高速逆流色谱法一步制备分离鸢尾中鸢尾苷元的方法

摘要

本发明涉及一种鸢尾中单体化合物鸢尾苷元的分离纯化方法，具体涉及从鸢尾中分离纯化鸢尾苷元的方法。本发明采用甲醇溶液浸泡提取制备鸢尾粗提取物，粗提物加少量水分散，用乙酸乙酯溶液萃取，除去水溶性杂质，将乙酸乙酯溶液浓缩成浸膏，再采用高速逆流色谱法一步对乙酸乙酯样品进行分离纯化，得到纯度高于95％的鸢尾苷元。本发明制备方法操作简便、分离效率高、产品纯度好，适合工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及利用高速逆流色谱法从鸢尾中分离纯化鸢尾苷元的方法。

背景技术

鸢尾(川射干)为是鸢尾科鸢尾属植物鸢尾Iris tectorum Maxim的干燥根茎，具有清热解毒、消痰利咽的功效，主要用于咽喉肿痛、痰咳气喘等症，为中国药典2005年版一部收载品种(国家药典委员会.中华人民共和国药典[S]，一部，北京：化学工业出版社.2005：28-29.)。主产于四川、重庆、贵州、云南、广西等省份。现代研究发现，鸢尾中含有丰富的异黄酮类成分，其中鸢尾苷元是鸢尾中的主要活性成分(赏后勤，秦民坚，吴靳荣.鸢尾的化学成分[J].中国天然药物，2007，5(4)：312-314.)。

高速逆流色谱法(high speed counter-current chromatography，HSCCC)是一种新型液-液色谱分离方法。它不同于传统液相色谱法，可以在短时间内实现高效分离和分析，具有不需要固体载体，避免了分离样品与固体载体表面产生化学反应而变性和不可逆吸附等优点，而且对样品的预处理要求低，适用于粗提取物的分离。近年来，HSCCC在生物科学、医药和化工等领域广为运用，在植物天然活性成分的分离制备中更为突出，制备的量和制备纯度均得到极大的提高。

目前国内外多采用柱层析法等传统方法分离纯化鸢尾中的鸢尾苷元(袁崇均，王笳，陈帅，等.鸢尾化学成分的研究[J].天然产物研究与开发，2008，20(9)：444-446，449；邱庆浩，张志国，王建华，等.鸢尾中异黄酮类化学成分研究[J]，中药材，2009，32(9)：1392-1394.)，这类方法多使用大量的氯仿、甲醇等有毒的有机溶剂，会造成环境污染，而且柱层析法的不足之处是分离周期长，回收率低，分离效果不理想。最近，范国荣等(范国荣，周婷婷，冯超，谢瑛，闻俊，崔莉俊，陈丹霞，李霁，解蕊，魏华，张鹤.二次高速逆流色谱分离射干中异黄酮类单体化合物的方法，公开号：CN101357933A，公开日：2009年2月4日)利用HSCCC从鸢尾同科不同属植物射干(Belamcandachinensis(L.)DC.)中分离得到了鸢尾苷元，所用方法繁琐，耗时长。现有文献中，未见HSCCC用于一步快速制备分离鸢尾中鸢尾苷元的报道。因此，本发明公开了HSCCC从鸢尾中一步制备分离鸢尾苷元的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、高效分离鸢尾中鸢尾苷元的新方法，即使用高速逆流色谱法从鸢尾中一步分离制备鸢尾苷元的方法。成品中采用高效液相色谱面积归一法测定鸢尾苷元的纯度达到95％以上。该方法分离条件温和，分离效率高，且分离时间短，能得到高纯度的鸢尾苷元。

本发明提供一种从鸢尾中分离纯化鸢尾苷元的方法，包括如下步骤：

步骤(1)

取鸢尾药材，样品经粉碎机粉碎，过40目筛；称取干燥的鸢尾粉末，加入甲醇，室温浸泡提取，过滤；将滤渣重复上述步骤，再提取2次，合并滤液，减压浓缩成浸膏状，得鸢尾的提取物；

步骤(2)

将上述步骤制得的鸢尾提取物加少量的水分散后，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩乙酸乙酯溶液，即得乙酸乙酯浸膏；

步骤(3)

在分液漏斗中配制两相溶剂系统，充分振摇后在室温下静置过夜；使用前分别取分液漏斗中的上相(作为HSCCC的固定相)和下相(作为HSCCC的流动相)，超声脱气；取步骤(2)中的乙酸乙酯浸膏用相同体积的上相和下相溶解样品；

步骤(4)

将溶剂系统的上相注入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后调整主机转速，泵入下相，待流动相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入步骤(3)中的样品溶液；在280nm波长下检测，记录色谱图，根据色谱图确认收集得到单体化合物鸢尾苷元。

步骤(1)中所述鸢尾粉末与加入的甲醇重量比为1∶20。

步骤(1)中使用甲醇浸泡提取24h，提取3次。

步骤(2)中鸢尾提取物加少量的水分散后，用乙酸乙酯萃取5次以上。

步骤(3)中所述溶剂系统为石油醚(沸程为60-90℃)∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶6∶4∶3，v/v)。

步骤(4)中所述高速逆流色谱仪的主机转速为900rpm/min。

步骤(4)中所述高速逆流色谱仪的流动相流速为2.0mL/min。

本发明采用了合理的溶剂系统，控制了高速逆流色谱仪的主机转速、流动相流速和检测器波长等条件，用本发明方法可得到纯度较高的鸢尾苷元。该分离条件容易控制，分离时间短。由于不引入酸碱，而且在常温下进行分离，目标化合物不发生变化，最大程度的保持了化合物的稳定性。

具体实施方式

实施例

(1)制备鸢尾提取物：

取鸢尾药材，样品经粉碎机粉碎，过40目筛。称取干燥的鸢尾粉末20g，加入20倍重量的甲醇中，室温浸泡提取24h，过滤；将滤渣重复上述步骤，再提取2次，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，得鸢尾粗提取物。

(2)提取物的进一步纯化：

将上述步骤制得的鸢尾提取物加适量水混悬后，用乙酸乙酯萃取5次，除去水溶性杂质，减压浓缩乙酸乙酯溶液至浸膏状，得到乙酸乙酯浸膏2.9g。

(3)高速逆流色谱分离鸢尾苷元：

a.溶剂系统和样品溶液的配制

在分液漏斗中配制石油醚(沸程60-90℃)∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶6∶4∶3，v/v)两相溶剂体系，充分振摇后在室温下静置过夜。使用前分别取分液漏斗中的上相(作为HSCCC的固定相)和下相(作为HSCCC的流动相)，超声脱气30min。取步骤(2)乙酸乙酯浸膏2.0g，用1mL上相和1mL下相溶解样品，备用。

b.高速逆流色谱分离制备过程

用最大流速(9.99mL/min)将溶剂系统的上相泵入高速逆流色谱仪分离管中，待上相充满整个管路后调整主机转速900rpm/min，再以2.0mL/min流速泵入下相，待流动相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入a中的样品溶液，在280nm波长处对流出液紫外检测器连续检测，记录色谱图，根据色谱图收集流分Ⅰ。

c.鸢尾苷元的分析和鉴定

使用高效液相色谱面积归一法对b中分离得到的流分Ⅰ进行纯度检测：应用Symmetry C₁₈色谱柱(25mm×4.6mm i.d.，5μm)，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，在0到20min，乙腈比例为40％，在20到30min，乙腈比例由40％升到50％，检测波长为280nm，测定温度为室温。测得流分Ⅰ为单一峰，纯度为95.2％。将流分Ⅰ挥干，得化合物Ⅰ白色针晶15.7mg，使用¹H NMR和¹³C NMR对Ⅰ进行结构鉴定并与文献数据对比，确定化合物Ⅰ为鸢尾苷元。

关于本发明溶剂系统的选择

溶剂系统的选择是应用HSCCC分离纯化天然药物中有效成分的关键问题。不同的溶剂系统具有不同的极性、粘度、密度，相同溶剂系统不同的上、下相之比也会对相同的成分产生不同的溶解和分配能力，形成分配系数的差异，从而对分离效果产生一定的影响。合适的两相溶剂系统一般应该满足下列基本条件：分层时间短于30s；目标化合物的两相中的分配系数应0.5＜K＜2(OuyangX K，Jin M C，He C H.Sep.Purif.Technol.，2007，56(3)：319～324.)。

分配系数的测定：取5mg粗提物于5mL试管中，分别加入预先达到分配平衡的上、下相溶剂系统各2mL，剧烈震荡1min后静置分层，HPLC法检测目标化合物在上、下相分配，上相峰面积为A₁，下相峰面积为A₂，分配系数K＝A₁/A₂。

本实验测定目标化合物在乙酸乙酯-水、乙酸乙酯-甲醇-水、正丁醇-水、石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水等溶剂系统中的分配系数(见表)。结果表明：采用乙酸乙酯-水(1∶1，v/v)乙酸乙酯-甲醇-水(3∶1∶3，v/v)正丁醇-水(1∶1，v/v)石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶5∶2∶4，v/v)，分配系数较大，色谱峰展宽，且分离时间长；采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶6∶4∶3，v/v)时，分配系数合理，分配时间短，可以实现目标化合物的分离。因此，实验采用石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶6∶4∶3，v/v)系统进行HSCCC分离纯化。

表鸢尾苷元在不同溶剂系统中的分配系数

化合物的¹H NMR和¹³C NMR的鉴定数据：¹H NMR(DMSO-d₆)δ13.06(1H，s，5-OH)，10.78(1H，s，7-OH)，9.59(1H，s，4’-OH)，8.34(1H，s，H-2)，7.37(2H，d，J＝8.4Hz，H-2′，H-6′)，6.82(2H，d，J＝8.4Hz，H-3′，H-5′)，6.50(1H，s，H-8)，3.75(3H，s，6-OCH₃)。¹³C NMR(DMSO-d₆)δ180.5(C-4)，157.4(C-5)，157.3(C-4′)，154.0(C-7)，153.2(C-9)，152.6(C-2)，131.3(C-6)，130.1(C-2′，6′)，121.7(C-1′)，121.1(C-3)，115.0(C-3′，5′)，104.7(C-10)，60.0(6-OCH₃)。通过以上数据化合物鉴定为5，7，4′-三羟基-6-甲氧基异黄酮，即鸢尾苷元(tectorigenin)。