所述制备的完整YL DGAT2DNA进行探针杂交(图9)。0.584kb(内部片段)的强杂交条带和另外两条分别为≥0.2kb和≥0.77kb的片段，可指示YL DGAT2表达框的一个完整拷贝的插入。除4818.1.9外的全部事件均表现出指示存在YLDGAT2的完整插入的杂交模式。推断4818.1.9仅包含YL DGAT1的一个功能性表达单位。

将事件4818.1.9和4818.1.3的T1植株培育至成熟并收集种子，其中所述T1植株来源于事件4818.1.9和4818.1.3的油脂和油酸含量升高了的种子。通过对来自T2种子的切片进行TMSH衍生和GC分析，测定了T2种子的脂肪酸组成。来自4818.1.9和4818.1.3的T2植株的转基因和无转基因分离子种子的脂肪酸组成比较于表中(表15B)。其证明了YL DGAT1的表达如同YL DGAT1和YLDGAT2的共表达一样，改变了大豆种子的脂肪酸谱。最显著的改变是油酸的升高和亚麻酸的降低。并且，YL DGAT基因的表达还导致了棕榈酸和亚油酸的降低和硬脂酸的升高。

实施例12

转基因事件的分析：生长室

本实施例描述了对来自携带纯合或杂合的转基因的T2植株的大豆进行的油脂含量测量，其中所述转基因包括分别的YL DGAT1或YL DGAT2，以及YL DGAT1和YL DGAT2。T2植株生长于受控环境(生长室)中。

利用NMR对来自生长于植物生长室的植株的T2大豆种子进行了油脂分析。种子分别收集自单个植株。从杂合植株的种子选择表现出DS red标记的分离，其中所述杂合植株来自用解脂耶氏酵母的DGAT2基因进行的转化。来自相同植株的DS red阳性种子(带有DGAT2转基因)和无转基因分离子种子的油脂含量显示于表16中。在所述表中，比较了包含DGAT2转基因的种子的油脂含量和来自相同植株的非转基因的、无转基因分离子种子的油脂含量。

表16

来自用于分离解脂耶氏酵母DGAT2转基因的转基因大豆T2植株的转基因种子和无转基因分离子种子的油脂含量

通过共转化KS349和KS362而产生的事件的T2种子选择，系如上所述(实施例6)通过对种子切片的GC分析进行筛选。种子分别收集自单个植株。令来自杂合植株的种子选择分离，以分离出油酸含量升高(＞22％总脂肪酸)的种子选择，其中所述杂合植株来自用解脂耶氏酵母DGAT基因进行的转化。实施例11描述了事件4818.1.9仅包含来自解脂耶氏酵母的DGAT1基因的一个完整表达框。来自相同植株的油酸含量升高的种子(带有DGAT1转基因)和无转基因分离子种子的油脂含量显示于表17中。在该表中，比较了包含DGAT 1转基因的种子的油脂含量和来自相同植株的非转基因的、无转基因分离子植株种子的油脂含量。

表17

来自用于分离解脂耶氏酵母DGAT1转基因的转基因大豆T1植株的转基因种子和无转基因分离子种子的油脂含量

实施例11中描述了通过共转化KS349和KS362产生的其他事件包含解脂耶氏酵母两种DGAT基因的一个完整表达框。来自相同植株的油酸含量升高的种子(带有两种DGAT转基因)和无转基因分离子种子的油脂含量显示于表18中。在该表中，比较了包含两种DGAT转基因的种子的油脂含量和来自相同植株的非转基因的、无转基因分离子植株的油脂含量。

表18

来自用于分离耶氏酵母DGAT1和DGAT2转基因的转基因大豆T1植株的转基因种子和无转基因分离子种子的油脂含量

KS362来源的耶氏酵母DGAT2基因表达框纯合的T2种子选择，其DS-red标记不再分离。通过NMR对48粒种子(或者当所获得的种子少于48粒时对获得的全部种子)进行了油脂含量测量。对于每一事件，将DS-red阴性的T1种子种植于栽培DGAT转基因纯合的T1植株所用的同一生长室中，并从长出的植株收集了无转基因分离子的T2种子。来自无转基因分离子选择的种子和来自DGAT转基因纯合品系的种子的油脂含量显示于表19中

表19

来自耶氏酵DGAT2转基因纯合的转基因大豆T1植株的无转基因分离子种子和转基因种子的油脂含量

KS349来源的耶氏酵母DGAT1和KS362来源的DGAT2表达框纯合的T2种子选择，其与耶氏酵母DGAT基因的表达相联系的油酸升高(油酸≥22％)这一表型不再分离。通过NMR对48粒种子(或者当所获得的种子少于48粒时对获得的全部种子)进行了油脂含量测量。对于每一事件，将未表现出油酸升高的T1无转基因分离子种子种植于栽培DGAT转基因纯合的T1植株所用的同一生长室中，并从长出的植株收集了无转基因分离子的T2种子。来自无转基因分离子选择的种子和来自DGAT转基因纯合品系的种子的油脂含量显示于表20中。

表20

来自耶氏酵母DGAT1和DGAT2转基因纯合的转基因大豆T1植株转基因种子和无转基因分离子种子的油脂含量

总之，从生长室获得的结果显示，大豆种子中与过表达耶氏酵母两种DGAT基因之一或共表达耶氏酵母两种DGAT基因相联系的油脂增加这一性状有极好的遗传力。与单独表达一种耶氏酵母DGAT基因相联系的油脂增加(与无转基因分离子种子相比)至少为10.9％，最高达25.1％。与共表达两种耶氏酵母DGAT基因相联系的油脂增加(与无转基因分离子种子相比)至少为14.4％，最高达24.2％。

实施例13A

转基因事件的分析：大田

本实施例描述了对来自携带纯合或杂合的转基因的T2植株的大豆进行的油脂含量测量，其中所述转基因包括分别的YL DGAT1或YL DGAT2，以及YL DGAT1和YL DGAT2。T2植株生长于非受控环境(大田)中。

利用YL DGAT2(包含于KS362中)产生的转基因事件的DS red阳性T1种子，和相应的DS red阴性的无转基因分离子种子，于2007年夏季种植于爱荷华州的一块大田中。通过利用YL DGAT1和YL DGAT2共转化而产生且油酸含量升高的T1种子，和相应的具有正常油酸水平的无转基因分离子种子，也以相似方式进行种植。自单个植株分别收集T2种子，并对其进行NMR分析以测量油脂含量。表21显示了来自KS362转基因纯合的事件的48粒均为DS red阳性的种子的油脂含量，和来自培育于相同环境中的相同事件的DS-red阴性的无转基因分离子种子的油脂含量。

表21

来自耶氏酵母DGAT2转基因纯合的大田生长转基因大豆T1植株的无转基因分离子种子和转基因种子的油脂含量

表22显示了来自YL DGAT1和YL DGAT2纯合的分离子的48粒种子的油脂含量。所有种子均收集自表现出与YL DGAT表达相联系的油酸含量升高的纯合T2种子选择。在表22中，比较了上述品系的油脂含量，和相同事件的油酸水平未变的无转基因分离子种子的油脂含量，其中所述无转基因分离子种子来自与前者种植于相同环境中的植株。

表22

来自耶氏酵母DGAT1和DGAT2转基因纯合的大田生长转基因大豆T1植株的无转基因分离子种子和转基因种子的油脂含量

实施例11描述了事件4818.1.9仅包含来自耶氏酵母的DGAT1基因的一个完整表达框。来自油酸含量升高的T1种子的上述事件的三株T1植株，与来自油酸含量未变的T1种子的无转基因分离子植株一起栽培于上述爱荷华州大田内。全部三个转基因分离子的T2种子仍然表现出油酸含量升高这一表型的分离，这表明亲本品系依然为DGAT1转基因杂合的。利用GC分析将所有转基因阳性的种子从这些品系中鉴定出来，并通过NMR对其进行油脂分析。在表23中，将这些种子的油脂含量与来自生长于相同环境中的T1植株的无转基因分离子种子的油脂含量进行了比较。

表23

来自耶氏酵母DGAT1转基因杂合的大田生长转基因大豆T1植株的无转基因分离子种子和转基因种子的油脂含量

总之，在大田环境下获得的结果显示，大豆种子中与过表达耶氏酵母两种DGAT基因之一或共表达耶氏酵母两种DGAT基因相联系的油脂增加这一性状有极好的遗传力。与单独表达一种耶氏酵母DGAT基因相联系的油脂增加(与无转基因分离子种子相比)至少为11％，最高达14％。与共表达耶氏酵母DGAT基因相联系的油脂增加(与无转基因分离子种子相比)至少为19％，最高达20％。

实施例13B

大豆种子的组成分析

本实施例描述了对大豆种子的组成参数，如蛋白质含量和可溶性碳水化合物含量的测量，其中所述大豆种子来自单独表达一种YLDGAT基因(YL DGAT2)或同时表达两种YL DGAT基因的转基因事件。

对大豆种子与YL DGAT基因的表达相联系的组成变化进行了测量。出于此目的，测量了蛋白质、可溶性碳水化合物和淀粉的浓度如下。

非结构性碳水化合物和蛋白质分析。

将大豆干种子用GenoGrinder研磨仪研磨为细粉，称取子样品(精确度为0.1mg)并置入13x 100mm玻璃管，所述玻璃管配有内衬的密封旋盖。所测试的每一样品设三个重复。通过称量子样品在置于强制通风的烘箱内105℃烘干18h之前和之后的重量，计算出组织干重。

通过向每一玻璃管加入2mL庚烷进行脂质的萃取。将上述玻璃进行振荡混匀，并置入充满60℃热水的超声波浴缸(VWR ScientificModel 750D)。将样品满功率(约360W)超声处理15min，然后离心(5min×1700g)。将上清转入干净的13×100mm玻璃管，用庚烷(第二次萃取2mL，第三次萃取1mL)将沉淀再萃取两次，合并每次萃取的上清。进行脂质萃取之后，向沉淀加入1mL丙酮，振荡混匀以令材料完全分散，然后用Speedvac真空离心浓缩仪进行干燥。

非结构性碳水化合物萃取和分析。

向上述干燥后的沉淀加入2mL 80％酒精。将样品彻底地振荡混匀，直至植物材料完全分散于溶剂中，然后于60℃超声处理15min。5min×1700g离心之后，将上清轻轻倒入干净的13×100mm玻璃管。用80％酒精再进行两次萃取，合并每次萃取的上清。将萃取后的沉淀悬浮于丙酮并干燥(如上所述)。每次萃取时在用Speedvac干燥之前，加入β-苯基吡喃葡萄糖苷(100μL 0.5000+/-0.0010g/100mL储备液)作为内部标准。将萃取物保存于干燥器留待进一步分析。

将上述丙酮干燥后的粉末悬浮于0.9mL包含100U热稳定的α-淀粉酶(来自地衣芽孢杆菌；Sigma A-4551)的MOPS(50mM 3-N(吗啉代)丙烷-磺酸，5mM CaCl₂，pH7.0)缓冲液。将样品置于加热块(90℃)中75min，每15min振荡混匀一次。令样品冷却至室温，向每一样品加入0.6mL包含5U淀粉葡萄糖苷酶(Roche 110 202 367001)的醋酸盐(285mM，pH 4.5)缓冲液。将样品在配有往复式摇动器的水浴器内于55℃孵育15至18h，掺入可溶性马铃薯淀粉(SigmaS-2630)作为标准物，以确保淀粉消化完全。

消化完成后萃取释放出的碳水化合物，然后进行分析。向每一管中加入无水酒精(6mL)，将样品振荡混匀之后于60℃超声处理15min。将样品离心(5min×1700g)，然后将上清轻轻倒入干净的13×100mm玻璃管。用3mL 80％酒精将沉淀再萃取两次，合并所得到的上清。每一样品在用Speedvac干燥之前先加入内部标准(100μL β-苯基吡喃葡萄糖苷，如上所述)。

样品的制备和分析

令来自上述可溶性和淀粉萃取的干燥后的样品，溶解于包含30mg/mL盐酸羟胺(Sigma-Aldrich 159417)的无水吡啶(Sigma-AldrichP57506)中。将样品置于定轨摇床(300rpm)过夜，然后加热1h(75℃)，加热过程中每15min剧烈振荡混匀一次。冷却至室温后，加入1mL六甲基二硅氮烷(Sigma-Aldrich H-4875)和100μL三氟乙酸(Sigma-Aldrich T-6508)。将样品振荡混匀，令沉淀物沉降，然后将上清转移至GC样品瓶。

在一台配有DB-17MS毛细管柱(15m×0.32mm×0.25μm膜)的Agilent 6890气象色谱仪上对样品进行分析。入口和检测器温度均为275℃。注射(2μL，20∶1分流)后，将柱温以3℃/min的速率从初始温度(150℃)升高至180℃，然后再以25℃/min的速率升高至320℃终点温度。终点温度维持10min。载气为51cm/sec线速度的H2。通过火焰电离进行检测。数据分析利用Agilent ChemStation软件进行。每种糖相对于内部标准进行定量，并记录每种单独的碳水化合物的检测器响应(从与每组样品一起受测的标准物计算)。最终的碳水化合物浓度以组织干重作为基准表示。

蛋白质分析

通过在一台Thermo Finnigan Flash 1112EA燃烧分析器上进行燃烧分析，估计出蛋白质含量。用一台Mettler-Toledo MX5微量天平以0.001mg精确度称量4至8mg的样品用于分析。将通过分析器测定出的％N乘以6.25，计算出蛋白质含量。最终的蛋白质含量以占组织干重基准的％表示。

表24

来自两株分别为无转基因分离子或YL DGAT1 YL DGAT2转基因纯合的T1植株的大豆种子的组成分析。所述植株生长于相同的生长室环境中。数值单位为g/kg DW，除非另有说明。

表25

来自一株YL DGAT2转基因杂合的T1植株的大豆种子的组成分析。所述植株生长于生长室中。基于作为可见标记的DS red的表达，对YL DGAT转基因种子和无转基因分离子种子进行了选择。如上所述，将八粒DS red阳性的和DS red阴性的种子合并并进行了分析。数值单位为g/kg DW，除非另有说明。

表26

来自YL DGAT2转基因杂合或YL DGAT1 YL DGAT2转基因杂合的T1植株的大豆种子的组成分析。所述植株生长于大田中。基于作为可见标记的DS red的表达(4822.2.10)，或基于GC分析测定为油酸含量升高(4818.1.2)，对YL DGAT转基因种子和无转基因分离子种子进行了选择。如上所述，将八粒转基因阳性的和转基因阴性的种子合并并进行了分析。数值单位为g/kg DW，除非另有说明。

表24至26说明，一种或两种YL DGAT基因在不同环境(生长室，大田)中的表达，与种子组成的一种一致改变相联系，其中所述改变的特征在于可溶性碳水化合物的减少，也就是蔗糖的减少和水苏糖的更小程度的减少。最重要的是，当油脂积累通过YL DGAT基因的表达增加时，并未观察到蛋白质含量的减少。

实施例14

发育中的种子和体细胞胚中DGAT活性的测量

本实施例描述了单独包含耶氏酵母DGAT2或同时包含耶氏酵母DGAT2和DGAT1的大豆表达载体的构建、上述基因在大豆种子或体细胞胚中的表达以及在这些组织内的DGAT酶活性。

包含YL DGAT2的pKR1234的构建

将KS362(SEQ ID NO：52)包含YL DGAT2的NotI片段，克隆至pKR72(SEQ ID NO：26；实施例4)的NotI片段，以构建出pKR1234(SEQ ID NO：68)。

包含YL DGAT1和DGAT2的pKR1236的构建

利用引物oSGly-2(SEQ ID NO：69)和oSGly-3(SEQ ID NO：70)，通过PCR将大豆球蛋白Gy1启动子从pZBL119(描述于PCT专利公布WO 2004/071467，该专利的内容特此引入本文以供参考)上扩增出来。按生产商的说明书，将所获得的PCR片段亚克隆至中间克隆载体pCR-Script AMP SK(+)(Stratagene)，以构建出质粒pPSgly32(SEQ ID NO：71)。

将质粒pSGly32(SEQ ID NO：71)包含Gy1启动子的PstI/NotI片段，克隆至质粒pKR142(描述于PCT专利公布WO 2004/071467)的PstI/NotI片段，以构建出pKR264(SEQ ID NO：72)，其中所述质粒pKR142包含豆球蛋白A23′转录终止区域、一个氨苄青霉素抗性基因和细菌复制起点。如此，载体pKR264包含了一个两侧分别为大豆球蛋白Gy1基因启动子和豆球蛋白A23′转录终止区域的NotI位点(Gy1/NotI/legA2框)。

将质粒KS349(SEQ ID NO：48)包含耶氏酵母DGAT1的NcoI/XbaI片段，克隆至质粒pKR908(US Pat.Pub US20080095915)的NcoI/XbaI位点，以构建出pKR1212(SEQ ID NO：73)，其中所述质粒pKR908包含两侧为NotI位点的NcoI/XbaI位点。

将pKR1212(SEQ ID NO：73)包含耶氏酵母DGAT1基因的NotI片段，克隆至pKR264(SEQ ID NO：72)的NotI片段，以构建出pKR1235(SEQ ID NO：74)。

将pKR1235(74)包含耶氏酵母DGAT1的BsiWI片段，克隆至pKR1234(SEQ ID NO：68)的BsiWI位点，以构建出pKR1236(SEQ IDNO：75)。

对来自发育中T2种子的微粒体提取物进行的DGAT分析

如本文(实施例6)所述，用KS362转化了大豆胚胎生成悬浮培养物(cv.Jack)，其中所述KS362如本文所述包含耶氏酵母DGAT2，并且种植了来自大豆植株AFS4822.1.13.1(种子称为7GR11-58)和AFS4822.2.10.1(种子称为7GR11-66)的T1种子，植物的栽培如实施例12中所述。在上述两个事件中，均发现转基因阳性种子与同一事件的无转基因分离子种子相比，油脂浓度有提高。

类似地，如本文(实施例6)所述，用KS362(包含YL DGAT2)和KS349(包含YL DGAT1)共转化了大豆胚胎生成悬浮培养物(cv.Jack)。来自事件AFS4818.1.2.1的转基因阳性T1种子被命名为7GR11-2。在该事件中，发现转基因阳性种子与同一事件(实施例6)的无转基因分离子种子相比，油脂浓度有提高。来自AFS4818.1.2.1和AFS4818.1.3.17的转基因阴性的无转基因分离子T1种子分别被命名为7GR11-7和7GR11-15。种植了这些种子，植物的栽培如实施例12中所述。

从经选择的开花后30天(DAF)的植株收集约1g T2种子，在液氮中急冻，然后保存于-80℃留待处理。用研钵和研杵将1g冷冻的种子组织在液氮中磨碎，然后加入3mL植物匀浆缓冲液(300mM蔗糖；1mM EDTA；10mM Tris.HCl，pH 8.0；1mM DTT；0.1％交联聚乙烯基吡咯烷酮)，并用polytron匀浆器将组织进一步匀浆1分钟。用3层粗滤布真空过滤，继而以1层mira cloth神奇滤布过滤，收集滤渣。将得到的滤液于1,500×g离心15min两次，然后将上清于100,000x g离心60min。用移液器轻轻吹打令所得到的沉淀重悬于约0.5至1mL微粒体缓冲液(100mM磷酸钾，pH 7.2)中，并在一个涂有特氟隆的2mL尺寸杜恩斯匀浆器中进一步重悬。用Bradford试剂(Sigma-Aldrich)测定蛋白质浓度，将微粒体在液氮中急冻，保存于-80℃留待分析。

DGAT分析于25℃在植物分析缓冲液(500mM三(羟甲基)甲基甘氨酸，pH 7.8；28mM氯化钠；0.06％CHAPS)中进行，反应体系还包含20μM 1-14C-标记的油酰-辅酶A(50mCi/mmol，Perkin Elmer)、1.5mM二油酰基甘油(Sigma-Aldrich)和20μg的微粒体蛋白质，总反应体积为100μL，反应时间为5min。每一反应开始之前，先将其余的反应组分加好，最后加入微粒体膜。通过加入1mL热异丙醇(75℃)并于75℃加热10min终止反应。待反应混合液冷却至室温，加入1.5mL己烷并将样品混匀。加入1.25mL 500mM硫酸钠，低速离心分相，将上相转入另一玻璃管。然后在氮气中干燥上相。将来自每一反应的脂质重溶于75μL己烷，并加入1μL大豆油。将脂质加到一块Partisil K6 Silica Gel 60A TLC平板(Whatman，250μL厚，20cm×20cm)，通过用80∶20∶1(v/v/v)的己烷∶二乙醚∶乙酸处理，使甘油三酯于其他脂质分开。通过在一个缸内用碘蒸气轻微染色，使甘油三酯显色并将其标记。将平板自碘缸中移出，待颜色褪去后，刮掉甘油三酯，通过液体闪烁计数测定放射性，以dpm/min表示。利用下列公式，将总活性测定为每分钟每mg蛋白质掺入甘油三酯中的放射性同位素标记的油酸的量：([dpm]/[2200000dpm/uCi]/[50uCi/umol]/[5min.]/[0.02mg蛋白质]×[1000nmol/umol])。所述每一样品的DGAT活性显示于表27中。

表27

经选择的发育中T2种子的DGAT活性。

来自大豆体细胞胚的微粒体萃取物的DGAT分析

用包含耶氏酵母DGAT2的pKR1234(SEQ ID NO：68)转化大豆胚胎生成悬浮培养物(cv.Jack)，实验编号为MSE2181；用包含耶氏酵母DGAT2和DGAT1的pKR1236(SEQ ID NO：75)转化大豆胚胎生成悬浮培养物(cv.Jack)，实验编号为MSE2182。对事件进行选择，体细胞胚在ShaM中的成熟如实施例5所述。

在ShaM中成熟2周后，将来自每一事件的约1g组织在液氮中冷冻，并用研钵和研杵磨碎，如处理大豆发育中种子的方法中所述。将少量研磨后的组织(约100mg)冻干过夜，剩余组织保存于-80℃。

利用GC方法和17:0内部标准物，对来自每一事件的约10mg冻干的组织测定油脂浓度，完全如实施例5中所述，油脂浓度和油酸含量(％总FAME)显示于表28中。微粒体蛋白质的制备、蛋白质浓度的测定和对经选择的事件的DGAT分析的进行完全如上述处理种子组织的方法中所述，其中所述经选择的事件已被测定为具有一定范围的油脂浓度。DGAT分析的结果也显示于表28中。

表28

用pKR1234或pKR1236转化的大豆体细胞胚的酯化脂肪酸、油酸含量和DGAT活性

与具有野生型油脂水平的事件相比，用pKR1234转化并且具有最高的一些油脂浓度的事件的DGAT活性升高达到了9倍。与具有野生型油脂水平的事件相比，用pKR1236转化并且具有最高的一些油脂浓度的事件的DGAT活性升高达到了15.8倍。

此外还用包含耶氏酵母DGAT2和DGAT1的KS364(SEQ ID NO：63)转化了大豆胚胎生成悬浮培养物(cv.Jack)(实验编号MSE2134)，并分析了各个事件的脂肪酸谱和油脂浓度，如实施例5中所述。基于上述数据，选择了两个事件进行DGAT分析，一个事件(事件54)具有高油酸(占总脂肪酸的32.83％)和油脂浓度(12.5％DCWt)，另一个事件(事件33)具有野生型的油酸(占总脂肪酸的15.52％)和油脂浓度(8.2％DCWt)。将来自每一事件的转化的胚胎生成悬浮培养物培养于SB 196培养液中，并令胚胎在ShaM中成熟，如实施例5中所述。

在ShaM中成熟2周后，将来自每一事件的约1g组织在液氮中冷冻，制备微粒体蛋白质，对每一事件进行DGAT分析，完全如上文所述，结果显示于表29中。同样也提取了总脂质，并如下文所述测定了油酸和油脂浓度，结果报告于表29中。

表29

用KS364转化的大豆体细胞胚的酯化脂肪酸、油酸含量和DGAT活性

与具有野生型油脂水平的事件(事件33)相比，具有高油脂浓度的事件(事件54)的DGAT活性升高达到10.7倍。

实施例15

表达DGAT基因的转基因种子和体细胞胚的脂质成分分析

将用来自一个具有野生型油脂和油酸浓度的事件(事件33)和来自一个具有具有高油脂和油酸浓度的事件(事件54)的KS364转化的大豆体细胞胚，冻干48小时，并用genogrinder研磨仪将组织磨碎，完全如实施例5中所述。

总脂质萃取

利用在Bligh，E.G.和Dyer，W.J.方法(Can.J.Biochem.Physiol.37：911-917(1959))基础上作了一些改进的方法，从每一事件提取了总脂质。简言之，将来自每一事件的约100mg研磨后的组织加入至一个16mm×125mm尺寸的配有内衬特氟隆的旋盖的试管中。加入甲醇∶氯仿/2∶1混合物(6mL)，温和搅拌萃取样品1小时，然后加入2mL氯仿，并继续搅拌30min。然后，加入3.6mL水，剧烈振荡试管，用临床离心机离心分相。将下层有机相小心转移至第二个玻璃试管，用2mL氯仿将上层水相再萃取一次。再次离心，并将下层有机相与第一次的有机相合并。将样品于50℃在氮气流中干燥，通过称重估算出总脂质，将脂质溶于氯仿∶甲醇/6∶1至浓度为约10mg/mL。利用本文(实施例4)所述的硫酸/甲醇方法，对约50μg的每一样品进行FAME分析，结果显示于表30中。

中性和极性脂质的分离

依次用5mL甲醇、5mL甲醇∶氯仿/1∶1和5mL氯仿平衡Sep-pak氨基-丙基固相萃取柱(Waters；6cc柱，WAT054560)。向每一柱中加入溶于氯仿∶甲醇/6∶1的约5mg总脂质，然后加入5x 1mL的氯仿等份以洗脱中性脂质，收集并合并所有流分，于50℃在氮气流中干燥。然后依次用5×1mL等分试样的甲醇∶氯仿/1∶1等份和5×1mL的甲醇等份将极性脂质从每一柱上洗脱，合并所有流分并在氮气中干燥。将中性脂质溶解于约1mL的CHCl3∶MeOH/6∶1中，将极性脂质溶解于约200μL的CHCl3∶MeOH/6∶1中。利用本文(实施例4)所述的硫酸/甲醇方法，对约50μg的中性脂质进行FAME分析，结果显示于表30中。

通过TLC对TAG、PC和PE的分离

将约100μL中性脂质萃取物上样至一块Partisil K6 Silica Gel 60A TLC平板(Whatman，250μL厚，20cm x 20cm)距底部2cm处。类似地，将约200μL极性脂质流分上样至相同的TLC平板上。TAG、PC和PE的标准溶液(10mg/mL，溶于氯仿∶甲醇/6∶1)也同样上样至平板。用CHCl3∶MeOH∶AcOH/65∶35∶8混合液处理TLC平板，直到溶剂前沿达至平板的约一半处。将TLC平板置于空气中干燥10min，然后将其完全暴露于70∶30∶1(v/v/v)的己烷∶二乙醚∶乙酸中。通过在碘缸内轻微染色，使标准物显色，并将TAG、PC和PE所对应的条带自TLC平板上挖去。利用本文(实施例4)所述的硫酸/甲醇方法，直接衍生包含各种脂质的硅胶，结果显示于表30中。

TAG的脂肪酸位置分析

利用猪胰脂肪酶移除TAG sn1和sn3位上的酰基，继而通过所得到的单酰甘油(MAG)的酯交换反应，测定了TAG sn2位的脂肪酸谱。将约5mg的中性脂质萃取物悬浮于2mL 1M Tris.HCl，pH 8.0，置于一个带旋盖的玻璃试管中，并加入0.2mL 2.2％氯化钙和0.5mL0.05％胆盐。将脂质于37℃孵育5min，直接加入5mg猪胰脂肪酶，将悬液于37℃在摇动中孵育20min。孵育后，加入1mL乙醇并继而加入1mL 6M HCl，以终止反应。混匀之后加入2.5mL二乙醚，离心分相，小心转移上层有机相。重复二乙醚萃取一次，将两次的上层二乙醚相合并。用无水硫酸钠干燥，然后于50℃在氮气流中令二乙醚蒸发，将所得到的脂质溶于200μL氯仿∶甲醇/6∶1中。将上述脂质与三酰甘油(TAG)、二酰甘油(DAG)、单酰甘油(MAG)和游离脂肪酸(FFA)标准物一起上样至一块Partisil K6TLC平板，并将平板如本文所述进行处理。然后，通过轻微的碘染色令标准物显色，将MAG条带切下，并用如本文中所述的硫酸/甲醇方法衍化。来自上述MAG条带的FAME脂肪酸谱结果，代表了TAG sn2位(即甘油的C2上的酰基)的脂肪酸谱，所述结果与sn1和sn3位的计算值一起显示于表30中。表30中，在TAG sn1和sn3位上，每种脂肪酸(即16:0、18:0、18:1、18:2和18:3)占总脂肪酸的％通过下列公式计算：＝([TAGx]-[sn2x]/3)*3/2；其中x指代所感兴趣的脂肪酸。

表30

TAG中各种脂质的脂肪酸组成和位置分布

在TAG中观察到的同YL DGAT的表达相联系的脂肪酸谱的变化，在极性脂质中也同样有观察到。

实施例16

氨基酸序列发生改变的耶氏酵母DGAT突变体

本实施例描述了突变体形式的耶氏酵母DGAT2的构建，突变基因向酵母表达载体的克隆，以及对微粒体蛋白组分的DGAT活性的分析。.

包含突变型耶氏酵母DGAT2的酿酒酵母表达载体的构建

按照生产商的说明书，利用Phusion^TM高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)以及寡核苷酸引物oYDG2-1(SEQ ID NO：76)和oYDG2-2(SEQ ID NO：77)，将耶氏酵母DGAT2自pKR1234(SEQ ID NO：68；实施例14)中扩增出来。按照生产商的说明书，利用ZeroPCR克隆试剂盒(Invitrogen Corporation)，将得到的DNA片段克隆至克隆载体，从而得到pKR1254(SEQ ID NO：78)。

按照生产商的说明书，利用定点突变试剂盒(Cat.No.200518，Stratagene，La Jolla，CA)以及寡核苷酸Y1D2_Y326F-5(SEQ ID NO：79)和Y1D2_Y326F-3(SEQ ID NO：80)使耶氏酵母DGAT2序列上的一个密码子发生改变，所述密码子编码耶氏酵母DGAT2序列所对应的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)上的氨基酸Y326。经过大量测序，选择了一个克隆用于进一步研究，该克隆编码的一种氨基酸序列除Y326变为了F326外，与耶氏酵母DGAT2(SEQ IDNO：10)完全一致。该克隆被命名为pKR1254_Y326F(SEQ ID NO：81)。编码序列(Y1DGAT2_Y326F)改变后的核苷酸序列如SEQ IDNO：82所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：83所示。

按照生产商的说明书，利用定点突变试剂盒(Cat.No.200518，Stratagene，La Jolla，CA)以及寡核苷酸Y1D2_Y326L-5(SEQ ID NO：84)和Y1D2_Y326L-3(SEQ ID NO：85)使耶氏酵母DGAT2序列上的一个密码子发生改变，所述密码子编码耶氏酵母DGAT2序列所对应的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)上的氨基酸Y326。经过大量测序，选择了一个克隆用于进一步研究，该克隆编码的一种氨基酸序列除Y326变为了L326外，与耶氏酵母DGAT2(SEQ IDNO：10)完全一致。该克隆被命名为pKR1254_Y326L(SEQ ID NO：86)。编码序列(Y1DGAT2 Y326L)改变后的核苷酸序列如SEQ IDNO：87所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：88所示。

按照生产商的说明书，利用定点突变试剂盒(Cat.No.200518，Stratagene，La Jolla，CA)以及寡核苷酸Y1D2_R327K-5(SEQ ID NO：89)和Y1D2_R327K-3(SEQ ID NO：90)使耶氏酵母DGAT2序列上的一个密码子发生改变，所述密码子编码耶氏酵母DGAT2序列所对应的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)上的氨基酸R327。经过大量测序，选择了一个克隆用于进一步研究，该克隆编码的一种氨基酸序列除R327变为了K327外，与耶氏酵母DGAT2(SEQ IDNO：10)完全一致。该克隆被命名为pKR1254_R327K(SEQ ID NO：91)。编码序列(Y1DGAT2_Y326L)改变后的核苷酸序列如SEQ ID NO：92所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：93所示。

将pKR1254、pKR1254_Y326F、pKR1254_Y326L和pKR1254_R327K各自包含一个野生型或突变型Y1DGAT2基因的NotI片段，分别克隆至pY75(SEQ ID NO：3；实施例1)的NotI位点，从而分别获得pY191(SEQ ID NO：94)、pY192(SEQ ID NO：95)、pY193(SEQ ID NO：96)和pY194(SEQ ID NO：97)。

对突变型耶氏酵母DGAT2的DGAT活性的分析

自Open Biosystems(http://www.openbiosystems.com/)获得了一种敲除了内源性DGAT2基因并具有下列基因型(BY4741，MATa his3Δ1leu2Δ0met15Δ0 ura3Δ0)的酿酒酵母突变型菌株(DGA1)。用pY191、pY192、pY193或pY194转化该菌株并如本文所述分离转化子。将每一转化的三个独立的转化子在2mL添加了CSM-leu的DOBA培养液中于30℃孵育16h，获得培养物。将细胞(1mL)转入50mL上述DOBA培养液中并于30℃再培养16h。离心令细胞沉淀，在液氮中冷冻，然后保存于-80℃留待使用。

将沉淀重悬于2mL酵母匀浆缓冲液(20mM Tris.HCl，pH 8.0；10mM MgCl2；1mM EDTA；5％glycerol；1mM DTT；0.3M(NH₄)₂SO₄)，并将悬液加入至包含约1mL 0.5mm玻璃珠的2mL旋盖管中。通过旋涡振荡除去气穴，此时悬液充至管的上部，盖上管盖，用珠磨器5000rpm研磨三次以破碎细胞，每次1min，每次研磨后置冰上5min。1,500x g 4℃离心酵母匀浆物15min，然后将得到的上清液100,000xg离心60min。用移液器轻轻吹打令所得到的沉淀重悬于约0.2至1mL微粒体缓冲液(100mM磷酸钾，pH 7.2)中，并在一个涂有特氟隆的2mL尺寸杜恩斯匀浆器中进一步重悬。用Bradford试剂(Sigma-Aldrich)测定蛋白质浓度，将微粒体在液氮中急冻，保存于-80℃留待分析。

DGAT分析于25℃在植物分析缓冲液(50mM磷酸钾(pH 7.2))中进行，反应体系还包含20μM 1-14C-标记的油酰-辅酶A(50mCi/mmol，Perkin Elmer)和20μg的微粒体蛋白，总反应体积为100μL，反应时间为1min。每一反应开始之前，先将其余的反应组分加好，最后加入微粒体膜。除了所用的公式针对1min的反应时间作了相应改变以外，分析的终止和TAG中放射性的测定完全如对植物的DGAT分析中所述。assay time(i.e.[dpm]/[2200000dpm/uCi]/[50uCi/umol]/[5min.]/[0.02mg protein]×[1000nmol/umol]).所述每一样品的DGAT活性以及平均值显示于表31中。

表31

用pY191、pY192、pY193或pY194转化的DGA1的DGAT活性。

从表31来看，Y326F和Y326L氨基酸变化似乎对在酵母中检测的耶氏酵母DGAT2活性影响轻微，选择将这两个突变用于在大豆体细胞胚中表达。

构建包含突变型耶氏酵母DGAT2的大豆表达载体

将pKR1254(SEQ ID NO：78)、pKR1254_Y326F(SEQ ID NO：81)或pKR1254_Y326L(SEQ ID NO：86)各自包含野生型或突变型耶氏酵母DGAT2基因的NotI片段，分别克隆至pKR72(SEQ ID NO：26；实施例4)的NotI片段，从而分别获得pKR1256(SEQ ID NO：98)、pKR1277(SEQ ID NO：99)或pKR1278(SEQ ID NO：100)。

测定表达突变型耶氏酵母DGAT2的大豆体细胞胚的油脂浓度

用包含野生型耶氏酵母DGAT2的pKR1256(SEQ ID NO：98)转化大豆胚胎生成悬浮培养物(cv.Jack)，实验编号为MSE2228；或用包含耶氏酵母DGAT2_Y326F的pKR1277(SEQ ID NO：99)转化大豆胚胎生成悬浮培养物(cv.Jack)，实验编号为MSE2229；或用包含耶氏酵母DGAT2_Y326L的pKR1278(SEQ ID NO：100)转化大豆胚胎生成悬浮培养物(cv.Jack)，实验编号为MSE2230。对事件进行选择，体细胞胚在ShaM中的成熟如实施例5所述。对每一事件，利用NMR测定油脂浓度，并通过GC测定脂肪酸谱，完全如本文中所述，油脂浓度和脂肪酸含量(％总FAME)的结果显示于表32中。

表32

用pKR1256、pKR1277或pKR1278转化的大豆体细胞胚的油脂浓度

在大豆体细胞胚中，携带Y326F突变的YL DGAT2蛋白变异体所导致的油脂浓度升高和油脂的脂肪酸谱改变的程度，至少也同野生型耶氏酵母DGAT2所导致的程度一样。

实施例17

针对表达进行过优化的DAGT基因

针对在大豆植物中的表达而优化过的编码YL DGAT1和YLDGAT2基因的序列如SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：66所示。上述序列的设计描述于实施例9中。包括两翼为NotI限制性位点的上述DNA序列的DNA分子通过DNA 2.0(California，USA)进行合成。用NotI消化含有上述合成的基因的质粒DNA。将包含DGAT基因的NotI限制性片段，与经NotI线性化的去磷酸化的KS332DNA连接，所述KS332描述于实施例5中。在所得到的DNA构造中，耶氏酵母DGAT1或耶氏酵母DGAT2基因针对表达而优化过的变异体的表达，处于β-大豆伴球蛋白启动子的控制下，将所述DNA构造分别命名为KS392和KS393。它们的序列如SEQ ID NO：101和SEQ IDNO：102所示。此外还构建了质粒KS391。为了构建KS391，首先用NotI和NcoI消化KS349的DNA。将所得到的DGAT1限制性片段的两端与经NotI线性化的KS332DNA连接，使前者完全插入至质粒中。得到的质粒构造称为KS391。在该质粒构造中，天然的YLDGAT1序列处于β-大豆伴球蛋白启动子的控制下。KS391的序列如SEQ ID NO：103所示。如上所述(实施例5)，用质粒KS391、KS392、KS 362和KS393的DNA进行基因枪轰击，进而再生出转基因大豆体细胞胚。利用NMR测量了体细胞胚的油脂含量。如上所述(实施例4)，将短暂冻干的胚胎组织置于genogrnder瓶中粉碎。将20至200mg组织粉末转入NMR管。如实施例4中所述，从NMR信号计算出上述体细胞胚组织粉末的油脂含量。

表33

用pKS392和pKS391转化的大豆体细胞胚的油脂含量

     ID           质粒构造     ％油脂

1    2196.1.08    KS392        15.7

2    2196.3.03    KS392        13.9

3    2196.1.05    KS392        13.7

4    2196.1.15    KS392        13.4

5    2196.1.02    KS392        12.2

6    2196.3.07    KS392        12.1

7     2196.3.04    KS392    12.1

8     2196.3.05    KS392    11.6

9     2196.1.06    KS392    11.4

10    2196.1.07    KS392    11.4

11    2196.1.03    KS392    10.4

12    2196.1.14    KS392    10.2

13    2196.1.12    KS392    9.4

14    2196.3.08    KS392    9.1

15    2196.3.09    KS392    8.1

16    2196.4.02    KS392    8.1

17    2196.1.09    KS392    7.8

18    2196.2.01    KS392    7.6

19    2196.5.01    KS392    7.4

20    2196.3.01    KS392    7.4

21    2196.1.04    KS392    7.3

22    2196.2.02    KS392    7.3

23    2196.3.02    KS392    6.9

24    2196.1.10    KS392    6.5

25    2196.4.03    KS392    6.5

26    2196.1.11    KS392    6.0

27    2196.4.01    KS392    5.7

28    2196.3.06    KS392    5.4

29    2196.5.02    KS392    5.3

30    2196.1.13    KS392    3.5

                  平均％油脂9.1

1     2195.3.15    KS391    12.8

2     2195.5.02    KS391    11.5

3     2195.3.01    KS391    11.2

4     2195.3.03    KS391    11.0

5     2195.3.02    KS391    10.6

6     2195.4.06    KS391    10.4

7     2195.3.08    KS391    10.2

8     2195.2.01    KS391    10.1

9     2195.3.04    KS391    9.3

10    2195.3.05    KS391    9.2

11    2195.5.01    KS391    9.1

12    2195.2.04    KS391    8.8

13    2195.3.14    KS391    8.6

14    2195.3.10    KS391    7.8

15    2195.4.01    KS391    7.7

16    2195.5.03    KS391    6.5

17    2195.4.02    KS391    6.4

18    2195.3.09    KS391    6.3

19    2195.4.07    KS391    6.2

20    2195.3.06    KS391    6.1

21    2195.3.13    KS391    6.0

22    2195.5.05    KS391    5.9

23    2195.4.03    KS391    5.6

24    2195.5.04    KS391    5.5

25    2196.1.01    KS391    5.3

26    2195.4.04    KS391    5.3

27    2195.3.11    KS391    5.2

28    2195.2.03    KS391    5.0

29    2195.4.05    KS391    4.9

30    2195.3.07    KS391    4.4

31    2195.2.02    KS391    4.3

              平均％油脂    7.6

表33比较了用KS392和KS391分别产生的30个和31个事件的油脂含量。用KS392产生的所有事件的平均油脂含量为9.1％，而用KS391产生的所有事件的平均油脂含量为7.6％。此外，用KS392转化的事件中最高的油脂含量为15.7％，而用KS391转化的最高为12.8％。申请人已证明，与天然的YL DGAT1基因相比，YL DGAT1针对表达所作的优化导致了发育中大豆胚胎油脂含量的升高。

表34

用pKS393和pKS362转化的大豆体细胞胚的油脂含量

样品#    ID        质粒构造 ％油脂

1     2207.5.05    KS393    12.3

2     2207.5.08    KS393    12.2

3     2207.5.06    KS393    11.7

4     2207.5.03    KS393    10.8

5     2207.5.01    KS393    10.6

6     2207.5.04    KS393    10.3

7     2207.4.04    KS393    10.3

8     2207.3.09    KS393    9.5

9     2207.5.07    KS393    9.3

10    2207.4.01    KS393    8.8

11    2207.4.02    KS393    8.7

12    2207.3.06    KS393    8.0

13    2207.3.04    KS393    7.9

14    2207.4.06    KS393    7.8

15    2207.4.03    KS393    7.7

16    2207.4.08    KS393    7.4

17    2207.3.14    KS393    7.1

18    2207.4.05    KS393    7.0

19    2207.3.12    KS393    7.0

20    2207.3.01    KS393    6.9

21    2207.5.02    KS393    6.8

22    2207.3.02    KS393    6.7

23    2207.3.07    KS393    6.7

24    2207.3.03    KS393    6.6

25    2207.3.13    KS393    6.5

26    2207.3.11    KS393    6.3

27    2207.3.05    KS393    5.8

28    2207.3.10    KS393    5.8

29    2207.4.07    KS393    5.5

30    2207.3.08    KS393    5.4

31    2207.4.09    KS393    5.4

      平均％油脂            8.0

1     2208.2.08    KS362    11.6

2     2208.5.04    KS362    11.5

3     2208.2.04    KS362    11.5

4     2208.2.10    KS362    11.2

5     2208.2.09    KS362    10.3

6     2208.2.02    KS362    10.2

7     2208.5.02    KS362    10.0

8     2208.3.10    KS362    9.8

9     2208.3.12    KS362    9.8

10    2208.3.06    KS362    9.5

11    2208.3.04    KS362    8.8

12    2208.5.05    KS362    8.6

13    2208.2.07    KS362    8.1

14    2208.2.03    KS362    8.0

15    2208.3.03    KS362    8.0

16    2208.5.01    KS362    8.0

17    2208.2.06    KS362    7.8

18    2208.2.11    KS362    7.4

19    2208.5.07    KS362    7.3

20    2208.3.14    KS362    7.2

21    2208.3.02    KS362    7.0

22    2208.3.08    KS362    6.4

23    2208.3.07    KS362    6.1

24    2208.2.12    KS362    6.1

25    2208.3.09    KS362    6.0

26    2208.3.11    KS362    6.0

27    2208.2.01    KS362    5.8

28    2208.2.05    KS362    5.7

29    2208.3.01    KS362    5.4

30    2208.5.03    KS362    5.1

31    2208.3.13    KS362    4.7

32    2208.5.06    KS362    4.1

33    2208.3.05    KS362    3.2

      平均％油脂            7.8

表34比较了用KS393和KS362分别产生的31个和33个事件的油脂含量。用KS393产生的所有事件的平均油脂含量为8.0％，而用KS393产生的所有事件的平均油脂含量为7.8％。此外，用KS393转化的事件中最高的油脂含量为12.3％，而用KS362转化的最高为11.6％。申请人已证明，与天然的YL DGAT2基因相比，YL DGAT2针对表达所作的优化导致了发育中大豆胚胎油脂含量的极少量的升高。

实施例18

YL DGAT1和一个FAD2/TE2下调构造在大豆体细胞胚中的共表达

本实施例描述了包含耶氏酵母DGAT1(YL DGAT1)的大豆表达载体pKR1274，以及包含一种大豆脂肪酸去饱和酶2(GM FAD2)/硫酯酶2(GM TE2)下调构造的大豆表达载体pKR1267或pKR1269的构建。pKR1267和pKR1269中的GM FAD2-TE2下调区域是相同的，并且都受KTi3启动子驱动，不过pKR1267仅包含KTi3终止子，而pKR1269既包含KTi3终止子又包含大豆白蛋白终止子。

包含YL DGAT1的pKR1274的构建

作为起始质粒的pKR85(SEQ ID NO：27)，此前已描述于实施例4中，其包含两翼分别与T7启动子和转录终止子相接(构成T7启动子/hpt/T7终止子框)的潮霉素B磷酸转移酶(HPT)基因(Gritz L.and Davies，J.，Gene 25：179-188(1983))，以及一个用于在细菌(例如E.coli)中选择和复制的细菌复制起点(ori)。此外，pKR72还包含两翼分别与35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))和NOS 3′转录终止子(Depicker等人，J.Mol.Appl.Genet.1：561-570(1982))相接(35S/hpt/NOS3′框)，从而可用于在植物，例如大豆中进行选择的潮霉素B磷酸转移酶基因。质粒pKR85(SEQ ID NO：27)还包含一个两翼分别与β-大豆伴球蛋白(Beachy等人，EMBO J.4：3047-3053(1985))的α亚单位和云扁豆蛋白(Doyle等人，J.Biol.Chem.261：9228-9238(1986))的3′转录终止区域相接的NotI限制性位点，称为Bcon/NotI/Phas3′框。

通过HindIII消化，将上述Bcon/NotI/Phas3′框从pKR85(SEQ ID NO：27)上切下，并将得到的片段重新连接以构建pKR278(SEQ ID NO：104)。

将包含YL DGAT1的pKR1235(SEQ ID NO：74，实施例14)BsiWI片段，克隆至pKR278(SEQ ID NO：104)的BsiWI位点，以构建出pKR1274(SEQ ID NO：105)，其中所述pKR278此前已描述于发表于US20080095915中的BB 1574中(该专利的内容特此引入本文以供参考)。

包含GM FAD2-TE2下调框的pKR1267的构建

按照生产商的说明书，利用Phusion^TM高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)以及寡核苷酸引物GmTE2_5-1(SEQID NO：108)和GmTE2_3-1(SEQ ID NO：109)，将GM TE2(SEQ ID NO：106)的5′端自pTC4(SEQ ID NO：107)上扩增出来，其中所述pTC4此前已描述于WO1996006936A1中(该专利的内容特此引入本文以供参考)。按照生产商的说明书，利用Phusion^TM高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)以及寡核苷酸引物GmTE2_5-2(SEQ ID NO：110)和GmTE2_3-2(SEQ ID NO：111)，将GM TE2(SEQ ID NO：106)的3′端自pTC4(SEQ ID NO：107)上扩增出来。合并所得到的两种PCR产物，并按照生产商的说明书，利用Phusion^TM高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)以及GmTE2_5-1(SEQ ID NO：108)和GmTE2_3-2(SEQ IDNO：111)进行扩增。按照生产商的说明书，利用ZeroPCR克隆试剂盒(Invitrogen Corporation)，将所得到的DNA片段克隆至克隆载体，以构建出pKR1258(SEQ ID NO：112)。

按照生产商的说明书，利用Phusion^TM高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)以及寡核苷酸引物GmFAD2-1_5-1(SEQ ID NO：115)和GmFAD2-1_3-1(SEQ ID NO：116)，将GM FAD2(SEQ ID NO：113)的5′端自pBS43(SEQ ID NO：114)上扩增出来，其中所述pBS43此前已描述于WO1997047731A2中(该专利的内容特此引入本文以供参考)。按照生产商的说明书，利用Phusion^TM高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)以及寡核苷酸引物GmFAD2-1_5-2(SEQ ID NO：117)和GmFAD2-1_3-2(SEQ IDNO：118)，将GM FAD2-1(SEQ ID NO：113)的3′端自pBS43(SEQID NO：114)上扩增出来。合并所得到的两种PCR产物，并按照生产商的说明书，利用Phusion^TM高保真DNA聚合酶(Cat.No.F553S，Finnzymes Oy，Finland)以及GmFAD2-1_5-1(SEQ ID NO：115)和GmFAD2-1_3-2(SEQ ID NO：118)进行扩增。按照生产商的说明书，利用ZeroPCR克隆试剂盒(Invitrogen Corporation)，将所得到的DNA片段克隆至克隆载体，以构建出PCRblunt-Fad2-1(SEQ ID NO：119)。

将包含GM TE2的pKR1258(SEQ ID NO：112)MluI片段，克隆至包含GM FAD2-1的PCRblunt-Fad2-1(SEQ ID NO：119)MluI片段，以构建出pKR1259(SEQ ID NO：120)。

将包含GM FAD2/TE2片段5′端的pKR1259(SEQ ID NO：120)EcoRI片段，克隆至KR1259(SEQ ID NO：122)的MfeI位点，以构建出pKR1261(SEQ ID NO：121)，并形成两翼为NotI位点的GMFAD2-TE2-TE2loop-TE2-FAD2发夹结构。

将包含GM FAD2-TE2-TE2loop-TE2-FAD2的pKR1261(SEQ IDNO：121)NotI片段，克隆至pKR123R(SEQ ID NO：122)的NotI位点，以构建出pKR1266(SEQ ID NO：123)，其中所述pKR123R此前已描述于WO2004071467A2中(该专利的内容特此引入本文以供参考)。

将包含GM FAD2-TE2-TE2loop-TE2-FAD2的pKR1266(SEQ IDNO：123)BsiWI/PstI片段，克隆至pKR278(SEQ ID NO：104)的BsiWI/SbfI片段，以构建出pKR1267(SEQ ID NO：124)。

包含GM FAD2-TE2下调框的pKR1269的构建

将包含GM FAD2-TE2-TE2loop-TE2-FAD2的pKR1261(SEQ IDNO：121)NotI片段，克隆至pKR457(SEQ ID NO：125)的NotI位点，以构建出pKR1264(SEQ ID NO：126)，其中所述pKR457此前已描述于PCT专利公布WO 2005/047479中(该专利的内容特此引入本文以供参考)。

将包含GM FAD2-TE2-TE2loop-TE2-FAD2的pKR 1264(SEQ IDNO：126)PstI片段，克隆至pKR277(SEQ ID NO：127)的SbfI片段，以构建出pKR1269(SEQ ID NO：128)，其中所述pKR277此前已描述于PCT专利公布WO 2004/071467中。

GM FAD2-TE2-TE2loop-TE2-FAD2下调构造的单独表达或与YL DGAT2的共表达

单独用pKR1267(SEQ ID NO：124)转化大豆胚胎生成悬浮培养物(cv.Jack)，实验编号为MSE2213；或用pKR1274(SEQ ID NO：105)和pKR1269(SEQ ID NO：128)的BsiWI片段转化大豆胚胎生成悬浮培养物(cv.Jack)，实验编号为MSE2210。对事件进行选择，体细胞胚在ShaM中的成熟如实施例5所述。如实施例4中所述，测定MSE2213和MSE2210中的油脂浓度和脂肪酸谱，每一实验的结果分别显示于表35和表36中。

表35

来自MSE2213的事件的油脂浓度和脂肪酸谱。

MSE2213(GM FAD2-TE2-TE2loop-TE2-FAD2)

事件       16:0   18:0   18:1    18:2    18:3    ％油脂

2213-16    5.8    2.6    72.7    10.5    8.5     16.8

2213-26    12.0   5.7    24.8    47.2    10.4    16.5

2213-30    11.7   5.3    18.5    53.1    11.4    15.4

2213-23    9.0    3.2    52.2    24.7    11.0    15.3

2213-29    13.1   3.7    13.3    57.1    12.8    15.0

2213-7     6.4    3.1    66.3    15.6    8.6     14.9

2213-31    11.7   3.0    26.9    46.5    11.9    14.5

2213-13    6.7    3.3    64.5    16.6    8.9     14.4

2213-5     3.5    3.0    78.0    7.5     8.1     13.8

2213-9     7.6    3.4    57.6    20.3    11.0    13.2

2213-20    7.8    4.1    56.7    20.8    10.6    13.1

2213-4     4.1    2.7    72.1    11.1    10.0    12.7

2213-17    7.7    5.2    57.0    19.7    10.4    12.5

2213-3     7.4    3.6    64.4    14.4    10.2    12.5

2213-24    12.9   7.3    29.4    39.0    11.4    12.1

2213-1     13.8   7.1    22.1    44.6    12.4    11.9

2213-6     6.7    2.2    57.2    22.2    11.7    11.8

2213-11    9.2    5.2    58.2    16.4    11.0    10.9

2213-2     7.8    4.3    45.3    31.0    11.7    10.6

2213-14    7.3    4.6    63.0    15.0    10.2    10.5

2213-27    8.5    6.0    48.9    25.0    11.6    10.1

2213-19    8.0    4.0    53.7    21.4    12.8    9.9

2213-21    11.1   5.6    28.3    40.6    14.4    9.8

2213-18    7.4    4.1    57.2    17.7    13.5    9.4

2213-12    6.4    4.3    63.2    15.5    10.6    9.4

2213-10    13.8   7.0    24.0    42.1    13.2    9.4

2213-28    8.8    4.1    54.1    19.1    13.8    9.1

2213-25    6.9    3.5    53.9    21.9    13.8    9.0

2213-15    5.2    3.4    61.7    17.6    12.1    8.0

2213-8     14.4   6.6    20.0    42.9    16.1    7.6

2213-22    14.3   6.3    21.3    41.9    16.2    7.2

平均值     8.9    4.4    47.9    27.1    11.6    11.9

表36

来自MSE2210的事件的油脂浓度和脂肪酸谱

MSE2210(YL DGAT1 & GM FAD2-TE2-TE2loop-TE2-FAD2)

事件       16:0    18:0   18:1    18:2    18:3    ％油脂

2210-2     3.8     2.7    74.7    13.1    5.8     22.1

2210-23    10.3    6.8    32.0    44.4    6.5     20.0

2210-29    7.5     5.5    63.9    17.1    6.0     20.0

2210-19    3.9     3.5    79.1    8.1     5.4     19.7

2210-10    7.3     3.8    66.6    15.6    6.7     19.6

2210-12    5.7     3.6    67.6    17.6    5.6     19.6

2210-14    4.5     2.4    67.9    17.8    7.4     19.3

2210-25    5.1     3.5    71.8    13.1    6.4     18.4

2210-5     9.0     4.1    43.1    35.9    7.9     17.8

2210-24    13.7    4.3    20.5    52.5    9.1     17.5

2210-13    10.2    5.5    36.8    40.4    7.0     17.4

2210-11    10.9    7.8    30.6    43.2    7.5     16.6

2210-1     4.1     3.0    75.6    9.6     7.7     15.9

2210-6     2.7     1.7    83.9    5.3     6.4     15.5

2210-16    8.4     3.7    48.5    31.3    8.1     15.3

2210-26    7.1     4.9    55.2    24.7    8.1     14.4

2210-7     4.3     3.2    62.9    20.8    8.7     14.3

2210-20    6.8     4.3    65.2    15.7    7.9     13.8

2210-27    10.9    7.4    42.4    30.0    9.3     13.8

2210-30    5.0     2.4    65.1    17.1    10.4    13.7

2210-3     7.1     4.8    52.9    27.4    7.9     13.6

2210-4     6.0     3.7    66.0    15.9    8.5     13.3

2210-22    3.2     3.3    77.7    8.1     7.8     13.2

2210-8     9.1     4.9    49.7    27.3    9.0     13.1

2210-21    6.0     3.5    67.8    14.9    7.8     12.8

2210-18    12.7    5.2    20.2    49.7    12.1    12.5

2210-31    4.4     2.9    73.1    10.1    9.5     11.7

2210-9     4.0     3.1    74.1    9.3     9.6     11.2

2210-15    3.5     2.4    72.5    11.0    10.6    11.1

2210-28    14.1    5.7    20.2    45.5    14.5    10.1

2217-29    12.0    7.5    28.0    38.8    13.8    8.7

平均值     7.2     4.2    56.6    23.6    8.4     15.4

对表35和36中的结果进行的比较证明，YL DGAT1的表达和GM FAD2-1与GM TE2的下调联合导致的脂肪酸谱改变程度，超过了仅有对FAD2-1和TE2基因的抑制时所观察到的改变程度。

序列表

 

<110>E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY

 

<120>用于在大豆中提高种子贮藏油脂的生成和改变脂肪酸谱的来自解脂耶氏酵母的DGAT基因

 

<130>BB1623

 

<140>60/939872

<141>2007-05-24

 

<140>61/013406

<141>2007-12-13

 

<160>128

 

<170>PatentIn版本3.5

 

<210>1

<211>1581

<212>DNA

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>1

atggaggtcc gacgacgaaa gatagacgtg ctcaaggccc agaaaaacgg ctacgaatcg    60

ggcccaccat ctcgacaatc gtcgcagccc tcctcaagag catcgtccag aacccgcaac    120

aaacactcct cgtccaccct gtcgctcagc ggactgacca tgaaagtcca gaagaaacct    180

gcgggacccc cggcgaactc caaaacgcca ttcctacaca tcaagcccgt gcacacgtgc    240

tgctccacat caatgctttc gcgcgattat gacggctcca accccagctt caagggcttc    300

aaaaacatcg gcatgatcat tctcattgtg ggaaatctac ggctcgcatt cgaaaactac    360

ctcaaatacg gcatttccaa cccgttcttc gaccccaaaa ttactccttc cgagtggcag    420

ctctcaggct tgctcatagt cgtggcctac gcacatatcc tcatggccta cgctattgag    480

agcgctgcca agctgctgtt cctctctagc aaacaccact acatggccgt ggggcttctg    540

cataccatga acactttgtc gtccatctcg ttgctgtcct acgtcgtcta ctactacctg    600

cccaaccccg tggcaggcac aatagtcgag tttgtggccg ttattctgtc tctcaaactc    660

gcctcatacg ccctcactaa ctcggatctc cgaaaagccg caattcatgc ccagaagctc    720

gacaagacgc aagacgataa cgaaaaggaa tccacctcgt cttcctcttc ttcagatgac    780

gcagagactt tggcagacat tgacgtcatt cctgcatact acgcacagct gccctacccc    840

cagaatgtga cgctgtcgaa cctgctgtac ttctggtttg ctcccacact ggtctaccag    900

cccgtgtacc ccaagacgga gcgtattcga cccaagcacg tgatccgaaa cctgtttgag    960

ctcgtctctc tgtgcatgct tattcagttt ctcatcttcc agtacgccta ccccatcatg    1020

cagtcgtgtc tggctctgtt cttccagccc aagctcgatt atgccaacat ctccgagcgc    1080

ctcatgaagt tggcctccgt gtctatgatg gtctggctca ttggattcta cgctttcttc    1140

cagaacggtc tcaatcttat tgccgagctc acctgttttg gaaacagaac cttctaccag    1200

cagtggtgga attcccgctc cattggccag tactggactc tatggaacaa gccagtcaac    1260

cagtacttta gacaccacgt ctacgtgcct cttctcgctc ggggcatgtc gcggttcaat    1320

gcgtcggtgg tggttttctt tttctccgcc gtcatccatg aactgcttgt cggcatcccc    1380

actcacaaca tcatcggagc cgccttcttc ggcatgatgt cgcaggtgcc tctgatcatg    1440

gctactgaga accttcagca tattaactcc tctctgggcc ccttccttgg caactgtgca    1500

ttctggttca cctttttcct gggacaaccc acttgtgcat tcctttacta tttggcctac    1560

aactacaagc agaaccagta g                                              1581

 

<210>2

<211>8325

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pYDA1

 

<400>2

aaacggtagg ttagtgcttg gtatatgagt tgtaggcatg acaatttgga aaggggtgga    60

ctttgggaat attgtgggat ttcaatacct tagtttgtac agggtaattg ttacaaatga    120

tacaaagaac tgtatttctt ttcatttgtt ttaattggtt gtatatcaag tccgttagac    180

gagctcagtg ccttggcttt tggcactgta tttcattttt agaggtacac tacattcagt    240

gaggtatggt aaggttgagg gcataatgaa ggcaccttgt actgacagtc acagacctct    300

caccgagaat tttatgagat atactcgggt tcattttagg ctcatcgatc aggagagacc    360

gggttggcgg cgtatttgtg tcccaaaaaa cagccccaat tgccccaatt gaccccaaat    420

tgacccagta gcgggcccaa ccccggcgag agcccccttc accccacata tcaaacctcc    480

cccggttccc acacttgccg ttaagggcgt agggtactgc agtctggaat ctacgcttgt    540

tcagactttg tactagtttc tttgtctggc catccgggta acccatgccg gacgcaaaat    600

agactactga aaattttttt gctttgtggt tgggacttta gccaagggta taaaagacca    660

ccgtccccga attacctttc ctcttctttt ctctctctcc ttgtcaactc acacccgaaa    720

tcgttaagca tttccttctg agtataagaa tcattcacca tggaggtccg acgacgaaag    780

atagacgtgc tcaaggccca gaaaaacggc tacgaatcgg gcccaccatc tcgacaatcg    840

tcgcagccct cctcaagagc atcgtccaga acccgcaaca aacactcctc gtccaccctg    900

tcgctcagcg gactgaccat gaaagtccag aagaaacctg cgggaccccc ggcgaactcc    960

aaaacgccat tcctacacat caagcccgtg cacacgtgct gctccacatc aatgctttcg    1020

cgcgattatg acggctccaa ccccagcttc aagggcttca aaaacatcgg catgatcatt    1080

ctcattgtgg gaaatctacg gctcgcattc gaaaactacc tcaaatacgg catttccaac    1140

ccgttcttcg accccaaaat tactccttcc gagtggcagc tctcaggctt gctcatagtc    1200

gtggcctacg cacatatcct catggcctac gctattgaga gcgctgccaa gctgctgttc    1260

ctctctagca aacaccacta catggccgtg gggcttctgc ataccatgaa cactttgtcg    1320

tccatctcgt tgctgtccta cgtcgtctac tactacctgc ccaaccccgt ggcaggcaca    1380

atagtcgagt ttgtggccgt tattctgtct ctcaaactcg cctcatacgc cctcactaac    1440

tcggatctcc gaaaagccgc aattcatgcc cagaagctcg acaagacgca agacgataac    1500

gaaaaggaat ccacctcgtc ttcctcttct tcagatgacg cagagacttt ggcagacatt    1560

gacgtcattc ctgcatacta cgcacagctg ccctaccccc agaatgtgac gctgtcgaac    1620

ctgctgtact tctggtttgc tcccacactg gtctaccagc ccgtgtaccc caagacggag    1680

cgtattcgac ccaagcacgt gatccgaaac ctgtttgagc tcgtctctct gtgcatgctt    1740

attcagtttc tcatcttcca gtacgcctac cccatcatgc agtcgtgtct ggctctgttc    1800

ttccagccca agctcgatta tgccaacatc tccgagcgcc tcatgaagtt ggcctccgtg    1860

tctatgatgg tctggctcat tggattctac gctttcttcc agaacggtct caatcttatt    1920

gccgagctca cctgttttgg aaacagaacc ttctaccagc agtggtggaa ttcccgctcc    1980

attggccagt actggactct atggaacaag ccagtcaacc agtactttag acaccacgtc    2040

tacgtgcctc ttctcgctcg gggcatgtcg cggttcaatg cgtcggtggt ggttttcttt    2100

ttctccgccg tcatccatga actgcttgtc ggcatcccca ctcacaacat catcggagcc    2160

gccttcttcg gcatgatgtc gcaggtgcct ctgatcatgg ctactgagaa ccttcagcat    2220

attaactcct ctctgggccc cttccttggc aactgtgcat tctggttcac ctttttcctg    2280

ggacaaccca cttgtgcatt cctttactat ttggcctaca actacaagca gaaccagtag    2340

cggccgcaag tgtggatggg gaagtgagtg cccggttctg tgtgcacaat tggcaatcca    2400

agatggatgg attcaacaca gggatatagc gagctacgtg gtggtgcgag gatatagcaa    2460

cggatattta tgtttgacac ttgagaatgt acgatacaag cactgtccaa gtacaatact    2520

aaacatactg tacatactca tactcgtacc cgggcaacgg tttcacttga gtgcagtggc    2580

tagtgctctt actcgtacag tgtgcaatac tgcgtatcat agtctttgat gtatatcgta    2640

ttcattcatg ttagttgcgt acgggcgtcg ttgcttgtgt gatttttgag gacccatccc    2700

tttggtatat aagtatactc tggggttaag gttgcccgtg tagtctaggt tatagttttc    2760

atgtgaaata ccgagagccg agggagaata aacgggggta tttggacttg tttttttcgc    2820

ggaaaagcgt cgaatcaacc ctgcgggcct tgcaccatgt ccacgacgtg tttctcgccc    2880

caattcgccc cttgcacgtc aaaattaggc ctccatctag acccctccat aacatgtgac    2940

tgtggggaaa agtataaggg aaaccatgca accatagacg acgtgaaaga cggggaggaa    3000

ccaatggagg ccaaagaaat ggggtagcaa cagtccagga gacagacaag gagacaagga    3060

gagggcgccc gaaagatcgg aaaaacaaac atgtccaatt ggggcagtga cggaaacgac    3120

acggacactt cagtacaatg gaccgaccat ctccaagcca gggttattcc ggtatcacct    3180

tggccgtaac ctcccgctgg tacctgatat tgtacacgtt cacattcaat atactttcag    3240

ctacaataag agaggctgtt tgtcgggcat gtgtgtccgt cgtatggggt gatgtccgag    3300

ggcgaaattc gctacaagct taactctggc gcttgtccag tatgaataga caagtcaaga    3360

ccagtggtgc catgattgac agggaggtac aagacttcga tactcgagca ttactcggac    3420

ttgtggcgat tgaacagacg ggcgatcgct tctcccccgt attgccggcg cgccagctgc    3480

attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt    3540

cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact    3600

caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag    3660

caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata    3720

ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc    3780

cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg    3840

ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc    3900

tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg    3960

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc    4020

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga    4080

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg    4140

gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa    4200

aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg    4260

tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt    4320

ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat    4380

tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct    4440

aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta    4500

tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa    4560

ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac    4620

gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa    4680

gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag    4740

taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg    4800

tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag    4860

ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg    4920

tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc    4980

ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat    5040

tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata    5100

ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa    5160

aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca    5220

actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc    5280

aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc    5340

tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg    5400

aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac    5460

ctgatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggaaattg    5520

taagcgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta    5580

accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt    5640

tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca    5700

aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa    5760

gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat    5820

ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag    5880

gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg    5940

ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg    6000

ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc    6060

tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac    6120

ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgcgct    6180

gatgacactt tggtctgaaa gagatgcatt ttgaatccca aacttgcagt gcccaagtga    6240

catacatctc cgcgttttgg aaaatgttca gaaacagttg attgtgttgg aatggggaat    6300

ggggaatgga aaaatgactc aagtatcaat tccaaaaact tctctggctg gcagtaccta    6360

ctgtccatac tactgcattt tctccagtca ggccactcta tactcgacga cacagtagta    6420

aaacccagat aatttcgaca taaacaagaa aacagaccca ataatattta tatatagtca    6480

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aaatatattc caatattttt aattcttaat ctcatttatt ttattctagc gaaatacatt    6600

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catatggcat tcgtgctcgc ttgttcacgt attcttcctg ttccatctct tggccgacaa    6720

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<210>3

<211>7518

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pY75

 

<400>3

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atgtgagtta cctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctccta    6720

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acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctc caccgcggga    6840

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tttaagaagt ttaagaaata gatttacaga attacaatca atacctaccg tctttatata    6960

cttattagtc aagtagggga ataatttcag ggaactggtt tcaacctttt ttttcagctt    7020

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<210>4

<211>9109

<212>DNA

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<220>

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gtcgttttgc caggtgacca cgttggtcaa gaaatcacag ccgaagccat taaggttctt    3120

aaagctattt ctgatgttcg ttccaatgtc aagttcgatt tcgaaaatca tttaattggt    3180

ggtgctgcta tcgatgctac aggtgtccca cttccagatg aggcgctgga agcctccaag    3240

aaggttgatg ccgttttgtt aggtgctgtg gctggtccta aatggggtac cggtagtgtt    3300

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ccatgtaact ttgcatccga ctctctttta gacttatctc caatcaagcc acaatttgct    3420

aaaggtactg acttcgttgt tgtcagagaa ttagtgggag gtatttactt tggtaagaga    3480

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caaagaatca caagaatggc cgctttcatg gccctacaac atgagccacc attgcctatt    3600

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acgaaattac aaaatggaat atgttcatag ggtagacgaa actatatacg caatctacat    4260

acatttatca agaaggagaa aaaggaggat agtaaaggaa tacaggtaag caaattgata    4320

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gaatgggata atatcacagg aggtactaga ctacctttca tcctacataa atagacgcat    5040

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cgcttccaca aacattgctc aaaagtatct ctttgctata tatctctgtg ctatatccct    5400

atataaccta cccatccacc tttcgctcct tgaacttgca tctaaactcg acctctacat    5460

tttttatgtt tatctctagt attactcttt agacaaaaaa attgtagtaa gaactattca    5520

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cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg    6360

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tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta    7260

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tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt    7380

tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt    7440

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tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg    8040

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caggcaggtt gcatcactcc attgaggttg tgcccgtttt ttgcctgttt gtgcccctgt    8760

tctctgtagt tgcgctaaga gaatggacct atgaactgat ggttggtgaa gaaaacaata    8820

ttttggtgct gggattcttt ttttttctgg atgccagctt aaaaagcggg ctccattata    8880

tttagtggat gccaggaata aactgttcac ccagacacct acgatgttat atattctgtg    8940

taacccgccc cctattttgg gcatgtacgg gttacagcag aattaaaagg ctaatttttt    9000

gactaaataa agttaggaaa atcactacta ttaattattt acgtattctt tgaaatggca    9060

gtattgataa tgataaactc gaaatcacta gtggatccgc ccagcggcc                9109

 

<210>5

<211>6849

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pRS425

 

<400>5

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca    60

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ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc    180

accatatcga ctacgtcgta aggccgtttc tgacagagta aaattcttga gggaactttc    240

accattatgg gaaatgcttc aagaaggtat tgacttaaac tccatcaaat ggtcaggtca    300

ttgagtgttt tttatttgtt gtattttttt ttttttagag aaaatcctcc aatatcaaat    360

taggaatcgt agtttcatga ttttctgtta cacctaactt tttgtgtggt gccctcctcc    420

ttgtcaatat taatgttaaa gtgcaattct ttttccttat cacgttgagc cattagtatc    480

aatttgctta cctgtattcc tttactatcc tcctttttct ccttcttgat aaatgtatgt    540

agattgcgta tatagtttcg tctaccctat gaacatattc cattttgtaa tttcgtgtcg    600

tttctattat gaatttcatt tataaagttt atgtacaaat atcataaaaa aagagaatct    660

ttttaagcaa ggattttctt aacttcttcg gcgacagcat caccgacttc ggtggtactg    720

ttggaaccac ctaaatcacc agttctgata cctgcatcca aaaccttttt aactgcatct    780

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aattgtggct tgattggaga taagtctaaa agagagtcgg atgcaaagtt acatggtctt    1440

aagttggcgt acaattgaag ttctttacgg atttttagta aaccttgttc aggtctaaca    1500

ctaccggtac cccatttagg accagccaca gcacctaaca aaacggcatc aaccttcttg    1560

gaggcttcca gcgcctcatc tggaagtggg acacctgtag catcgatagc agcaccacca    1620

attaaatgat tttcgaaatc gaacttgaca ttggaacgaa catcagaaat agctttaaga    1680

accttaatgg cttcggctgt gatttcttga ccaacgtggt cacctggcaa aacgacgatc    1740

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tattgctgaa atgtaaaagg taagaaaagt tagaaagtaa gacgattgct aaccacctat    1860

tggaaaaaac aataggtcct taaataatat tgtcaacttc aagtattgtg atgcaagcat    1920

ttagtcatga acgcttctct attctatatg aaaagccggt tccggcctct cacctttcct    1980

ttttctccca atttttcagt tgaaaaaggt atatgcgtca ggcgacctct gaaattaaca    2040

aaaaatttcc agtcatcgaa tttgattctg tgcgatagcg cccctgtgtg ttctcgttat    2100

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gtattcccac agttaactgc ggtcaagata tttcttgaat caggcgcctt agaccgctcg    2220

gccaaacaac caattacttg ttgagaaata gagtataatt atcctataaa tataacgttt    2280

ttgaacacac atgaacaagg aagtacagga caattgattt tgaagagaat gtggattttg    2340

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taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa    2580

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cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg    3480

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ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac    3600

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ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca    3720

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc    3780

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata    3840

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tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat    5400

aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgaa cgaagcatct gtgcttcatt    5460

ttgtagaaca aaaatgcaac gcgagagcgc taatttttca aacaaagaat ctgagctgca    5520

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catttttgta aaacaaaaat gcaacgcgag agcgctaatt tttcaaacaa agaatctgag    5640

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tcaagataaa ggcatccccg attatattct ataccgatgt ggattgcgca tactttgtga    6000

acagaaagtg atagcgttga tgattcttca ttggtcagaa aattatgaac ggtttcttct    6060

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ctctatgaat agttcttact acaatttttt tgtctaaaga gtaatactag agataaacat    6180

aaaaaatgta gaggtcgagt ttagatgcaa gttcaaggag cgaaaggtgg atgggtaggt    6240

tatataggga tatagcacag agatatatag caaagagata cttttgagca atgtttgtgg    6300

aagcggtatt cgcaatattt tagtagctcg ttacagtccg gtgcgttttt ggttttttga    6360

aagtgcgtct tcagagcgct tttggttttc aaaagcgctc tgaagttcct atactttcta    6420

gagaatagga acttcggaat aggaacttca aagcgtttcc gaaaacgagc gcttccgaaa    6480

atgcaacgcg agctgcgcac atacagctca ctgttcacgt cgcacctata tctgcgtgtt    6540

gcctgtatat atatatacat gagaagaacg gcatagtgcg tgtttatgct taaatgcgta    6600

cttatatgcg tctatttatg taggatgaaa ggtagtctag tacctcctgt gatattatcc    6660

cattccatgc ggggtatcgt atgcttcctt cagcactacc ctttagctgt tctatatgct    6720

gccactcctc aattggatta gtctcatcct tcaatgctat catttccttt gatattggat    6780

catactaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc    6840

cctttcgtc                                                            6849

 

<210>6

<211>7494

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pGPD425

 

<400>6

ggtggagctc cagcttttgt tccctttagt gagggttaat tgcgcgcttg gcgtaatcat    60

ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacataggag    120

ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gaggtaactc acattaattg    180

cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa    240

tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca    300

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg    360

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc    420

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc    480

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac    540

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc    600

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata    660

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc    720

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca    780

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag    840

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta    900

gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg    960

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc    1020

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt    1080

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa    1140

ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat    1200

atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga    1260

tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac    1320

gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg    1380

ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg    1440

caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt    1500

cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct    1560

cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat    1620

cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta    1680

agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca    1740

tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat    1800

agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac    1860

atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa    1920

ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt    1980

cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg    2040

caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat    2100

attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt    2160

agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgaacgaa    2220

gcatctgtgc ttcattttgt agaacaaaaa tgcaacgcga gagcgctaat ttttcaaaca    2280

aagaatctga gctgcatttt tacagaacag aaatgcaacg cgaaagcgct attttaccaa    2340

cgaagaatct gtgcttcatt tttgtaaaac aaaaatgcaa cgcgagagcg ctaatttttc    2400

aaacaaagaa tctgagctgc atttttacag aacagaaatg caacgcgaga gcgctatttt    2460

accaacaaag aatctatact tcttttttgt tctacaaaaa tgcatcccga gagcgctatt    2520

tttctaacaa agcatcttag attacttttt ttctcctttg tgcgctctat aatgcagtct    2580

cttgataact ttttgcactg taggtccgtt aaggttagaa gaaggctact ttggtgtcta    2640

ttttctcttc cataaaaaaa gcctgactcc acttcccgcg tttactgatt actagcgaag    2700

ctgcgggtgc attttttcaa gataaaggca tccccgatta tattctatac cgatgtggat    2760

tgcgcatact ttgtgaacag aaagtgatag cgttgatgat tcttcattgg tcagaaaatt    2820

atgaacggtt tcttctattt tgtctctata tactacgtat aggaaatgtt tacattttcg    2880

tattgttttc gattcactct atgaatagtt cttactacaa tttttttgtc taaagagtaa    2940

tactagagat aaacataaaa aatgtagagg tcgagtttag atgcaagttc aaggagcgaa    3000

aggtggatgg gtaggttata tagggatata gcacagagat atatagcaaa gagatacttt    3060

tgagcaatgt ttgtggaagc ggtattcgca atattttagt agctcgttac agtccggtgc    3120

gtttttggtt ttttgaaagt gcgtcttcag agcgcttttg gttttcaaaa gcgctctgaa    3180

gttcctatac tttctagaga ataggaactt cggaatagga acttcaaagc gtttccgaaa    3240

acgagcgctt ccgaaaatgc aacgcgagct gcgcacatac agctcactgt tcacgtcgca    3300

cctatatctg cgtgttgcct gtatatatat atacatgaga agaacggcat agtgcgtgtt    3360

tatgcttaaa tgcgtactta tatgcgtcta tttatgtagg atgaaaggta gtctagtacc    3420

tcctgtgata ttatcccatt ccatgcgggg tatcgtatgc ttccttcagc actacccttt    3480

agctgttcta tatgctgcca ctcctcaatt ggattagtct catccttcaa tgctatcatt    3540

tcctttgata ttggatcata ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat    3600

aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga    3660

cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa    3720

gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca    3780

tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atcgactacg tcgtaaggcc gtttctgaca    3840

gagtaaaatt cttgagggaa ctttcaccat tatgggaaat gcttcaagaa ggtattgact    3900

taaactccat caaatggtca ggtcattgag tgttttttat ttgttgtatt tttttttttt    3960

tagagaaaat cctccaatat caaattagga atcgtagttt catgattttc tgttacacct    4020

aactttttgt gtggtgccct cctccttgtc aatattaatg ttaaagtgca attctttttc    4080

cttatcacgt tgagccatta gtatcaattt gcttacctgt attcctttac tatcctcctt    4140

tttctccttc ttgataaatg tatgtagatt gcgtatatag tttcgtctac cctatgaaca    4200

tattccattt tgtaatttcg tgtcgtttct attatgaatt tcatttataa agtttatgta    4260

caaatatcat aaaaaaagag aatcttttta agcaaggatt ttcttaactt cttcggcgac    4320

agcatcaccg acttcggtgg tactgttgga accacctaaa tcaccagttc tgatacctgc    4380

atccaaaacc tttttaactg catcttcaat ggccttacct tcttcaggca agttcaatga    4440

caatttcaac atcattgcag cagacaagat agtggcgata gggtcaacct tattctttgg    4500

caaatctgga gcagaaccgt ggcatggttc gtacaaacca aatgcggtgt tcttgtctgg    4560

caaagaggcc aaggacgcag atggcaacaa acccaaggaa cctgggataa cggaggcttc    4620

atcggagatg atatcaccaa acatgttgct ggtgattata ataccattta ggtgggttgg    4680

gttcttaact aggatcatgg cggcagaatc aatcaattga tgttgaacct tcaatgtagg    4740

gaattcgttc ttgatggttt cctccacagt ttttctccat aatcttgaag aggccaaaag    4800

attagcttta tccaaggacc aaataggcaa tggtggctca tgttgtaggg ccatgaaagc    4860

ggccattctt gtgattcttt gcacttctgg aacggtgtat tgttcactat cccaagcgac    4920

accatcacca tcgtcttcct ttctcttacc aaagtaaata cctcccacta attctctgac    4980

aacaacgaag tcagtacctt tagcaaattg tggcttgatt ggagataagt ctaaaagaga    5040

gtcggatgca aagttacatg gtcttaagtt ggcgtacaat tgaagttctt tacggatttt    5100

tagtaaacct tgttcaggtc taacactacc ggtaccccat ttaggaccag ccacagcacc    5160

taacaaaacg gcatcaacct tcttggaggc ttccagcgcc tcatctggaa gtgggacacc    5220

tgtagcatcg atagcagcac caccaattaa atgattttcg aaatcgaact tgacattgga    5280

acgaacatca gaaatagctt taagaacctt aatggcttcg gctgtgattt cttgaccaac    5340

gtggtcacct ggcaaaacga cgatcttctt aggggcagac ataggggcag acattagaat    5400

ggtatatcct tgaaatatat atatatattg ctgaaatgta aaaggtaaga aaagttagaa    5460

agtaagacga ttgctaacca cctattggaa aaaacaatag gtccttaaat aatattgtca    5520

acttcaagta ttgtgatgca agcatttagt catgaacgct tctctattct atatgaaaag    5580

ccggttccgg cctctcacct ttcctttttc tcccaatttt tcagttgaaa aaggtatatg    5640

cgtcaggcga cctctgaaat taacaaaaaa tttccagtca tcgaatttga ttctgtgcga    5700

tagcgcccct gtgtgttctc gttatgttga ggaaaaaaat aatggttgct aagagattcg    5760

aactcttgca tcttacgata cctgagtatt cccacagtta actgcggtca agatatttct    5820

tgaatcaggc gccttagacc gctcggccaa acaaccaatt acttgttgag aaatagagta    5880

taattatcct ataaatataa cgtttttgaa cacacatgaa caaggaagta caggacaatt    5940

gattttgaag agaatgtgga ttttgatgta attgttggga ttccattttt aataaggcaa    6000

taatattagg tatgtggata tactagaagt tctcctcgac cgtcgatatg cggtgtgaaa    6060

taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggaa attgtaaacg ttaatatttt    6120

gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat    6180

cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt    6240

ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt    6300

ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag    6360

gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg    6420

aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc    6480

gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc    6540

gctacagggc gcgtcgcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc    6600

ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt    6660

aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgagcg    6720

cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt gggtaccggg ccccccctcg aggtcgacgg    6780

tatcgataag cttgatatcg aattcctgca gcccggggga tccactagtg atttcgagtt    6840

tatcattatc aatactgcca tttcaaagaa tacgtaaata attaatagta gtgattttcc    6900

taactttatt tagtcaaaaa attagccttt taattctgct gtaacccgta catgcccaaa    6960

atagggggcg ggttacacag aatatataac atcgtaggtg tctgggtgaa cagtttattc    7020

ctggcatcca ctaaatataa tggagcccgc tttttaagct ggcatccaga aaaaaaaaga    7080

atcccagcac caaaatattg ttttcttcac caaccatcag ttcataggtc cattctctta    7140

gcgcaactac agagaacagg ggcacaaaca ggcaaaaaac gggcacaacc tcaatggagt    7200

gatgcaacct gcctggagta aatgatgaca caaggcaatt gacccacgca tgtatctatc    7260

tcattttctt acaccttcta ttaccttctg ctctctctga tttggaaaaa gctgaaaaaa    7320

aaggttgaaa ccagttccct gaaattattc ccctacttga ctaataagta tataaagacg    7380

gtaggtattg attgtaattc tgtaaatcta tttcttaaac ttcttaaatt ctacttttat    7440

agttagtctt ttttttagtt ttaaaacacc aagaacttag tttcgaaatc ccgc          7494

 

<210>7

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒oYLDGAT2-1

 

<400>7

gcggccgcat gactatcgac tcacaatact acaagt                              36

 

<210>8

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒oYLDGAT2-2

 

<400>8

gcggccgctt actcaatcat tcggaactct ggggct                              36

 

<210>9

<211>1545

<212>DNA

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>9

atgactatcg actcacaata ctacaagtcg cgagacaaaa acgacacggc acccaaaatc    60

gcgggaatcc gatatgcccc gctatcgaca ccattactca accgatgtga gaccttctct    120

ctggtctggc acattttcag cattcccact ttcctcacaa ttttcatgct atgctgcgca    180

attccactgc tctggccatt tgtgattgcg tatgtagtgt acgctgttaa agacgactcc    240

ccgtccaacg gaggagtggt caagcgatac tcgcctattt caagaaactt cttcatctgg    300

aagctctttg gccgctactt ccccataact ctgcacaaga cggtggatct ggagcccacg    360

cacacatact accctctgga cgtccaggag tatcacctga ttgctgagag atactggccg    420

cagaacaagt acctccgagc aatcatcacc accatcgagt actttctgcc cgccttcatg    480

aaacggtctc tttctatcaa cgagcaggag cagcctgccg agcgagatcc tctcctgtct    540

cccgtttctc ccagctctcc gggttctcaa cctgacaagt ggattaacca cgacagcaga    600

tatagccgtg gagaatcatc tggctccaac ggccacgcct cgggctccga acttaacggc    660

aacggcaaca acggcaccac taaccgacga cctttgtcgt ccgcctctgc tggctccact    720

gcatctgatt ccacgcttct taacgggtcc ctcaactcct acgccaacca gatcattggc    780

gaaaacgacc cacagctgtc gcccacaaaa ctcaagccca ctggcagaaa atacatcttc    840

ggctaccacc cccacggcat tatcggcatg ggagcctttg gtggaattgc caccgaggga    900

gctggatggt ccaagctctt tccgggcatc cctgtttctc ttatgactct caccaacaac    960

ttccgagtgc ctctctacag agagtacctc atgagtctgg gagtcgcttc tgtctccaag    1020

aagtcctgca aggccctcct caagcgaaac cagtctatct gcattgtcgt tggtggagca    1080

caggaaagtc ttctggccag acccggtgtc atggacctgg tgctactcaa gcgaaagggt    1140

tttgttcgac ttggtatgga ggtcggaaat gtcgcccttg ttcccatcat ggcctttggt    1200

gagaacgacc tctatgacca ggttagcaac gacaagtcgt ccaagctgta ccgattccag    1260

cagtttgtca agaacttcct tggattcacc cttcctttga tgcatgcccg aggcgtcttc    1320

aactacgatg tcggtcttgt cccctacagg cgacccgtca acattgtggt tggttccccc    1380

attgacttgc cttatctccc acaccccacc gacgaagaag tgtccgaata ccacgaccga    1440

tacatcgccg agctgcagcg aatctacaac gagcacaagg atgaatattt catcgattgg    1500

accgaggagg gcaaaggagc cccagagttc cgaatgattg agtaa                    1545

 

<210>10

<211>514

<212>PRT

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>10

Met Thr Ile Asp Ser Gln Tyr Tyr Lys Set Arg Asp Lys Asn Asp Thr

1               5                   10                  15

Ala Pro Lys Ile Ala Gly Ile Arg Tyr Ala Pro Leu Ser Thr Pro Leu

            20                  25                  30

Leu Asn Arg Cys Glu Thr Phe Ser Leu Val Trp His Ile Phe Ser Ile

        35                  40                  45

Pro Thr Phe Leu Thr Ile Phe Met Leu Cys Cys Ala Ile Pro Leu Leu

    50                  55                  60

Trp Pro Phe Val Ile Ala Tyr Val Val Tyr Ala Val Lys Asp Asp Ser

65                  70                  75                  80

Pro Ser Asn Gly Gly Val Val Lys Arg Tyr Ser Pro Ile Ser Arg Asn

                85                  90                  95

Phe Phe Ile Trp Lys Leu Phe Gly Arg Tyr Phe Pro Ile Thr Leu His

            100                 105                 110

Lys Thr Val Asp Leu Glu Pro Thr His Thr Tyr Tyr Pro Leu Asp Val

        115                 120                 125

Gln Glu Tyr His Leu Ile Ala Glu Arg Tyr Trp Pro Gln Asn Lys Tyr

    130                 135                 140

Leu Arg Ala Ile Ile Thr Thr Ile Glu Tyr Phe Leu Pro Ala Phe Met

145                 150                 155                 160

Lys Arg Set Leu Ser Ile Asn Glu Gln Glu Gln Pro Ala Glu Arg Asp

                165                 170                 175

Pro Leu Leu Ser Pro Val Ser Pro Ser Ser Pro Gly Ser Gln Pro Asp

            180                 185                 190

Lys Trp Ile Asn His Asp Ser Arg Tyr Ser Arg Gly Glu Ser Ser Gly

        195                 200                 205

Ser Asn Gly His Ala Ser Gly Ser Glu Leu Asn Gly Asn Gly Asn Asn

    210                 215                 220

Gly Thr Thr Asn Arg Arg Pro Leu Ser Ser Ala Ser Ala Gly Ser Thr

225                 230                 235                 240

Ala Ser Asp Ser Thr Leu Leu Asn Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Ala Asn

                245                 250                 255

Gln Ile Ile Gly Glu Asn Asp Pro Gln Leu Ser Pro Thr Lys Leu Lys

            260                 265                 270

Pro Thr Gly Arg Lys Tyr Ile Phe Gly Tyr His Pro His Gly Ile Ile

        275                 280                 285

Gly Met Gly Ala Phe Gly Gly Ile Ala Thr Glu Gly Ala Gly Trp Ser

    290                 295                 300

Lys Leu Phe Pro Gly Ile Pro Val Ser Leu Met Thr Leu Thr Asn Asn

305                 310                 315                 320

Phe Arg Val Pro Leu Tyr Arg Glu Tyr Leu Met Ser Leu Gly Val Ala

                325                 330                 335

Ser Val Ser Lys Lys Ser Cys Lys Ala Leu Leu Lys Arg Asn Gln Ser

            340                 345                 350

Ile Cys Ile Val Val Gly Gly Ala Gln Glu Ser Leu Leu Ala Arg Pro

        355                 360                 365

Gly Val Met Asp Leu Val Leu Leu Lys Arg Lys Gly Phe Val Arg Leu

    370                 375                 380

Gly Met Glu Val Gly Asn Val Ala Leu Val Pro Ile Met Ala Phe Gly

385                 390                 395                 400

Glu Asn Asp Leu Tyr Asp Gln Val Ser Asn Asp Lys Ser Ser Lys Leu

                405                 410                 415

Tyr Arg Phe Gln Gln Phe Val Lys Asn Phe Leu Gly Phe Thr Leu Pro

            420                 425                 430

Leu Met His Ala Arg Gly Val Phe Asn Tyr Asp Val Gly Leu Val Pro

        435                 440                 445

Tyr Arg Arg Pro Val Asn Ile Val Val Gly Ser Pro Ile Asp Leu Pro

    450                 455                 460

Tyr Leu Pro His Pro Thr Asp Glu Glu Val Ser Glu Tyr His Asp Arg

465                 470                 475                 480

Tyr Ile Ala Glu Leu Gln Arg Ile Tyr Asn Glu His Lys Asp Glu Tyr

                485                 490                 495

Phe Ile Asp Trp Thr Glu Glu Gly Lys Gly Ala Pro Glu Phe Arg Met

            500                 505                 510

Ile Glu

 

<210>11

<211>9070

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pY75 YLDGAT2

 

<400>11

ggccgcaggg cggatccccc gggctgcagg aattcgatat caagcttatc gataccgtcg    60

acctcgaggg ggggcccggt acccaattcg ccctatagtg agtcgtatta cgcgcgctca    120

ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc    180

cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc    240

ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcg acgcgccctg tagcggcgca    300

ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta    360

gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt    420

caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac    480

cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt    540

tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga    600

acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg    660

gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata    720

ttaacgttta caatttcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac    780

accgcatatc gacggtcgag gagaacttct agtatatcca catacctaat attattgcct    840

tattaaaaat ggaatcccaa caattacatc aaaatccaca ttctcttcaa aatcaattgt    900

cctgtacttc cttgttcatg tgtgttcaaa aacgttatat ttataggata attatactct    960

atttctcaac aagtaattgg ttgtttggcc gagcggtcta aggcgcctga ttcaagaaat    1020

atcttgaccg cagttaactg tgggaatact caggtatcgt aagatgcaag agttcgaatc    1080

tcttagcaac cattattttt ttcctcaaca taacgagaac acacaggggc gctatcgcac    1140

agaatcaaat tcgatgactg gaaatttttt gttaatttca gaggtcgcct gacgcatata    1200

cctttttcaa ctgaaaaatt gggagaaaaa ggaaaggtga gaggccggaa ccggcttttc    1260

atatagaata gagaagcgtt catgactaaa tgcttgcatc acaatacttg aagttgacaa    1320

tattatttaa ggacctattg ttttttccaa taggtggtta gcaatcgtct tactttctaa    1380

cttttcttac cttttacatt tcagcaatat atatatatat ttcaaggata taccattcta    1440

atgtctgccc ctatgtctgc ccctaagaag atcgtcgttt tgccaggtga ccacgttggt    1500

caagaaatca cagccgaagc cattaaggtt cttaaagcta tttctgatgt tcgttccaat    1560

gtcaagttcg atttcgaaaa tcatttaatt ggtggtgctg ctatcgatgc tacaggtgtc    1620

ccacttccag atgaggcgct ggaagcctcc aagaaggttg atgccgtttt gttaggtgct    1680

gtggctggtc ctaaatgggg taccggtagt gttagacctg aacaaggttt actaaaaatc    1740

cgtaaagaac ttcaattgta cgccaactta agaccatgta actttgcatc cgactctctt    1800

ttagacttat ctccaatcaa gccacaattt gctaaaggta ctgacttcgt tgttgtcaga    1860

gaattagtgg gaggtattta ctttggtaag agaaaggaag acgatggtga tggtgtcgct    1920

tgggatagtg aacaatacac cgttccagaa gtgcaaagaa tcacaagaat ggccgctttc    1980

atggccctac aacatgagcc accattgcct atttggtcct tggataaagc taatcttttg    2040

gcctcttcaa gattatggag aaaaactgtg gaggaaacca tcaagaacga attccctaca    2100

ttgaaggttc aacatcaatt gattgattct gccgccatga tcctagttaa gaacccaacc    2160

cacctaaatg gtattataat caccagcaac atgtttggtg atatcatctc cgatgaagcc    2220

tccgttatcc caggttcctt gggtttgttg ccatctgcgt ccttggcctc tttgccagac    2280

aagaacaccg catttggttt gtacgaacca tgccacggtt ctgctccaga tttgccaaag    2340

aataaggttg accctatcgc cactatcttg tctgctgcaa tgatgttgaa attgtcattg    2400

aacttgcctg aagaaggtaa ggccattgaa gatgcagtta aaaaggtttt ggatgcaggt    2460

atcagaactg gtgatttagg tggttccaac agtaccaccg aagtcggtga tgctgtcgcc    2520

gaagaagtta agaaaatcct tgcttaaaaa gattctcttt ttttatgata tttgtacata    2580

aactttataa atgaaattca taatagaaac gacacgaaat tacaaaatgg aatatgttca    2640

tagggtagac gaaactatat acgcaatcta catacattta tcaagaagga gaaaaaggag    2700

gatagtaaag gaatacaggt aagcaaattg atactaatgg ctcaacgtga taaggaaaaa    2760

gaattgcact ttaacattaa tattgacaag gaggagggca ccacacaaaa agttaggtgt    2820

aacagaaaat catgaaacta cgattcctaa tttgatattg gaggattttc tctaaaaaaa    2880

aaaaaataca acaaataaaa aacactcaat gacctgacca tttgatggag tttaagtcaa    2940

taccttcttg aagcatttcc cataatggtg aaagttccct caagaatttt actctgtcag    3000

aaacggcctt acgacgtagt cgatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc    3060

atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct    3120

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag    3180

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt    3240

ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagtatgat ccaatatcaa aggaaatgat    3300

agcattgaag gatgagacta atccaattga ggagtggcag catatagaac agctaaaggg    3360

tagtgctgaa ggaagcatac gataccccgc atggaatggg ataatatcac aggaggtact    3420

agactacctt tcatcctaca taaatagacg catataagta cgcatttaag cataaacacg    3480

cactatgccg ttcttctcat gtatatatat atacaggcaa cacgcagata taggtgcgac    3540

gtgaacagtg agctgtatgt gcgcagctcg cgttgcattt tcggaagcgc tcgttttcgg    3600

aaacgctttg aagttcctat tccgaagttc ctattctcta gaaagtatag gaacttcaga    3660

gcgcttttga aaaccaaaag cgctctgaag acgcactttc aaaaaaccaa aaacgcaccg    3720

gactgtaacg agctactaaa atattgcgaa taccgcttcc acaaacattg ctcaaaagta    3780

tctctttgct atatatctct gtgctatatc cctatataac ctacccatcc acctttcgct    3840

ccttgaactt gcatctaaac tcgacctcta cattttttat gtttatctct agtattactc    3900

tttagacaaa aaaattgtag taagaactat tcatagagtg aatcgaaaac aatacgaaaa    3960

tgtaaacatt tcctatacgt agtatataga gacaaaatag aagaaaccgt tcataatttt    4020

ctgaccaatg aagaatcatc aacgctatca ctttctgttc acaaagtatg cgcaatccac    4080

atcggtatag aatataatcg gggatgcctt tatcttgaaa aaatgcaccc gcagcttcgc    4140

tagtaatcag taaacgcggg aagtggagtc aggctttttt tatggaagag aaaatagaca    4200

ccaaagtagc cttcttctaa ccttaacgga cctacagtgc aaaaagttat caagagactg    4260

cattatagag cgcacaaagg agaaaaaaag taatctaaga tgctttgtta gaaaaatagc    4320

gctctcggga tgcatttttg tagaacaaaa aagaagtata gattctttgt tggtaaaata    4380

gcgctctcgc gttgcatttc tgttctgtaa aaatgcagct cagattcttt gtttgaaaaa    4440

ttagcgctct cgcgttgcat ttttgtttta caaaaatgaa gcacagattc ttcgttggta    4500

aaatagcgct ttcgcgttgc atttctgttc tgtaaaaatg cagctcagat tctttgtttg    4560

aaaaattagc gctctcgcgt tgcatttttg ttctacaaaa tgaagcacag atgcttcgtt    4620

caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac    4680

attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa    4740

aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat    4800

tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc    4860

agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga    4920

gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg    4980

cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc    5040

agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag    5100

taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc    5160

tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg    5220

taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg    5280

acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac    5340

ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac    5400

cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg    5460

agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg    5520

tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg    5580

agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac    5640

tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg    5700

ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg    5760

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc    5820

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc    5880

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt    5940

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc    6000

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact    6060

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac    6120

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag    6180

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg    6240

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg    6300

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga    6360

gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt    6420

ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct    6480

ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg    6540

aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt    6600

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta    6660

atgtgagtta cctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctccta    6720

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt    6780

acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctc caccgcggga    6840

tttcgaaact aagttcttgg tgttttaaaa ctaaaaaaaa gactaactat aaaagtagaa    6900

tttaagaagt ttaagaaata gatttacaga attacaatca atacctaccg tctttatata    6960

cttattagtc aagtagggga ataatttcag ggaactggtt tcaacctttt ttttcagctt    7020

tttccaaatc agagagagca gaaggtaata gaaggtgtaa gaaaatgaga tagatacatg    7080

cgtgggtcaa ttgccttgtg tcatcattta ctccaggcag gttgcatcac tccattgagg    7140

ttgtgcccgt tttttgcctg tttgtgcccc tgttctctgt agttgcgcta agagaatgga    7200

cctatgaact gatggttggt gaagaaaaca atattttggt gctgggattc tttttttttc    7260

tggatgccag cttaaaaagc gggctccatt atatttagtg gatgccagga ataaactgtt    7320

cacccagaca cctacgatgt tatatattct gtgtaacccg ccccctattt tgggcatgta    7380

cgggttacag cagaattaaa aggctaattt tttgactaaa taaagttagg aaaatcacta    7440

ctattaatta tttacgtatt ctttgaaatg gcagtattga taatgataaa ctcgaaatca    7500

ctagtggatc cgcccagcgg ccgcatgact atcgactcac aatactacaa gtcgcgagac    7560

aaaaacgaca cggcacccaa aatcgcggga atccgatatg ccccgctatc gacaccatta    7620

ctcaaccgat gtgagacctt ctctctggtc tggcacattt tcagcattcc cactttcctc    7680

acaattttca tgctatgctg cgcaattcca ctgctctggc catttgtgat tgcgtatgta    7740

gtgtacgctg ttaaagacga ctccccgtcc aacggaggag tggtcaagcg atactcgcct    7800

atttcaagaa acttcttcat ctggaagctc tttggccgct acttccccat aactctgcac    7860

aagacggtgg atctggagcc cacgcacaca tactaccctc tggacgtcca ggagtatcac    7920

ctgattgctg agagatactg gccgcagaac aagtacctcc gagcaatcat ctccaccatc    7980

gagtactttc tgcccgcctt catgaaacgg tctctttcta tcaacgagca ggagcagcct    8040

gccgagcgag atcctctcct gtctcccgtt tctcccagct ctccgggttc tcaacctgac    8100

aagtggatta accacgacag cagatatagc cgtggagaat catctggctc caacggccac    8160

gcctcgggct ccgaacttaa cggcaacggc aacaatggca ccactaaccg acgacctttg    8220

tcgtccgcct ctgctggctc cactgcatct gattccacgc ttcttaacgg gtccctcaac    8280

tcctacgcca accagatcat tggcgaaaac gacccacagc tgtcgcccac aaaactcaag    8340

cccactggca gaaaatacat cttcggctac cacccccacg gcattatcgg catgggagcc    8400

tttggtggaa ttgccaccga gggagctgga tggtccaagc tctttccggg catccctgtt    8460

tctcttatga ctctcaccaa caacttccga gtgcctctct acagagagta cctcatgagt    8520

ctgggagtcg cttctgtctc caagaagtcc tgcaaggccc tcctcaagcg aaaccagtct    8580

atctgcattg tcgttggtgg agcacaggaa agtcttctgg ccagacccgg tgtcatggac    8640

ctggtgctac tcaagcgaaa gggttttgtt cgacttggta tggaggtcgg aaatgtcgcc    8700

cttgttccca tcatggcctt tggtgagaac gacctctatg accaggttag caacgacaag    8760

tcgtccaagc tgtaccgatt ccagcagttt gtcaagaact tccttggatt cacccttcct    8820

ttgatgcatg cccgaggcgt cttcaactac gatgtcggtc ttgtccccta caggcgaccc    8880

gtcaacattg tggttggttc ccccattgac ttgccttatc tcccacaccc caccgacgaa    8940

gaagtgtccg aataccacga ccgatacatc gccgagctgc agcgaatcta caacgagcac    9000

aaggatgaat atttcatcga ttggaccgag gagggcaaag gagcccagag ttccgaatga    9060

ttgagtaagc                                                           9070

 

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物YDGAT1-F

 

<400>12

gatcatccat ggaagtccga cgacgaaaaa tc                                  32

 

<210>13

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物YDGAT1-R

 

<400>13

gatcaagcgg ccgcctactg gttctgcttg tagttg                              36

 

<210>14

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物YDGAT2-F

 

<400>14

gatcatccat ggctatcgac tcacaatact acaag                               35

 

<210>15

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物YDGAT2-R

 

<400>15

gatcatgcgg ccgcttactc aatcattcgg aactctg                             37

 

<210>16

<211>1603

<212>DNA

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>16

gatcatccat ggaagtccga cgacgaaaaa tcgacgtgct caaggcccag aaaaacggct    60

acgaatcggg cccaccatct cgacaatcgt cgcagccctc ctcaagagca tcgtccagaa    120

cccgcaacaa acactcctcg tccaccctgt cgctcagcgg actgaccatg aaagtccaga    180

agaaacctgc gggacccccg gcgaactcca aaacgccatt cctacacatc aagcccgtgc    240

acacgtgctg ctccacatca atgctttcgc gcgattatga cggctccaac cccagcttca    300

agggcttcaa aaacatcggc atgatcattc tcattgtggg aaatctacgg ctcgcattcg    360

aaaactacct caaatacggc atttccaacc cgttcttcga ccccaaaatt actccttccg    420

agtggcagct ctcaggcttg ctcatagtcg tggcctacgc acatatcctc atggcctacg    480

ctattgagag cgctgccaag ctgctgttcc tctctagcaa acaccactac atggccgtgg    540

ggcttctgca taccatgaac actttgtcgt ccatctcgtt gctgtcctac gtcgtctact    600

actacctgcc caaccccgtg gcaggcacaa tagtcgagtt tgtggccgtt attctgtctc    660

tcaaactcgc ctcatacgcc ctcactaact cggatctccg aaaagccgca attcatgccc    720

agaagctcga caagacgcaa gacgataacg aaaaggaatc cacctcgtct tcctcttctt    780

cagatgacgc agagactttg gcagacattg acgtcattcc tgcatactac gcacagctgc    840

cctaccccca gaatgtgacg ctgtcgaacc tgctgtactt ctggtttgct cccacactgg    900

tctaccagcc cgtgtacccc aagacggagc gtattcgacc caagcacgtg atccgaaacc    960

tgtttgagct cgtctctctg tgcatgctta ttcagtttct catcttccag tacgcctacc    1020

ccatcatgca gtcgtgtctg gctctgttct tccagcccaa gctcgattat gccaacatct    1080

ccgagcgcct catgaagttg gcctccgtgt ctatgatggt ctggctcatt ggattctacg    1140

ctttcttcca gaacggtctc aatcttattg ccgagctcac ctgttttgga aacagaacct    1200

tctaccagca gtggtggaat tcccgctcca ttggccagta ctggactcta tggaacaagc    1260

cagtcaacca gtactttaga caccacgtct acgtgcctct tctcgctcgg ggcatgtcgc    1320

ggttcaatgc gtcggtggtg gttttctttt tctccgccgt catccatgaa ctgcttgtcg    1380

gcatccccac tcacaacatc atcggagccg ccttcttcgg catgatgtcg caggtgcctc    1440

tgatcatggc tactgagaac cttcagcata ttaactcctc tctgggcccc ttccttggca    1500

actgtgcatt ctggttcacc tttttcctgg gacaacccac ttgtgcattc ctttattatc    1560

tggcttacaa ctacaagcag aaccagtagg cggccgcttg atc                      1603

 

<210>17

<211>1567

<212>DNA

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>17

gatcatccat ggctatcgac tcacaatact acaagtcgcg agacaaaaac gacacggcac    60

ccaaaatcgc gggaatccga tatgccccgc tatcgacacc attactcaac cgatgtgaga    120

ccttctctct ggtctggcac attttcagca ttcccacttt cctcacaatt ttcatgctat    180

gctgcgcaat tccactgctc tggccatttg tgattgcgta tgtagtgtac gctgttaaag    240

acgactcccc gtccaacgga ggagtggtca agcgatactc gcctatttca agaaacttct    300

tcatctggaa gctctttggc cgctacttcc ccataactct gcacaagacg gtggatctgg    360

agcccacgca cacatactac cctctggacg tccaggagta tcacctgatt gctgagagat    420

actggccgca gaacaagtac ctccgagcaa tcatctccac catcgagtac tttctgcccg    480

ccttcatgaa acggtctctt tctatcaacg agcaggagca gcctgccgag cgagatcctc    540

tcctgtctcc cgtttctccc agctctccgg gttctcaacc tgacaagtgg attaaccacg    600

acagcagata tagccgtgga gaatcatctg gctccaacgg ccacgcctcg ggctccgaac    660

ttaacggcaa cggcaacaat ggcaccacta accgacgacc tttgtcgtcc gcctctgctg    720

gctccactgc atctgattcc acgcttctta acgggtccct caactcctac gccaaccaga    780

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gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg    1380

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cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg    900

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ttatatgtat tatatatata catcatgatg atactgacag tcatgtccca ttgctaaata    3300

gacagactcc atctgccgcc tccaactgat gttctcaata tttaaggggt catctcgcat    3360

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tcctatttag gaaacaattt ataatggcag ttcgttcatt taacaattta tgtagaataa    3540

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ctcatataag tataagtagt tcaacgtatt agcactgtac ccagcatctc cgtatcgaga    4620

aacacaacaa catgccccat tggacagatc atgcggatac acaggttgtg cagtatcata    4680

catactcgat cagacaggtc gtctgaccat catacaagct gaacaagcgc tccatacttg    4740

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<210>20

<211>8532

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pFBAIN-YLDGAT2

 

<400>20

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ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc    3000

ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattgtaa tacgactcac tatagggcga    3060

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ttatatgtat tatatatata catcatgatg atactgacag tcatgtccca ttgctaaata    3300

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tcctatttag gaaacaattt ataatggcag ttcgttcatt taacaattta tgtagaataa    3540

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tgacattcta tcttgcaaat tcaacaatta taataagata taccaaagta gcggtatagt    3900

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ctcatataag tataagtagt tcaacgtatt agcactgtac ccagcatctc cgtatcgaga    4620

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cgtcaacatt gtggttggtt cccccattga cttgccttat ctcccacacc ccaccgacga    8400

agaagtgtcc gaataccacg accgatacat cgccgagctg cagcgaatct acaacgagca    8460

caaggatgaa tatttcatcg attggaccga ggagggcaaa ggagccccag agttccgaat    8520

gattgagtaa gc                                                        8532

 

<210>21

<211>7049

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKS123

 

<400>21

agcttggatc cgtcgacggc gcgcccgatc atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa    60

aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg    120

cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt tgttagcagc cggatcgatc caagctgtac    180

ctcactattc ctttgccctc ggacgagtgc tggggcgtcg gtttccacta tcggcgagta    240

cttctacaca gccatcggtc cagacggccg cgcttctgcg ggcgatttgt gtacgcccga    300

cagtcccggc tccggatcgg acgattgcgt cgcatcgacc ctgcgcccaa gctgcatcat    360

cgaaattgcc gtcaaccaag ctctgataga gttggtcaag accaatgcgg agcatatacg    420

cccggagccg cggcgatcct gcaagctccg gatgcctccg ctcgaagtag cgcgtctgct    480

gctccataca agccaaccac ggcctccaga agaagatgtt ggcgacctcg tattgggaat    540

ccccgaacat cgcctcgctc cagtcaatga ccgctgttat gcggccattg tccgtcagga    600

cattgttgga gccgaaatcc gcgtgcacga ggtgccggac ttcggggcag tcctcggccc    660

aaagcatcag ctcatcgaga gcctgcgcga cggacgcact gacggtgtcg tccatcacag    720

tttgccagtg atacacatgg ggatcagcaa tcgcgcatat gaaatcacgc catgtagtgt    780

attgaccgat tccttgcggt ccgaatgggc cgaacccgct cgtctggcta agatcggccg    840

cagcgatcgc atccatagcc tccgcgaccg gctgcagaac agcgggcagt tcggtttcag    900

gcaggtcttg caacgtgaca ccctgtgcac ggcgggagat gcaataggtc aggctctcgc    960

tgaattcccc aatgtcaagc acttccggaa tcgggagcgc ggccgatgca aagtgccgat    1020

aaacataacg atctttgtag aaaccatcgg cgcagctatt tacccgcagg acatatccac    1080

gccctcctac atcgaagctg aaagcacgag attcttcgcc ctccgagagc tgcatcaggt    1140

cggagacgct gtcgaacttt tcgatcagaa acttctcgac agacgtcgcg gtgagttcag    1200

gcttttccat gggtatatct ccttcttaaa gttaaacaaa attatttcta gagggaaacc    1260

gttgtggtct ccctatagtg agtcgtatta atttcgcggg atcgagatcg atccaattcc    1320

aatcccacaa aaatctgagc ttaacagcac agttgctcct ctcagagcag aatcgggtat    1380

tcaacaccct catatcaact actacgttgt gtataacggt ccacatgccg gtatatacga    1440

tgactggggt tgtacaaagg cggcaacaaa cggcgttccc ggagttgcac acaagaaatt    1500

tgccactatt acagaggcaa gagcagcagc tgacgcgtac acaacaagtc agcaaacaga    1560

caggttgaac ttcatcccca aaggagaagc tcaactcaag cccaagagct ttgctaaggc    1620

cctaacaagc ccaccaaagc aaaaagccca ctggctcacg ctaggaacca aaaggcccag    1680

cagtgatcca gccccaaaag agatctcctt tgccccggag attacaatgg acgatttcct    1740

ctatctttac gatctaggaa ggaagttcga aggtgaaggt gacgacacta tgttcaccac    1800

tgataatgag aaggttagcc tcttcaattt cagaaagaat gctgacccac agatggttag    1860

agaggcctac gcagcaggtc tcatcaagac gatctacccg agtaacaatc tccaggagat    1920

caaatacctt cccaagaagg ttaaagatgc agtcaaaaga ttcaggacta attgcatcaa    1980

gaacacagag aaagacatat ttctcaagat cagaagtact attccagtat ggacgattca    2040

aggcttgctt cataaaccaa ggcaagtaat agagattgga gtctctaaaa aggtagttcc    2100

tactgaatct aaggccatgc atggagtcta agattcaaat cgaggatcta acagaactcg    2160

ccgtgaagac tggcgaacag ttcatacaga gtcttttacg actcaatgac aagaagaaaa    2220

tcttcgtcaa catggtggag cacgacactc tggtctactc caaaaatgtc aaagatacag    2280

tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag gataatttcg ggaaacctcc    2340

tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcgaaag gacagtagaa aaggaaggtg    2400

gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cattcaagat gcctctgccg    2460

acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc    2520

caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgacatctc cactgacgta agggatgacg    2580

cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg    2640

agaggacacg ctcgagctca tttctctatt acttcagcca taacaaaaga actcttttct    2700

cttcttatta aaccatgaaa aagcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga    2760

tcgaaaagtt cgacagcgtc tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg    2820

ctttcagctt cgatgtagga gggcgtggat atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg    2880

gtttctacaa agatcgttat gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg    2940

aagtgcttga cattggggaa ttcagcgaga gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac    3000

agggtgtcac gttgcaagac ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg cagccggtcg    3060

cggaggccat ggatgcgatc gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat    3120

tcggaccgca aggaatcggt caatacacta catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg    3180

atccccatgt gtatcactgg caaactgtga tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc    3240

aggctctcga tgagctgatg ctttgggccg aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc    3300

acgcggattt cggctccaac aatgtcctga cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg    3360

actggagcga ggcgatgttc ggggattccc aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga    3420

ggccgtggtt ggcttgtatg gagcagcaga cgcgctactt cgagcggagg catccggagc    3480

ttgcaggatc gccgcggctc cgggcgtata tgctccgcat tggtcttgac caactctatc    3540

agagcttggt tgacggcaat ttcgatgatg cagcttgggc gcagggtcga tgcgacgcaa    3600

tcgtccgatc cggagccggg actgtcgggc gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg    3660

tctggaccga tggctgtgta gaagtactcg ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc    3720

gtccgagggc aaaggaatag tgaggtacct aaagaaggag tgcgtcgaag cagatcgttc    3780

aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat    3840

catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt    3900

atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga    3960

aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact    4020

agatcgatgt cgaatctgat caacctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc    4080

ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt    4140

cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca    4200

ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa    4260

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat    4320

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc    4380

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc    4440

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt    4500

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac    4560

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg    4620

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca    4680

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc    4740

gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa    4800

accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa    4860

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac    4920

tcacgttaag ggattttggt catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc    4980

tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag    5040

acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca    5100

gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg    5160

agagtgcacc atatggacat attgtcgtta gaacgcggct acaattaata cataacctta    5220

tgtatcatac acatacgatt taggtgacac tatagaacgg cgcgccaagc ttttgatcca    5280

tgcccttcat ttgccgctta ttaattaatt tggtaacagt ccgtactaat cagttactta    5340

tccttccccc atcataatta atcttggtag tctcgaatgc cacaacactg actagtctct    5400

tggatcataa gaaaaagcca aggaacaaaa gaagacaaaa cacaatgaga gtatcctttg    5460

catagcaatg tctaagttca taaaattcaa acaaaaacgc aatcacacac agtggacatc    5520

acttatccac tagctgatca ggatcgccgc gtcaagaaaa aaaaactgga ccccaaaagc    5580

catgcacaac aacacgtact cacaaaggtg tcaatcgagc agcccaaaac attcaccaac    5640

tcaacccatc atgagccctc acatttgttg tttctaaccc aacctcaaac tcgtattctc    5700

ttccgccacc tcatttttgt ttatttcaac acccgtcaaa ctgcatgcca ccccgtggcc    5760

aaatgtccat gcatgttaac aagacctatg actataaata gctgcaatct cggcccaggt    5820

tttcatcatc aagaaccagt tcaatatcct agtacaccgt attaaagaat ttaagatata    5880

ctgcggccgc aagtatgaac taaaatgcat gtaggtgtaa gagctcatgg agagcatgga    5940

atattgtatc cgaccatgta acagtataat aactgagctc catctcactt cttctatgaa    6000

taaacaaagg atgttatgat atattaacac tctatctatg caccttattg ttctatgata    6060

aatttcctct tattattata aatcatctga atcgtgacgg cttatggaat gcttcaaata    6120

gtacaaaaac aaatgtgtac tataagactt tctaaacaat tctaacctta gcattgtgaa    6180

cgagacataa gtgttaagaa gacataacaa ttataatgga agaagtttgt ctccatttat    6240

atattatata ttacccactt atgtattata ttaggatgtt aaggagacat aacaattata    6300

aagagagaag tttgtatcca tttatatatt atatactacc catttatata ttatacttat    6360

ccacttattt aatgtcttta taaggtttga tccatgatat ttctaatatt ttagttgata    6420

tgtatatgaa agggtactat ttgaactctc ttactctgta taaaggttgg atcatcctta    6480

aagtgggtct atttaatttt attgcttctt acagataaaa aaaaaattat gagttggttt    6540

gataaaatat tgaaggattt aaaataataa taaataacat ataatatatg tatataaatt    6600

tattataata taacatttat ctataaaaaa gtaaatattg tcataaatct atacaatcgt    6660

ttagccttgc tggacgaatc tcaattattt aaacgagagt aaacatattt gactttttgg    6720

ttatttaaca aattattatt taacactata tgaaattttt ttttttatca gcaaagaata    6780

aaattaaatt aagaaggaca atggtgtccc aatccttata caaccaactt ccacaagaaa    6840

gtcaagtcag agacaacaaa aaaacaagca aaggaaattt tttaatttga gttgtcttgt    6900

ttgctgcata atttatgcag taaaacacta cacataaccc ttttagcagt agagcaatgg    6960

ttgaccgtgt gcttagcttc ttttatttta tttttttatc agcaaagaat aaataaaata    7020

aaatgagaca cttcagggat gtttcaaca                                      7049

 

<210>22

<211>1098

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>cal a24-4

 

<400>22

aggatcctgc aggcagccaa gaaggttttg gagcgagttc caatctcaaa accgccattc    60

gaatacaatg atctgaagaa agcagtacca ccacattgtt tttcacgacc actttcccga    120

tccttgtatt tcctctttca cgacattatt gtaacatgta tccttttcta cgtagcatca    180

aactacattc atatgctccc tcgtttcctt tcctgcatcg tatggcctgt ttactggatc    240

tcccaaggag tttttctcgg cagattgtgg atgatcggcc acgaatgcgg tcatcatagc    300

ttcagtaatt accgttgggt cgacgataca gtcggttttc taatccatac ggccaccctc    360

actccctatt tttccttcaa atatagccac cgtaatcacc atgcacacac caattccatg    420

gaatacgacg aggttcatat cccgaaacgc aaatcagaag ctctctactt tgaatttctg    480

ggcaacaacc caatcggctt aatgatcacc atgctatgta aactgacttt cggatatgca    540

gcttacatta tgttcaatta cacaggtaag aagcacaaat ctgggggctt agcgagccac    600

ttctacccac aaagccctct ctttaacgac agcgaacgta accatgtttt gttctctgac    660

atcgggattt gcatcgtctt gtacgcgtgt taccgtattg tgacggtcac aggggcaatg    720

ccggcatttt atgtgtacgg tattccttgg gttataatga gtgctattct ctttgcagca    780

acttatttac aacacactca tccttcaatc cctcattatg atacaacgga gtggaactgg    840

cttagagggg ctttatcgac aattgataga gatttagggt tcttcaacat gaacaaaaca    900

cattatcatg ttatccacca tttgtttcct gtcattccgg aataccatgc acaagaggca    960

accgaggcca tcaagcccat cttaggtcaa tattacaagt atgatggtac tccgtttcta    1020

aaggccttgt ggagagaaat gaaggagtgt atttatgtag aatccgatga aggtcagaag    1080

aaacctgcag gagatctt                                                  1098

 

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物oCal-15

 

<400>23

aggatcctgc aggcagccaa gaaggttttg                                     30

 

<210>24

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物oCal-6

 

<400>24

aagatctcct gcaggtttct tctgacctc                                      29

 

<210>25

<211>8138

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR53B

 

<400>25

gatccgtcga cggcgcgccc gatcatccgg atatagttcc tcctttcagc aaaaaacccc    60

tcaagacccg tttagaggcc ccaaggggtt atgctagtta ttgctcagcg gtggcagcag    120

ccaactcagc ttcctttcgg gctttgttag cagccggatc gatccaagct gtacctcact    180

attcctttgc cctcggacga gtgctggggc gtcggtttcc actatcggcg agtacttcta    240

cacagccatc ggtccagacg gccgcgcttc tgcgggcgat ttgtgtacgc ccgacagtcc    300

cggctccgga tcggacgatt gcgtcgcatc gaccctgcgc ccaagctgca tcatcgaaat    360

tgccgtcaac caagctctga tagagttggt caagaccaat gcggagcata tacgcccgga    420

gccgcggcga tcctgcaagc tccggatgcc tccgctcgaa gtagcgcgtc tgctgctcca    480

tacaagccaa ccacggcctc cagaagaaga tgttggcgac ctcgtattgg gaatccccga    540

acatcgcctc gctccagtca atgaccgctg ttatgcggcc attgtccgtc aggacattgt    600

tggagccgaa atccgcgtgc acgaggtgcc ggacttcggg gcagtcctcg gcccaaagca    660

tcagctcatc gagagcctgc gcgacggacg cactgacggt gtcgtccatc acagtttgcc    720

agtgatacac atggggatca gcaatcgcgc atatgaaatc acgccatgta gtgtattgac    780

cgattccttg cggtccgaat gggccgaacc cgctcgtctg gctaagatcg gccgcagcga    840

tcgcatccat agcctccgcg accggctgca gaacagcggg cagttcggtt tcaggcaggt    900

cttgcaacgt gacaccctgt gcacggcggg agatgcaata ggtcaggctc tcgctgaatt    960

ccccaatgtc aagcacttcc ggaatcggga gcgcggccga tgcaaagtgc cgataaacat    1020

aacgatcttt gtagaaacca tcggcgcagc tatttacccg caggacatat ccacgccctc    1080

ctacatcgaa gctgaaagca cgagattctt cgccctccga gagctgcatc aggtcggaga    1140

cgctgtcgaa cttttcgatc agaaacttct cgacagacgt cgcggtgagt tcaggctttt    1200

ccatgggtat atctccttct taaagttaaa caaaattatt tctagaggga aaccgttgtg    1260

gtctccctat agtgagtcgt attaatttcg cgggatcgag atcgatccaa ttccaatccc    1320

acaaaaatct gagcttaaca gcacagttgc tcctctcaga gcagaatcgg gtattcaaca    1380

ccctcatatc aactactacg ttgtgtataa cggtccacat gccggtatat acgatgactg    1440

gggttgtaca aaggcggcaa caaacggcgt tcccggagtt gcacacaaga aatttgccac    1500

tattacagag gcaagagcag cagctgacgc gtacacaaca agtcagcaaa cagacaggtt    1560

gaacttcatc cccaaaggag aagctcaact caagcccaag agctttgcta aggccctaac    1620

aagcccacca aagcaaaaag cccactggct cacgctagga accaaaaggc ccagcagtga    1680

tccagcccca aaagagatct cctttgcccc ggagattaca atggacgatt tcctctatct    1740

ttacgatcta ggaaggaagt tcgaaggtga aggtgacgac actatgttca ccactgataa    1800

tgagaaggtt agcctcttca atttcagaaa gaatgctgac ccacagatgg ttagagaggc    1860

ctacgcagca ggtctcatca agacgatcta cccgagtaac aatctccagg agatcaaata    1920

ccttcccaag aaggttaaag atgcagtcaa aagattcagg actaattgca tcaagaacac    1980

agagaaagac atatttctca agatcagaag tactattcca gtatggacga ttcaaggctt    2040

gcttcataaa ccaaggcaag taatagagat tggagtctct aaaaaggtag ttcctactga    2100

atctaaggcc atgcatggag tctaagattc aaatcgagga tctaacagaa ctcgccgtga    2160

agactggcga acagttcata cagagtcttt tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg    2220

tcaacatggt ggagcacgac actctggtct actccaaaaa tgtcaaagat acagtctcag    2280

aagaccaaag ggctattgag acttttcaac aaaggataat ttcgggaaac ctcctcggat    2340

tccattgccc agctatctgt cacttcatcg aaaggacagt agaaaaggaa ggtggctcct    2400

acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ctatcattca agatgcctct gccgacagtg    2460

gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca    2520

cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgaca tctccactga cgtaagggat gacgcacaat    2580

cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagga    2640

cacgctcgag ctcatttctc tattacttca gccataacaa aagaactctt ttctcttctt    2700

attaaaccat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt ctgatcgaaa    2760

agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca    2820

gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct    2880

acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc    2940

ttgacattgg ggaattcagc gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt gcacagggtg    3000

tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt tctgcagccg gtcgcggagg    3060

ccatggatgc gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac    3120

cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc    3180

atgtgtatca ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc    3240

tcgatgagct gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc gtgcacgcgg    3300

atttcggctc caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga    3360

gcgaggcgat gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc tggaggccgt    3420

ggttggcttg tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag    3480

gatcgccgcg gctccgggcg tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct    3540

tggttgacgg caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc    3600

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tctaacctta gcattgtgaa cgagacataa gtgttaagaa gacataacaa ttataatgga    960

agaagtttgt ctccatttat atattatata ttacccactt atgtattata ttaggatgtt    1020

aaggagacat aacaattata aagagagaag tttgtatcca tttatatatt atatactacc    1080

catttatata ttatacttat ccacttattt aatgtcttta taaggtttga tccatgatat    1140

ttctaatatt ttagttgata tgtatatgaa agggtactat ttgaactctc ttactctgta    1200

taaaggttgg atcatcctta aagtgggtct atttaatttt attgcttctt acagataaaa    1260

aaaaaattat gagttggttt gataaaatat tgaaggattt aaaataataa taaataacat    1320

ataatatatg tatataaatt tattataata taacatttat ctataaaaaa gtaaatattg    1380

tcataaatct atacaatcgt ttagccttgc tggacgaatc tcaattattt aaacgagagt    1440

aaacatattt gactttttgg ttatttaaca aattattatt taacactata tgaaattttt    1500

ttttttatca gcaaagaata aaattaaatt aagaaggaca atggtgtccc aatccttata    1560

caaccaactt ccacaagaaa gtcaagtcag agacaacaaa aaaacaagca aaggaaattt    1620

tttaatttga gttgtcttgt ttgctgcata atttatgcag taaaacacta cacataaccc    1680

ttttagcagt agagcaatgg ttgaccgtgt gcttagcttc ttttatttta tttttttatc    1740

agcaaagaat aaataaaata aaatgagaca cttcagggat gtttcaacaa gcttggatct    1800

cctgcaggat ctggccggcc ggatctcgta cggatccgtc gacggcgcgc ccgatcatcc    1860

ggatatagtt cctcctttca gcaaaaaacc cctcaagacc cgtttagagg ccccaagggg    1920

ttatgctagt tattgctcag cggtggcagc agccaactca gcttcctttc gggctttgtt    1980

agcagccgga tcgatccaag ctgtacctca ctattccttt gccctcggac gagtgctggg    2040

gcgtcggttt ccactatcgg cgagtacttc tacacagcca tcggtccaga cggccgcgct    2100

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gtcaagacca atgcggagca tatacgcccg gagccgcggc gatcctgcaa gctccggatg    2280

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cccgctcgtc tggctaagat cggccgcagc gatcgcatcc atagcctccg cgaccggctg    2700

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gagcgcggcc gatgcaaagt gccgataaac ataacgatct ttgtagaaac catcggcgca    2880

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ttcgccctcc gagagctgca tcaggtcgga gacgctgtcg aacttttcga tcagaaactt    3000

ctcgacagac gtcgcggtga gttcaggctt ttccatgggt atatctcctt cttaaagtta    3060

aacaaaatta tttctagagg gaaaccgttg tggtctccct atagtgagtc gtattaattt    3120

cgcgggatcg agatcgatcc aattccaatc ccacaaaaat ctgagcttaa cagcacagtt    3180

gctcctctca gagcagaatc gggtattcaa caccctcata tcaactacta cgttgtgtat    3240

aacggtccac atgccggtat atacgatgac tggggttgta caaaggcggc aacaaacggc    3300

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tacccgagta acaatctcca ggagatcaaa taccttccca agaaggttaa agatgcagtc    3780

aaaagattca ggactaattg catcaagaac acagagaaag acatatttct caagatcaga    3840

agtactattc cagtatggac gattcaaggc ttgcttcata aaccaaggca agtaatagag    3900

attggagtct ctaaaaaggt agttcctact gaatctaagg ccatgcatgg agtctaagat    3960

tcaaatcgag gatctaacag aactcgccgt gaagactggc gaacagttca tacagagtct    4020

tttacgactc aatgacaaga agaaaatctt cgtcaacatg gtggagcacg acactctggt    4080

ctactccaaa aatgtcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg agacttttca    4140

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cgaaaggaca gtagaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa    4260

ggctatcatt caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag    4320

gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga    4380

catctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc    4440

tatataagga agttcatttc atttggagag gacacgctcg agctcatttc tctattactt    4500

cagccataac aaaagaactc ttttctcttc ttattaaacc atgaaaaagc ctgaactcac    4560

cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca    4620

gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt    4680

cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt atcggcactt    4740

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cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc agcagacgcg    5280

ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg cggctccggg cgtatatgct    5340

ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg atgatgcagc    5400

ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg tcgggcgtac    5460

acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag tactcgccga    5520

tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag gaatagtgag gtacctaaag    5580

aaggagtgcg tcgaagcaga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat    5640

cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta    5700

ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg    5760

caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta    5820

tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgatgtcgaa tcgatcaacc tgcattaatg    5880

aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct    5940

cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc    6000

ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg    6060

ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg    6120

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caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag    6480

agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac    6540

tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt    6600

tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa    6660

gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg    6720

gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga cattaaccta    6780

taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa    6840

cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag    6900

cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta    6960

tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg gacatattgt cgttagaacg    7020

cggctacaat taatacataa ccttatgtat catacacata cgatttaggt gacactatag    7080

aacgg                                                                7085

 

<210>28

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物oKR85-1

 

<400>28

actcgaggcg cgccgtcgac gg                                             22

 

<210>29

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物oKR85-2

 

<400>29

aagatctggc gcgccaag                                                  18

 

<210>30

<211>4827

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pPCR85

 

<400>30

actcgaggcg cgccgtcgac ggatccgtac gagatccggc cggccagatc ctgcaggaga    60

tccaagcttg ttgaaacatc cctgaagtgt ctcattttat tttatttatt ctttgctgat    120

aaaaaaataa aataaaagaa gctaagcaca cggtcaacca ttgctctact gctaaaaggg    180

ttatgtgtag tgttttactg cataaattat gcagcaaaca agacaactca aattaaaaaa    240

tttcctttgc ttgttttttt gttgtctctg acttgacttt cttgtggaag ttggttgtat    300

aaggattggg acaccattgt ccttcttaat ttaattttat tctttgctga taaaaaaaaa    360

aatttcatat agtgttaaat aataatttgt taaataacca aaaagtcaaa tatgtttact    420

ctcgtttaaa taattgagat tcgtccagca aggctaaacg attgtataga tttatgacaa    480

tatttacttt tttatagata aatgttatat tataataaat ttatatacat atattatatg    540

ttatttatta ttattttaaa tccttcaata ttttatcaaa ccaactcata attttttttt    600

tatctgtaag aagcaataaa attaaataga cccactttaa ggatgatcca acctttatac    660

agagtaagag agttcaaata gtaccctttc atatacatat caactaaaat attagaaata    720

tcatggatca aaccttataa agacattaaa taagtggata agtataatat ataaatgggt    780

agtatataat atataaatgg atacaaactt ctctctttat aattgttatg tctccttaac    840

atcctaatat aatacataag tgggtaatat ataatatata aatggagaca aacttcttcc    900

attataattg ttatgtcttc ttaacactta tgtctcgttc acaatgctaa ggttagaatt    960

gtttagaaag tcttatagta cacatttgtt tttgtactat ttgaagcatt ccataagccg    1020

tcacgattca gatgatttat aataataaga ggaaatttat catagaacaa taaggtgcat    1080

agatagagtg ttaatatatc ataacatcct ttgtttattc atagaagaag tgagatggag    1140

ctcagttatt atactgttac atggtcggat acaatattcc atgctctcca tgagctctta    1200

cacctacatg cattttagtt catacttgcg gccgcagtat atcttaaatt ctttaatacg    1260

gtgtactagg atattgaact ggttcttgat gatgaaaacc tgggccgaga ttgcagctat    1320

ttatagtcat aggtcttgtt aacatgcatg gacatttggc cacggggtgg catgcagttt    1380

gacgggtgtt gaaataaaca aaaatgaggt ggcggaagag aatacgagtt tgaggttggg    1440

ttagaaacaa caaatgtgag ggctcatgat gggttgagtt ggtgaatgtt ttgggctgct    1500

cgattgacac ctttgtgagt acgtgttgtt gtgcatggct tttggggtcc agtttttttt    1560

tcttgacgcg gcgatcctga tcagctagtg gataagtgat gtccactgtg tgtgattgcg    1620

tttttgtttg aattttatga acttagacat tgctatgcaa aggatactct cattgtgttt    1680

tgtcttcttt tgttccttgg ctttttctta tgatccaaga gactagtcag tgttgtggca    1740

ttcgagacta ccaagattaa ttatgatggg ggaaggataa gtaactgatt agtacggact    1800

gttaccaaat taattaataa gcggcaaatg aagggcatgg atcaaaagct tggcgcgcca    1860

gatcttgggc tagagcggcc gccaccgcgg tggagctcca gcttttgttc cctttagtga    1920

gggttaattg cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat    1980

ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc    2040

taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga    2100

aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt    2160

attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg    2220

cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac    2280

gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg    2340

ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca    2400

agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc    2460

tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc    2520

ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag    2580

gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc    2640

ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca    2700

gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg    2760

aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg    2820

aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct    2880

ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa    2940

gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa    3000

gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa    3060

tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc    3120

ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga    3180

ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca    3240

atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc    3300

ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat    3360

tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc    3420

attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt    3480

tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc    3540

ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg    3600

gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt    3660

gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg    3720

gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga    3780

aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg    3840

taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg    3900

tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt    3960

tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc    4020

atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca    4080

tttccccgaa aagtgccacc taaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa    4140

atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata    4200

aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac    4260

tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc    4320

cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa    4380

atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg    4440

cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg    4500

tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtccc    4560

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat    4620

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt    4680

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat    4740

agggcgaatt gggtaccggg ccccccctcg aggtcgacgg tatcgataag cttgatatcg    4800

aattcctgca gcccggggga tccgccc                                        4827

 

<210>31

<211>15114

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR91

 

<400>31

gatctggcgc gccaagcttt tgatccatgc ccttcatttg ccgcttatta attaatttgg    60

taacagtccg tactaatcag ttacttatcc ttcccccatc ataattaatc ttggtagtct    120

cgaatgccac aacactgact agtctcttgg atcataagaa aaagccaagg aacaaaagaa    180

gacaaaacac aatgagagta tcctttgcat agcaatgtct aagttcataa aattcaaaca    240

aaaacgcaat cacacacagt ggacatcact tatccactag ctgatcagga tcgccgcgtc    300

aagaaaaaaa aactggaccc caaaagccat gcacaacaac acgtactcac aaaggtgtca    360

atcgagcagc ccaaaacatt caccaactca acccatcatg agccctcaca tttgttgttt    420

ctaacccaac ctcaaactcg tattctcttc cgccacctca tttttgttta tttcaacacc    480

cgtcaaactg catgccaccc cgtggccaaa tgtccatgca tgttaacaag acctatgact    540

ataaatagct gcaatctcgg cccaggtttt catcatcaag aaccagttca atatcctagt    600

acaccgtatt aaagaattta agatatactg cggccgcaag tatgaactaa aatgcatgta    660

ggtgtaagag ctcatggaga gcatggaata ttgtatccga ccatgtaaca gtataataac    720

tgagctccat ctcacttctt ctatgaataa acaaaggatg ttatgatata ttaacactct    780

atctatgcac cttattgttc tatgataaat ttcctcttat tattataaat catctgaatc    840

gtgacggctt atggaatgct tcaaatagta caaaaacaaa tgtgtactat aagactttct    900

aaacaattct aaccttagca ttgtgaacga gacataagtg ttaagaagac ataacaatta    960

taatggaaga agtttgtctc catttatata ttatatatta cccacttatg tattatatta    1020

ggatgttaag gagacataac aattataaag agagaagttt gtatccattt atatattata    1080

tactacccat ttatatatta tacttatcca cttatttaat gtctttataa ggtttgatcc    1140

atgatatttc taatatttta gttgatatgt atatgaaagg gtactatttg aactctctta    1200

ctctgtataa aggttggatc atccttaaag tgggtctatt taattttatt gcttcttaca    1260

gataaaaaaa aaattatgag ttggtttgat aaaatattga aggatttaaa ataataataa    1320

ataacatata atatatgtat ataaatttat tataatataa catttatcta taaaaaagta    1380

aatattgtca taaatctata caatcgttta gccttgctgg acgaatctca attatttaaa    1440

cgagagtaaa catatttgac tttttggtta tttaacaaat tattatttaa cactatatga    1500

aatttttttt tttatcagca aagaataaaa ttaaattaag aaggacaatg gtgtcccaat    1560

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gaaatttttt aatttgagtt gtcttgtttg ctgcataatt tatgcagtaa aacactacac    1680

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tggatctcct gcaggatctg gccggccgga tctcgtacgg atccgtcgac ggcgcgcctc    1860

gagtgggcgg atcccccggg ctgcaggaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac    1920

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tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat    2040

ggcgaatgga tcgatccatc gcgatgtacc ttttgttagt cagcctctcg attgctcatc    2100

gtcattacac agtaccgaag tttgatcgat ctagtaacat agatgacacc gcgcgcgata    2160

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ggactctaat cataaaaacc catctcataa ataacgtcat gcattacatg ttaattatta    2280

catgcttaac gtaattcaac agaaattata tgataatcat cgcaagaccg gcaacaggat    2340

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ggaactgaag ttaccaatca cgctggatga tttgccagtt ggattaatct tgcctttccc    2520

cgcatgaata atattgatga atgcatgcgt gaggggtagt tcgatgttgg caatagctgc    2580

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gtcagggcat gcatgatgca cgttatgagg tgacggtgct aggcagtatt ccctcaaagt    2700

ttcatagtca gtatcatatt catcattgca ttcctgcaag agagaattga gacgcaatcc    2760

acacgctgcg gcaaccttcc ggcgttcgtg gtctatttgc tcttggacgt tgcaaacgta    2820

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tcatccagcc ggcgtcccgg aaaacgattc cgaagcccaa cctttcatag aaggcggcgg    2940

tggaatcgaa atctcgtgat ggcaggttgg gcgtcgcttg gtcggtcatt tcgaacccca    3000

gagtcccgct cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg    3060

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aatatcacgg gtagccaacg ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca    3180

gtcgatgaat ccagaaaagc ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc    3240

atgggtcacg acgagatcct cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc    3300

ggctggcgcg agcccctgat gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc    3360

catccgagta cgtgctcgct cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc    3420

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agcaaggtga gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct    3540

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atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc agtggagata tcacatcaat ccacttgctt    3960

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tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttc aacgatggcc tttcctttat cgcaatgatg    4080

gcatttgtag gagccacctt ccttttccac tatcttcaca ataaagtgac agatagctgg    4140

gcaatggaat ccgaggaggt ttccggatat taccctttgt tgaaaagtct caattgccct    4200

ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt tttggagtag acaagcgtgt cgtgctccac    4260

catgttgacg aagattttct tcttgtcatt gagtcgtaag agactctgta tgaactgttc    4320

gccagtcttt acggcgagtt ctgttaggtc ctctatttga atctttgact ccatggcctt    4380

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aagcaagcct tgaatcgtcc atactggaat agtacttctg atcttgagaa atatatcttt    4500

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gtagagatag aggaagtcgt ccattgtgat ctctggggca aaggagatct gaattaattc    4800

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actgtcagta tttatgtata tgagtgtata ttttcgcata atctcagacc aatctgaaga    5040

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cccccatttg gacgtgaatg tagacacgtc gaaataaaga tttccgaatt agaataattt    5160

gtttattgct ttcgcctata aatacgacgg atcgtaattt gtcgttttat caaaatgtac    5220

tttcatttta taataacgct gcggacatct acatttttga attgaaaaaa aattggtaat    5280

tactctttct ttttctccat attgaccatc atactcattg ctgatccatg tagatttccc    5340

ggacatgaag ccatttacaa ttgaatatat cctgccgccg ctgccgcttt gcacccggtg    5400

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catgggactt ttaaacatca tccgtcggat ggcgttgcga gagaagcagt cgatccgtga    5580

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catggcgacc acacccgtcc tgtggtccaa cccctccgct gctatagtgc agtcggcttc    6060

tgacgttcag tgcagccgtc ttctgaaaac gacatgtcgc acaagtccta agttacgcga    6120

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tagaatactt gcgactagaa ccggagacat tacgccatga acaagagcgc cgccgctggc    6240

ctgctgggct atgcccgcgt cagcaccgac gaccaggact tgaccaacca acgggccgaa    6300

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cctaccctca ccccggcaca gatcgcgcac gcccgcgagc tgatcgacca ggaaggccgc    6720

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gtcatgcggt cgctgcgtat atgatgcgat gagtaaataa acaaatacgc aagggaacgc    7200

atgaagttat cgctgtactt aaccagaaag gcgggtcagg caagacgacc atcgcaaccc    7260

atctagcccg cgccctgcaa ctcgccgggg ccgatgttct gttagtcgat tccgatcccc    7320

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tgcccattct tgagtcccgt atcacgcagc gcgtgagcta cccaggcact gccgccgccg    7740

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ccgctgaaat taaatcaaaa ctcatttgag ttaatgaggt aaagagaaaa tgagcaaaag    7860

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gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt ccgatgctct atgacgtggg    8520

cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc cgtctgtcga agcgtgaccg    8580

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tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc gatggcggaa agcagaaaga    8820

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ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc ctggcacgcc gcgccgcagg    9120

caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa cgcagtggca gcgccggaga    9180

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cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta gtcatgcgct accgcaacct    9300

gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag cagatgctag ggcaaattgc    9360

cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg gatagcacgt acattgggaa    9420

cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg    9480

gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa aaaggcgatt tttccgccta    9540

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ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt cggtcgctgc gctccctacg    9660

ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc tcaaaaatgg ctggcctacg    9720

gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg ccactcgacc gccggcgccc    9780

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agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg    9960

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ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc    10140

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catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt    10260

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tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt    10860

gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt    10920

catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa    10980

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gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg    11160

agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga    11220

gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga    11280

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catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc    11400

aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc    11460

gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca    11520

taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac    11580

caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaacacg    11640

ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aagacctgca    11700

gggggggggg ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc    11760

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taggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg    11880

ggaagatgcg tgatctgatc cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccgc    11940

cgtcccgtca agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa ccaattaacc aattctgatt    12000

agaaaaactc atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac    12060

catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata    12120

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<210>32

<211>13268

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

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<210>33

<211>19604

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR92 YLDGAT2

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(4526)..(4526)

<223>n为a，c，g，或t

 

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atgtagacac gtcgaaataa agatttccga attagaataa tttgtttatt gctttcgcct    9660

ataaatacga cggatcgtaa tttgtcgttt tatcaaaatg tactttcatt ttataataac    9720

gctgcggaca tctacatttt tgaattgaaa aaaaattggt aattactctt tctttttctc    9780

catattgacc atcatactca ttgctgatcc atgtagattt cccggacatg aagccattta    9840

caattgaata tatcctgccg ccgctgccgc tttgcacccg gtggagcttg catgttggtt    9900

tctacgcaga actgagccgg ttaggcagat aatttccatt gagaactgag ccatgtgcac    9960

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ccctggatgc tgtaggcata ggcttggtta tgccggtact gccgggcctc ttgcgggata    10320

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cgccgtctaa aaaggtgatg tgtatttgag taaaacagct tgcgtcatgc ggtcgctgcg    11640

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tactcaagtt ctgccggcga gccgatggcg gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct    13320

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cggggcaggc tggcccgatc ctagtcatgc gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat    13800

ccgccggttc ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag    13860

gtcgaaaagg tctctttcct gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg    13920

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aagtgactga tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta    14040

ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc tggccagcgc acagccgaag    14100

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ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc    14340

acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt    14400

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ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa    15420

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cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta    15960

agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca    16020

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gtaatgctct gccagtgtta caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc    16500

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aaaagcttat gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca    16800

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gttcatgatg atatattttt atcttgtgca atgtaacatc agagattttg agacacaacg    17400

tggctttccc ccccccccct gcaggtcaat tcggtcgata tggctattac gaagaaggct    17460

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ggccatttcg ttaaaatgcg cagccatggc tgcttcgtcc agcatggcgt aatactgatc    17580

ctcgtcttcg gctggcggta tattgccgat gggcttcaaa agccgccgtg gttgaaccag    17640

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cctcccaagt ggcgacataa gtacggacat gcgcaaaggc tttcccggtt tgtcgctgat    18060

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gttgcgccaa agatccgctt gcggagcggt cgaacattca tgctgggact tcaagaggtc    18720

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catggacgtg aacaaatcgc ccggaccaag gatgccacgg atacaaaagc tcgcgaagct    18840

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aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt    19500

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat    19560

tacgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat ctgg                     19604

 

<210>34

<211>20082

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR92 YLDGAT1 YLDGAT2

 

<400>34

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ctcaactcct acgccaacca gatcattggc gaaaacgacc cacagctgtc gcccacaaaa    1440

ctcaagccca ctggcagaaa atacatcttc ggctaccacc cccacggcat tatcggcatg    1500

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gtcgcccttg ttcccatcat ggcctttggt gagaacgacc tctatgacca ggttagcaac    1860

gacaagtcgt ccaagctgta ccgattccag cagtttgtca agaacttcct tggattcacc    1920

cttcctttga tgcatgcccg aggcgtcttc aactacgatg tcggtcttgt cccctacagg    1980

cgacccgtca acattgtggt tggttccccc attgacttgc cttatctccc acaccccacc    2040

gacgaagaag tgtccgaata ccacgaccga tacatcgccg agctgcagcg aatctacaac    2100

gagcacaagg atgaatattt catcgattgg accgaggagg gcaaaggagc cccagagttc    2160

cgaatgattg agtaagcggc cgcaagtatg aactaaaatg catgtaggtg taagagctca    2220

tggagagcat ggaatattgt atccgaccat gtaacagtat aataactgag ctccatctca    2280

cttcttctat gaataaacaa aggatgttat gatatattaa cactctatct atgcacctta    2340

ttgttctatg ataaatttcc tcttattatt ataaatcatc tgaatcgtga cggcttatgg    2400

aatgcttcaa atagtacaaa aacaaatgtg tactataaga ctttctaaac aattctaacc    2460

ttagcattgt gaacgagaca taagtgttaa gaagacataa caattataat ggaagaagtt    2520

tgtctccatt tatatattat atattaccca cttatgtatt atattaggat gttaaggaga    2580

cataacaatt ataaagagag aagtttgtat ccatttatat attatatact acccatttat    2640

atattatact tatccactta tttaatgtct ttataaggtt tgatccatga tatttctaat    2700

attttagttg atatgtatat gaaagggtac tatttgaact ctcttactct gtataaaggt    2760

tggatcatcc ttaaagtggg tctatttaat tttattgctt cttacagata aaaaaaaaat    2820

tatgagttgg tttgataaaa tattgaagga tttaaaataa taataaataa catataatat    2880

atgtatataa atttattata atataacatt tatctataaa aaagtaaata ttgtcataaa    2940

tctatacaat cgtttagcct tgctggacga atctcaatta tttaaacgag agtaaacata    3000

tttgactttt tggttattta acaaattatt atttaacact atatgaaatt ttttttttta    3060

tcagcaaaga ataaaattaa attaagaagg acaatggtgt cccaatcctt atacaaccaa    3120

cttccacaag aaagtcaagt cagagacaac aaaaaaacaa gcaaaggaaa ttttttaatt    3180

tgagttgtct tgtttgctgc ataatttatg cagtaaaaca ctacacataa cccttttagc    3240

agtagagcaa tggttgaccg tgtgcttagc ttcttttatt ttattttttt atcagcaaag    3300

aataaataaa ataaaatgag acacttcagg gatgtttcaa caagcttgga tcctagccta    3360

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ttaataaaac acttacaaca ccggattttt tttaattaaa atgtgccatt taggataaat    3480

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tgaaaatatt aatatgttta aatcaacaca atctatcaaa attaaactaa aaaaaaaata    3600

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aaagcgagtc taatttttaa attatgaacc tgcatatata aaaggaaaga aagaatccag    3720

gaagaaaaga aatgaaacca tgcatggtcc cctcgtcatc acgagtttct gccatttgca    3780

atagaaacac tgaaacacct ttctctttgt cacttaattg agatgccgaa gccacctcac    3840

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taaataacca cgcctcaggt tctccgcttc acaactcaaa cattctctcc attggtcctt    4020

aaacactcat cagtcatcac catggaggtc cgacgacgaa agatagacgt gctcaaggcc    4080

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cagtataata actgagctcc atctcacttc ttctatgaat aaacaaagga tgttatgata    5760

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acataacaat tataatggaa gaagtttgtc tccatttata tattatatat tacccactta    6000

tgtattatat taggatgtta aggagacata acaattataa agagagaagt ttgtatccat    6060

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tgaactctct tactctgtat aaaggttgga tcatccttaa agtgggtcta tttaatttta    6240

ttgcttctta cagataaaaa aaaaattatg agttggtttg ataaaatatt gaaggattta    6300

aaataataat aaataacata taatatatgt atataaattt attataatat aacatttatc    6360

tataaaaaag taaatattgt cataaatcta tacaatcgtt tagccttgct ggacgaatct    6420

caattattta aacgagagta aacatatttg actttttggt tatttaacaa attattattt    6480

aacactatat gaaatttttt tttttatcag caaagaataa aattaaatta agaaggacaa    6540

tggtgtccca atccttatac aaccaacttc cacaagaaag tcaagtcaga gacaacaaaa    6600

aaacaagcaa aggaaatttt ttaatttgag ttgtcttgtt tgctgcataa tttatgcagt    6660

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tttattttat ttttttatca gcaaagaata aataaaataa aatgagacac ttcagggatg    6780

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gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa    7200

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cttattgaaa acgtgggtag caccaaaacg aatcaagtcg ctggaactga agttaccaat    7440

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atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg    8340

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atgaaatgaa cttccttata tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc    8880

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ccatactgga atagtacttc tgatcttgag aaatatatct ttctctgtgt tcttgatgca    9480

gttagtcctg aatcttttga ctgcatcttt aaccttcttg ggaaggtatt tgatctcctg    9540

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aattatgtga ggtaatgggc tacactgaat tggtagctca aactgtcagt atttatgtat    9960

atgagtgtat attttcgcat aatctcagac caatctgaag atgaaatggg tatctgggaa    10020

tggcgaaatc aaggcatcga tcgtgaagtt tctcatctaa gcccccattt ggacgtgaat    10080

gtagacacgt cgaaataaag atttccgaat tagaataatt tgtttattgc tttcgcctat    10140

aaatacgacg gatcgtaatt tgtcgtttta tcaaaatgta ctttcatttt ataataacgc    10200

tgcggacatc tacatttttg aattgaaaaa aaattggtaa ttactctttc tttttctcca    10260

tattgaccat catactcatt gctgatccat gtagatttcc cggacatgaa gccatttaca    10320

attgaatata tcctgccgcc gctgccgctt tgcacccggt ggagcttgca tgttggtttc    10380

tacgcagaac tgagccggtt aggcagataa tttccattga gaactgagcc atgtgcacct    10440

tccccccaac acggtgagcg acggggcaac ggagtgatcc acatgggact tttaaacatc    10500

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tttcctggcg ttttcttgtc gcgtgtttta gtcgcataaa gtagaatact tgcgactaga    11160

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tgcttgacca cctacgccct ggcgacgttg tgacagtgac caggctagac cgcctggccc    11400

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gagtaaatga gcaaatgaat aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat    13080

ggaaaatcaa gaacaaccag gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg    13140

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caagcccgag gaatcggcgt gagcggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg    13260

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aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa    14460

gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt    14520

aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac agccgaagag    14580

ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg    14640

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cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata    15000

ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact    15060

gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta    15120

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caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc    15240

cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta    15300

taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg    15360

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aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga    15660

aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt    15720

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gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg    15900

atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat    15960

gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc    16020

tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg    16080

gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct    16140

ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca    16200

actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg    16260

ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg    16320

tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc    16380

cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag    16440

ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg    16500

ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag    16560

tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat    16620

agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaagacctgc aggggggggg gggcgctgag    16680

gtctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc ctgaatcgcc ccatcatcca    16740

gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac cagttggtga    16800

ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc gggaagatgc gtgatctgat    16860

ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc aagtcagcgt    16920

aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat tagaaaaact catcgagcat    16980

caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg    17040

tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta    17100

tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa    17160

aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa    17220

aagcttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa    17280

atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac    17340

gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac    17400

tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc    17460

tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg    17520

cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt    17580

aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt    17640

cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata    17700

cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc ctcgagcaag acgtttcccg    17760

ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt    17820

tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag agattttgag acacaacgtg    17880

gctttccccc ccccccctgc aggtcaattc ggtcgatatg gctattacga agaaggctcg    17940

tgcgcggagt cccgtgaact ttcccacgca acaagtgaac cgcaccgggt ttgccggagg    18000

ccatttcgtt aaaatgcgca gccatggctg cttcgtccag catggcgtaa tactgatcct    18060

cgtcttcggc tggcggtata ttgccgatgg gcttcaaaag ccgccgtggt tgaaccagtc    18120

tatccattcc aaggtagcga actcgaccgc ttcgaagctc ctccatggtc cacgccgatg    18180

aatgacctcg gccttgtaaa gaccgttgat cgcttctgcg agggcgttgt cgtgctgtcg    18240

ccgacgcttc cgatagatgg ctcgatacct gcttctgcca accgctcgga atagcgaaag    18300

gacacgtatt gaacaccgcg atccgagtga tgcactaggc cgccatgagc gggacgccga    18360

tcatgatgag cctcctcgag ggcatcgagg acaaagcctg catgtgctgt ccggctcgcc    18420

cgccatccga caatgcgacg ggcgaagacg tcgatcacga aggccacgta gacgaagccc    18480

tcccaagtgg cgacataagt acggacatgc gcaaaggctt tcccggtttg tcgctgatgg    18540

tgcaagagac gctgaagcgc gatccgatgc gcaggcatct gttcgtcttc cgcggtcgtg    18600

gcggtggcct gatcaaggtc actcgccgaa gagctgcatg attggctcga aaccgagcgg    18660

gggaaattgt cgcgcagttc tcccgtcgcc gaggcgataa attacatgct caagcgatgg    18720

gatggcatta cgtcattcct cgatgacggc ccgatttgcc tgacgaacaa tgctgccgaa    18780

cgaacgctca gaggctatgt actcggcagg aagtcatggc tgtttgccgg atcggatcgt    18840

tgtgctgaac gtgcggcgtt catggcgaca ctgatcatga gcgccaagct caataacatc    18900

gatccgcagg cctggcttgc cgacgtccgc gccgaccttg cggacgctcc gatcagcagg    18960

cttgagcaac agctgccgtg gaactggaca tccaagacac tgagtgctca ggcggcctga    19020

cctgcggcct tcaccggata cttaccccat tatcgcagat tgcgatgaag catcagcgtc    19080

attcagcaat cttgccaaag tatgcaggct cgcgagaatc gacgtgcgaa accggctggt    19140

tgcgccaaag atccgcttgc ggagcggtcg aacattcatg ctgggacttc aagaggtcga    19200

gtagaggaag aaccggaaag gttgcaccgg aaaatatgcg ttcctttgga gagcgcctca    19260

tggacgtgaa caaatcgccc ggaccaagga tgccacggat acaaaagctc gcgaagctcg    19320

gtcccgtggg tgttctgtcg tctcgttgta caacgaaatc cattcccatt ccgcgctcaa    19380

gatggcttcc cctcggcagt tcatcagggc taaatcaatc tagccgactt gtccggtgaa    19440

atgggctgca ctccaacaga aacaatcaaa caaacataca cagcgactta ttcacacgag    19500

ctcaaattac aacggtatat atcctgccag tcagcatcat cacaccaaaa gttaggcccg    19560

aatagtttga aattagaaag ctcgcaattg aggtctacag gccaaattcg ctcttagccg    19620

tacaatatta ctcaccggtg cgatgccccc catcgtaggt gaaggtggaa attaatgatc    19680

catcttgaga ccacaggccc acaacagcta ccagtttcct caagggtcca ccaaaaacgt    19740

aagcgcttac gtacatggtc gataagaaaa ggcaatttgt agatgttaac atccaacgtc    19800

gctttcaggg atcgatccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta    19860

atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa    19920

tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat    19980

gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta    20040

cgccaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatct gg                       20082

 

<210>35

<211>3527

<212>DNA

<213>大豆

 

<400>35

tagcctaagt acgtactcaa aatgccaaca aataaaaaaa aagttgcttt aataatgcca    60

aaacaaatta ataaaacact tacaacaccg gatttttttt aattaaaatg tgccatttag    120

gataaatagt taatattttt aataattatt taaaaagccg tatctactaa aatgattttt    180

atttggttga aaatattaat atgtttaaat caacacaatc tatcaaaatt aaactaaaaa    240

aaaaataagt gtacgtggtt aacattagta cagtaatata agaggaaaat gagaaattaa    300

gaaattgaaa gcgagtctaa tttttaaatt atgaacctgc atatataaaa ggaaagaaag    360

aatccaggaa gaaaagaaat gaaaccatgc atggtcccct cgtcatcacg agtttctgcc    420

atttgcaata gaaacactga aacacctttc tctttgtcac ttaattgaga tgccgaagcc    480

acctcacacc atgaacttca tgaggtgtag cacccaaggc ttccatagcc atgcatactg    540

aagaatgtct caagctcagc accctacttc tgtgacgttg tccctcattc accttcctct    600

cttccctata aataaccacg cctcaggttc tccgcttcac aactcaaaca ttctcctcca    660

ttggtcctta aacactcatc agtcatcacc atggccaagc tagttttttc cctttgtttt    720

ctgcttttca gtggctgctg cttcgctttc agttccagag agcagcctca gcaaaacgag    780

tgccagatcc aaaaactcaa tgccctcaaa ccggataacc gtatagagtc agaaggaggg    840

ctcattgaga catggaaccc taacaacaag ccattccagt gtgccggtgt tgccctctct    900

cgctgcaccc tcaaccgcaa cgcccttcgt agaccttcct acaccaacgg tccccaggaa    960

atctacatcc aacaaggtcc atcttgtcca aacttcacat ataaatatat aatagactta    1020

aatatgttta agggtttgat aaatgaggga attttatttt agatttttaa taattttttt    1080

tgttttgagt ttttatatat taaaattttt gttttgattt cttccatatg acgtaacata    1140

atcatatcat tgataatgtt gggttcctaa tttttgtttg tttgttgttt tgtaatatga    1200

ataggtaagg gtatttttgg catgatatac ccgggttgtc ctagcacatt tgaagagcct    1260

caacaacctc aacaaagagg acaaagcagc agaccacaag accgtcacca gaagatctat    1320

aacttcagag agggtgattt gatcgcagtg cctactggtg ttgcatggtg gatgtacaac    1380

aatgaagaca ctcctgttgt tgccgtttct attattgaca ccaacagctt ggagaaccag    1440

ctcgaccaga tgcctagggt gagccacata gcaatattag atattataat tctttaaagg    1500

tttaaatatc attttagttc gtggagttgc actttctaat ttagtaccta tagattaaaa    1560

tatgccaatt gaatccttat agttgtgttt ttttatccaa tttggttctt gtcttgaaat    1620

aaatggacaa tattgtagct gataaaaaaa ggaaactgga ctacattgta acgttaagat    1680

tagaattctt aagttctaat actagctggt tacagattga caactatttg ttttgacaat    1740

tcttggcaga gattctatct tgctgggaac caagagcaag agtttctaaa atatcagcaa    1800

gagcaaggag gtcatcaaag ccagaaagga aagcatcagc aagaagaaga aaacgaagga    1860

ggcagcatat tgagtggctt caccctggaa ttcttggaac atgcattcag cgtggacaag    1920

cagatagcga aaaacctaca aggagagaac gaaggggaag acaagggagc cattgtgaca    1980

gtgaaaggag gtctgagcgt gataaaacca cccacggacg agcagcaaca aagaccccag    2040

gaagaggaag aagaagaaga ggatgagaag ccacagtgca agggtaaaga caaacactgc    2100

caacgccccc gaggaagcca aagcaaaagc agaagaaatg gcattgacga gaccatatgc    2160

accatgagac ttcgccacaa cattggccag acttcatcac ctgacatcta caaccctcaa    2220

gccggtagcg tcacaaccgc caccagcctt gacttcccag ccctctcgtg gctcagactc    2280

agtgctgagt ttggatctct ccgcaaggta cgtacatcat tcatcaaaga tcaacataca    2340

tttatacatt aaactaatat ttgttgccaa atatttatta attttattga taattaattt    2400

ttttagaaaa tttgtttgat cacttttaat ggagtctttc atcttaatta cattatttat    2460

acttagacta atgatttatt gattaataat aatcttagat acactataaa atgtgtgacg    2520

gagttatctt aacacttgca tggattctat cttttctgtc tttatatata gaaatagaga    2580

gaaaaaaaaa gaaaagattg atgaaaaaag caaaacaaaa aatagtatta ttataaaaat    2640

attggatgaa tttgttgtga ctcttgcatg cattgatgta cgatgcagaa tgcaatgttc    2700

gtgccacact acaacctgaa cgcgaacagc ataatatacg cattgaatgg acgggcattg    2760

atacaagtgg tgaattgcaa cggtgagaga gtgtttgatg gagagctgca agagggacgg    2820

gtgctgatcg tgccacaaaa ctttgtggtg gctgcaagat cacagagtga caacttcgag    2880

tatgtgtcat tcaagaccaa tgatacaccc atgatcggca ctcttgcagg ggcaaactca    2940

ttgttgaacg cattaccaga ggaagtgatt cagcacactt tcaacctaaa aagccagcag    3000

gccaggcaga taaagaacaa caaccctttc aagttcctgg ttccacctca ggagtctcag    3060

aagagagctg tggcttagag ccctttttgt atgtgctacc ccacttttgt ctttttggca    3120

atagtgctag caaccaataa ataataataa taataatgaa taagaaaaca aaggctttag    3180

cttgcctttt gttcactgta aaataataat gtaagtactc tctataatga gtcacgaaac    3240

ttttgcggga ataaaaggag aaattccaat gagttttctg tcaaatcttc ttttgtctct    3300

ctctctctct cttttttttt tctttcttct gagcttcttg caaaacaaaa ggcaaacaat    3360

aacgattggt ccaatgatag ttagcttgat cgatgatatc tttaggaagt gttggcagga    3420

caggacatga tgtagaagac taaaattgaa agtattgcag acccaatagt tgaagattaa    3480

ctttaagaat gaagacgtct tatcaggttc ttcatgactt ggagctc                  3527

 

<210>36

<211>690

<212>DNA

<213>大豆

 

<400>36

tagcctaagt acgtactcaa aatgccaaca aataaaaaaa aagttgcttt aataatgcca    60

aaacaaatta ataaaacact tacaacaccg gatttttttt aattaaaatg tgccatttag    120

gataaatagt taatattttt aataattatt taaaaagccg tatctactaa aatgattttt    180

atttggttga aaatattaat atgtttaaat caacacaatc tatcaaaatt aaactaaaaa    240

aaaaataagt gtacgtggtt aacattagta cagtaatata agaggaaaat gagaaattaa    300

gaaattgaaa gcgagtctaa tttttaaatt atgaacctgc atatataaaa ggaaagaaag    360

aatccaggaa gaaaagaaat gaaaccatgc atggtcccct cgtcatcacg agtttctgcc    420

atttgcaata gaaacactga aacacctttc tctttgtcac ttaattgaga tgccgaagcc    480

acctcacacc atgaacttca tgaggtgtag cacccaaggc ttccatagcc atgcatactg    540

aagaatgtct caagctcagc accctacttc tgtgacgttg tccctcattc accttcctct    600

cttccctata aataaccacg cctcaggttc tccgcttcac aactcaaaca ttctcctcca    660

ttggtcctta aacactcatc agtcatcacc                                     690

 

<210>37

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物oGY1-1

 

<400>37

cgcggatcct agcctaagta cgtactcaaa atgcca                              36

 

<210>38

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物oGY1-2

 

<400>38

gaattcccat ggggtgatga ctgatgagtg tttaaggac                           39

 

<210>39

<211>6660

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pZBL114

 

<400>39

cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat    60

taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgcca    120

agctgacttg gtcagcggcc gctctagaac tagtggatcc tagcctaagt acgtactcaa    180

aatgccaaca aataaaaaaa aagttgcttt aataatgcca aaacaaatta ataaaacact    240

tacaacaccg gatttttttt aattaaaatg tgccatttag gataaatagt taatattttt    300

aataattatt taaaaagccg tatctactaa aatgattttt atttggttga aaatattaat    360

atgtttaaat caacacaatc tatcaaaatt aaactaaaaa aaaaataagt gtacgtggtt    420

aacattagta cagtaatata agaggaaaat gagaaattaa gaaattgaaa gcgagtctaa    480

tttttaaatt atgaacctgc atatataaaa ggaaagaaag aatccaggaa gaaaagaaat    540

gaaaccatgc atggtcccct cgtcatcacg agtttctgcc atttgcaata gaaacactga    600

aacacctttc tctttgtcac ttaattgaga tgccgaagcc acctcacacc atgaacttca    660

tgaggtgtag cacccaaggc ttccatagcc atgcatactg aagaatgtct caagctcagc    720

accctacttc tgtgacgtgt ccctcattca ccttcctctc ttccctataa ataaccacgc    780

ctcaggttct ccgcttcaca actcaaacat tctctccatt ggtccttaaa cactcatcag    840

tcatcaccat ggtacgtcct gtagaaaccc caacccgtga aatcaaaaaa ctcgacggcc    900

tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattga tcagcgttgg tgggaaagcg    960

cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt taacgatcag ttcgccgatg    1020

cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg cgaagtcttt ataccgaaag    1080

gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt cactcattac ggcaaagtgt    1140

gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta tacgccattt gaagccgatg    1200

tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtatcac cgtttgtgtg aacaacgaac    1260

tgaactggca gactatcccg ccgggaatgg tgattaccga cgaaaacggc aagaaaaagc    1320

agtcttactt ccatgatttc tttaactatg ccggaatcca tcgcagcgta atgctctaca    1380

ccacgccgaa cacctgggtg gacgatatca ccgtggtgac gcatgtcgcg caagactgta    1440

accacgcgtc tgttgactgg caggtggtgg ccaatggtga tgtcagcgtt gaactgcgtg    1500

atgcggatca acaggtggtt gcaactggac aaggcactag cgggactttg caagtggtga    1560

atccgcacct ctggcaaccg ggtgaaggtt atctctatga actgtgcgtc acagccaaaa    1620

gccagacaga gtgtgatatc tacccgcttc gcgtcggcat ccggtcagtg gcagtgaagg    1680

gccaacagtt cctgattaac cacaaaccgt tctactttac tggctttggt cgtcatgaag    1740

atgcggactt acgtggcaaa ggattcgata acgtgctgat ggtgcacgac cacgcattaa    1800

tggactggat tggggccaac tcctaccgta cctcgcatta cccttacgct gaagagatgc    1860

tcgactgggc agatgaacat ggcatcgtgg tgattgatga aactgctgct gtcggcttta    1920

acctctcttt aggcattggt ttcgaagcgg gcaacaagcc gaaagaactg tacagcgaag    1980

aggcagtcaa cggggaaact cagcaagcgc acttacaggc gattaaagag ctgatagcgc    2040

gtgacaaaaa ccacccaagc gtggtgatgt ggagtattgc caacgaaccg gatacccgtc    2100

cgcaagtgca cgggaatatt tcgccactgg cggaagcaac gcgtaaactc gacccgacgc    2160

gtccgatcac ctgcgtcaat gtaatgttct gcgacgctca caccgatacc atcagcgatc    2220

tctttgatgt gctgtgcctg aaccgttatt acggatggta tgtccaaagc ggcgatttgg    2280

aaacggcaga gaaggtactg gaaaaagaac ttctggcctg gcaggagaaa ctgcatcagc    2340

cgattatcat caccgaatac ggcgtggata cgttagccgg gctgcactca atgtacaccg    2400

acatgtggag tgaagagtat cagtgtgcat ggctggatat gtatcaccgc gtctttgatc    2460

gcgtcagcgc cgtcgtcggt gaacaggtat ggaatttcgc cgattttgcg acctcgcaag    2520

gcatattgcg cgttggcggt aacaagaaag ggatcttcac tcgcgaccgc aaaccgaagt    2580

cggcggcttt tctgctgcaa aaacgctgga ctggcatgaa cttcggtgaa aaaccgcagc    2640

agggaggcaa acaatgaatc aacaactctc ctggcgcacc atcgtcggct acagcctcgg    2700

tggggaattc cccgggggta cctctagaca tggccacgtg catgaagtat gaactaaaat    2760

gcatgtaggt gtaagagctc atggagagca tggaatattg tatccgacca tgtaacagta    2820

taataactga gctccatctc acttcttcta tgaataaaca aaggatgtta tgatatatta    2880

acactctatc tatgcacctt attgttctat gataaatttc ctcttattat tataaatcat    2940

ctgaatcgtg acggcttatg gaatgcttca aatagtacaa aaacaaatgt gtactataag    3000

actttctaaa caattctaac tttagcattg tgaacgagac ataagtgtta agaagacata    3060

acaattataa tggaagaagt ttgtctccat ttatatatta tatattaccc acttatgtat    3120

tatattagga tgttaaggag acataacaat tataaagaga gaagtttgta tccatttata    3180

tattatatac tacccattta tatattatac ttatccactt atttaatgtc tttataaggt    3240

ttgatccatg atatttctaa tattttagtt gatatgtata tgaaagggta ctatttgaac    3300

tctcttactc tgtataaagg ttggatcatc cttaaagtgg gtctatttaa ttttattgct    3360

tcttacagat aaaaaaaaaa ttatgagttg gtttgataaa atattgaagg atttaaaata    3420

ataataaata ataaataaca tataatatat gtatataaat ttattataat ataacattta    3480

tctataaaaa agtaaatatt gtcataaatc tatacaatcg tttagccttg ctggacgact    3540

ctcaattatt taaacgagag taaacatatt tgactttttg gttatttaac aaattattat    3600

ttaacactat atgaaatttt ttttttttat cagcaaagaa ataaaattaa attaagaagg    3660

acaatggtgt gtcccaatcc ttatacaacc aacttccaca agaaagtcaa gtcagagaca    3720

acaaaaaaac aagcaaagga aattttttaa tttgagttgt cttgtttgct gcataattta    3780

tgcagtaaaa cactacacat aaccctttta gcagtagagc aatggttgac cgtgtgctta    3840

gcttctttta ttttattttt ttatcagcaa agaataaata aaataaaatg agacacttca    3900

gggatgtttc aacaagcttt gctctagact ggaattcgtc gacgagctcc ctatagtgag    3960

tcgtattaga ggccgacttg gccaaattcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga    4020

aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc    4080

tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc    4140

cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc    4200

ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt    4260

cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca    4320

ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa    4380

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat    4440

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc    4500

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc    4560

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt    4620

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cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg    4740

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca    4800

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc    4860

gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa    4920

accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa    4980

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac    5040

tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta    5100

aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt    5160

taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata    5220

gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc    5280

agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac    5340

cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag    5400

tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac    5460

gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc    5520

agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg    5580

gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc    5640

atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct    5700

gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc    5760

tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc    5820

atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc    5880

agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc    5940

gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca    6000

cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt    6060

tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt    6120

ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg    6180

gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct    6240

cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta    6300

aatcggggca tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa    6360

cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct    6420

ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc    6480

aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg    6540

ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacaaaa    6600

tattaacgtt tacaatttcc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat    6660

 

<210>40

<211>1437

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>GM GY1 gene

 

<400>40

atgggttcca gagagcagcc tcagcaaaac gagtgccaga tccaaaaact caatgccctc    60

aaaccggata accgtataga gtcagaagga gggctcattg agacatggaa ccctaacaac    120

aagccattcc agtgtgccgg tgttgccctc tctcgctgca ccctcaaccg caacgccctt    180

cgtagacctt cctacaccaa cggtccccag gaaatctaca tccaacaagg taagggtatt    240

tttggcatga tatacccggg ttgtcctagc acatttgaag agcctcaaca acctcaacaa    300

agaggacaaa gcagcagacc acaagaccgt caccagaaga tctataactt cagagagggt    360

gatttgatcg cagtgcctac tggtgttgca tggtggatgt acaacaatga agacactcct    420

gttgttgccg tttctattat tgacaccaac agcttggaga accagctcga ccagatgcct    480

aggagattct atcttgctgg gaaccaagag caagagtttc taaaatatca gcaagagcaa    540

ggaggtcatc aaagccagaa aggaaagcat cagcaagaag aagaaaacga aggaggcagc    600

atattgagtg gcttcaccct ggaattcttg gaacatgcat tcagcgtgga caagcagata    660

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ccccgaggaa gccaaagcaa aagcagaaga aatggcattg acgagaccat atgcaccatg    900

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agcgtcacaa ccgccaccag ccttgacttc ccagccctct cgtggctcag actcagtgct    1020

gagtttggat ctctccgcaa gaatgcaatg ttcgtgccac actacaacct gaacgcgaac    1080

agcataatat acgcattgaa tggacgggca ttgatacaag tggtgaattg caacggtgag    1140

agagtgtttg atggagagct gcaagaggga cgggtgctga tcgtgccaca aaactttgtg    1200

gtggctgcaa gatcacagag tgacaacttc gagtatgtgt cattcaagac caatgataca    1260

cccatgatcg gcactcttgc aggggcaaac tcattgttga acgcattacc agaggaagtg    1320

attcagcaca ctttcaacct aaaaagccag caggccaggc agataaagaa caacaaccct    1380

ttcaagttcc tggttccacc tcaggagtct cagaagagag ctgtggctta gggtacc       1437

 

<210>41

<211>204

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>synthetic BHL8 gene

 

<400>41

atggctaaga ttaagtgcac gtggcctgag ctggtgggca agaccgtgga gaaagccaag    60

aagatgatca tgaaggacaa gccagaggcg aagatcatgg ttctgccagt tgggaccaaa    120

gtgaccggtg aatggaagat ggatcgcgtc cgcctctggg tcgataagaa ggacaagatc    180

gccaagactc cgaagtgcgg ctag                                           204

 

<210>42

<211>1701

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>GY1-BHL8 fusion product

 

<400>42

atggccaagc tagttttttc cctttgtttt ctgcttttca gtggctgctg cttcgctttc    60

agttccagag agcagcctca gcaaaacgag tgccagatcc aaaaactcaa tgccctcaaa    120

ccggataacc gtatagagtc agaaggaggg ctcattgaga catggaaccc taacaacaag    180

ccattccagt gtgccggtgt tgccctctct cgctgcaccc tcaaccgcaa cgcccttcgt    240

agaccttcct acaccaacgg tccccaggaa atctacatcc aacaaggtaa gggtattttt    300

ggcatgatat acccgggttg tcctagcaca tttgaagagc ctcagcaacc tcaacaaaga    360

ggacaaagca gcagaccaca agaccgtcac cagaagatct ataacttcag agagggtgat    420

ttgatcgcag tgcctactgg tgttgcatgg tggatgtaca acaatgaaga cactcctgtt    480

gttgccgttt ctattattga caccaacagc ttggagaacc agctcgacca gatgcctagg    540

agattctatc ttgctgggaa ccaagagcaa gagtttctaa aatatcagca agagcaagga    600

ggtcatcaaa gccagaaagg aaagcatcag caagaagaag aaaacgaagg aggcagcata    660

ttgagtggct tcaccctgga attcttggaa catgcattca gcgtggacaa gcagatagcg    720

aaaaacctac aaggagagaa cgaaggggaa gacaagggag ccattgtgac agtgaaagga    780

ggtctgagcg tgttaaaacc acccacggac gagcagcaac aaagacccca ggaagaggaa    840

gaagaagaag aggatgagaa gccacagtgc aagggtaaag acaaacactg ccaacgcccc    900

cgaggaagcc aaagcaaaag cagaagaaat ggcattgacg agaccatatg caccatgaga    960

cttcgccaca acattggcca gacttcatca cctgacatct acaaccctca agccggtagc    1020

gtcacaaccg ccaccagcct tgacttccca gccctctcgt ggctcagact cagtgctgag    1080

tttggatctc tccgcaagaa tgcaatgttc gtgccacact acaacctgaa cgcgaacagc    1140

ataatatacg cattgaatgg acgggcattg atacaagtgg tgaattgcaa cggtgagaga    1200

gtgtttgatg gagagctgca agagggacgg gtgctgatcg tgccacaaaa ctttgtggtg    1260

gctgcaagat cacagagtga caacttcgag tatgtgtcat tcaagaccaa tgatacaccc    1320

atgatcggca ctcttgcagg ggcaaactca ttgttgaacg cattaccaga ggaagtgatt    1380

cagcacactt tcaacctaaa aagccagcag gccaggcaga taaagaacaa caaccctttc    1440

aagttcctgg ttccacctca ggagtctcag aagagagctg tggctggtgg tggatctatg    1500

gctaagatta agtgcacgtg gcctgagctg gtgggcaaga ccgtggagaa agccaagaag    1560

atgatcatga aggacaagcc agaggcgaag atcatggttc tgccagttgg gaccaaagtg    1620

accggtgaat ggaagatgga tcgcgtccgc ctctgggtcg ataagaagga caagatcgcc    1680

aagactccga agtgcggcta g                                              1701

 

<210>43

<211>6493

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pZBL133

 

<400>43

cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat    60

taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgcca    120

agctgacttg gtcagcggcc gctctagaac tagtggatcc tagcctaagt acgtactcaa    180

aatgccaaca aataaaaaaa aagttgcttt aataatgcca aaacaaatta ataaaacact    240

tacaacaccg gatttttttt aattaaaatg tgccatttag gataaatagt taatattttt    300

aataattatt taaaaagccg tatctactaa aatgattttt atttggttga aaatattaat    360

atgtttaaat caacacaatc tatcaaaatt aaactaaaaa aaaaataagt gtacgtggtt    420

aacattagta cagtaatata agaggaaaat gagaaattaa gaaattgaaa gcgagtctaa    480

tttttaaatt atgaacctgc atatataaaa ggaaagaaag aatccaggaa gaaaagaaat    540

gaaaccatgc atggtcccct cgtcatcacg agtttctgcc atttgcaata gaaacactga    600

aacacctttc tctttgtcac ttaattgaga tgccgaagcc acctcacacc atgaacttca    660

tgaggtgtag cacccaaggc ttccatagcc atgcatactg aagaatgtct caagctcagc    720

accctacttc tgtgacgtgt ccctcattca ccttcctctc ttccctataa ataaccacgc    780

ctcaggttct ccgcttcaca actcaaacat tctctccatt ggtccttaaa cactcatcag    840

tcatcaccat ggccaagcta gttttttccc tttgttttct gcttttcagt ggctgctgct    900

tcgctttcag ttccagagag cagcctcagc aaaacgagtg ccagatccaa aaactcaatg    960

ccctcaaacc ggataaccgt atagagtcag aaggagggct cattgagaca tggaacccta    1020

acaacaagcc attccagtgt gccggtgttg ccctctctcg ctgcaccctc aaccgcaacg    1080

cccttcgtag accttcctac accaacggtc cccaggaaat ctacatccaa caaggtaagg    1140

gtatttttgg catgatatac ccgggttgtc ctagcacatt tgaagagcct cagcaacctc    1200

aacaaagagg acaaagcagc agaccacaag accgtcacca gaagatctat aacttcagag    1260

agggtgattt gatcgcagtg cctactggtg ttgcatggtg gatgtacaac aatgaagaca    1320

ctcctgttgt tgccgtttct attattgaca ccaacagctt ggagaaccag ctcgaccaga    1380

tgcctaggag attctatctt gctgggaacc aagagcaaga gtttctaaaa tatcagcaag    1440

agcaaggagg tcatcaaagc cagaaaggaa agcatcagca agaagaagaa aacgaaggag    1500

gcagcatatt gagtggcttc accctggaat tcttggaaca tgcattcagc gtggacaagc    1560

agatagcgaa aaacctacaa ggagagaacg aaggggaaga caagggagcc attgtgacag    1620

tgaaaggagg tctgagcgtg ttaaaaccac ccacggacga gcagcaacaa agaccccagg    1680

aagaggaaga agaagaagag gatgagaagc cacagtgcaa gggtaaagac aaacactgcc    1740

aacgcccccg aggaagccaa agcaaaagca gaagaaatgg cattgacgag accatatgca    1800

ccatgagact tcgccacaac attggccaga cttcatcacc tgacatctac aaccctcaag    1860

ccggtagcgt cacaaccgcc accagccttg acttcccagc cctctcgtgg ctcagactca    1920

gtgctgagtt tggatctctc cgcaagaatg caatgttcgt gccacactac aacctgaacg    1980

cgaacagcat aatatacgca ttgaatggac gggcattgat acaagtggtg aattgcaacg    2040

gtgagagagt gtttgatgga gagctgcaag agggacgggt gctgatcgtg ccacaaaact    2100

ttgtggtggc tgcaagatca cagagtgaca acttcgagta tgtgtcattc aagaccaatg    2160

atacacccat gatcggcact cttgcagggg caaactcatt gttgaacgca ttaccagagg    2220

aagtgattca gcacactttc aacctaaaaa gccagcaggc caggcagata aagaacaaca    2280

accctttcaa gttcctggtt ccacctcagg agtctcagaa gagagctgtg gctggtggtg    2340

gatctatggc taagattaag tgcacgtggc ctgagctggt gggcaagacc gtggagaaag    2400

ccaagaagat gatcatgaag gacaagccag aggcgaagat catggttctg ccagttggga    2460

ccaaagtgac cggtgaatgg aagatggatc gcgtccgcct ctgggtcgat aagaaggaca    2520

agatcgccaa gactccgaag tgcggctagg gtacctctag acatggccac gtgcatgaag    2580

tatgaactaa aatgcatgta ggtgtaagag ctcatggaga gcatggaata ttgtatccga    2640

ccatgtaaca gtataataac tgagctccat ctcacttctt ctatgaataa acaaaggatg    2700

ttatgatata ttaacactct atctatgcac cttattgttc tatgataaat ttcctcttat    2760

tattataaat catctgaatc gtgacggctt atggaatgct tcaaatagta caaaaacaaa    2820

tgtgtactat aagactttct aaacaattct aactttagca ttgtgaacga gacataagtg    2880

ttaagaagac ataacaatta taatggaaga agtttgtctc catttatata ttatatatta    2940

cccacttatg tattatatta ggatgttaag gagacataac aattataaag agagaagttt    3000

gtatccattt atatattata tactacccat ttatatatta tacttatcca cttatttaat    3060

gtctttataa ggtttgatcc atgatatttc taatatttta gttgatatgt atatgaaagg    3120

gtactatttg aactctctta ctctgtataa aggttggatc atccttaaag tgggtctatt    3180

taattttatt gcttcttaca gataaaaaaa aaattatgag ttggtttgat aaaatattga    3240

aggatttaaa ataataataa ataataaata acatataata tatgtatata aatttattat    3300

aatataacat ttatctataa aaaagtaaat attgtcataa atctatacaa tcgtttagcc    3360

ttgctggacg actctcaatt atttaaacga gagtaaacat atttgacttt ttggttattt    3420

aacaaattat tatttaacac tatatgaaat tttttttttt tatcagcaaa gaaataaaat    3480

taaattaaga aggacaatgg tgtgtcccaa tccttataca accaacttcc acaagaaagt    3540

caagtcagag acaacaaaaa aacaagcaaa ggaaattttt taatttgagt tgtcttgttt    3600

gctgcataat ttatgcagta aaacactaca cataaccctt ttagcagtag agcaatggtt    3660

gaccgtgtgc ttagcttctt ttattttatt tttttatcag caaagaataa ataaaataaa    3720

atgagacact tcagggatgt ttcaacaagc tttgctctag actggaattc gtcgacgagc    3780

tccctatagt gagtcgtatt agaggccgac ttggccaaat tcgtaatcat ggtcatagct    3840

gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat    3900

aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc    3960

actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg    4020

cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct    4080

gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt    4140

atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc    4200

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<210>44

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caaacattct ctccattggt ccttaaacac tcatcagtca tcaccatggc caagctagtt    3600

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ggttgtccta gcacatttga agagcctcag caacctcaac aaagaggaca aagcagcaga    3960

ccacaagacc gtcaccagaa gatctataac ttcagagagg gtgatttgat cgcagtgcct    4020

actggtgttg catggtggat gtacaacaat gaagacactc ctgttgttgc cgtttctatt    4080

attgacacca acagcttgga gaaccagctc gaccagatgc ctaggagatt ctatcttgct    4140

gggaaccaag agcaagagtt tctaaaatat cagcaagagc aaggaggtca tcaaagccag    4200

aaaggaaagc atcagcaaga agaagaaaac gaaggaggca gcatattgag tggcttcacc    4260

ctggaattct tggaacatgc attcagcgtg gacaagcaga tagcgaaaaa cctacaagga    4320

gagaacgaag gggaagacaa gggagccatt gtgacagtga aaggaggtct gagcgtgtta    4380

aaaccaccca cggacgagca gcaacaaaga ccccaggaag aggaagaaga agaagaggat    4440

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ggccagactt catcacctga catctacaac cctcaagccg gtagcgtcac aaccgccacc    4620

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atctcacttc ttctatgaat aaacaaagga tgttatgata tattaacact ctatctatgc    5460

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ctaaccttag cattgtgaac gagacataag tgttaagaag acataacaat tataatggaa    5640

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tctaatattt tagttgatat gtatatgaaa gggtactatt tgaactctct tactctgtat    5880

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taatatatgt atataaattt attataatat aacatttatc tataaaaaag taaatattgt    6060

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tttttatcag caaagaataa aattaaatta agaaggacaa tggtgtccca atccttatac    6240

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<210>48

<211>8720

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pK8349

 

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tatgaaaggg tactatttga actctcttac tctgtataaa ggttggatca tccttaaagt    600

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gtaatagtag ttatatgtag gaaaaaagta ctgcacgcat aatatataca aaaagattaa    5520

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gcatggttaa attaggtggc caactttgtt gtgaacgata gaattttttt tatattaagt    660

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tttatattac gaaataacag tgatcaaaac aaacagtttt atctttatta acaagatttt    1380

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<210>52

<211>11611

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKS362

 

<220>

<221>misc_feature

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<223>n为a，c，g，或t

 

<400>52

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cgccactcac tattgcagct ttttcatgca ttggtcagat tgacggttga ttgtattttt    1680

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gatggttacc taatatggtc catgggtaca tgcatggtta aattaggtgg ccaactttgt    1800

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aaaaaattat gataaatatt taccatctca taagatattt aaaataatga taaaaatata    3000

gattattttt tatgcaacta gctagccaaa aagagaacac gggtatatat aaaaagagta    3060

cctttaaatt ctactgtact tcctttattc ctgacgtttt tatatcaagt ggacatacgt    3120

gaagatttta attatcagtc taaatatttc attagcactt aatacttttc tgttttattc    3180

ctatcctata agtagtcccg attctcccaa cattgcttat tcacacaact aactaagaaa    3240

gtcttccata gccccccaag cggcccatgg cctcctccga ggacgtcatc aaggagttca    3300

tgcgcttcaa ggtgcgcatg gagggctccg tgaacggcca cgagttcgag atcgagggcg    3360

agggcgaggg ccgcccctac gagggcaccc agaccgccaa gctgaaggtg accaagggcg    3420

gccccctgcc cttcgcctgg gacatcctgt ccccccagtt ccagtacggc tccaaggtgt    3480

acgtgaagca ccccgccgac atccccgact acaagaagct gtccttcccc gagggcttca    3540

agtgggagcg cgtgatgaac ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc caggactcct    3600

ccctgcagga cggctccttc atctacaagg tgaagttcat cggcgtgaac ttcccctccg    3660

acggccccgt aatgcagaag aagactatgg gctgggaggc ctccaccgag cgcctgtacc    3720

cccgcgacgg cgtgctgaag ggcgagatcc acaaggccct gaagctgaag gacggcggcc    3780

actacctggt ggagttcaag tccatctaca tggccaagaa gcccgtgcag ctgcccggct    3840

actactacgt ggactccaag ctggacatca cctcccacaa cgaggactac accatcgtgg    3900

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aagtgtgaga gtactaaata aatgctttgg ttgtacgaaa tcattacact aaataaaata    4020

atcaaagctt atatatgcct tccgctaagg ccgaatgcaa agaaattggt tctttctcgt    4080

tatcttttgc cacttttact agtacgtatt aattactact taatcatctt tgtttacggc    4140

tcattatatc cgtcgacggc gcgccgctct agaactagtg gatccgtcga cggcgcgccc    4200

gatcatccgg atatagttcc tcctttcagc aaaaaacccc tcaagacccg tttagaggcc    4260

ccaaggggtt atgctagtta ttgctcagcg gtggcagcag ccaactcagc ttcctttcgg    4320

gctttgttag cagccggatc gatccaagct gtacctcact attcctttgc cctcggacga    4380

gtgctggggc gtcggtttcc actatcggcg agtacttcta cacagccatc ggtccagacg    4440

gccgcgcttc tgcgggcgat ttgtgtacgc ccgacagtcc cggctccgga tcggacgatt    4500

gcgtcgcatc gaccctgcgc ccaagctgca tcatcgaaat tgccgtcaac caagctctga    4560

tagagttggt caagaccaat gcggagcata tacgcccgga gccgcggcga tcctgcaagc    4620

tccggatgcc tccgctcgaa gtagcgcgtc tgctgctcca tacaagccaa ccacggcctc    4680

cagaagaaga tgttggcgac ctcgtattgg gaatccccga acatcgcctc gctccagtca    4740

atgaccgctg ttatgcggcc attgtccgtc aggacattgt tggagccgaa atccgcgtgc    4800

acgaggtgcc ggacttcggg gcagtcctcg gcccaaagca tcagctcatc gagagcctgc    4860

gcgacggacg cactgacggt gtcgtccatc acagtttgcc agtgatacac atggggatca    4920

gcaatcgcgc atatgaaatc acgccatgta gtgtattgac cgattccttg cggtccgaat    4980

gggccgaacc cgctcgtctg gctaagatcg gccgcagcga tcgcatccat agcctccgcg    5040

accggctgca gaacagcggg cagttcggtt tcaggcaggt cttgcaacgt gacaccctgt    5100

gcacggcggg agatgcaata ggtcaggctc tcgctgaatt ccccaatgtc aagcacttcc    5160

ggaatcggga gcgcggccga tgcaaagtgc cgataaacat aacgatcttt gtagaaacca    5220

tcggcgcagc tatttacccg caggacatat ccacgccctc ctacatcgaa gctgaaagca    5280

cgagattctt cgccctccga gagctgcatc aggtcggaga cgctgtcgaa cttttcgatc    5340

agaaacttct cgacagacgt cgcggtgagt tcaggctttt ccatgggtat atctccttct    5400

taaagttaaa caaaattatt tctagaggga aaccgttgtg gtctccctat agtgagtcgt    5460

attaatttcg cgggatcgag atcgatccaa ttccaatccc acaaaaatct gagcttaaca    5520

gcacagttgc tcctctcaga gcagaatcgg gtattcaaca ccctcatatc aactactacg    5580

ttgtgtataa cggtccacat gccggtatat acgatgactg gggttgtaca aaggcggcaa    5640

caaacggcgt tcccggagtt gcacacaaga aatttgccac tattacagag gcaagagcag    5700

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cccactggct cacgctagga accaaaaggc ccagcagtga tccagcccca aaagagatct    5880

cctttgcccc ggagattaca atggacgatt tcctctatct ttacgatcta ggaaggaagt    5940

tcgaaggtga aggtgacgac actatgttca ccactgataa tgagaaggtt agcctcttca    6000

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agacgatcta cccgagtaac aatctccagg agatcaaata ccttcccaag aaggttaaag    6120

atgcagtcaa aagattcagg actaattgca tcaagaacac agagaaagac atatttctca    6180

agatcagaag tactattcca gtatggacga ttcaaggctt gcttcataaa ccaaggcaag    6240

taatagagat tggagtctct aaaaaggtag ttcctactga atctaaggcc atgcatggag    6300

tctaagattc aaatcgagga tctaacagaa ctcgccgtga agactggcga acagttcata    6360

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actctggtct actccaaaaa tgtcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggctattgag    6480

acttttcaac aaaggataat ttcgggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt    6540

cacttcatcg aaaggacagt agaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat    6600

aaaggaaagg ctatcattca agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca    6660

cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat    6720

tgatgtgaca tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac    6780

ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cacgctcgag ctcatttctc    6840

tattacttca gccataacaa aagaactctt ttctcttctt attaaaccat gaaaaagcct    6900

gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt ctgatcgaaa agttcgacag cgtctccgac    6960

ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt    7020

ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg ttatgtttat    7080

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gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt gcacagggtg tcacgttgca agacctgcct    7200

gaaaccgaac tgcccgctgt tctgcagccg gtcgcggagg ccatggatgc gatcgctgcg    7260

gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac    7320

actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca ctggcaaact    7380

gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc tcgatgagct gatgctttgg    7440

gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc gtgcacgcgg atttcggctc caacaatgtc    7500

ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat gttcggggat    7560

tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc tggaggccgt ggttggcttg tatggagcag    7620

cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag gatcgccgcg gctccgggcg    7680

tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct tggttgacgg caatttcgat    7740

gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc cgggactgtc    7800

gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg gccgtctgga ccgatggctg tgtagaagta    7860

ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc actcgtccga gggcaaagga atagtgaggt    7920

acctaaagaa ggagtgcgtc gaagcagatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa    7980

gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta    8040

agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta    8100

gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg    8160

ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg atgtcgaatc tgatcaacct    8220

gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc    8280

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca    8340

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg    8400

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca    8460

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa    8520

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc    8580

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc    8640

gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct    8700

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg    8760

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag    8820

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta    8880

cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg    8940

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt    9000

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt    9060

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgac    9120

attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga    9180

cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga    9240

tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg    9300

gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgg acatattgtc    9360

gttagaacgc ggctacaatt aatacataac cttatgtatc atacacatac gatttaggtg    9420

acactataga acggcgcgcc aagcttttga tccatgccct tcatttgccg cttattaatt    9480

aatttggtaa cagtccgtac taatcagtta cttatccttc ccccatcata attaatcttg    9540

gtagtctcga atgccacaac actgactagt ctcttggatc ataagaaaaa gccaaggaac    9600

aaaagaagac aaaacacaat gagagtatcc tttgcatagc aatgtctaag ttcataaaat    9660

tcaaacaaaa acgcaatcac acacagtgga catcacttat ccactagctg atcaggatcg    9720

ccgcgtcaag aaaaaaaaac tggaccccaa aagccatgca caacaacacg tactcacaaa    9780

ggtgtcaatc gagcagccca aaacattcac caactcaacc catcatgagc cctcacattt    9840

gttgtttcta acccaacctc aaactcgtat tctcttccgc cacctcattt ttgtttattt    9900

caacacccgt caaactgcat gccaccccgt ggccaaatgt ccatgcatgt taacaagacc    9960

tatgactata aatagctgca atctcggccc aggttttcat catcaagaac cagttcaata    10020

tcctagtaca ccgtattaaa gaatttaaga tatactgcgg ccgcatgact atcgactcac    10080

aatactacaa gtcgcgagac aaaaacgaca cggcacccaa aatcgcggga atccgatatg    10140

ccccgctatc gacaccatta ctcaaccgat gtgagacctt ctctctggtc tggcacattt    10200

tcagcattcc cactttcctc acaattttca tgctatgctg cgcaattcca ctgctctggc    10260

catttgtgat tgcgtatgta gtgtacgctg ttaaagacga ctccccgtcc aacggaggag    10320

tggtcaagcg atactcgcct atttcaagaa acttcttcat ctggaagctc tttggccgct    10380

acttccccat aactctgcac aagacggtgg atctggagcc cacgcacaca tactaccctc    10440

tggacgtcca ggagtatcac ctgattgctg agagatactg gccgcagaac aagtacctcc    10500

gagcaatcat caccaccatc gagtactttc tgcccgcctt catgaaacgg tctctttcta    10560

tcaacgagca ggagcagcct gccgagcgag atcctctcct gtctcccgtt tctcccagct    10620

ctccgggttc tcaacctgac aagtggatta accacgacag cagatatagc cgtggagaat    10680

catctggctc caacggccac gcctcgggct ccgaacttaa cggcaacggc aacaacggca    10740

ccactaaccg acgacctttg tcgtccgcct ctgctggctc cactgcatct gattccacgc    10800

ttcttaacgg gtccctcaac tcctacgcca accagatcat tggcgaaaac gacccacagc    10860

tgtcgcccac aaaactcaag cccactggca gaaaatacat cttcggctac cacccccacg    10920

gcattatcgg catgggagcc tttggtggaa ttgccaccga gggagctgga tggtccaagc    10980

tctttccggg catccctgtt tctcttatga ctctcaccaa caacttccga gtgcctctct    11040

acagagagta cctcatgagt ctgggagtcg cttctgtctc caagaagtcc tgcaaggccc    11100

tcctcaagcg aaaccagtct atctgcattg tcgttggtgg agcacaggaa agtcttctgg    11160

ccagacccgg tgtcatggac ctggtgctac tcaagcgaaa gggttttgtt cgacttggta    11220

tggaggtcgg aaatgtcgcc cttgttccca tcatggcctt tggtgagaac gacctctatg    11280

accaggttag caacgacaag tcgtccaagc tgtaccgatt ccagcagttt gtcaagaact    11340

tccttggatt cacccttcct ttgatgcatg cccgaggcgt cttcaactac gatgtcggtc    11400

ttgtccccta caggcgaccc gtcaacattg tggttggttc ccccattgac ttgccttatc    11460

tcccacaccc caccgacgaa gaagtgtccg aataccacga ccgatacatc gccgagctgc    11520

agcgaatcta caacgagcac aaggatgaat atttcatcga ttggaccgag gagggcaaag    11580

gagccccaga gttccgaatg attgagtaag c                                   11611

 

<210>53

<211>1422

<212>DNA

<213>大豆

 

<400>53

ggatccaact aaaaaaagct ctcaaattac attttgagtt gtttcaggtt ccattgcctt    60

attgctaaaa ctccaactaa aataacaaat agcacatgca ggtgcaaaca acacgttact    120

ctgatgaagg tgatgtgcct ctagcagtct agcttatgag gctcgctgct tatcaacgat    180

tcatcattcc ccaagacgtg tacgcagatt aaacaatgga caaaacttca atcgattata    240

gaataataat tttaacagtg ccgacttttt tctgtaaaca aaaggccaga atcatatcgc    300

acatcatctt gaatgcagtg tcgagtttgg accatttgag tacaaagcca atattgaatg    360

atttttcgat tttacatgtg tgaatcagac aaaagtgcat gcaatcactt gcaagtaaat    420

taaggatact aatctattcc tttcatttta tatgctccac ttttatataa aaaaatatac    480

attattatat atgcattatt aattattgca gtattatgct attggtttta tggccctgct    540

aaataaccta aatgagtcta actattgcat atgaatcaaa tgaaggaaga atcatgatct    600

aaacctgagt acccaatgca ataaaatgcg tcctattacc taaacttcaa acacacattg    660

ccatcggacg tataaattaa tgcatataga ttattttgag aaaagaaaac atcaaaagct    720

ctaaaacttc ttttaacttt gaaataagct gataaaaata cgctttaaat caactgtgtg    780

ctgtatataa gctgcaattt cacattttac caaaccgaaa caagaatggt aacagtgagg    840

caaaaatttg aaaaatgtcc tacttcacat tcacatcaaa ttaattacaa ctaaataaat    900

aaacatcgtg attcaagcag taatgaaagt cgaaatcaga tagaatatac acgtttaaca    960

tcaattgaat ttttttttaa atggatatat acaagtttac tattttatat ataatgaaaa    1020

ttcattttgt gttagcacaa aacttacaga aagagataaa ttttaaataa agagaattat    1080

atccaatttt ataatccaaa ataatcaaat taaagaatat tggctagata gaccggcttt    1140

ttcactgccc ctgctggata atgaaaattc atatcaaaac aatacagaag ttctagttta    1200

ataataaaaa agttggcaaa ctgtcattcc ctgttggttt ttaagccaaa tcacaattca    1260

attacgtatc agaaattaat ttaaaccaaa tatatagcta cgagggaact tcttcagtca    1320

ttactagcta gctcactaat cactatatat acgacatgct acaagtgaag tgaccatatc    1380

ttaatttcaa atcataaaat tcttccacca agttgcggcc gc                       1422

 

<210>54

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物oP34-1

 

<400>54

cgcggatcca actaaaaaaa gctctcaaat tacattttga g                        41

 

<210>55

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物oP34-2

 

<400>55

gaattcgcgg ccgcaacttg gtggaagaat tttatgattt gaaa                     44

 

<210>56

<211>7466

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pZBL115

 

<400>56

gatccgtcga cggcgcgccc gatcatccgg atatagttcc tcctttcagc aaaaaacccc    60

tcaagacccg tttagaggcc ccaaggggtt atgctagtta ttgctcagcg gtggcagcag    120

ccaactcagc ttcctttcgg gctttgttag cagccggatc gatccaagct gtacctcact    180

attcctttgc cctcggacga gtgctggggc gtcggtttcc actatcggcg agtacttcta    240

cacagccatc ggtccagacg gccgcgcttc tgcgggcgat ttgtgtacgc ccgacagtcc    300

cggctccgga tcggacgatt gcgtcgcatc gaccctgcgc ccaagctgca tcatcgaaat    360

tgccgtcaac caagctctga tagagttggt caagaccaat gcggagcata tacgcccgga    420

gccgcggcga tcctgcaagc tccggatgcc tccgctcgaa gtagcgcgtc tgctgctcca    480

tacaagccaa ccacggcctc cagaagaaga tgttggcgac ctcgtattgg gaatccccga    540

acatcgcctc gctccagtca atgaccgctg ttatgcggcc attgtccgtc aggacattgt    600

tggagccgaa atccgcgtgc acgaggtgcc ggacttcggg gcagtcctcg gcccaaagca    660

tcagctcatc gagagcctgc gcgacggacg cactgacggt gtcgtccatc acagtttgcc    720

agtgatacac atggggatca gcaatcgcgc atatgaaatc acgccatgta gtgtattgac    780

cgattccttg cggtccgaat gggccgaacc cgctcgtctg gctaagatcg gccgcagcga    840

tcgcatccat agcctccgcg accggctgca gaacagcggg cagttcggtt tcaggcaggt    900

cttgcaacgt gacaccctgt gcacggcggg agatgcaata ggtcaggctc tcgctgaatt    960

ccccaatgtc aagcacttcc ggaatcggga gcgcggccga tgcaaagtgc cgataaacat    1020

aacgatcttt gtagaaacca tcggcgcagc tatttacccg caggacatat ccacgccctc    1080

ctacatcgaa gctgaaagca cgagattctt cgccctccga gagctgcatc aggtcggaga    1140

cgctgtcgaa cttttcgatc agaaacttct cgacagacgt cgcggtgagt tcaggctttt    1200

ccatgggtat atctccttct taaagttaaa caaaattatt tctagaggga aaccgttgtg    1260

gtctccctat agtgagtcgt attaatttcg cgggatcgag atcgatccaa ttccaatccc    1320

acaaaaatct gagcttaaca gcacagttgc tcctctcaga gcagaatcgg gtattcaaca    1380

ccctcatatc aactactacg ttgtgtataa cggtccacat gccggtatat acgatgactg    1440

gggttgtaca aaggcggcaa caaacggcgt tcccggagtt gcacacaaga aatttgccac    1500

tattacagag gcaagagcag cagctgacgc gtacacaaca agtcagcaaa cagacaggtt    1560

gaacttcatc cccaaaggag aagctcaact caagcccaag agctttgcta aggccctaac    1620

aagcccacca aagcaaaaag cccactggct cacgctagga accaaaaggc ccagcagtga    1680

tccagcccca aaagagatct cctttgcccc ggagattaca atggacgatt tcctctatct    1740

ttacgatcta ggaaggaagt tcgaaggtga aggtgacgac actatgttca ccactgataa    1800

tgagaaggtt agcctcttca atttcagaaa gaatgctgac ccacagatgg ttagagaggc    1860

ctacgcagca ggtctcatca agacgatcta cccgagtaac aatctccagg agatcaaata    1920

ccttcccaag aaggttaaag atgcagtcaa aagattcagg actaattgca tcaagaacac    1980

agagaaagac atatttctca agatcagaag tactattcca gtatggacga ttcaaggctt    2040

gcttcataaa ccaaggcaag taatagagat tggagtctct aaaaaggtag ttcctactga    2100

atctaaggcc atgcatggag tctaagattc aaatcgagga tctaacagaa ctcgccgtga    2160

agactggcga acagttcata cagagtcttt tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg    2220

tcaacatggt ggagcacgac actctggtct actccaaaaa tgtcaaagat acagtctcag    2280

aagaccaaag ggctattgag acttttcaac aaaggataat ttcgggaaac ctcctcggat    2340

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acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ctatcattca agatgcctct gccgacagtg    2460

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gaagtgtctc attttatttt atttattctt tgctgataaa aaaataaaat aaaagaagct    5340

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taggggctta cataaacggt cgattaatct aattggggat gaaattgact tctcttatcc    6780

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gcaatttgca aaacaatttt gaatgaattt gtttaaaaag tattgctgtt aaatttttta    7440

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<210>57

<211>7841

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pJS89

 

<400>57

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gtctccctat agtgagtcgt attaatttcg cgggatcgag atcgatccaa ttccaatccc    1320

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gtctctgact tgactttctt gtggaagttg gttgtataag gattgggaca ccattgtcct    5520

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caaacttctc tctttataat tgttatgtct ccttaacatc ctaatataat acataagtgg    6060

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<213>Morteriella alpina

 

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ccccaatgtc aagcacttcc ggaatcggga gcgcggccga tgcaaagtgc cgataaacat    1020

aacgatcttt gtagaaacca tcggcgcagc tatttacccg caggacatat ccacgccctc    1080

ctacatcgaa gctgaaagca cgagattctt cgccctccga gagctgcatc aggtcggaga    1140

cgctgtcgaa cttttcgatc agaaacttct cgacagacgt cgcggtgagt tcaggctttt    1200

ccatgggtat atctccttct taaagttaaa caaaattatt tctagaggga aaccgttgtg    1260

gtctccctat agtgagtcgt attaatttcg cgggatcgag atcgatccaa ttccaatccc    1320

acaaaaatct gagcttaaca gcacagttgc tcctctcaga gcagaatcgg gtattcaaca    1380

ccctcatatc aactactacg ttgtgtataa cggtccacat gccggtatat acgatgactg    1440

gggttgtaca aaggcggcaa caaacggcgt tcccggagtt gcacacaaga aatttgccac    1500

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gaacttcatc cccaaaggag aagctcaact caagcccaag agctttgcta aggccctaac    1620

aagcccacca aagcaaaaag cccactggct cacgctagga accaaaaggc ccagcagtga    1680

tccagcccca aaagagatct cctttgcccc ggagattaca atggacgatt tcctctatct    1740

ttacgatcta ggaaggaagt tcgaaggtga aggtgacgac actatgttca ccactgataa    1800

tgagaaggtt agcctcttca atttcagaaa gaatgctgac ccacagatgg ttagagaggc    1860

ctacgcagca ggtctcatca agacgatcta cccgagtaac aatctccagg agatcaaata    1920

ccttcccaag aaggttaaag atgcagtcaa aagattcagg actaattgca tcaagaacac    1980

agagaaagac atatttctca agatcagaag tactattcca gtatggacga ttcaaggctt    2040

gcttcataaa ccaaggcaag taatagagat tggagtctct aaaaaggtag ttcctactga    2100

atctaaggcc atgcatggag tctaagattc aaatcgagga tctaacagaa ctcgccgtga    2160

agactggcga acagttcata cagagtcttt tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg    2220

tcaacatggt ggagcacgac actctggtct actccaaaaa tgtcaaagat acagtctcag    2280

aagaccaaag ggctattgag acttttcaac aaaggataat ttcgggaaac ctcctcggat    2340

tccattgccc agctatctgt cacttcatcg aaaggacagt agaaaaggaa ggtggctcct    2400

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cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagga    2640

cacgctcgag ctcatttctc tattacttca gccataacaa aagaactctt ttctcttctt    2700

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cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc    3180

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cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat    4200

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gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc    4320

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga    4380

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atccctgaag tgtctcattt tattttattt attctttgct gataaaaaaa taaaataaaa    5340

gaagctaagc acacggtcaa ccattgcttt actgctaaaa gggttatgtg tagtgtttta    5400

ctgcataaat tatgcagcaa acaagacaac tcaaattaaa aaatttcctt tgcttgtttt    5460

tttgttgtct ctgacttgac tttcttgtgg aagttggttg tataaggatt gggacaccat    5520

tgtcctcctt aatttaattt tattctttgc tgataaaaaa aaaaatttca tatagtgtta    5580

aataataatt tgttaaataa ccaaaaagtc aaatatgttt actctcgttt aaataattga    5640

gattcgtcca gcaaggctaa acgattgtat agatttatga caatatttac ttttttatag    5700

ataaatgtta tattataata aatttatata catatattat atgttattta ttattatttt    5760

aaatccttca atattttatc aaaccaactc ataatttttt ttttatctgt aagaagcaat    5820

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taaagacatt aaataagtgg ataagtataa tatataaatg ggtagtatat aatatataaa    6000

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gtgcaatagg ggcttacata aacggtcgat taatctaatt ggggatgaaa ttgacttctc    6780

ttatcccttc caaattgtct ctccgttatc ccttccaaat gatgttaaga tttgtattaa    6840

tatttaaaat gatatcattt tgaaagaata atttgaaaaa ggataataaa aagttaaatc    6900

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tctctcaact ctcaaatgtt tctctttaat tctatgcaac ttaagctcta attaatagca    7020

cttactagta gttagaggca gataaaaaca tgaagaaaaa aaaaactttc tttatcaatt    7080

gatacaagaa tatgatcctt tatttatatt aaagtggaag tgacatttag cctatcgcac    7140

gtagtgttga accattcctc aattgaaaga gaatgtgaag ggtgaattga aaagaaaaaa    7200

gagagatgga aaggaagaat ttgaaataga gatagaacaa caaagtttag ctctttgcct    7260

tcgtacatat attttaaaaa tattattttt cagtacaaaa atcgcaataa tgtcacacta    7320

tgatttatgt atgacattgt tgtaagttgg tgtggcgtaa gtacttgatt aaattattta    7380

tcaaatgcaa tttgcaaaac aattttgaat gaatttgttt aaaaagtatt gctgttaaat    7440

tttttatctt agaagaattg agggatcggg cg                                  7472

 

<210>61

<211>7847

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKS343

 

<400>61

ggccgcaagt atgaactaaa atgcacgtag gtgtaagagc tcatggagag catggaatat    60

tgtatccgac catgtaacag tataataact gagctccatc tcacttcttc tatgaataaa    120

caaaggatgt tatgatatat taacactcta tctatgcacc ttattgttct atgataaatt    180

tcctcttatt attataaatc atctgaatcg tgacggctta tggaatgctt caaatagtac    240

aaaaacaaat gtgtactata agactttcta aacaattcta actttagcat tgtgaacgag    300

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tatatattac ccacttatgt attatattag gatgttaagg agacataaca attataaaga    420

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ttatttaatg tctttataag gtttgatcca tgatatttct aatattttag ttgatatgta    540

tatgaaaggg tactatttga actctcttac tctgtataaa ggttggatca tccttaaagt    600

gggtctattt aattttattg cttcttacag ataaaaaaaa aattatgagt tggtttgata    660

aaatattgaa ggatttaaaa taataataaa taacatataa tatatgtata taaatttatt    720

ataatataac atttatctat aaaaaagtaa atattgtcat aaatctatac aatcgtttag    780

ccttgctgga cgaatctcaa ttatttaaac gagagtaaac atatttgact ttttggttat    840

ttaacaaatt attatttaac actatatgaa attttttttt ttatcagcaa agaataaaat    900

taaattaagg aggacaatgg tgtcccaatc cttatacaac caacttccac aagaaagtca    960

agtcagagac aacaaaaaaa caagcaaagg aaatttttta atttgagttg tcttgtttgc    1020

tgcataattt atgcagtaaa acactacaca taaccctttt agcagtaaag caatggttga    1080

ccgtgtgctt agcttctttt attttatttt tttatcagca aagaataaat aaaataaaat    1140

gagacacttc agggatgttt caacggatcc aagcttggcg cgccgttcta tagtgtcacc    1200

taaatcgtat gtgtatgata cataaggtta tgtattaatt gtagccgcgt tctaacgaca    1260

atatgtccat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc    1320

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caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca    1500

tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga    1560

tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa    1620

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aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt    1740

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taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat    1860

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cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag    2040

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cactattcct ttgccctcgg acgagtgctg gggcgtcggt ttccactatc ggcgagtact    2760

tctacacagc catcggtcca gacggccgcg cttctgcggg cgatttgtgt acgcccgaca    2820

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gagacgctgt cgaacttttc gatcagaaac ttctcgacag acgtcgcggt gagttcaggc    3720

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ctcactatag ggagaccaca acggtttccc tctagaaata attttgttta actttaagaa    5220

ggagatatac ccatggaaaa gcctgaactc accgcgacgt ctgtcgagaa gtttctgatc    5280

gaaaagttcg acagcgtctc cgacctgatg cagctctcgg agggcgaaga atctcgtgct    5340

ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat gtcctgcggg taaatagctg cgccgatggt    5400

ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac tttgcatcgg ccgcgctccc gattccggaa    5460

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ggaccgcaag gaatcggtca atacactaca tggcgtgatt tcatatgcgc gattgctgat    5700

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gcaggatcgc cgcggctccg ggcgtatatg ctccgcattg gtcttgacca actctatcag    6060

agcttggttg acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc agggtcgatg cgacgcaatc    6120

gtccgatccg gagccgggac tgtcgggcgt acacaaatcg cccgcagaag cgcggccgtc    6180

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tgcaagtaaa ttaaggatac taatctattc ctttcatttt atatgctcca cttttatata    6900

aaaaaatata cattattata tatgcattat taattattgc agtattatgc tattggtttt    6960

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aacacacatt gccatcggac gtataaatta atgcatatag attattttga gaaaagaaaa    7140

catcaaaagc tctaaaactt cttttaactt tgaaataagc tgataaaaat acgctttaaa    7200

tcaactgtgt gctgtatata agctgcaatt tcacatttta ccaaaccgaa acaagaatgg    7260

taacagtgag gcaaaaattt gaaaaatgtc ctacttcaca ttcacatcaa attaattaca    7320

actaaataaa taaacatcgt gattcaagca gtaatgaaag tcgaaatcag atagaatata    7380

cacgtttaac atcaattgaa ttttttttta aatggatata tacaagttta ctattttata    7440

tataatgaaa attcattttg tgttagcaca aaacttacag aaagagataa attttaaata    7500

aagagaatta tatccaattt tataatccaa aataatcaaa ttaaagaata ttggctagat    7560

agaccggctt tttcactgcc cctgctggat aatgaaaatt catatcaaaa caatacagaa    7620

gttctagttt aataataaaa aagttggcaa actgtcattc cctgttggtt tttaagccaa    7680

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gtgaccatat cttaatttca aatcataaaa ttcttccacc aagttgc                  7847

 

<210>62

<211>10866

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKS352

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(9689)..(9689)

<223>n为a，c，g，或t

 

<400>62

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gtattaattg tagccgcgtt ctaacgacaa tatgtccata tggtgcactc tcagtacaat    120

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ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt    300

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ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct    420

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tattaaatgt ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa taacgtcatg    1380

cattacatgt taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat gataatcatc    1440

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tcgatctcga tcccgcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagaccacaa cggtttccct    4020

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ctcaaattac attttgagtt gtttcaggtt ccattgcctt attgctaaaa ctccaactaa    5340

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tacgcagatt aaacaatgga caaaacttca atcgattata gaataataat tttaacagtg    5520

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gaaataagct gataaaaata cgctttaaat caactgtgtg ctgtatataa gctgcaattt    6060

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gtctccattt atatattata tattacccac ttatgtatta tattaggatg ttaaggagac    7080

ataacaatta taaagagaga agtttgtatc catttatata ttatatacta cccatttata    7140

tattatactt atccacttat ttaatgtctt tataaggttt gatccatgat atttctaata    7200

ttttagttga tatgtatatg aaagggtact atttgaactc tcttactctg tataaaggtt    7260

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tataaaaaca ttatttatat ttatattgtt gacaaccaaa tttgcctatc aaatctaacc    9600

aatataatgc atgcgtggca ggtaatgtac taccatgaac ttaagtcatg acataataaa    9660

ccgtgaatct gaccaatgca tgtacctanc taaattgtat ttgtgacacg aagcaaatga    9720

ttcaattcac aatggagatg ggaaacaaat aatgaagaac ccagaactaa gaaagctttt    9780

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tcacttaact tttatttttt ttttcttttt atttatcata aagagaatat tgataatata    10680

ctttttaaca tatttttatg acatttttta ttggtgaaaa cttattaaaa atcataaatt    10740

ttgtaagtta gatttattta aagagttcct cttcttattt taaatttttt aataaatttt    10800

taaataacta aaatttgtgt taaaaatgtt aaaaaagtgt gttattaacc cttctcttcg    10860

aggatc                                                               10866

 

<210>63

<211>12055

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKS364

 

<400>63

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aatcagttac ttatccttcc cccatcataa ttaatcttgg tagtctcgaa tgccacaaca    120

ctgactagtc tcttggatca taagaaaaag ccaaggaaca aaagaagaca aaacacaatg    180

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agtactttct gcccgccttc atgaaacggt ctctttctat caacgagcag gagcagcctg    1140

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tggtgctact caagcgaaag ggttttgttc gacttggtat ggaggtcgga aatgtcgccc    1800

ttgttcccat catggccttt ggtgagaacg acctctatga ccaggttagc aacgacaagt    1860

cgtccaagct gtaccgattc cagcagtttg tcaagaactt ccttggattc acccttcctt    1920

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aggatgaata tttcatcgat tggaccgagg agggcaaagg agccccagag ttccgaatga    2160

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tatgaataaa caaaggatgt tatgatatat taacactcta tctatgcacc ttattgttct    2340

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ttgatatgta tatgaaaggg tactatttga actctcttac tctgtataaa ggttggatca    2760

tccttaaagt gggtctattt aattttattg cttcttacag ataaaaaaaa aattatgagt    2820

tggtttgata aaatattgaa ggatttaaaa taataataaa taacatataa tatatgtata    2880

taaatttatt ataatataac atttatctat aaaaaagtaa atattgtcat aaatctatac    2940

aatcgtttag ccttgctgga cgaatctcaa ttatttaaac gagagtaaac atatttgact    3000

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aacacttaca acaccggatt ttttttaatt aaaatgtgcc atttaggata aatagttaat    3480

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attaatatgt ttaaatcaac acaatctatc aaaattaaac taaaaaaaaa ataagtgtac    3600

gtggttaaca ttagtacagt aatataagag gaaaatgaga aattaagaaa ttgaaagcga    3660

gtctaatttt taaattatga acctgcatat ataaaaggaa agaaagaatc caggaagaaa    3720

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acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg    11460

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg    11520

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acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca    11760

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ttgtactgag agtgcaccat atggacatat tgtcgttaga acgcggctac aattaataca    12000

taaccttatg tatcatacac atacgattta ggtgacacta tagaacggcg cgcca         12055

 

<210>64

<211>1581

<212>DNA

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>64

atggaggtgc gcagacgcaa gattgacgtt ctcaaggccc agaagaatgg ttacgagtcc    60

ggcccaccat ctagacagtc ctctcagcca tcctctagag cctcctccag aacacgcaac    120

aagcactcct cctccacact ttccctttcc ggcctcacca tgaaggtgca gaagaagcca    180

gctggtccac cagccaactc caagacccca ttcctccaca tcaagccagt gcacacttgc    240

tgctccacct caatgctctc cagagactac gacggctcca acccatcctt caagggcttc    300

aagaacatcg gcatgatcat cctcatcgtg ggcaatcttc gcctcgcctt cgagaactac    360

ctcaagtacg gcatctccaa ccccttcttc gaccccaaga tcacaccctc cgagtggcag    420

ctttctggac ttctcatcgt tgtggcttac gctcacatcc tcatggctta cgctatcgag    480

tccgctgcca agctcctctt cctctcctcc aagcaccact acatggccgt tggtctcctc    540

cacaccatga acaccctctc ctccatttcc ctcctctcct acgtggtgta ctactacctc    600

cccaatccag tggctggcac tatcgttgag ttcgtggccg tgatcctttc tctcaagctc    660

gcttcctacg cccttaccaa ctccgatctc agaaaggctg ccattcacgc ccagaagctc    720

gacaagacac aggacgacaa cgagaaggag tccacctcct cttcctcttc ctctgacgac    780

gccgagacac ttgccgacat cgacgttatc ccagcttact acgctcagct tccctaccca    840

cagaacgtta ccctctccaa cctcctctac ttctggttcg ctcccaccct tgtgtaccag    900

cccgtttacc caaagacaga gagaatccgc cccaagcatg tgatccgcaa cctcttcgag    960

cttgtgtctc tctgcatgct catccagttc ctcatcttcc agtacgccta ccccatcatg    1020

cagtcttgcc ttgccctctt cttccagcca aagctcgact acgccaacat ttccgagcgc    1080

ctcatgaagc tcgcctctgt gtccatgatg gtgtggctca tcggtttcta cgccttcttc    1140

cagaacggtc tcaacctcat cgccgagctc acctgcttcg gtaaccgcac attctaccag    1200

cagtggtgga actccagatc tattggccag tactggacac tctggaacaa gcccgtgaac    1260

cagtacttcc gccatcacgt ttacgttcct cttctcgcta ggggcatgtc cagattcaac    1320

gcctctgttg tggtgttctt cttctccgct gtgattcacg agctccttgt gggcattccc    1380

acacacaaca tcatcggcgc tgccttcttc ggaatgatgt cccaggtgcc acttatcatg    1440

gccaccgaga accttcagca catcaactcc tcccttggcc cattccttgg taactgcgct    1500

ttctggttca ccttcttcct tggtcagcct acctgcgcct ttctctacta ccttgcctac    1560

aactacaagc agaaccagta g                                              1581

 

<210>65

<211>526

<212>PRT

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>65

Met Glu Val Arg Arg Arg Lys Ile Asp Val Leu Lys Ala Gln Lys Asn

1               5                   10                  15

Gly Tyr Glu Ser Gly Pro Pro Ser Arg Gln Ser Ser Gln Pro Ser Ser

            20                  25                  30

Arg Ala Ser Ser Arg Thr Arg Asn Lys His Ser Ser Ser Thr Leu Ser

        35                  40                  45

Leu Ser Gly Leu Thr Met Lys Val Gln Lys Lys Pro Ala Gly Pro Pro

    50                  55                  60

Ala Asn Ser Lys Thr Pro Phe Leu His Ile Lys Pro Val His Thr Cys

65                  70                  75                  80

Cys Ser Thr Ser Met Leu Ser Arg Asp Tyr Asp Gly Ser Asn Pro Ser

                85                  90                  95

Phe Lys Gly Phe Lys Asn Ile Gly Met Ile Ile Leu Ile Val Gly Asn

            100                 105                 110

Leu Arg Leu Ala Phe Glu Asn Tyr Leu Lys Tyr Gly Ile Ser Asn Pro

        115                 120                 125

Phe Phe Asp Pro Lys Ile Thr Pro Ser Glu Trp Gln Leu Ser Gly Leu

    130                 135                 140

Leu Ile Val Val Ala Tyr Ala His Ile Leu Met Ala Tyr Ala Ile Glu

145                 150                 155                 160

Ser Ala Ala Lys Leu Leu Phe Leu Ser Ser Lys His His Tyr Met Ala

                165                 170                 175

Val Gly Leu Leu His Thr Met Asn Thr Leu Ser Ser Ile Ser Leu Leu

            180                 185                 190

Ser Tyr Val Val Tyr Tyr Tyr Leu Pro Asn Pro Val Ala Gly Thr Ile

        195                 200                 205

Val Glu Phe Val Ala Val Ile Leu Ser Leu Lys Leu Ala Ser Tyr Ala

    210                 215                 220

Leu Thr Asn Ser Asp Leu Arg Lys Ala Ala Ile His Ala Gln Lys Leu

225                 230                 235                 240

Asp Lys Thr Gln Asp Asp Asn Glu Lys Glu Ser Thr Ser Ser Ser Ser

                245                 250                 255

Ser Ser Asp Asp Ala Glu Thr Leu Ala Asp Ile Asp Val Ile Pro Ala

            260                 265                 270

Tyr Tyr Ala Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Asn Val Thr Leu Ser Asn Leu

        275                 280                 285

Leu Tyr Phe Trp Phe Ala Pro Thr Leu Val Tyr Gln Pro Val Tyr Pro

    290                 295                 300

Lys Thr Glu Arg Ile Arg Pro Lys His Val Ile Arg Asn Leu Phe Glu

305                 310                 315                 320

Leu Val Ser Leu Cys Met Leu Ile Gln Phe Leu Ile Phe Gln Tyr Ala

                325                 330                 335

Tyr Pro Ile Met Gln Ser Cys Leu Ala Leu Phe Phe Gln Pro Lys Leu

            340                 345                 350

Asp Tyr Ala Asn Ile Ser Glu Arg Leu Met Lys Leu Ala Ser Val Ser

        355                 360                 365

Met Met Val Trp Leu Ile Gly Phe Tyr Ala Phe Phe Gln Asn Gly Leu

    370                 375                 380

Asn Leu Ile Ala Glu Leu Thr Cys Phe Gly Asn Arg Thr Phe Tyr Gln

385                 390                 395                 400

Gln Trp Trp Asn Ser Arg Ser Ile Gly Gln Tyr Trp Thr Leu Trp Asn

                405                 410                 415

Lys Pro Val Asn Gln Tyr Phe Arg His His Val Tyr Val Pro Leu Leu

            420                 425                 430

Ala Arg Gly Met Ser Arg Phe Asn Ala Ser Val Val Val Phe Phe Phe

        435                 440                 445

Ser Ala Val Ile His Glu Leu Leu Val Gly Ile Pro Thr His Asn Ile

    450                 455                 460

Ile Gly Ala Ala Phe Phe Gly Met Met Ser Gln Val Pro Leu Ile Met

465                 470                 475                 480

Ala Thr Glu Asn Leu Gln His Ile Asn Ser Ser Leu Gly Pro Phe Leu

                485                 490                 495

Gly Asn Cys Ala Phe Trp Phe Thr Phe Phe Leu Gly Gln Pro Thr Cys

            500                 505                 510

Ala Phe Leu Tyr Tyr Leu Ala Tyr Asn Tyr Lys Gln Asn Gln

        515                 520                 525

 

<210>66

<211>1545

<212>DNA

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>66

atgaccatcg actcccagta ctacaagtcc cgcgacaaga acgacaccgc tcccaagatt    60

gctggtatcc gctacgctcc tctgtctact ccactcttga accgctgcga gactttctct    120

ttggtgtggc acatcttctc catccctacc ttcctcacca tcttcatgct ctgctgtgcc    180

attcccttgc tctggccctt cgtgatcgct tacgttgtgt acgccgtgaa ggatgactcc    240

ccttccaacg gcggtgttgt gaagcgctat tcccctatct cccgcaactt cttcatctgg    300

aagctctttg gccgctactt ccccatcacc ctccacaaga ccgttgattt ggagcccacc    360

cacacttact atcccttgga cgtccaagag taccacctga ttgctgagcg ctattggcct    420

cagaacaagt acctgcgcgc catcattacc accatcgagt acttcctgcc cgctttcatg    480

aagcgttccc tctccatcaa cgagcaggag cagcctgctg agagagaccc tctgttgtct    540

cccgtttccc cctcttctcc tggttctcag cccgacaagt ggatcaacca tgattcccgc    600

tattccagag gtgagtcctc tggctccaat ggtcatgctt ctggctctga actgaatggc    660

aatggcaaca acggcactac caatcgccgc cctctttctt ctgcttccgc tggctctact    720

gcttctgact ctaccttgct caacggctct ctcaactcct acgccaacca gatcattggc    780

gagaacgacc ctcagttgtc tcccactaag ctcaagccta ctggcaggaa gtacatcttc    840

gggtaccatc ctcacggtat cattgggatg ggcgcctttg gtggcattgc tactgaaggt    900

gctggctggt ccaagctctt tcctggtatc cccgtttccc tcatgaccct caccaacaac    960

tttcgcgttc ctctctatcg cgagtacctc atgtccctgg gcgttgcttc cgtttctaag    1020

aagtcctgta aggccctcct caagcgtaat cagtccatct gcatcgtggt gggtggtgcc    1080

caggaatcct tgttggctag gcctggtgtt atggatctcg tgttgctgaa gcgcaagggt    1140

tttgtgcgct tgggtatgga ggtgggcaat gttgccctcg ttccaatcat ggctttcggc    1200

gagaacgatc tctacgacca ggtgtccaac gacaagtcct ccaagctgta ccgcttccag    1260

cagttcgtga agaacttcct cggcttcacc ctccctctca tgcatgccag aggtgtgttc    1320

aactacgatg ttgggctcgt tccctaccgc cgccctgtga acattgtggt tggttctcct    1380

atcgacttgc cttacctccc tcatcccacc gatgaggaag tttccgagta ccacgaccgt    1440

tacatcgctg agctccagcg catctacaac gagcacaagg acgagtactt catcgactgg    1500

actgaggagg gtaagggcgc tcctgagttt cgtatgatcg agtag                    1545

 

<210>67

<211>514

<212>PRT

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>67

Met Thr Ile Asp Ser Gln Tyr Tyr Lys Ser Arg Asp Lys Asn Asp Thr

1               5                   10                  15

Ala Pro Lys Ile Ala Gly Ile Arg Tyr Ala Pro Leu Ser Thr Pro Leu

            20                  25                  30

Leu Asn Arg Cys Glu Thr Phe Ser Leu Val Trp His Ile Phe Ser Ile

        35                  40                  45

Pro Thr Phe Leu Thr Ile Phe Met Leu Cys Cys Ala Ile Pro Leu Leu

    50                  55                  60

Trp Pro Phe Val Ile Ala Tyr Val Val Tyr Ala Val Lys Asp Asp Ser

65                  70                  75                  80

Pro Ser Asn Gly Gly Val Val Lys Arg Tyr Ser Pro Ile Ser Arg Asn

                85                  90                  95

Phe Phe Ile Trp Lys Leu Phe Gly Arg Tyr Phe Pro Ile Thr Leu His

            100                 105                 110

Lys Thr Val Asp Leu Glu Pro Thr His Thr Tyr Tyr Pro Leu Asp Val

        115                 120                 125

Gln Glu Tyr His Leu Ile Ala Glu Arg Tyr Trp Pro Gln Asn Lys Tyr

    130                 135                 140

Leu Arg Ala Ile Ile Thr Thr Ile Glu Tyr Phe Leu Pro Ala Phe Met

145                 150                 155                 160

Lys Arg Ser Leu Ser Ile Asn Glu Gln Glu Gln Pro Ala Glu Arg Asp

                165                 170                 175

Pro Leu Leu Ser Pro Val Ser Pro Ser Ser Pro Gly Ser Gln Pro Asp

            180                 185                 190

Lys Trp Ile Asn His Asp Ser Arg Tyr Ser Arg Gly Glu Ser Ser Gly

        195                 200                 205

Ser Asn Gly His Ala Ser Gly Ser Glu Leu Asn Gly Asn Gly Asn Asn

    210                 215                 220

Gly Thr Thr Asn Arg Arg Pro Leu Ser Ser Ala Ser Ala Gly Ser Thr

225                 230                 235                 240

Ala Ser Asp Ser Thr Leu Leu Asn Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Ala Asn

                245                 250                 255

Gln Ile Ile Gly Glu Asn Asp Pro Gln Leu Ser Pro Thr Lys Leu Lys

            260                 265                 270

Pro Thr Gly Arg Lys Tyr Ile Phe Gly Tyr His Pro His Gly Ile Ile

        275                 280                 285

Gly Met Gly Ala Phe Gly Gly Ile Ala Thr Glu Gly Ala Gly Trp Ser

    290                 295                 300

Lys Leu Phe Pro Gly Ile Pro Val Ser Leu Met Thr Leu Thr Asn Asn

305                 310                 315                 320

Phe Arg Val Pro Leu Tyr Arg Glu Tyr Leu Met Ser Leu Gly Val Ala

                325                 330                 335

Ser Val Ser Lys Lys Ser Cys Lys Ala Leu Leu Lys Arg Asn Gln Ser

            340                 345                 350

Ile Cys Ile Val Val Gly Gly Ala Gln Glu Ser Leu Leu Ala Arg Pro

        355                 360                 365

Gly Val Met Asp Leu Val Leu Leu Lys Arg Lys Gly Phe Val Arg Leu

    370                 375                 380

Gly Met Glu Val Gly Asn Val Ala Leu Val Pro Ile Met Ala Phe Gly

385                 390                 395                 400

Glu Asn Asp Leu Tyr Asp Gln Val Ser Asn Asp Lys Ser Ser Lys Leu

                405                 410                 415

Tyr Arg Phe Gln Gln Phe Val Lys Asn Phe Leu Gly Phe Thr Leu Pro

            420                 425                 430

Leu Met His Ala Arg Gly Val Phe Asn Tyr Asp Val Gly Leu Val Pro

        435                 440                 445

Tyr Arg Arg Pro Val Asn Ile Val Val Gly Ser Pro Ile Asp Leu Pro

    450                 455                 460

Tyr Leu Pro His Pro Thr Asp Glu Glu Val Ser Glu Tyr His Asp Arg

465                 470                 475                 480

Tyr Ile Ala Glu Leu Gln Arg Ile Tyr Asn Glu His Lys Asp Glu Tyr

                485                 490                 495

Phe Ile Asp Trp Thr Glu Glu Gly Lys Gly Ala Pro Glu Phe Arg Met

            500                 505                 510

Ile Glu

 

<210>68

<211>8638

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR1234

 

<400>68

ggccgcaagt atgaactaaa atgcatgtag gtgtaagagc tcatggagag catggaatat    60

tgtatccgac catgtaacag tataataact gagctccatc tcacttcttc tatgaataaa    120

caaaggatgt tatgatatat taacactcta tctatgcacc ttattgttct atgataaatt    180

tcctcttatt attataaatc atctgaatcg tgacggctta tggaatgctt caaatagtac    240

aaaaacaaat gtgtactata agactttcta aacaattcta accttagcat tgtgaacgag    300

acataagtgt taagaagaca taacaattat aatggaagaa gtttgtctcc atttatatat    360

tatatattac ccacttatgt attatattag gatgttaagg agacataaca attataaaga    420

gagaagtttg tatccattta tatattatat actacccatt tatatattat acttatccac    480

ttatttaatg tctttataag gtttgatcca tgatatttct aatattttag ttgatatgta    540

tatgaaaggg tactatttga actctcttac tctgtataaa ggttggatca tccttaaagt    600

gggtctattt aattttattg cttcttacag ataaaaaaaa aattatgagt tggtttgata    660

aaatattgaa ggatttaaaa taataataaa taacatataa tatatgtata taaatttatt    720

ataatataac atttatctat aaaaaagtaa atattgtcat aaatctatac aatcgtttag    780

ccttgctgga cgaatctcaa ttatttaaac gagagtaaac atatttgact ttttggttat    840

ttaacaaatt attatttaac actatatgaa attttttttt ttatcagcaa agaataaaat    900

taaattaaga aggacaatgg tgtcccaatc cttatacaac caacttccac aagaaagtca    960

agtcagagac aacaaaaaaa caagcaaagg aaatttttta atttgagttg tcttgtttgc    1020

tgcataattt atgcagtaaa acactacaca taaccctttt agcagtagag caatggttga    1080

ccgtgtgctt agcttctttt attttatttt tttatcagca aagaataaat aaaataaaat    1140

gagacacttc agggatgttt caacaagctt ggcgcgccgt tctatagtgt cacctaaatc    1200

gtatgtgtat gatacataag gttatgtatt aattgtagcc gcgttctaac gacaatatgt    1260

ccatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac    1320

acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca    1380

gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga    1440

aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgacca    1500

aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag    1560

gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac    1620

cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa    1680

ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc    1740

accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag    1800

tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac    1860

cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc    1920

gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagca ttgagaaagc gccacgcttc    1980

ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca    2040

cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc    2100

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg    2160

ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct    2220

ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata    2280

ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc    2340

gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc aggttgatcg    2400

attcgacatc gatctagtaa catagatgac accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg    2460

cgctatattt tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt gcgggactct aatcataaaa    2520

acccatctca taaataacgt catgcattac atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc    2580

aacagaaatt atatgataat catcgcaaga ccggcaacag gattcaatct taagaaactt    2640

tattgccaaa tgtttgaacg atctgcttcg acgcactcct tctttaggta cctcactatt    2700

cctttgccct cggacgagtg ctggggcgtc ggtttccact atcggcgagt acttctacac    2760

agccatcggt ccagacggcc gcgcttctgc gggcgatttg tgtacgcccg acagtcccgg    2820

ctccggatcg gacgattgcg tcgcatcgac cctgcgccca agctgcatca tcgaaattgc    2880

cgtcaaccaa gctctgatag agttggtcaa gaccaatgcg gagcatatac gcccggagcc    2940

gcggcgatcc tgcaagctcc ggatgcctcc gctcgaagta gcgcgtctgc tgctccatac    3000

aagccaacca cggcctccag aagaagatgt tggcgacctc gtattgggaa tccccgaaca    3060

tcgcctcgct ccagtcaatg accgctgtta tgcggccatt gtccgtcagg acattgttgg    3120

agccgaaatc cgcgtgcacg aggtgccgga cttcggggca gtcctcggcc caaagcatca    3180

gctcatcgag agcctgcgcg acggacgcac tgacggtgtc gtccatcaca gtttgccagt    3240

gatacacatg gggatcagca atcgcgcata tgaaatcacg ccatgtagtg tattgaccga    3300

ttccttgcgg tccgaatggg ccgaacccgc tcgtctggct aagatcggcc gcagcgatcg    3360

catccatggc ctccgcgacc ggctgcagaa cagcgggcag ttcggtttca ggcaggtctt    3420

gcaacgtgac accctgtgca cggcgggaga tgcaataggt caggctctcg ctgaattccc    3480

caatgtcaag cacttccgga atcgggagcg cggccgatgc aaagtgccga taaacataac    3540

gatctttgta gaaaccatcg gcgcagctat ttacccgcag gacatatcca cgccctccta    3600

catcgaagct gaaagcacga gattcttcgc cctccgagag ctgcatcagg tcggagacgc    3660

tgtcgaactt ttcgatcaga aacttctcga cagacgtcgc ggtgagttca ggctttttca    3720

tggtttaata agaagagaaa agagttcttt tgttatggct gaagtaatag agaaatgagc    3780

tcgagcgtgt cctctccaaa tgaaatgaac ttccttatat agaggaaggg tcttgcgaag    3840

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ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat    3960

ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt gaatgatagc ctttccttta tcgcaatgat    4020

ggcatttgta ggagccacct tccttttcta ctgtcctttc gatgaagtga cagatagctg    4080

ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgaaa ttatcctttg ttgaaaagtc tcaatagccc    4140

tttggtcttc tgagactgta tctttgacat ttttggagta gaccagagtg tcgtgctcca    4200

ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat tgagtcgtaa aagactctgt atgaactgtt    4260

cgccagtctt cacggcgagt tctgttagat cctcgatttg aatcttagac tccatgcatg    4320

gccttagatt cagtaggaac taccttttta gagactccaa tctctattac ttgccttggt    4380

ttatgaagca agccttgaat cgtccatact ggaatagtac ttctgatctt gagaaatatg    4440

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ttgggaaggt atttgatctc ctggagattg ttactcgggt agatcgtctt gatgagacct    4560

gctgcgtagg cctctctaac catctgtggg tcagcattct ttctgaaatt gaagaggcta    4620

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ggtgggcttg ttagggcctt agcaaagctc ttgggcttga gttgagcttc tcctttgggg    4860

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tacccatgga aaagcctgaa ctcaccgcga cgtctgtcga gaagtttctg atcgaaaagt    5280

tcgacagcgt ctccgacctg atgcagctct cggagggcga agaatctcgt gctttcagct    5340

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aagatcgtta tgtttatcgg cactttgcat cggccgcgct cccgattccg gaagtgcttg    5460

acattgggga attcagcgag agcctgacct attgcatctc ccgccgtgca cagggtgtca    5520

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tgtatcactg gcaaactgtg atggacgaca ccgtcagtgc gtccgtcgcg caggctctcg    5760

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tcggctccaa caatgtcctg acggacaatg gccgcataac agcggtcatt gactggagcg    5880

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tggcttgtat ggagcagcag acgcgctact tcgagcggag gcatccggag cttgcaggat    6000

cgccgcggct ccgggcgtat atgctccgca ttggtcttga ccaactctat cagagcttgg    6060

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atgcccttca tttgccgctt attaattaat ttggtaacag tccgtactaa tcagttactt    6540

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ttggatcata agaaaaagcc aaggaacaaa agaagacaaa acacaatgag agtatccttt    6660

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cacttatcca ctagctgatc aggatcgccg cgtcaagaaa aaaaaactgg accccaaaag    6780

ccatgcacaa caacacgtac tcacaaaggt gtcaatcgag cagcccaaaa cattcaccaa    6840

ctcaacccat catgagccct cacatttgtt gtttctaacc caacctcaaa ctcgtattct    6900

cttccgccac ctcatttttg tttatttcaa cacccgtcaa actgcatgcc accccgtggc    6960

caaatgtcca tgcatgttaa caagacctat gactataaat agctgcaatc tcggcccagg    7020

ttttcatcat caagaaccag ttcaatatcc tagtacaccg tattaaagaa tttaagatat    7080

actgcggccg catgactatc gactcacaat actacaagtc gcgagacaaa aacgacacgg    7140

cacccaaaat cgcgggaatc cgatatgccc cgctatcgac accattactc aaccgatgtg    7200

agaccttctc tctggtctgg cacattttca gcattcccac tttcctcaca attttcatgc    7260

tatgctgcgc aattccactg ctctggccat ttgtgattgc gtatgtagtg tacgctgtta    7320

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tcttcatctg gaagctcttt ggccgctact tccccataac tctgcacaag acggtggatc    7440

tggagcccac gcacacatac taccctctgg acgtccagga gtatcacctg attgctgaga    7500

gatactggcc gcagaacaag tacctccgag caatcatcac caccatcgag tactttctgc    7560

ccgccttcat gaaacggtct ctttctatca acgagcagga gcagcctgcc gagcgagatc    7620

ctctcctgtc tcccgtttct cccagctctc cgggttctca acctgacaag tggattaacc    7680

acgacagcag atatagccgt ggagaatcat ctggctccaa cggccacgcc tcgggctccg    7740

aacttaacgg caacggcaac aacggcacca ctaaccgacg acctttgtcg tccgcctctg    7800

ctggctccac tgcatctgat tccacgcttc ttaacgggtc cctcaactcc tacgccaacc    7860

agatcattgg cgaaaacgac ccacagctgt cgcccacaaa actcaagccc actggcagaa    7920

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ccaccgaggg agctggatgg tccaagctct ttccgggcat ccctgtttct cttatgactc    8040

tcaccaacaa cttccgagtg cctctctaca gagagtacct catgagtctg ggagtcgctt    8100

ctgtctccaa gaagtcctgc aaggccctcc tcaagcgaaa ccagtctatc tgcattgtcg    8160

ttggtggagc acaggaaagt cttctggcca gacccggtgt catggacctg gtgctactca    8220

agcgaaaggg ttttgttcga cttggtatgg aggtcggaaa tgtcgccctt gttcccatca    8280

tggcctttgg tgagaacgac ctctatgacc aggttagcaa cgacaagtcg tccaagctgt    8340

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ttggttcccc cattgacttg ccttatctcc cacaccccac cgacgaagaa gtgtccgaat    8520

accacgaccg atacatcgcc gagctgcagc gaatctacaa cgagcacaag gatgaatatt    8580

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<210>69

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物oSGly-2

 

<400>69

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<210>70

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物oSGly-3

 

<400>70

taagcttcgt acgctagcct aagtacgtac tc                                  32

 

<210>71

<211>3673

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pPSgly32

 

<400>71

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attgcgcgct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc    120

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tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg    300

cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg    360

gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga    420

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gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag    540

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ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt    720

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc    780

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc    840

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ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat    1080

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt    1140

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agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc    1320

gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata    1380

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cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct    1560

acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa    1620

cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt    1680

cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca    1740

ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac    1800

tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca    1860

atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt    1920

tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc    1980

actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca    2040

aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata    2100

ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc    2160

ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc    2220

cgaaaagtgc cacctaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt    2280

gttaaatcag ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa    2340

aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa    2400

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gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga    2520

accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa    2580

aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc    2640

tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcccattcgc    2700

cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc    2760

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agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg agcgcgcgta atacgactca ctatagggcg    2880

aattgggtac cgggcccccc ctcgaggtcg acggtatcga taagcttgat atcgaattcc    2940

tgcagcccgg gggatccgcc ctaagcttcg tacgctagcc taagtacgta ctcaaaatgc    3000

caacaaataa aaaaaaagtt gctttaataa tgccaaaaca aattaataaa acacttacaa    3060

caccggattt tttttaatta aaatgtgcca tttaggataa atagttaata tttttaataa    3120

ttatttaaaa agccgtatct actaaaatga tttttatttg gttgaaaata ttaatatgtt    3180

taaatcaaca caatctatca aaattaaact aaaaaaaaaa taagtgtacg tggttaacat    3240

tagtacagta atataagagg aaaatgagaa attaagaaat tgaaagcgag tctaattttt    3300

aaattatgaa cctgcatata taaaaggaaa gaaagaatcc aggaagaaaa gaaatgaaac    3360

catgcatggt cccctcgtca tcacgagttt ctgccatttg caatagaaac actgaaacac    3420

ctttctcttt gtcacttaat tgagatgccg aagccacctc acaccatgaa cttcatgagg    3480

tgtagcaccc aaggcttcca tagccatgca tactgaagaa tgtctcaagc tcagcaccct    3540

acttctgtga cgtgtccctc attcaccttc ctctcttccc tataaataac cacgcctcag    3600

gttctccgct tcacaactca aacattctct ccattggtcc ttaaacactc atcagtcatc    3660

accgcggccg ctt                                                       3673

 

<210>72

<211>4171

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR264

 

<400>72

gcccggggga tccgccctaa gcttcgtacg ctagcctaag tacgtactca aaatgccaac    60

aaataaaaaa aaagttgctt taataatgcc aaaacaaatt aataaaacac ttacaacacc    120

ggattttttt taattaaaat gtgccattta ggataaatag ttaatatttt taataattat    180

ttaaaaagcc gtatctacta aaatgatttt tatttggttg aaaatattaa tatgtttaaa    240

tcaacacaat ctatcaaaat taaactaaaa aaaaaataag tgtacgtggt taacattagt    300

acagtaatat aagaggaaaa tgagaaatta agaaattgaa agcgagtcta atttttaaat    360

tatgaacctg catatataaa aggaaagaaa gaatccagga agaaaagaaa tgaaaccatg    420

catggtcccc tcgtcatcac gagtttctgc catttgcaat agaaacactg aaacaccttt    480

ctctttgtca cttaattgag atgccgaagc cacctcacac catgaacttc atgaggtgta    540

gcacccaagg cttccatagc catgcatact gaagaatgtc tcaagctcag caccctactt    600

ctgtgacgtg tccctcattc accttcctct cttccctata aataaccacg cctcaggttc    660

tccgcttcac aactcaaaca ttctctccat tggtccttaa acactcatca gtcatcaccg    720

cggccgcatt tcgcaccaaa tcaatgaaag taataatgaa aagtctgaat aagaatactt    780

aggcttagat gcctttgtta cttgtgtaaa ataacttgag tcatgtacct ttggcggaaa    840

cagaataaat aaaaggtgaa attccaatgc tctatgtata agttagtaat acttaatgtg    900

ttctacggtt gtttcaatat catcaaactc taattgaaac tttagaacca caaatctcaa    960

tcttttctta atgaaatgaa aaatcttaat tgtaccatgt ttatgttaaa caccttacaa    1020

ttggttggag aggaggacca accgatggga caacattggg agaaagagat tcaatggaga    1080

tttggatagg agaacaacat tctttttcac ttcaatacaa gatgagtgca acactaagga    1140

tatgtatgag actttcagaa gctacgacaa catagatgag tgaggtggtg attcctagca    1200

agaaagacat tagaggaagc caaaatcgaa caaggaagac atcaagggca agagacagga    1260

ccatccatct caggaaaagg agctttggga tagtccgaga agttgtacaa gaaatttttt    1320

ggagggtgag tgatgcattg ctggtgactt taactcaatc aaaattgaga aagaaagaaa    1380

agggaggggg ctcacatgtg aatagaaggg aaacgggaga attttacagt tttgatctaa    1440

tgggcatccc agctagtggt aacatattca ccatgtttaa ccttcacgta cgtctagagg    1500

atccccgggt accgagctcg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa    1560

accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta    1620

atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat    1680

ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt    1740

gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa    1800

cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg    1860

tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga    1920

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt    1980

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt    2040

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat    2100

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt    2160

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg    2220

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga    2280

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc    2340

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac    2400

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg    2460

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca    2520

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg    2580

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg    2640

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg    2700

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag    2760

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg    2820

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct    2880

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac    2940

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact    3000

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<210>73

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<210>75

<211>11693

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR1236

 

<400>75

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cctgcgcgac ggacgcactg acggtgtcgt ccatcacagt ttgccagtga tacacatggg    5460

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tcgtgatgac gaggggacca tgcatggttt catttctttt cttcctggat tctttctttc    11340

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cattttcctc ttatattact gtactaatgt taaccacgta cacttatttt ttttttagtt    11460

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<210>76

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物oYDG2-1

 

<400>76

agcggccgca acatgactat cgactcacaa tact                                34

 

<210>77

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物oYDG2-2

 

<400>77

tgcggccgct tactcaatca ttcgg                                          25

 

<210>78

<211>5079

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR1254

 

<400>78

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tagcttgagt attctaacgc gtcacctaaa tagcttggcg taatcatggt catagctgtt    120

tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa    180

gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact    240

gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc    300

ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg    360

ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc    420

cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaagcccag    480

gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca    540

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atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag    720

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cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg    1080

cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg    1140

gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta    1200

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ggcgacgtcg cgcgcggtga gcaccggaac ggcactggtc aacttggcca tggtggccct    1620

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tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc    1740

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tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga    3360

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cgctatcgac accattactc aaccgatgtg agaccttctc tctggtctgg cacattttca    3660

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tccccataac tctgcacaag acggtggatc tggagcccac gcacacatac taccctctgg    3900

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ttatcggcat gggagccttt ggtggaattg ccaccgaggg agctggatgg tccaagctct    4440

ttccgggcat ccctgtttct cttatgactc tcaccaacaa cttccgagtg cctctctaca    4500

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<210>79

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物YlD2_Y326F-5

 

<400>79

cttccgagtg cctctcttca gagagtacct catg                                34

 

<210>80

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物YlD2_Y326F-3

 

<400>80

catgaggtac tctctgaaga gaggcactcg gaag                                34

 

<210>81

<211>5079

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR1254_Y326F

 

<400>81

aattccagca cactggcggc cgttactagt ggatccgagc tcggtaccaa gcttgatgca    60

tagcttgagt attctaacgc gtcacctaaa tagcttggcg taatcatggt catagctgtt    120

tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa    180

gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact    240

gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc    300

ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg    360

ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc    420

cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaagcccag    480

gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca    540

tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca    600

ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg    660

atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag    720

gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt    780

tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca    840

cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg    900

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gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta    1200

gatcctttta aattaaaaat gaagttttag cacgtgtcag tcctgctcct cggccacgaa    1260

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cacctggtcc tggaccgcgc tgatgaacag ggtcacgtcg tcccggacca caccggcgaa    1500

gtcgtcctcc acgaagtccc gggagaaccc gagccggtcg gtccagaact cgaccgctcc    1560

ggcgacgtcg cgcgcggtga gcaccggaac ggcactggtc aacttggcca tggtggccct    1620

cctcacgtgc tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt    1680

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc    1740

acctgtatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggaaa    1800

ttgtaagcgt taataattca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc    1860

gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc    1920

tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc    1980

cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag    2040

gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgctcgcctt gagcctggcg    2100

aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga    2160

ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg    2220

caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc    2280

tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc    2340

cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg    2400

gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtct tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg    2460

gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag    2520

cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga    2580

gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga    2640

tcagagcttg atcccctgcg ccatcagatc cttggcggcg agaaagccat ccagtttact    2700

ttgcagggct tcccaacctt accagagggc gccccagctg gcaattccgg ttcgcttgct    2760

gtccataaaa ccgcccagtc tagctatcgc catgtaagcc cactgcaagc tacctgcttt    2820

ctctttgcgc ttgcgttttc ccttgtccag atagcccagt agctgacatt catccggggt    2880

cagcaccgtt tctgcggact ggctttctac gtgaaaagga tctaggtgaa gatccttttt    2940

gataatctca tgcctgacat ttatattccc cagaacatca ggttaatggc gtttttgatg    3000

tcattttcgc ggtggctgag atcagccact tcttccccga taacggagac cggcacactg    3060

gccatatcgg tggtcatcat gcgccagctt tcatccccga tatgcaccac cgggtaaagt    3120

tcacgggaga ctttatctga eagcagacgt gcactggcca gggggatcac catccgtcgc    3180

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ttataggtgt aaaccttaaa ctgccgtacg tataggctgc gcaactgttg ggaagggcga    3300

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ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa    3420

ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggccctctag atgcatgctc gagcggccgc    3480

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actacaagtc gcgagacaaa aacgacacgg cacccaaaat cgcgggaatc cgatatgccc    3600

cgctatcgac accattactc aaccgatgtg agaccttctc tctggtctgg cacattttca    3660

gcattcccac tttcctcaca attttcatgc tatgctgcgc aattccactg ctctggccat    3720

ttgtgattgc gtatgtagtg tacgctgtta aagacgactc cccgtccaac ggaggagtgg    3780

tcaagcgata ctcgcctatt tcaagaaact tcttcatctg gaagctcttt ggccgctact    3840

tccccataac tctgcacaag acggtggatc tggagcccac gcacacatac taccctctgg    3900

acgtccagga gtatcacctg attgctgaga gatactggcc gcagaacaag tacctccgag    3960

caatcatcac caccatcgag tactttctgc ccgccttcat gaaacggtct ctttctatca    4020

acgagcagga gcagcctgcc gagcgagatc ctctcctgtc tcccgtttct cccagctctc    4080

cgggttctca acctgacaag tggattaacc acgacagcag atatagccgt ggagaatcat    4140

ctggctccaa cggccacgcc tcgggctccg aacttaacgg caacggcaac aacggcacca    4200

ctaaccgacg acctttgtcg tccgcctctg ctggctccac tgcatctgat tccacgcttc    4260

ttaacgggtc cctcaactcc tacgccaacc agatcattgg cgaaaacgac ccacagctgt    4320

cgcccacaaa actcaagccc actggcagaa aatacatctt cggctaccac ccccacggca    4380

ttatcggcat gggagccttt ggtggaattg ccaccgaggg agctggatgg tccaagctct    4440

ttccgggcat ccctgtttct cttatgactc tcaccaacaa cttccgagtg cctctcttca    4500

gagagtacct catgagtctg ggagtcgctt ctgtctccaa gaagtcctgc aaggccctcc    4560

tcaagcgaaa ccagtctatc tgcattgtcg ttggtggagc acaggaaagt cttctggcca    4620

gacccggtgt catggacctg gtgctactca agcgaaaggg ttttgttcga cttggtatgg    4680

aggtcggaaa tgtcgccctt gttcccatca tggcctttgg tgagaacgac ctctatgacc    4740

aggttagcaa cgacaagtcg tccaagctgt accgattcca gcagtttgtc aagaacttcc    4800

ttggattcac ccttcctttg atgcatgccc gaggcgtctt caactacgat gtcggtcttg    4860

tcccctacag gcgacccgtc aacattgtgg ttggttcccc cattgacttg ccttatctcc    4920

cacaccccac cgacgaagaa gtgtccgaat accacgaccg atacatcgcc gagctgcagc    4980

gaatctacaa cgagcacaag gatgaatatt tcatcgattg gaccgaggag ggcaaaggag    5040

ccccagagtt ccgaatgatt gagtaagcgg ccgcacctg                           5079

 

<210>82

<211>1545

<212>DNA

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>82

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gcgggaatcc gatatgcccc gctatcgaca ccattactca accgatgtga gaccttctct    120

ctggtctggc acattttcag cattcccact ttcctcacaa ttttcatgct atgctgcgca    180

attccactgc tctggccatt tgtgattgcg tatgtagtgt acgctgttaa agacgactcc    240

ccgtccaacg gaggagtggt caagcgatac tcgcctattt caagaaactt cttcatctgg    300

aagctctttg gccgctactt ccccataact ctgcacaaga cggtggatct ggagcccacg    360

cacacatact accctctgga cgtccaggag tatcacctga ttgctgagag atactggccg    420

cagaacaagt acctccgagc aatcatcacc accatcgagt actttctgcc cgccttcatg    480

aaacggtctc tttctatcaa cgagcaggag cagcctgccg agcgagatcc tctcctgtct    540

cccgtttctc ccagctctcc gggttctcaa cctgacaagt ggattaacca cgacagcaga    600

tatagccgtg gagaatcatc tggctccaac ggccacgcct cgggctccga acttaacggc    660

aacggcaaca acggcaccac taaccgacga cctttgtcgt ccgcctctgc tggctccact    720

gcatctgatt ccacgcttct taacgggtcc ctcaactcct acgccaacca gatcattggc    780

gaaaacgacc cacagctgtc gcccacaaaa ctcaagccca ctggcagaaa atacatcttc    840

ggctaccacc cccacggcat tatcggcatg ggagcctttg gtggaattgc caccgaggga    900

gctggatggt ccaagctctt tccgggcatc cctgtttctc ttatgactct caccaacaac    960

ttccgagtgc ctctcttcag agagtacctc atgagtctgg gagtcgcttc tgtctccaag    1020

aagtcctgca aggccctcct caagcgaaac cagtctatct gcattgtcgt tggtggagca    1080

caggaaagtc ttctggccag acccggtgtc atggacctgg tgctactcaa gcgaaagggt    1140

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attgacttgc cttatctccc acaccccacc gacgaagaag tgtccgaata ccacgaccga    1440

tacatcgccg agctgcagcg aatctacaac gagcacaagg atgaatattt catcgattgg    1500

accgaggagg gcaaaggagc cccagagttc cgaatgattg agtaa                    1545

 

<210>83

<211>514

<212>PRT

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>83

Met Thr Ile Asp Ser Gln Tyr Tyr Lys Ser Arg Asp Lys Asn Asp Thr

1               5                   10                  15

Ala Pro Lys Ile Ala Gly Ile Arg Tyr Ala Pro Leu Ser Thr Pro Leu

            20                  25                  30

Leu Asn Arg Cys Glu Thr Phe Ser Leu Val Trp His Ile Phe Ser Ile

        35                  40                  45

Pro Thr Phe Leu Thr Ile Phe Met Leu Cys Cys Ala Ile Pro Leu Leu

    50                  55                  60

Trp Pro Phe Val Ile Ala Tyr Val Val Tyr Ala Val Lys Asp Asp Ser

65                  70                  75                  80

Pro Ser Asn Gly Gly Val Val Lys Arg Tyr Ser Pro Ile Ser Arg Asn

                85                  90                  95

Phe Phe Ile Trp Lys Leu Phe Gly Arg Tyr Phe Pro Ile Thr Leu His

            100                 105                 110

Lys Thr Val Asp Leu Glu Pro Thr His Thr Tyr Tyr Pro Leu Asp Val

        115                 120                 125

Gln Glu Tyr His Leu Ile Ala Glu Arg Tyr Trp Pro Gln Asn Lys Tyr

    130                 135                 140

Leu Arg Ala Ile Ile Thr Thr Ile Glu Tyr Phe Leu Pro Ala Phe Met

145                 150                 155                 160

Lys Arg Ser Leu Ser Ile Asn Glu Gln Glu Gln Pro Ala Glu Arg Asp

                165                 170                 175

Pro Leu Leu Ser Pro Val Ser Pro Ser Ser Pro Gly Ser Gln Pro Asp

            180                 185                 190

Lys Trp Ile Asn His Asp Ser Arg Tyr Ser Arg Gly Glu Ser Ser Gly

        195                 200                 205

Ser Asn Gly His Ala Ser Gly Ser Glu Leu Asn Gly Asn Gly Asn Asn

    210                 215                 220

Gly Thr Thr Asn Arg Arg Pro Leu Ser Ser Ala Ser Ala Gly Ser Thr

225                 230                 235                 240

Ala Ser Asp Ser Thr Leu Leu Asn Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Ala Asn

                245                 250                 255

Gln Ile Ile Gly Glu Asn Asp Pro Gln Leu Ser Pro Thr Lys Leu Lys

            260                 265                 270

Pro Thr Gly Arg Lys Tyr Ile Phe Gly Tyr His Pro His Gly Ile Ile

        275                 280                 285

Gly Met Gly Ala Phe Gly Gly Ile Ala Thr Glu Gly Ala Gly Trp Ser

    290                 295                 300

Lys Leu Phe Pro Gly Ile Pro Val Ser Leu Met Thr Leu Thr Asn Asn

305                 310                 315                 320

Phe Arg Val Pro Leu Phe Arg Glu Tyr Leu Met Ser Leu Gly Val Ala

                325                 330                 335

Ser Val Ser Lys Lys Ser Cys Lys Ala Leu Leu Lys Arg Asn Gln Ser

            340                 345                 350

Ile Cys Ile Val Val Gly Gly Ala Gln Glu Ser Leu Leu Ala Arg Pro

        355                 360                 365

Gly Val Met Asp Leu Val Leu Leu Lys Arg Lys Gly Phe Val Arg Leu

    370                 375                 380

Gly Met Glu Val Gly Asn Val Ala Leu Val Pro Ile Met Ala Phe Gly

385                 390                 395                 400

Glu Asn Asp Leu Tyr Asp Gln Val Ser Asn Asp Lys Ser Ser Lys Leu

                405                 410                 415

Tyr Arg Phe Gln Gln Phe Val Lys Asn Phe Leu Gly Phe Thr Leu Pro

            420                 425                 430

Leu Met His Ala Arg Gly Val Phe Asn Tyr Asp Val Gly Leu Val Pro

        435                 440                 445

Tyr Arg Arg Pro Val Asn Ile Val Val Gly Ser Pro Ile Asp Leu Pro

    450                 455                 460

Tyr Leu Pro His Pro Thr Asp Glu Glu Val Ser Glu Tyr His Asp Arg

465                 470                 475                 480

Tyr Ile Ala Glu Leu Gln Arg Ile Tyr Asn Glu His Lys Asp Glu Tyr

                485                 490                 495

Phe Ile Asp Trp Thr Glu Glu Gly Lys Gly Ala Pro Glu Phe Arg Met

            500                 505                 510

Ile Glu

 

<210>84

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物YlD2_Y326L-5

 

<400>84

cttccgagtg cctctcctca gagagtacct catg                                34

 

<210>85

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物YlD2_Y326L-3

 

<400>85

catgaggtac tctctgagga gaggcactcg gaag                                34

 

<210>86

<211>5079

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR1254_Y326L

 

<400>86

aattccagca cactggcggc cgttactagt ggatccgagc tcggtaccaa gcttgatgca    60

tagcttgagt attctaacgc gtcacctaaa tagcttggcg taatcatggt catagctgtt    120

tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa    180

gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact    240

gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc    300

ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg    360

ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc    420

cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaagcccag    480

gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca    540

tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca    600

ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg    660

atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag    720

gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt    780

tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca    840

cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg    900

cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt    960

tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc    1020

cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg    1080

cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg    1140

gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta    1200

gatcctttta aattaaaaat gaagttttag cacgtgtcag tcctgctcct cggccacgaa    1260

gtgcacgcag ttgccggccg ggtcgcgcag ggcgaactcc cgcccccacg gctgctcgcc    1320

gatctcggtc atggccggcc cggaggcgtc ccggaagttc gtggacacga cctccgacca    1380

ctcggcgtac agctcgtcca ggccgcgcac ccacacccag gccagggtgt tgtccggcac    1440

cacctggtcc tggaccgcgc tgatgaacag ggtcacgtcg tcccggacca caccggcgaa    1500

gtcgtcctcc acgaagtccc gggagaaccc gagccggtcg gtccagaact cgaccgctcc    1560

ggcgacgtcg cgcgcggtga gcaccggaac ggcactggtc aacttggcca tggtggccct    1620

cctcacgtgc tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt    1680

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc    1740

acctgtatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggaaa    1800

ttgtaagcgt taataattca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc    1860

gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc    1920

tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc    1980

cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag    2040

gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgctcgcctt gagcctggcg    2100

aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga    2160

ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg    2220

caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc    2280

tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc    2340

cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg    2400

gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtct tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg    2460

gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag    2520

cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga    2580

gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga    2640

tcagagcttg atcccctgcg ccatcagatc cttggcggcg agaaagccat ccagtttact    2700

ttgcagggct tcccaacctt accagagggc gccccagctg gcaattccgg ttcgcttgct    2760

gtccataaaa ccgcccagtc tagctatcgc catgtaagcc cactgcaagc tacctgcttt    2820

ctctttgcgc ttgcgttttc ccttgtccag atagcccagt agctgacatt catccggggt    2880

cagcaccgtt tctgcggact ggctttctac gtgaaaagga tctaggtgaa gatccttttt    2940

gataatctca tgcctgacat ttatattccc cagaacatca ggttaatggc gtttttgatg    3000

tcattttcgc ggtggctgag atcagccact tcttccccga taacggagac cggcacactg    3060

gccatatcgg tggtcatcat gcgccagctt tcatccccga tatgcaccac cgggtaaagt    3120

tcacgggaga ctttatctga cagcagacgt gcactggcca gggggatcac catccgtcgc    3180

cccggcgtgt caataatatc actctgtaca tccacaaaca gacgataacg gctctctctt    3240

ttataggtgt aaaccttaaa ctgccgtacg tataggctgc gcaactgttg ggaagggcga    3300

tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga    3360

ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa    3420

ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggccctctag atgcatgctc gagcggccgc    3480

cagtgtgatg gatatctgca gaattcagga gcggccgcaa catgactatc gactcacaat    3540

actacaagtc gcgagacaaa aacgacacgg cacccaaaat cgcgggaatc cgatatgccc    3600

cgctatcgac accattactc aaccgatgtg agaccttctc tctggtctgg cacattttca    3660

gcattcccac tttcctcaca attttcatgc tatgctgcgc aattccactg ctctggccat    3720

ttgtgattgc gtatgtagtg tacgctgtta aagacgactc cccgtccaac ggaggagtgg    3780

tcaagcgata ctcgcctatt tcaagaaact tcttcatctg gaagctcttt ggccgctact    3840

tccccataac tctgcacaag acggtggatc tggagcccac gcacacatac taccctctgg    3900

acgtccagga gtatcacctg attgctgaga gatactggcc gcagaacaag tacctccgag    3960

caatcatcac caccatcgag tactttctgc ccgccttcat gaaacggtct ctttctatca    4020

acgagcagga gcagcctgcc gagcgagatc ctctcctgtc tcccgtttct cccagctctc    4080

cgggttctca acctgacaag tggattaacc acgacagcag atatagccgt ggagaatcat    4140

ctggctccaa cggccacgcc tcgggctccg aacttaacgg caacggcaac aacggcacca    4200

ctaaccgacg acctttgtcg tccgcctctg ctggctccac tgcatctgat tccacgcttc    4260

ttaacgggtc cctcaactcc tacgccaacc agatcattgg cgaaaacgac ccacagctgt    4320

cgcccacaaa actcaagccc actggcagaa aatacatctt cggctaccac ccccacggca    4380

ttatcggcat gggagccttt ggtggaattg ccaccgaggg agctggatgg tccaagctct    4440

ttccgggcat ccctgtttct cttatgactc tcaccaacaa cttccgagtg cctctcctca    4500

gagagtacct catgagtctg ggagtcgctt ctgtctccaa gaagtcctgc aaggccctcc    4560

tcaagcgaaa ccagtctatc tgcattgtcg ttggtggagc acaggaaagt cttctggcca    4620

gacccggtgt catggacctg gtgctactca agcgaaaggg ttttgttcga cttggtatgg    4680

aggtcggaaa tgtcgccctt gttcccatca tggcctttgg tgagaacgac ctctatgacc    4740

aggttagcaa cgacaagtcg tccaagctgt accgattcca gcagtttgtc aagaacttcc    4800

ttggattcac ccttcctttg atgcatgccc gaggcgtctt caactacgat gtcggtcttg    4860

tcccctacag gcgacccgtc aacattgtgg ttggttcccc cattgacttg ccttatctcc    4920

cacaccccac cgacgaagaa gtgtccgaat accacgaccg atacatcgcc gagctgcagc    4980

gaatctacaa cgagcacaag gatgaatatt tcatcgattg gaccgaggag ggcaaaggag    5040

ccccagagtt ccgaatgatt gagtaagcgg ccgcacctg                           5079

 

<210>87

<211>1545

<212>DNA

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>87

atgactatcg actcacaata ctacaagtcg cgagacaaaa acgacacggc acccaaaatc    60

gcgggaatcc gatatgcccc gctatcgaca ccattactca accgatgtga gaccttctct    120

ctggtctggc acattttcag cattcccact ttcctcacaa ttttcatgct atgctgcgca    180

attccactgc tctggccatt tgtgattgcg tatgtagtgt acgctgttaa agacgactcc    240

ccgtccaacg gaggagtggt caagcgatac tcgcctattt caagaaactt cttcatctgg    300

aagctctttg gccgctactt ccccataact ctgcacaaga cggtggatct ggagcccacg    360

cacacatact accctctgga cgtccaggag tatcacctga ttgctgagag atactggccg    420

cagaacaagt acctccgagc aatcatcacc accatcgagt actttctgcc cgccttcatg    480

aaacggtctc tttctatcaa cgagcaggag cagcctgccg agcgagatcc tctcctgtct    540

cccgtttctc ccagctctcc gggttctcaa cctgacaagt ggattaacca cgacagcaga    600

tatagccgtg gagaatcatc tggctccaac ggccacgcct cgggctccga acttaacggc    660

aacggcaaca acggcaccac taaccgacga cctttgtcgt ccgcctctgc tggctccact    720

gcatctgatt ccacgcttct taacgggtcc ctcaactcct acgccaacca gatcattggc    780

gaaaacgacc cacagctgtc gcccacaaaa ctcaagccca ctggcagaaa atacatcttc    840

ggctaccacc cccacggcat tatcggcatg ggagcctttg gtggaattgc caccgaggga    900

gctggatggt ccaagctctt tccgggcatc cctgtttctc ttatgactct caccaacaac    960

ttccgagtgc ctctcctcag agagtacctc atgagtctgg gagtcgcttc tgtctccaag    1020

aagtcctgca aggccctcct caagcgaaac cagtctatct gcattgtcgt tggtggagca    1080

caggaaagtc ttctggccag acccggtgtc atggacctgg tgctactcaa gcgaaagggt    1140

tttgttcgac ttggtatgga ggtcggaaat gtcgcccttg ttcccatcat ggcctttggt    1200

gagaacgacc tctatgacca ggttagcaac gacaagtcgt ccaagctgta ccgattccag    1260

cagtttgtca agaacttcct tggattcacc cttcctttga tgcatgcccg aggcgtcttc    1320

aactacgatg tcggtcttgt cccctacagg cgacccgtca acattgtggt tggttccccc    1380

attgacttgc cttatctccc acaccccacc gacgaagaag tgtccgaata ccacgaccga    1440

tacatcgccg agctgcagcg aatctacaac gagcacaagg atgaatattt catcgattgg    1500

accgaggagg gcaaaggagc cccagagttc cgaatgattg agtaa                    1545

 

<210>88

<211>514

<212>PRT

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>88

Met Thr Ile Asp Ser Gln Tyr Tyr Lys Ser Arg Asp Lys Asn Asp Thr

1               5                   10                  15

Ala Pro Lys Ile Ala Gly Ile Arg Tyr Ala Pro Leu Ser Thr Pro Leu

            20                  25                  30

Leu Asn Arg Cys Glu Thr Phe Ser Leu Val Trp His Ile Phe Ser Ile

        35                  40                  45

Pro Thr Phe Leu Thr Ile Phe Met Leu Cys Cys Ala Ile Pro Leu Leu

    50                  55                  60

Trp Pro Phe Val Ile Ala Tyr Val Val Tyr Ala Val Lys Asp Asp Ser

65                  70                  75                  80

Pro Ser Asn Gly Gly Val Val Lys Arg Tyr Ser Pro Ile Ser Arg Asn

                85                  90                  95

Phe Phe Ile Trp Lys Leu Phe Gly Arg Tyr Phe Pro Ile Thr Leu His

            100                 105                 110

Lys Thr Val Asp Leu Glu Pro Thr His Thr Tyr Tyr Pro Leu Asp Val

        115                 120                 125

Gln Glu Tyr His Leu Ile Ala Glu Arg Tyr Trp Pro Gln Asn Lys Tyr

    130                 135                 140

Leu Arg Ala Ile Ile Thr Thr Ile Glu Tyr Phe Leu Pro Ala Phe Met

145                 150                 155                 160

Lys Arg Ser Leu Ser Ile Asn Glu Gln Glu Gln Pro Ala Glu Arg Asp

                165                 170                 175

Pro Leu Leu Ser Pro Val Ser Pro Ser Ser Pro Gly Ser Gln Pro Asp

            180                 185                 190

Lys Trp Ile Asn His Asp Ser Arg Tyr Ser Arg Gly Glu Ser Ser Gly

        195                 200                 205

Ser Asn Gly His Ala Ser Gly Ser Glu Leu Asn Gly Asn Gly Asn Asn

    210                 215                 220

Gly Thr Thr Asn Arg Arg Pro Leu Ser Ser Ala Ser Ala Gly Ser Thr

225                 230                 235                 240

Ala Ser Asp Ser Thr Leu Leu Asn Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Ala Asn

                245                 250                 255

Gln Ile Ile Gly Glu Asn Asp Pro Gln Leu Ser Pro Thr Lys Leu Lys

            260                 265                 270

Pro Thr Gly Arg Lys Tyr Ile Phe Gly Tyr His Pro His Gly Ile Ile

        275                 280                 285

Gly Met Gly Ala Phe Gly Gly Ile Ala Thr Glu Gly Ala Gly Trp Ser

    290                 295                 300

Lys Leu Phe Pro Gly Ile Pro Val Ser Leu Met Thr Leu Thr Asn Asn

305                 310                 315                 320

Phe Arg Val Pro Leu Leu Arg Glu Tyr Leu Met Ser Leu Gly Val Ala

                325                 330                 335

Ser Val Ser Lys Lys Ser Cys Lys Ala Leu Leu Lys Arg Asn Gln Ser

            340                 345                 350

Ile Cys Ile Val Val Gly Gly Ala Gln Glu Ser Leu Leu Ala Arg Pro

        355                 360                 365

Gly Val Met Asp Leu Val Leu Leu Lys Arg Lys Gly Phe Val Arg Leu

    370                 375                 380

Gly Met Glu Val Gly Asn Val Ala Leu Val Pro Ile Met Ala Phe Gly

385                 390                 395                 400

Glu Asn Asp Leu Tyr Asp Gln Val Ser Asn Asp Lys Ser Ser Lys Leu

                405                 410                 415

Tyr Arg Phe Gln Gln Phe Val Lys Asn Phe Leu Gly Phe Thr Leu Pro

            420                 425                 430

Leu Met His Ala Arg Gly Val Phe Asn Tyr Asp Val Gly Leu Val Pro

        435                 440                 445

Tyr Arg Arg Pro Val Asn Ile Val Val Gly Ser Pro Ile Asp Leu Pro

    450                 455                 460

Tyr Leu Pro His Pro Thr Asp Glu Glu Val Ser Glu Tyr His Asp Arg

465                 470                 475                 480

Tyr Ile Ala Glu Leu Gln Arg Ile Tyr Asn Glu His Lys Asp Glu Tyr

                485                 490                 495

Phe Ile Asp Trp Thr Glu Glu Gly Lys Gly Ala Pro Glu Phe Arg Met

            500                 505                 510

Ile Glu

 

<210>89

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物YlD2_R327K-5

 

<400>89

ccgagtgcct ctctacaaag agtacctcat gagtc                               35

 

<210>90

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物YlD2_R327K-3

 

<400>90

gactcatgag gtactctttg tagagaggca ctcgg                               35

 

<210>91

<211>5079

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR1254_R327K

 

<400>91

aattccagca cactggcggc cgttactagt ggatccgagc tcggtaccaa gcttgatgca    60

tagcttgagt attctaacgc gtcacctaaa tagcttggcg taatcatggt catagctgtt    120

tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa    180

gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact    240

gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc    300

ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg    360

ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc    420

cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaagcccag    480

gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca    540

tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca    600

ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg    660

atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag    720

gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt    780

tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca    840

cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg    900

cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt    960

tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc    1020

cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg    1080

cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg    1140

gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta    1200

gatcctttta aattaaaaat gaagttttag cacgtgtcag tcctgctcct cggccacgaa    1260

gtgcacgcag ttgccggccg ggtcgcgcag ggcgaactcc cgcccccacg gctgctcgcc    1320

gatctcggtc atggccggcc cggaggcgtc ccggaagttc gtggacacga cctccgacca    1380

ctcggcgtac agctcgtcca ggccgcgcac ccacacccag gccagggtgt tgtccggcac    1440

cacctggtcc tggaccgcgc tgatgaacag ggtcacgtcg tcccggacca caccggcgaa    1500

gtcgtcctcc acgaagtccc gggagaaccc gagccggtcg gtccagaact cgaccgctcc    1560

ggcgacgtcg cgcgcggtga gcaccggaac ggcactggtc aacttggcca tggtggccct    1620

cctcacgtgc tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt    1680

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc    1740

acctgtatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggaaa    1800

ttgtaagcgt taataattca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc    1860

gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc    1920

tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc    1980

cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag    2040

gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgctcgcctt gagcctggcg    2100

aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga    2160

ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg    2220

caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc    2280

tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc    2340

cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg    2400

gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtct tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg    2460

gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag    2520

cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga    2580

gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga    2640

tcagagcttg atcccctgcg ccatcagatc cttggcggcg agaaagccat ccagtttact    2700

ttgcagggct tcccaacctt accagagggc gccccagctg gcaattccgg ttcgcttgct    2760

gtccataaaa ccgcccagtc tagctatcgc catgtaagcc cactgcaagc tacctgcttt    2820

ctctttgcgc ttgcgttttc ccttgtccag atagcccagt agctgacatt catccggggt    2880

cagcaccgtt tctgcggact ggctttctac gtgaaaagga tctaggtgaa gatccttttt    2940

gataatctca tgcctgacat ttatattccc cagaacatca ggttaatggc gtttttgatg    3000

tcattttcgc ggtggctgag atcagccact tcttccccga taacggagac cggcacactg    3060

gccatatcgg tggtcatcat gcgccagctt tcatccccga tatgcaccac cgggtaaagt    3120

tcacgggaga ctttatctga cagcagacgt gcactggcca gggggatcac catccgtcgc    3180

cccggcgtgt caataatatc actctgtaca tccacaaaca gacgataacg gctctctctt    3240

ttataggtgt aaaccttaaa ctgccgtacg tataggctgc gcaactgttg ggaagggcga    3300

tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga    3360

ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa    3420

ttgtaatacg actcactata gggcgaattg ggccctctag atgcatgctc gagcggccgc    3480

cagtgtgatg gatatctgca gaattcagga gcggccgcaa catgactatc gactcacaat    3540

actacaagtc gcgagacaaa aacgacacgg cacccaaaat cgcgggaatc cgatatgccc    3600

cgctatcgac accattactc aaccgatgtg agaccttctc tctggtctgg cacattttca    3660

gcattcccac tttcctcaca attttcatgc tatgctgcgc aattccactg ctctggccat    3720

ttgtgattgc gtatgtagtg tacgctgtta aagacgactc cccgtccaac ggaggagtgg    3780

tcaagcgata ctcgcctatt tcaagaaact tcttcatctg gaagctcttt ggccgctact    3840

tccccataac tctgcacaag acggtggatc tggagcccac gcacacatac taccctctgg    3900

acgtccagga gtatcacctg attgctgaga gatactggcc gcagaacaag tacctccgag    3960

caatcatcac caccatcgag tactttctgc ccgccttcat gaaacggtct ctttctatca    4020

acgagcagga gcagcctgcc gagcgagatc ctctcctgtc tcccgtttct cccagctctc    4080

cgggttctca acctgacaag tggattaacc acgacagcag atatagccgt ggagaatcat    4140

ctggctccaa cggccacgcc tcgggctccg aacttaacgg caacggcaac aacggcacca    4200

ctaaccgacg acctttgtcg tccgcctctg ctggctccac tgcatctgat tccacgcttc    4260

ttaacgggtc cctcaactcc tacgccaacc agatcattgg cgaaaacgac ccacagctgt    4320

cgcccacaaa actcaagccc actggcagaa aatacatctt cggctaccac ccccacggca    4380

ttatcggcat gggagccttt ggtggaattg ccaccgaggg agctggatgg tccaagctct    4440

ttccgggcat ccctgtttct cttatgactc tcaccaacaa cttccgagtg cctctctaca    4500

aagagtacct catgagtctg ggagtcgctt ctgtctccaa gaagtcctgc aaggccctcc    4560

tcaagcgaaa ccagtctatc tgcattgtcg ttggtggagc acaggaaagt cttctggcca    4620

gacccggtgt catggacctg gtgctactca agcgaaaggg ttttgttcga cttggtatgg    4680

aggtcggaaa tgtcgccctt gttcccatca tggcctttgg tgagaacgac ctctatgacc    4740

aggttagcaa cgacaagtcg tccaagctgt accgattcca gcagtttgtc aagaacttcc    4800

ttggattcac ccttcctttg atgcatgccc gaggcgtctt caactacgat gtcggtcttg    4860

tcccctacag gcgacccgtc aacattgtgg ttggttcccc cattgacttg ccttatctcc    4920

cacaccccac cgacgaagaa gtgtccgaat accacgaccg atacatcgcc gagctgcagc    4980

gaatctacaa cgagcacaag gatgaatatt tcatcgattg gaccgaggag ggcaaaggag    5040

ccccagagtt ccgaatgatt gagtaagcgg ccgcacctg                           5079

 

<210>92

<211>1545

<212>DNA

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>92

atgactatcg actcacaata ctacaagtcg cgagacaaaa acgacacggc acccaaaatc    60

gcgggaatcc gatatgcccc gctatcgaca ccattactca accgatgtga gaccttctct    120

ctggtctggc acattttcag cattcccact ttcctcacaa ttttcatgct atgctgcgca    180

attccactgc tctggccatt tgtgattgcg tatgtagtgt acgctgttaa agacgactcc    240

ccgtccaacg gaggagtggt caagcgatac tcgcctattt caagaaactt cttcatctgg    300

aagctctttg gccgctactt ccccataact ctgcacaaga cggtggatct ggagcccacg    360

cacacatact accctctgga cgtccaggag tatcacctga ttgctgagag atactggccg    420

cagaacaagt acctccgagc aatcatcacc accatcgagt actttctgcc cgccttcatg    480

aaacggtctc tttctatcaa cgagcaggag cagcctgccg agcgagatcc tctcctgtct    540

cccgtttctc ccagctctcc gggttctcaa cctgacaagt ggattaacca cgacagcaga    600

tatagccgtg gagaatcatc tggctccaac ggccacgcct cgggctccga acttaacggc    660

aacggcaaca acggcaccac taaccgacga cctttgtcgt ccgcctctgc tggctccact    720

gcatctgatt ccacgcttct taacgggtcc ctcaactcct acgccaacca gatcattggc    780

gaaaacgacc cacagctgtc gcccacaaaa ctcaagccca ctggcagaaa atacatcttc    840

ggctaccacc cccacggcat tatcggcatg ggagcctttg gtggaattgc caccgaggga    900

gctggatggt ccaagctctt tccgggcatc cctgtttctc ttatgactct caccaacaac    960

ttccgagtgc ctctctacaa agagtacctc atgagtctgg gagtcgcttc tgtctccaag    1020

aagtcctgca aggccctcct caagcgaaac cagtctatct gcattgtcgt tggtggagca    1080

caggaaagtc ttctggccag acccggtgtc atggacctgg tgctactcaa gcgaaagggt    1140

tttgttcgac ttggtatgga ggtcggaaat gtcgcccttg ttcccatcat ggcctttggt    1200

gagaacgacc tctatgacca ggttagcaac gacaagtcgt ccaagctgta ccgattccag    1260

cagtttgtca agaacttcct tggattcacc cttcctttga tgcatgcccg aggcgtcttc    1320

aactacgatg tcggtcttgt cccctacagg cgacccgtca acattgtggt tggttccccc    1380

attgacttgc cttatctccc acaccccacc gacgaagaag tgtccgaata ccacgaccga    1440

tacatcgccg agctgcagcg aatctacaac gagcacaagg atgaatattt catcgattgg    1500

accgaggagg gcaaaggagc cccagagttc cgaatgattg agtaa                    1545

 

<210>93

<211>514

<212>PRT

<213>解脂耶氏酵母

 

<400>93

Met Thr Ile Asp Ser Gln Tyr Tyr Lys Ser Arg Asp Lys Asn Asp Thr

1               5                   10                  15

Ala Pro Lys Ile Ala Gly Ile Arg Tyr Ala Pro Leu Ser Thr Pro Leu

            20                  25                  30

Leu Asn Arg Cys Glu Thr Phe Ser Leu Val Trp His Ile Phe Ser Ile

        35                  40                  45

Pro Thr Phe Leu Thr Ile Phe Met Leu Cys Cys Ala Ile Pro Leu Leu

    50                  55                  60

Trp Pro Phe Val Ile Ala Tyr Val Val Tyr Ala Val Lys Asp Asp Ser

65                  70                  75                  80

Pro Ser Asn Gly Gly Val Val Lys Arg Tyr Ser Pro Ile Ser Arg Asn

                85                  90                  95

Phe Phe Ile Trp Lys Leu Phe Gly Arg Tyr Phe Pro Ile Thr Leu His

            100                 105                 110

Lys Thr Val Asp Leu Glu Pro Thr His Thr Tyr Tyr Pro Leu Asp Val

        115                 120                 125

Gln Glu Tyr His Leu Ile Ala Glu Arg Tyr Trp Pro Gln Asn Lys Tyr

    130                 135                 140

Leu Arg Ala Ile Ile Thr Thr Ile Glu Tyr Phe Leu Pro Ala Phe Met

145                 150                 155                 160

Lys Arg Ser Leu Ser Ile Asn Glu Gln Glu Gln Pro Ala Glu Arg Asp

                165                 170                 175

Pro Leu Leu Ser Pro Val Ser Pro Ser Ser Pro Gly Ser Gln Pro Asp

            180                 185                 190

Lys Trp Ile Asn His Asp Ser Arg Tyr Ser Arg Gly Glu Ser Ser Gly

        195                 200                 205

Ser Asn Gly His Ala Ser Gly Ser Glu Leu Asn Gly Asn Gly Asn Asn

    210                 215                 220

Gly Thr Thr Asn Arg Arg Pro Leu Ser Ser Ala Ser Ala Gly Ser Thr

225                 230                 235                 240

Ala Ser Asp Ser Thr Leu Leu Asn Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Ala Asn

                245                 250                 255

Gln Ile Ile Gly Glu Asn Asp Pro Gln Leu Ser Pro Thr Lys Leu Lys

            260                 265                 270

Pro Thr Gly Arg Lys Tyr Ile Phe Gly Tyr His Pro His Gly Ile Ile

        275                 280                 285

Gly Met Gly Ala Phe Gly Gly Ile Ala Thr Glu Gly Ala Gly Trp Ser

    290                 295                 300

Lys Leu Phe Pro Gly Ile Pro Val Ser Leu Met Thr Leu Thr Asn Asn

305                 310                 315                 320

Phe Arg Val Pro Leu Tyr Lys Glu Tyr Leu Met Ser Leu Gly Val Ala

                325                 330                 335

Ser Val Ser Lys Lys Ser Cys Lys Ala Leu Leu Lys Arg Asn Gln Ser

            340                 345                 350

Ile Cys Ile Val Val Gly Gly Ala Gln Glu Ser Leu Leu Ala Arg Pro

        355                 360                 365

Gly Val Met Asp Leu Val Leu Leu Lys Arg Lys Gly Phe Val Arg Leu

    370                 375                 380

Gly Met Glu Val Gly Asn Val Ala Leu Val Pro Ile Met Ala Phe Gly

385                 390                 395                 400

Glu Asn Asp Leu Tyr Asp Gln Val Ser Asn Asp Lys Ser Ser Lys Leu

                405                 410                 415

Tyr Arg Phe Gln Gln Phe Val Lys Asn Phe Leu Gly Phe Thr Leu Pro

            420                 425                 430

Leu Met His Ala Arg Gly Val Phe Asn Tyr Asp Val Gly Leu Val Pro

        435                 440                 445

Tyr Arg Arg Pro Val Asn Ile Val Val Gly Ser Pro Ile Asp Leu Pro

    450                 455                 460

Tyr Leu Pro His Pro Thr Asp Glu Glu Val Ser Glu Tyr His Asp Arg

465                 470                 475                 480

Tyr Ile Ala Glu Leu Gln Arg Ile Tyr Asn Glu His Lys Asp Glu Tyr

                485                 490                 495

Phe Ile Asp Trp Thr Glu Glu Gly Lys Gly Ala Pro Glu Phe Arg Met

            500                 505                 510

Ile Glu

 

<210>94

<211>9074

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pY191

 

<400>94

ggccgcaggg cggatccccc gggctgcagg aattcgatat caagcttatc gataccgtcg    60

acctcgaggg ggggcccggt acccaattcg ccctatagtg agtcgtatta cgcgcgctca    120

ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc    180

cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc    240

ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcg acgcgccctg tagcggcgca    300

ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta    360

gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt    420

caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac    480

cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt    540

tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga    600

acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg    660

gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata    720

ttaacgttta caatttcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac    780

accgcatatc gacggtcgag gagaacttct agtatatcca catacctaat attattgcct    840

tattaaaaat ggaatcccaa caattacatc aaaatccaca ttctcttcaa aatcaattgt    900

cctgtacttc cttgttcatg tgtgttcaaa aacgttatat ttataggata attatactct    960

atttctcaac aagtaattgg ttgtttggcc gagcggtcta aggcgcctga ttcaagaaat    1020

atcttgaccg cagttaactg tgggaatact caggtatcgt aagatgcaag agttcgaatc    1080

tcttagcaac cattattttt ttcctcaaca taacgagaac acacaggggc gctatcgcac    1140

agaatcaaat tcgatgactg gaaatttttt gttaatttca gaggtcgcct gacgcatata    1200

cctttttcaa ctgaaaaatt gggagaaaaa ggaaaggtga gaggccggaa ccggcttttc    1260

atatagaata gagaagcgtt catgactaaa tgcttgcatc acaatacttg aagttgacaa    1320

tattatttaa ggacctattg ttttttccaa taggtggtta gcaatcgtct tactttctaa    1380

cttttcttac cttttacatt tcagcaatat atatatatat ttcaaggata taccattcta    1440

atgtctgccc ctatgtctgc ccctaagaag atcgtcgttt tgccaggtga ccacgttggt    1500

caagaaatca cagccgaagc cattaaggtt cttaaagcta tttctgatgt tcgttccaat    1560

gtcaagttcg atttcgaaaa tcatttaatt ggtggtgctg ctatcgatgc tacaggtgtc    1620

ccacttccag atgaggcgct ggaagcctcc aagaaggttg atgccgtttt gttaggtgct    1680

gtggctggtc ctaaatgggg taccggtagt gttagacctg aacaaggttt actaaaaatc    1740

cgtaaagaac ttcaattgta cgccaactta agaccatgta actttgcatc cgactctctt    1800

ttagacttat ctccaatcaa gccacaattt gctaaaggta ctgacttcgt tgttgtcaga    1860

gaattagtgg gaggtattta ctttggtaag agaaaggaag acgatggtga tggtgtcgct    1920

tgggatagtg aacaatacac cgttccagaa gtgcaaagaa tcacaagaat ggccgctttc    1980

atggccctac aacatgagcc accattgcct atttggtcct tggataaagc taatcttttg    2040

gcctcttcaa gattatggag aaaaactgtg gaggaaacca tcaagaacga attccctaca    2100

ttgaaggttc aacatcaatt gattgattct gccgccatga tcctagttaa gaacccaacc    2160

cacctaaatg gtattataat caccagcaac atgtttggtg atatcatctc cgatgaagcc    2220

tccgttatcc caggttcctt gggtttgttg ccatctgcgt ccttggcctc tttgccagac    2280

aagaacaccg catttggttt gtacgaacca tgccacggtt ctgctccaga tttgccaaag    2340

aataaggttg accctatcgc cactatcttg tctgctgcaa tgatgttgaa attgtcattg    2400

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atcagaactg gtgatttagg tggttccaac agtaccaccg aagtcggtga tgctgtcgcc    2520

gaagaagtta agaaaatcct tgcttaaaaa gattctcttt ttttatgata tttgtacata    2580

aactttataa atgaaattca taatagaaac gacacgaaat tacaaaatgg aatatgttca    2640

tagggtagac gaaactatat acgcaatcta catacattta tcaagaagga gaaaaaggag    2700

gatagtaaag gaatacaggt aagcaaattg atactaatgg ctcaacgtga taaggaaaaa    2760

gaattgcact ttaacattaa tattgacaag gaggagggca ccacacaaaa agttaggtgt    2820

aacagaaaat catgaaacta cgattcctaa tttgatattg gaggattttc tctaaaaaaa    2880

aaaaaataca acaaataaaa aacactcaat gacctgacca tttgatggag tttaagtcaa    2940

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gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt    3240

ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagtatgat ccaatatcaa aggaaatgat    3300

agcattgaag gatgagacta atccaattga ggagtggcag catatagaac agctaaaggg    3360

tagtgctgaa ggaagcatac gataccccgc atggaatggg ataatatcac aggaggtact    3420

agactacctt tcatcctaca taaatagacg catataagta cgcatttaag cataaacacg    3480

cactatgccg ttcttctcat gtatatatat atacaggcaa cacgcagata taggtgcgac    3540

gtgaacagtg agctgtatgt gcgcagctcg cgttgcattt tcggaagcgc tcgttttcgg    3600

aaacgctttg aagttcctat tccgaagttc ctattctcta gaaagtatag gaacttcaga    3660

gcgcttttga aaaccaaaag cgctctgaag acgcactttc aaaaaaccaa aaacgcaccg    3720

gactgtaacg agctactaaa atattgcgaa taccgcttcc acaaacattg ctcaaaagta    3780

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ccttgaactt gcatctaaac tcgacctcta cattttttat gtttatctct agtattactc    3900

tttagacaaa aaaattgtag taagaactat tcatagagtg aatcgaaaac aatacgaaaa    3960

tgtaaacatt tcctatacgt agtatataga gacaaaatag aagaaaccgt tcataatttt    4020

ctgaccaatg aagaatcatc aacgctatca ctttctgttc acaaagtatg cgcaatccac    4080

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tagtaatcag taaacgcggg aagtggagtc aggctttttt tatggaagag aaaatagaca    4200

ccaaagtagc cttcttctaa ccttaacgga cctacagtgc aaaaagttat caagagactg    4260

cattatagag cgcacaaagg agaaaaaaag taatctaaga tgctttgtta gaaaaatagc    4320

gctctcggga tgcatttttg tagaacaaaa aagaagtata gattctttgt tggtaaaata    4380

gcgctctcgc gttgcatttc tgttctgtaa aaatgcagct cagattcttt gtttgaaaaa    4440

ttagcgctct cgcgttgcat ttttgtttta caaaaatgaa gcacagattc ttcgttggta    4500

aaatagcgct ttcgcgttgc atttctgttc tgtaaaaatg cagctcagat tctttgtttg    4560

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attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa    4740

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tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg    5700

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tttaagaagt ttaagaaata gatttacaga attacaatca atacctaccg tctttatata    6960

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cctatgaact gatggttggt gaagaaaaca atattttggt gctgggattc tttttttttc    7260

tggatgccag cttaaaaagc gggctccatt atatttagtg gatgccagga ataaactgtt    7320

cacccagaca cctacgatgt tatatattct gtgtaacccg ccccctattt tgggcatgta    7380

cgggttacag cagaattaaa aggctaattt tttgactaaa taaagttagg aaaatcacta    7440

ctattaatta tttacgtatt ctttgaaatg gcagtattga taatgataaa ctcgaaatca    7500

ctagtggatc cgcccagcgg ccgcaacatg actatcgact cacaatacta caagtcgcga    7560

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gtagtgtacg ctgttaaaga cgactccccg tccaacggag gagtggtcaa gcgatactcg    7800

cctatttcaa gaaacttctt catctggaag ctctttggcc gctacttccc cataactctg    7860

cacaagacgg tggatctgga gcccacgcac acatactacc ctctggacgt ccaggagtat    7920

cacctgattg ctgagagata ctggccgcag aacaagtacc tccgagcaat catcaccacc    7980

atcgagtact ttctgcccgc cttcatgaaa cggtctcttt ctatcaacga gcaggagcag    8040

cctgccgagc gagatcctct cctgtctccc gtttctccca gctctccggg ttctcaacct    8100

gacaagtgga ttaaccacga cagcagatat agccgtggag aatcatctgg ctccaacggc    8160

cacgcctcgg gctccgaact taacggcaac ggcaacaacg gcaccactaa ccgacgacct    8220

ttgtcgtccg cctctgctgg ctccactgca tctgattcca cgcttcttaa cgggtccctc    8280

aactcctacg ccaaccagat cattggcgaa aacgacccac agctgtcgcc cacaaaactc    8340

aagcccactg gcagaaaata catcttcggc taccaccccc acggcattat cggcatggga    8400

gcctttggtg gaattgccac cgagggagct ggatggtcca agctctttcc gggcatccct    8460

gtttctctta tgactctcac caacaacttc cgagtgcctc tctacagaga gtacctcatg    8520

agtctgggag tcgcttctgt ctccaagaag tcctgcaagg ccctcctcaa gcgaaaccag    8580

tctatctgca ttgtcgttgg tggagcacag gaaagtcttc tggccagacc cggtgtcatg    8640

gacctggtgc tactcaagcg aaagggtttt gttcgacttg gtatggaggt cggaaatgtc    8700

gcccttgttc ccatcatggc ctttggtgag aacgacctct atgaccaggt tagcaacgac    8760

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cccgtcaaca ttgtggttgg ttcccccatt gacttgcctt atctcccaca ccccaccgac    8940

gaagaagtgt ccgaatacca cgaccgatac atcgccgagc tgcagcgaat ctacaacgag    9000

cacaaggatg aatatttcat cgattggacc gaggagggca aaggagcccc agagttccga    9060

atgattgagt aagc                                                      9074

 

<210>95

<211>9074

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pY192

 

<400>95

ggccgcaggg cggatccccc gggctgcagg aattcgatat caagcttatc gataccgtcg    60

acctcgaggg ggggcccggt acccaattcg ccctatagtg agtcgtatta cgcgcgctca    120

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ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta    360

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caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac    480

cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt    540

tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga    600

acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg    660

gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata    720

ttaacgttta caatttcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac    780

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tcttagcaac cattattttt ttcctcaaca taacgagaac acacaggggc gctatcgcac    1140

agaatcaaat tcgatgactg gaaatttttt gttaatttca gaggtcgcct gacgcatata    1200

cctttttcaa ctgaaaaatt gggagaaaaa ggaaaggtga gaggccggaa ccggcttttc    1260

atatagaata gagaagcgtt catgactaaa tgcttgcatc acaatacttg aagttgacaa    1320

tattatttaa ggacctattg ttttttccaa taggtggtta gcaatcgtct tactttctaa    1380

cttttcttac cttttacatt tcagcaatat atatatatat ttcaaggata taccattcta    1440

atgtctgccc ctatgtctgc ccctaagaag atcgtcgttt tgccaggtga ccacgttggt    1500

caagaaatca cagccgaagc cattaaggtt cttaaagcta tttctgatgt tcgttccaat    1560

gtcaagttcg atttcgaaaa tcatttaatt ggtggtgctg ctatcgatgc tacaggtgtc    1620

ccacttccag atgaggcgct ggaagcctcc aagaaggttg atgccgtttt gttaggtgct    1680

gtggctggtc ctaaatgggg taccggtagt gttagacctg aacaaggttt actaaaaatc    1740

cgtaaagaac ttcaattgta cgccaactta agaccatgta actttgcatc cgactctctt    1800

ttagacttat ctccaatcaa gccacaattt gctaaaggta ctgacttcgt tgttgtcaga    1860

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tccgttatcc caggttcctt gggtttgttg ccatctgcgt ccttggcctc tttgccagac    2280

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gatagtaaag gaatacaggt aagcaaattg atactaatgg ctcaacgtga taaggaaaaa    2760

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gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt    3240

ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagtatgat ccaatatcaa aggaaatgat    3300

agcattgaag gatgagacta atccaattga ggagtggcag catatagaac agctaaaggg    3360

tagtgctgaa ggaagcatac gataccccgc atggaatggg ataatatcac aggaggtact    3420

agactacctt tcatcctaca taaatagacg catataagta cgcatttaag cataaacacg    3480

cactatgccg ttcttctcat gtatatatat atacaggcaa cacgcagata taggtgcgac    3540

gtgaacagtg agctgtatgt gcgcagctcg cgttgcattt tcggaagcgc tcgttttcgg    3600

aaacgctttg aagttcctat tccgaagttc ctattctcta gaaagtatag gaacttcaga    3660

gcgcttttga aaaccaaaag cgctctgaag acgcactttc aaaaaaccaa aaacgcaccg    3720

gactgtaacg agctactaaa atattgcgaa taccgcttcc acaaacattg ctcaaaagta    3780

tctctttgct atatatctct gtgctatatc cctatataac ctacccatcc acctttcgct    3840

ccttgaactt gcatctaaac tcgacctcta cattttttat gtttatctct agtattactc    3900

tttagacaaa aaaattgtag taagaactat tcatagagtg aatcgaaaac aatacgaaaa    3960

tgtaaacatt tcctatacgt agtatataga gacaaaatag aagaaaccgt tcataatttt    4020

ctgaccaatg aagaatcatc aacgctatca ctttctgttc acaaagtatg cgcaatccac    4080

atcggtatag aatataatcg gggatgcctt tatcttgaaa aaatgcaccc gcagcttcgc    4140

tagtaatcag taaacgcggg aagtggagtc aggctttttt tatggaagag aaaatagaca    4200

ccaaagtagc cttcttctaa ccttaacgga cctacagtgc aaaaagttat caagagactg    4260

cattatagag cgcacaaagg agaaaaaaag taatctaaga tgctttgtta gaaaaatagc    4320

gctctcggga tgcatttttg tagaacaaaa aagaagtata gattctttgt tggtaaaata    4380

gcgctctcgc gttgcatttc tgttctgtaa aaatgcagct cagattcttt gtttgaaaaa    4440

ttagcgctct cgcgttgcat ttttgtttta caaaaatgaa gcacagattc ttcgttggta    4500

aaatagcgct ttcgcgttgc atttctgttc tgtaaaaatg cagctcagat tctttgtttg    4560

aaaaattagc gctctcgcgt tgcatttttg ttctacaaaa tgaagcacag atgcttcgtt    4620

caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac    4680

attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa    4740

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tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc    4860

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cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc    5040

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tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg    5220

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acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac    5340

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<210>96

<211>9074

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pY193

 

<400>96

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aagtcgtcca agctgtaccg attccagcag tttgtcaaga acttccttgg attcaccctt    8820

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cccgtcaaca ttgtggttgg ttcccccatt gacttgcctt atctcccaca ccccaccgac    8940

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cacaaggatg aatatttcat cgattggacc gaggagggca aaggagcccc agagttccga    9060

atgattgagt aagc                                                      9074

 

<210>97

<211>9074

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pY194

 

<400>97

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cctgtacttc cttgttcatg tgtgttcaaa aacgttatat ttataggata attatactct    960

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tcttagcaac cattattttt ttcctcaaca taacgagaac acacaggggc gctatcgcac    1140

agaatcaaat tcgatgactg gaaatttttt gttaatttca gaggtcgcct gacgcatata    1200

cctttttcaa ctgaaaaatt gggagaaaaa ggaaaggtga gaggccggaa ccggcttttc    1260

atatagaata gagaagcgtt catgactaaa tgcttgcatc acaatacttg aagttgacaa    1320

tattatttaa ggacctattg ttttttccaa taggtggtta gcaatcgtct tactttctaa    1380

cttttcttac cttttacatt tcagcaatat atatatatat ttcaaggata taccattcta    1440

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caagaaatca cagccgaagc cattaaggtt cttaaagcta tttctgatgt tcgttccaat    1560

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gaattgcact ttaacattaa tattgacaag gaggagggca ccacacaaaa agttaggtgt    2820

aacagaaaat catgaaacta cgattcctaa tttgatattg gaggattttc tctaaaaaaa    2880

aaaaaataca acaaataaaa aacactcaat gacctgacca tttgatggag tttaagtcaa    2940

taccttcttg aagcatttcc cataatggtg aaagttccct caagaatttt actctgtcag    3000

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gtgaacagtg agctgtatgt gcgcagctcg cgttgcattt tcggaagcgc tcgttttcgg    3600

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gactgtaacg agctactaaa atattgcgaa taccgcttcc acaaacattg ctcaaaagta    3780

tctctttgct atatatctct gtgctatatc cctatataac ctacccatcc acctttcgct    3840

ccttgaactt gcatctaaac tcgacctcta cattttttat gtttatctct agtattactc    3900

tttagacaaa aaaattgtag taagaactat tcatagagtg aatcgaaaac aatacgaaaa    3960

tgtaaacatt tcctatacgt agtatataga gacaaaatag aagaaaccgt tcataatttt    4020

ctgaccaatg aagaatcatc aacgctatca ctttctgttc acaaagtatg cgcaatccac    4080

atcggtatag aatataatcg gggatgcctt tatcttgaaa aaatgcaccc gcagcttcgc    4140

tagtaatcag taaacgcggg aagtggagtc aggctttttt tatggaagag aaaatagaca    4200

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cattatagag cgcacaaagg agaaaaaaag taatctaaga tgctttgtta gaaaaatagc    4320

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gcgctctcgc gttgcatttc tgttctgtaa aaatgcagct cagattcttt gtttgaaaaa    4440

ttagcgctct cgcgttgcat ttttgtttta caaaaatgaa gcacagattc ttcgttggta    4500

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tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc    5820

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tttaagaagt ttaagaaata gatttacaga attacaatca atacctaccg tctttatata    6960

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gaagaagtgt ccgaatacca cgaccgatac atcgccgagc tgcagcgaat ctacaacgag    9000

cacaaggatg aatatttcat cgattggacc gaggagggca aaggagcccc agagttccga    9060

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<210>98

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<213>人工序列

 

<220>

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<400>98

ggccgcaagt atgaactaaa atgcatgtag gtgtaagagc tcatggagag catggaatat    60

tgtatccgac catgtaacag tataataact gagctccatc tcacttcttc tatgaataaa    120

caaaggatgt tatgatatat taacactcta tctatgcacc ttattgttct atgataaatt    180

tcctcttatt attataaatc atctgaatcg tgacggctta tggaatgctt caaatagtac    240

aaaaacaaat gtgtactata agactttcta aacaattcta accttagcat tgtgaacgag    300

acataagtgt taagaagaca taacaattat aatggaagaa gtttgtctcc atttatatat    360

tatatattac ccacttatgt attatattag gatgttaagg agacataaca attataaaga    420

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aaatattgaa ggatttaaaa taataataaa taacatataa tatatgtata taaatttatt    720

ataatataac atttatctat aaaaaagtaa atattgtcat aaatctatac aatcgtttag    780

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acccatctca taaataacgt catgcattac atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc    2580

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aaaaaaaata ttttatcatt attaacaaaa tcatattagt taatttgtta actctataat    1920

aaaagaaata ctgtaacatt cacattacat ggtaacatct ttccaccctt tcatttgttt    1980

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caatttagnt aggtacatgc attggtcaga ttcacggttt attatgtcat gacttaagtt    2400

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aaaattacat atttcataaa taataacaca aatattttta aaaaatctga aataataatg    2700

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aaaaaattat gataaatatt taccatctca taagatattt aaaataatga taaaaatata    3000

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gaagatttta attatcagtc taaatatttc attagcactt aatacttttc tgttttattc    3180

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agtaggc                                                              11647

 

<210>102

<211>11611

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKS393

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(2349)..(2349)

<223>n为a，c，g，或t

 

<400>102

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tcctcttatt attataaatc atctgaatcg tgacggctta tggaatgctt caaatagtac    240

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ccgtgtgctt agcttctttt attttatttt tttatcagca aagaataaat aaaataaaat    1140

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cttttttaac atttttaaca caaattttag ttatttaaaa atttattaaa aaatttaaaa    1260

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gtgtgtataa atatatcaac cccgccaaca atttatttaa tccaaatata ttgaagtata    1500

ttattccata gcctttattt atttatatat ttattatata aaagctttat ttgttctagg    1560

ttgttcatga aatatttttt tggttttatc tccgttgtaa gaaaatcatg tgctttgtgt    1620

cgccactcac tattgcagct ttttcatgca ttggtcagat tgacggttga ttgtattttt    1680

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aacaatatta catattatca cgaaaattca ttaataaaaa tattatataa ataaaatgta    2760

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aaaaaattat gataaatatt taccatctca taagatattt aaaataatga taaaaatata    3000

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tctttcctgg tatccccgtt tccctcatga ccctcaccaa caactttcgc gttcctctct    11040

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ctaggcctgg tgttatggat ctcgtgttgc tgaagcgcaa gggttttgtg cgcttgggta    11220

tggaggtggg caatgttgcc ctcgttccaa tcatggcttt cggcgagaac gatctctacg    11280

accaggtgtc caacgacaag tcctccaagc tgtaccgctt ccagcagttc gtgaagaact    11340

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tcgttcccta ccgccgccct gtgaacattg tggttggttc tcctatcgac ttgccttacc    11460

tccctcatcc caccgatgag gaagtttccg agtaccacga ccgttacatc gctgagctcc    11520

agcgcatcta caacgagcac aaggacgagt acttcatcga ctggactgag gagggtaagg    11580

gcgctcctga gtttcgtatg atcgagtagg c                                   11611

 

<210>103

<211>11649

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKS391

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(2349)..(2349)

<223>n为a，c，g，或t

 

<400>103

ggccgcaagt atgaactaaa atgcatgtag gtgtaagagc tcatggagag catggaatat    60

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caaaggatgt tatgatatat taacactcta tctatgcacc ttattgttct atgataaatt    180

tcctcttatt attataaatc atctgaatcg tgacggctta tggaatgctt caaatagtac    240

aaaaacaaat gtgtactata agactttcta aacaattcta accttagcat tgtgaacgag    300

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tatatattac ccacttatgt attatattag gatgttaagg agacataaca attataaaga    420

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tatgaaaggg tactatttga actctcttac tctgtataaa ggttggatca tccttaaagt    600

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aaaaaattat gataaatatt taccatctca taagatattt aaaataatga taaaaatata    3000

gattattttt tatgcaacta gctagccaaa aagagaacac gggtatatat aaaaagagta    3060

cctttaaatt ctactgtact tcctttattc ctgacgtttt tatatcaagt ggacatacgt    3120

gaagatttta attatcagtc taaatatttc attagcactt aatacttttc tgttttattc    3180

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gtcttccata gccccccaag cggcccatgg cctcctccga ggacgtcatc aaggagttca    3300

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agtgggagcg cgtgatgaac ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc caggactcct    3600

ccctgcagga cggctccttc atctacaagg tgaagttcat cggcgtgaac ttcccctccg    3660

acggccccgt aatgcagaag aagactatgg gctgggaggc ctccaccgag cgcctgtacc    3720

cccgcgacgg cgtgctgaag ggcgagatcc acaaggccct gaagctgaag gacggcggcc    3780

actacctggt ggagttcaag tccatctaca tggccaagaa gcccgtgcag ctgcccggct    3840

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agcagtacga gcgcgccgag ggccgccacc acctgttcct gtagcggccg gccgcgacac    3960

aagtgtgaga gtactaaata aatgctttgg ttgtacgaaa tcattacact aaataaaata    4020

atcaaagctt atatatgcct tccgctaagg ccgaatgcaa agaaattggt tctttctcgt    4080

tatcttttgc cacttttact agtacgtatt aattactact taatcatctt tgtttacggc    4140

tcattatatc cgtcgacggc gcgccgctct agaactagtg gatccgtcga cggcgcgccc    4200

gatcatccgg atatagttcc tcctttcagc aaaaaacccc tcaagacccg tttagaggcc    4260

ccaaggggtt atgctagtta ttgctcagcg gtggcagcag ccaactcagc ttcctttcgg    4320

gctttgttag cagccggatc gatccaagct gtacctcact attcctttgc cctcggacga    4380

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cagaagaaga tgttggcgac ctcgtattgg gaatccccga acatcgcctc gctccagtca    4740

atgaccgctg ttatgcggcc attgtccgtc aggacattgt tggagccgaa atccgcgtgc    4800

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gcaatcgcgc atatgaaatc acgccatgta gtgtattgac cgattccttg cggtccgaat    4980

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accggctgca gaacagcggg cagttcggtt tcaggcaggt cttgcaacgt gacaccctgt    5100

gcacggcggg agatgcaata ggtcaggctc tcgctgaatt ccccaatgtc aagcacttcc    5160

ggaatcggga gcgcggccga tgcaaagtgc cgataaacat aacgatcttt gtagaaacca    5220

tcggcgcagc tatttacccg caggacatat ccacgccctc ctacatcgaa gctgaaagca    5280

cgagattctt cgccctccga gagctgcatc aggtcggaga cgctgtcgaa cttttcgatc    5340

agaaacttct cgacagacgt cgcggtgagt tcaggctttt ccatgggtat atctccttct    5400

taaagttaaa caaaattatt tctagaggga aaccgttgtg gtctccctat agtgagtcgt    5460

attaatttcg cgggatcgag atcgatccaa ttccaatccc acaaaaatct gagcttaaca    5520

gcacagttgc tcctctcaga gcagaatcgg gtattcaaca ccctcatatc aactactacg    5580

ttgtgtataa cggtccacat gccggtatat acgatgactg gggttgtaca aaggcggcaa    5640

caaacggcgt tcccggagtt gcacacaaga aatttgccac tattacagag gcaagagcag    5700

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cccactggct cacgctagga accaaaaggc ccagcagtga tccagcccca aaagagatct    5880

cctttgcccc ggagattaca atggacgatt tcctctatct ttacgatcta ggaaggaagt    5940

tcgaaggtga aggtgacgac actatgttca ccactgataa tgagaaggtt agcctcttca    6000

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atgcagtcaa aagattcagg actaattgca tcaagaacac agagaaagac atatttctca    6180

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taatagagat tggagtctct aaaaaggtag ttcctactga atctaaggcc atgcatggag    6300

tctaagattc aaatcgagga tctaacagaa ctcgccgtga agactggcga acagttcata    6360

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cacttcatcg aaaggacagt agaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat    6600

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ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cacgctcgag ctcatttctc    6840

tattacttca gccataacaa aagaactctt ttctcttctt attaaaccat gaaaaagcct    6900

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ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat gttcggggat    7560

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tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct tggttgacgg caatttcgat    7740

gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc cgggactgtc    7800

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agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta    8100

gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg    8160

ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg atgtcgaatc tgatcaacct    8220

gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc    8280

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tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc    8640

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gtagtctcga atgccacaac actgactagt ctcttggatc ataagaaaaa gccaaggaac    9600

aaaagaagac aaaacacaat gagagtatcc tttgcatagc aatgtctaag ttcataaaat    9660

tcaaacaaaa acgcaatcac acacagtgga catcacttat ccactagctg atcaggaccg    9720

ccgcgtcaag aaaaaaaaac tggaccccaa aagccatgca caacaacacg tactcacaaa    9780

ggtgtcaatc gagcagccca aaacattcac caactcaacc catcatgagc cctcacattt    9840

gttgtttcta acccaacctc aaactcgtat tctcttccgc cacctcattt ttgtttattt    9900

caacacccgt caaactgcat gccaccccgt ggccaaatgt ccatgcatgt taacaagacc    9960

tatgactata aatagctgca atctcggccc aggttttcat catcaagaac cagttcaata    10020

tcctagtaca ccgtattaaa gaatttaaga tatactgcgg cccatggagg tccgacgacg    10080

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gttcctctct agcaaacacc actacatggc cgtggggctt ctgcatacca tgaacacttt    10620

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cacaatagtc gagtttgtgg ccgttattct gtctctcaaa ctcgcctcat acgccctcac    10740

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gcttattcag tttctcatct tccagtacgc ctaccccatc atgcagtcgt gtctggctct    11100

gttcttccag cccaagctcg attatgccaa catctccgag cgcctcatga agttggcctc    11160

cgtgtctatg atggtctggc tcattggatt ctacgctttc ttccagaacg gtctcaatct    11220

tattgccgag ctcacctgtt ttggaaacag aaccttctac cagcagtggt ggaattcccg    11280

ctccattggc cagtactgga ctctatggaa caagccagtc aaccagtact ttagacacca    11340

cgtctacgtg cctcttctcg ctcggggcat gtcgcggttc aatgcgtcgg tggtggtttt    11400

ctttttctcc gccgtcatcc atgaactgct tgtcggcatc cccactcaca acatcatcgg    11460

agccgccttc ttcggcatga tgtcgcaggt gcctctgatc atggctactg agaaccttca    11520

gcatattaac tcctctctgg gccccttcct tggcaactgt gcattctggt tcaccttttt    11580

cctgggacaa cccacttgtg cattccttta ctatttggcc tacaactaca agcagaacca    11640

gtagcggcc                                                            11649

 

<210>104

<211>5303

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR278

 

<400>104

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cccgatcatc cggatatagt tcctcctttc agcaaaaaac ccctcaagac ccgtttagag    120

gccccaaggg gttatgctag ttattgctca gcggtggcag cagccaactc agcttccttt    180

cgggctttgt tagcagccgg atcgatccaa gctgtacctc actattcctt tgccctcgga    240

cgagtgctgg ggcgtcggtt tccactatcg gcgagtactt ctacacagcc atcggtccag    300

acggccgcgc ttctgcgggc gatttgtgta cgcccgacag tcccggctcc ggatcggacg    360

attgcgtcgc atcgaccctg cgcccaagct gcatcatcga aattgccgtc aaccaagctc    420

tgatagagtt ggtcaagacc aatgcggagc atatacgccc ggagccgcgg cgatcctgca    480

agctccggat gcctccgctc gaagtagcgc gtctgctgct ccatacaagc caaccacggc    540

ctccagaaga agatgttggc gacctcgtat tgggaatccc cgaacatcgc ctcgctccag    600

tcaatgaccg ctgttatgcg gccattgtcc gtcaggacat tgttggagcc gaaatccgcg    660

tgcacgaggt gccggacttc ggggcagtcc tcggcccaaa gcatcagctc atcgagagcc    720

tgcgcgacgg acgcactgac ggtgtcgtcc atcacagttt gccagtgata cacatgggga    780

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cgtattaatt tcgcgggatc gagatcgatc caattccaat cccacaaaaa tctgagctta    1380

acagcacagt tgctcctctc agagcagaat cgggtattca acaccctcat atcaactact    1440

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tacactacat ggcgtgattt catatgcgcg attgctgatc cccatgtgta tcactggcaa    3240

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gtcctgacgg acaatggccg cataacagcg gtcattgact ggagcgaggc gatgttcggg    3420

gattcccaat acgaggtcgc caacatcttc ttctggaggc cgtggttggc ttgtatggag    3480

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ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact    4020

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<210>105

<211>8358

<212>DNA

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<220>

<223>质粒pKR1274

 

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<220>

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<222>(3725)..(3725)

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aaaggagaag ctcaactcaa gcccaagagc tttgctaagg ccctaacaag cccaccaaag    1560

caaaaagccc actggctcac gctaggaacc aaaaggccca gcagtgatcc agccccaaaa    1620

gagatctcct ttgccccgga gattacaatg gacgatttcc tctatcttta cgatctagga    1680

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ctcatcaaga cgatctaccc gagtaacaat ctccaggaga tcaaatacct tcccaagaag    1860

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tttctcaaga tcagaagtac tattccagta tggacgattc aaggcttgct tcataaacca    1980

aggcaagtaa tagagattgg agtctctaaa aaggtagttc ctactgaatc taaggccatg    2040

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gttcatacag agtcttttac gactcaatga caagaagaaa atcttcgtca acatggtgga    2160

gcacgacact ctggtctact ccaaaaatgt caaagataca gtctcagaag accaaagggc    2220

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ttgcgataaa ggaaaggcta tcattcaaga tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg    2400

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caatgtcctg acggacaatg gccgcataac agcggtcatt gactggagcg aggcgatgtt    3300

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ccgggcgtat atgctccgca ttggtcttga ccaactctat cagagcttgg ttgacggcaa    3480

tttcgatgat gcagcttggg cgcagggtcg atgcgacgca atcgtccgat ccggagccgg    3540

gactgtcggg cgtacacaaa tcgcccgcag aagcgcggcc gtctggaccg atggctgtgt    3600

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gtgaggtacc taatagtgag atccaacact tacgtttgca acgtccaaga gcaaatagac    3720

cacgnacgcc ggaaggttgc cgcagcgtgt ggattgcgtc tcaattctct cttgcaggaa    3780

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cctcataacg tgcatcatgc atgccctgac aacatggaac atcgctattt ttctgaagaa    3900

ttatgctcgt tggaggatgt cgcggcaatt gcagctattg ccaacatcga actacccctc    3960

acgcatgcat tcatcaatat tattcatgcg gggaaaggca agattaatcc aactggcaaa    4020

tcatccagcg tgattggtaa cttcagttcc agcgacttga ttcgttttgg tgctacccac    4080

gttttcaata aggacgagat ggtggagtaa agaaggagtg cgtcgaagca gatcgttcaa    4140

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tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat    4260

ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa    4320

acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag    4380

atcgatcaaa cttcggtact gtgtaatgac gatgagcaat cgagaggctg actaacaaaa    4440

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gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa    5400

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tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt    5520

ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat    5580

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aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta    5700

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ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac    5820

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ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat    6240

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ccacagttgt tacatctaaa gaaagcttca agcatgatga tgatctacct tcgcctcccc    8400

ccagaacttt tatcaaccag ttgcctgatt ggagcatgct tcttgctgct atcacaacaa    8460

ttttcttggc cgctgaaaag cagtggatga tgcttgattg gaagccacgg cgacctgaca    8520

tgcttattga cccctttggg ataggaaaaa ttgttcagga tggtcttgtg ttccgtgaaa    8580

acttttctat tagatcatat gagattggtg ctgatcgtac cgcatctata gaaacagtaa    8640

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gctttggttc cacgccagaa atgtgcaaaa agaacttgat atgggtggtt actcggatgc    8760

aggttgtggt ggaacgctat cctacatggg gtgacatagt tcaagtggac acttgggttt    8820

ctggatcagg gaagaatggt atgcgtcgtg attggctttt acgtgactcc aaaactggtg    8880

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ctaaaattcc agaagaagtc agacaggaga taggatctta ttttgtggat tctgatccaa    9000

ttctggaaga ggataacaga aaactgacta aacttgacga caacacagcg gattatattc    9060

gtaccggttt aagtcctagg tggagtgatc tagatatcaa tcagcatgtc aacaatgtga    9120

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cttccatgac tttagagtat aggagagagt gtggtaggga cagtgtgctg gattccctga    9240

ctgctgtatc tggggccgac atgggcaatc tagctcacag cgggcatgtt gagtgcaagc    9300

atttgcttcg actggaaaat ggtgctgaga ttgtgagggg caggactgag tggaggccca    9360

aacctgtgaa caactttggt gttgtgaacc aggttccagc agaaagcacc taagatttga    9420

aatggttaac gattggagtt gcatcagtct ccttgctatg tttagactta ttctggttcc    9480

ctggggagag ttttgcttgt gtctatccaa tcaatctaca tgtctttaaa tatatacacc    9540

ttctaatttg tgatactttg gtgggtaagg gggaaaagca gcagtaaatc gc            9592

 

<210>108

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物GmTE2 5-1

 

<400>108

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<210>109

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物GmTE2 3-1

 

<400>109

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<210>110

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物GmTE2 5-2

 

<400>110

gcttttacgt gactccaaaa cttaagaatt cggtgaaatc ttgacaagag c             51

 

<210>111

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物GmTE2 3-2

 

<400>111

tcgcggccgc tgtacaggaa caattgtgat taattagtca caatctcagc accattttcc    60

 

<210>112

<211>4738

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR1258

 

<400>112

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aattaatgga accacagttg ttacatctaa agaaagcttc aagcatgatg atgatctacc    240

ttcgcctccc cccagaactt ttatcaacca gttgcctgat tggagcatgc ttcttgctgc    300

tatcacaaca attttcttgg ccgctgaaaa gcagtggatg atgcttgatt ggaagccacg    360

gcgacctgac atgcttattg acccctttgg gataggaaaa attgttcagg atggtcttgt    420

gttccgtgaa aacttttcta ttagatcata tgagattggt gctgatcgta ccgcatctat    480

agaaacagta atgaaccatt tgcaagaaac tgcacttaat catgttaaaa gtgctgggct    540

tcttggtgat ggctttggtt ccacgccaga aatgtgcaaa aagaacttga tatgggtggt    600

tactcggatg caggttgtgg tggaacgcta tcctacatgg ggtgacatag ttcaagtgga    660

cacttgggtt tctggatcag ggaagaatgg tatgcgtcgt gattggcttt tacgtgactc    720

caaaacttaa gaattcggtg aaatcttgac aagagcttcc agtgtttggg tcatgatgaa    780

taagctaaca cggaggctgt ctaaaattcc agaagaagtc agacaggaga taggatctta    840

ttttgtggat tctgatccaa ttctggaaga ggataacaga aaactgacta aacttgacga    900

cgacacagcg gattatattc gtaccggttt aagtcctagg tggagtgatc tagatatcaa    960

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cagtgtgctg gattccctga ctgctgtatc tggggccgac atgggcaatc tagctcacag    1140

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tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat    1440

gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc    1500

tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg    1560

ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag    1620

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag    1680

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa agcccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc    1740

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc    1800

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc    1860

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt    1920

cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg    1980

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<210>113

<211>1164

<212>DNA

<213>大豆

 

<400>113

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tattggtaca ggaacaagta ttga                                           1164

 

<210>114

<211>10303

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pBS43

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(3347)..(3347)

<223>n为a，c，g，或t

 

<400>114

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acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta    3900

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<212>DNA

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<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物GmFad2-1 5-2

 

<400>117

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<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

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<400>118

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<212>DNA

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<220>

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agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca    1200

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gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc    1320

gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg    1380

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ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg    1500

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cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac    1680

tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa    1740

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ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg    2820

tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcttgcat    2880

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acatttttaa cacaaatttt agttatttaa aaatttatta aaaaatttaa aataagaaga    3000

ggaactcttt aaataaatct aacttacaaa atttatgatt tttaataagt tttcaccaat    3060

aaaaaatgtc ataaaaatat gttaaaaagt atattatcaa tattctcttt atgataaata    3120

aaaagaaaaa aaaaataaaa gttaagtgaa aatgagattg aagtgacttt aggtgtgtat    3180

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tagcctttat ttatttatat atttattata taaaagcttt atttgttcta ggttgttcat    3300

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atagaatttt ttttatatta agtaaactat ttttatatta tgaaataata ataaaaaaaa    3600

tattttatca ttattaacaa aatcatatta gttaatttgt taactctata ataaaagaaa    3660

tactgtaaca ttcacattac atggtaacat ctttccaccc tttcatttgt tttttgtttg    3720

atgacttttt ttcttgttta aatttatttc ccttctttta aatttggaat acattatcat    3780

catatataaa ctaaaatact aaaaacagga ttacacaaat gataaataat aacacaaata    3840

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ntaggtacat gcattggtca gattcacggt ttattatgtc atgacttaag ttcatggtag    4140

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acaatataaa tataaataat gtttttatat tacgaaataa cagtgatcaa aacaaacagt    4260

tttatcttta ttaacaagat tttgtttttg tttgatgacg ttttttaatg tttacgcttt    4320

cccccttctt ttgaatttag aacactttat catcataaaa tcaaatacta aaaaaattac    4380

atatttcata aataataaca caaatatttt taaaaaatct gaaataataa tgaacaatat    4440

tacatattat cacgaaaatt cattaataaa aatattatat aaataaaatg taatagtagt    4500

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ccaacacagg ttcccttgac taagatctcg tgatgaagtg tttgtcccaa aaccaaaatc    5520

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tgtggtggaa cgctatccta catggggtga catagttcaa gtggacactt gggtttctgg    6720

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caccaagaag cccagcactt ttaacatgat taagtgcagt ttcttgcaaa tggttcatta    7500

ctgtttctat agatgcggta cgatcagcac caatctcata tgatctaata gaaaagtttt    7560

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taccagagac attgaaggct aaatacatag gccaccctat tgtgagtgtg acgagaagag    8460

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acccacaaca tcatcaaccc attggtactt gctgaaggca tggtgaccac actcgtgagc    8700

aatcacccac acaccagtga gaaggcaacc ttggagaacc caatagattg gccatgcaat    8760

gagggaaaag ggttgaggaa ggaggtggaa gtaggtggtg gcaatgtaga aaatgaaggc    8820

aaatgaaagg tcataaacaa cataggagaa tgaagtgagg agggagcgct gaaagcagtg    8880

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<210>124

<211>11615

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR1267

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(6454)..(6454)

<223>n  a，c，g，或t

 

<400>124

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ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga ctctaatcat aaaaacccat ctcataaata    1380

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aaaatttatg atttttaata agttttcacc aataaaaaat gtcataaaaa tatgttaaaa    5460

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gaaaatgaga ttgaagtgac tttaggtgtg tataaatata tcaaccccgc caacaattta    5580

tttaatccaa atatattgaa gtatattatt ccatagcctt tatttattta tatatttatt    5640

atataaaagc tttatttgtt ctaggttgtt catgaaatat ttttttggtt ttatctccgt    5700

tgtaagaaaa tcatgtgctt tgtgtcgcca ctcactattg cagctttttc atgcattggt    5760

cagattgacg gttgattgta tttttgtttt ttatggtttt gtgttatgac ttaagtcttc    5820

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tatttttata ttatgaaata ataataaaaa aaatatttta tcattattaa caaaatcata    6000

ttagttaatt tgttaactct ataataaaag aaatactgta acattcacat tacatggtaa    6060

catctttcca ccctttcatt tgttttttgt ttgatgactt tttttcttgt ttaaatttat    6120

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catgtgcttt ctggactgat gatgcagtat acttttgaca ttgcctttat tttatttttc    6360

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ttggttagat ttgataggca aatttggttg tcaacaatat aaatataaat aatgttttta    6600

tattacgaaa taacagtgat caaaacaaac agttttatct ttattaacaa gattttgttt    6660

ttgtttgatg acgtttttta atgtttacgc tttccccctt cttttgaatt tagaacactt    6720

tatcatcata aaatcaaata ctaaaaaaat tacatatttc ataaataata acacaaatat    6780

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caccaatctc atatgatcta atagaaaagt tttcacggaa cacaagacca tcctgaacaa    9960

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cttgctgaag gcatggtgac cacactcgtg agcaatcacc cacacaccag tgagaaggca    11100

accttggaga acccaataga ttggccatgc aatgagggaa aagggttgag gaaggaggtg    11160

gaagtaggtg gtggcaatgt agaaaatgaa ggcaaatgaa aggtcataaa caacatagga    11220

gaatgaagtg aggagggagc gctgaaagca gtgtggtgga attgctttct tgagttggcc    11280

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cactttggcc acacgacctc tacctcccat tgttgtttcc tttgctagac ctagttaatt    11400

aggtaccgcg gccgcgacac aagtgtgaga gtactaaata aatgctttgg ttgtacgaaa    11460

tcattacact aaataaaata atcaaagctt atatatgcct tccgctaagg ccgaatgcaa    11520

agaaattggt tctttctcgt tatcttttgc cacttttact agtacgtatt aattactact    11580

taatcatctt tgtttacggc tcattatatc ctgca                               11615

 

<210>125

<211>5252

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>质粒pKR457

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(3872)..(3872)

<223>n为a，c，g，或t

 

<400>125

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aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa    480

taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt    540

gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa    600

tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta    660

ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag    720

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<210>128

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