用于毛细管电泳分离蛋白质的聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的制备方法

摘要

用于毛细管电泳分离蛋白质的聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的制备方法，第一步，氨基聚环氧乙烷的合成，将端基为羟基的聚环氧乙烷(PEG)转化为更具活性的氨基聚环氧乙烷(PEG-NH2)，第二步，聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的制备，采用两步法将聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层键合在毛细管内壁。本发明提高了PEG涂层的稳定性，改善了蛋白质的分离效率，延长了聚合物涂层的使用寿命，同时也扩大了涂层的应用范围。

说明书

技术领域

本发明提供了一种用于毛细管电泳分离蛋白质的聚多巴胺-g-聚环氧乙烷(polydopamine-graft-PEG)毛细管涂层的制备方法，采用此种涂层涂覆毛细管后进行蛋白质的分离时，可以稳定及抑制电渗流，阻抗蛋白质的吸附，使蛋白质得到分离。

背景技术

毛细管电泳(CE)具有高效、快速、微量以及经济环保等优点，在生物大分子尤其在蛋白质的分离方面应用非常广泛。但是蛋白质与毛细管内壁之间静电及疏水等相互作用的存在，使蛋白质极易吸附在毛细管壁上，结果导致电渗流(EOF)发生改变、分离效率下降、峰高降低甚至不出峰等(McCormick R M，Anal.Chem，1988，60：2322-2328)，严重制约了毛细管电泳在该领域的应用，因此克服蛋白质的吸附是毛细管电泳分离蛋白质样品的首要任务。

目前常采用极端pH值(Lauer H H，McManigill D，Anal.Chem，1986，58：166-170)、添加小分子添加剂(Bushey M M，Jorgenson J M，J.Chromatogr A，1989，480：301-310)及聚合物涂覆毛细管内壁等方法以达到抑制蛋白质吸附、改变分离机制、控制电渗流、改善分离效率等目的。极端pH值和添加小分子添加剂两种方法虽然能在一定程度上降低蛋白质的吸附，但是容易引起蛋白质的聚集和变性。聚合物涂覆方法则是给毛细管内壁涂覆某种涂层，屏蔽毛细管内壁的硅羟基(Si-OH)，抑制蛋白质的吸附。因而聚合物涂覆技术对抑制蛋白质的吸附，提高分离效率尤为有效，也是目前解决毛细管对蛋白质的吸附中用得最广泛的方法。常用于分离蛋白质的聚合物有亲水性均聚物(Lucy C A，MacDonald A M，Gulcev M D，J.Chromatogr A，2008，1184：81-105)，如：聚环氧乙烷(PEG)、聚丙烯酰胺(PAA)、聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)、聚乙烯醇(PVA)、羟乙基纤维素(HEC)等。另外还有一些共聚物，如：聚醚(PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物)(Ng C L，Lee H K，J.Chromatogr A，1994，659：427-434)、聚环氧乙烷-b-聚4-乙烯基吡啶(Liu H，Shi，R，Wan W，Yang R，Wang Y，Electrophoresis，2008，29：2812-2819)、羟乙基纤维素-g-聚4-乙烯基吡啶(Yang R，Liu Y，Wang Y，Electrophoresis，2009，30：2321-2327)、聚N，N-二甲基丙烯酰胺-b-聚环氧乙烷-b-聚N，N-二甲基丙烯酰胺(Xu J，Yang L，Luo Z，WangY，Electrophoresis，2010，31：1713-1720)等。其中，聚环氧乙烷因其良好的亲水性、优异的抗蛋白质吸附能力、无毒以及很好的生物相容性而备受青睐。聚环氧乙烷及其共聚物已成功地应用于毛细管电泳分离蛋白质(Bruin G C，Chang J P，Kuhlman R H.，Zegers K，Kraak J C，PoppeH，J.Chromatogr，.1989，471：429-436；Liu H，Shi，R，Wan W，Yang R，Wang Y，Electrophorsis，2008，29：2812-2819；Tran N T，Taverna M，Miccoli L，Angulo JF，Electrophoresis，2005，26：3105-3112；Iki N，Yeung E S，J.Chromatogr.A 1996，731：273-282)、多肽(Vayaboury W，Kirby D，Giani O，Cottet H.，Electrophoresis，2005，26：2187-2197)、DNA(Fung E N，Yeung E S，Anal.Chem.1995，67：1913-1919)等生物分子。然而，采用聚环氧乙烷涂覆毛细管虽然能够得到较好的分离效率，但是由于其具有很强的亲水性，与毛细管内壁作用力很弱，使用多次后会缓慢降解，缓冲溶液很容易将其冲出毛细管，对抑制蛋白质的吸附作用减弱，导致分离效率降低，涂层管寿命也缩短，不能长期使用。因此，寻找具有强粘附性能的介质改善PEG的涂覆功能，提高PEG涂层的稳定性，提高分离效率仍然是毛细管电泳高效分离蛋白质的重要课题。

目前，仿生聚合物-聚多巴胺由于其具有很强的粘附性能而备受科学家的关注。聚多巴胺是由小分子多巴胺在碱性环境下，在氧的作用下通过自发氧化聚合而成(Herlinger E，Jameson R F，Linert W，J.Chem.Soc.Perkin Trans，1995，2：259-263)。多巴胺又名4(2-乙胺基)苯-1，2-二醇(Dopamine，DA)，是一种可以用来帮助细胞传送脉冲的神经传导物质。聚多巴胺不仅具有强粘附性，能够粘附在各种有机和无机材料表面，而且聚多巴胺还含有丰富的官能团能够通过迈克尔加成反应和SchiffBase反应接枝具有-SH、-NH₂等基团的聚合物(Burzio L A，Waite J H，Biochemistry，2000，39：11147-11153；LaVoie M J，Ostaszewski B L，Weihofen A，SchlossmacherM G，Selkoe D J，Nat.Med，2005，11：1214-1221)，从而赋予聚多巴胺涂层表面形成有机物质层改善材料的表面性能。

发明内容

本发明的技术解决问题：克服现有技术的不足，提供一种用于毛细管电泳分离蛋白质的聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的制备方法，提高了PEG涂层的稳定性，改善了蛋白质的分离效率，延长聚合物涂层的使用寿命，同时也扩大了涂层的应用范围。

本发明的技术解决方案：用于毛细管电泳分离蛋白质的聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的制备方法，通过强粘附性的聚多巴胺涂层将具有抗蛋白吸附性能的PEG-NH₂键合在毛细管内壁，从而形成有效而稳定的聚合物涂层应用于毛细管电泳分离蛋白质。整个毛细管涂层的制备过程只需两步，简单易行。这种涂层材料主要是由具有阻抗蛋白质吸附的亲水性聚合物PEG，以及具有强粘附能力的聚多巴胺组成的，PEG能有效地抑制蛋白质的吸附，提高蛋白质的分离效率。聚多巴胺涂层能够牢牢地将PEG键合在毛细管内壁，提高了PEG涂层的稳定性，改善了蛋白质的分离效率，延长聚合物涂层的使用寿命，同时也扩大了涂层的应用范围。

1.所用试剂及提纯方法

所用试剂均按常规方法进行纯化。

(1)去离子水(科生牌，中国科学技术大学)：使用前用SZ-3型自动三重纯水蒸馏器(上海沪西分析仪器厂)净化处理，最终所得水的电导率为1.4×10^-6S/cm。

(2)聚环氧乙烷(Aldrich，Mr 5000)：70℃真空干燥12h，P₂O₅为干燥剂。

(3)二氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司)：用去离子水洗三次，以除去溶液中含有的少量乙醇，然后用无水硫酸钠干燥24h，过滤，滤液中加入无水氯化钙在恒温水浴40℃环境下回流6h后常压蒸馏，收集40℃馏分。

(4)三乙胺(国药集团化学试剂有限公司，NEt₃)：用氢氧化钾干燥24h后，过滤，滤液加入无水氢化钙常压蒸馏，收集90℃的馏分。

(5)二甲基甲酰胺(国药集团化学试剂有限公司，DMF)：用硫酸钠干燥24h后，过滤，滤液减压蒸馏，收集76℃/4.79kPa(36mmHg)的馏分。

(6)四氢呋喃(国药集团化学试剂有限公司，THF)：一般四氢呋喃中含有少量的水及过氧化物，加入氢化锂铝在隔绝潮气下回流6h除去其中的水和过氧化物，然后在常压蒸馏，收集66℃的馏分。

(7)乙醚，乙腈，乙醇，苯甲醇：国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

(8)对甲基苯磺酰氯，叠氮化钠，三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxylmethyl)aminomethane，Tris)，柠檬酸，磷酸氢二钠，氢氧化钠均购于国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

(9)多巴胺盐酸(Sigma公司)。

(10)三苯基膦(Sigma公司)。

(11)细胞色素c(cytochrome c，pI 10.2，Mr 12 400)，溶菌酶(lysozyme，pI 11.1，Mr 14 300)，核糖核酸酶A  (ribonuclease A，pI 9.3，Mr 13 700)，肌球素(myoglobin，pI 7.0，Mr 17 800)，卵清蛋白(albumin，pI 4.0，Mr 67500)，胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor，pI 6.2，Mr 22 000)均购于Sigma公司。

2.聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的制备

第一步，氨基聚环氧乙烷的合成

将端基为羟基的聚环氧乙烷(PEG)转化为更具活性的氨基聚环氧乙烷(PEG-NH₂)，具体合成方法如下：

合成的具体反应式见图1。

对图1化学名称的说明：

PEG：聚环氧乙烷；

CH₂Cl₂：二氯甲烷；

N(C₂H₅)₃：三乙胺；

对甲苯磺酰氯；

苯磺酸酯封端的聚环氧乙烷；

NaN₃：叠氮化钠；

CH₃CN：乙腈；

DMF：二甲基甲酰胺

PEG-N₃：叠氮基封端的聚环氧乙烷；

Ph₃P：三苯基膦；

THF：四氢呋喃；

PEG-NH₂：氨基聚环氧乙烷

对图1化学式说明。图1表示三步反应过程，分别为如下所示：

(1.1)将干燥后的聚环氧乙烷和三乙胺按摩尔比1∶8～1∶12的比例溶于二氯甲烷中，形成溶液A，所述聚环氧乙烷与二氯甲烷的摩尔比为1∶150～1∶250；将对甲苯磺酰氯(TyCl)溶于二氯甲烷中，形成溶液B，所述聚环氧乙烷与对甲苯磺酰氯的摩尔比为1∶8～1∶12，所述对甲苯磺酰氯与二氯甲烷的摩尔比：1∶3～1∶15；在冰水浴的条件下，将溶液B逐滴滴入溶液A中，在室温搅拌的条件下反应20～30小时；待反应结束后，减压蒸馏除去大部分溶剂形成浓缩液，将所述浓缩液在冷乙醚中沉淀，然后抽滤，并用冷乙醚洗涤，所述冷乙醚的用量至少为所述浓缩液的5～10倍；收集的固体用二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂；上述固体的二氯甲烷溶液再次浓缩，在冷乙醚中沉淀，然后抽滤得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温下真空干燥至恒重，得到苯磺酸酯封端的聚环氧乙烷(PEG-Ty)；用红外光谱和核磁共振氢谱(¹H-NMR)表征。

(1.2)将PEG-Ty和叠氮化钠(NaN₃)按摩尔比为1∶16～1∶24的比例溶解在乙腈(CH₃CN)和二甲基甲酰胺(DMF)中，所述PEG-Ty与乙腈的摩尔比为1∶500～1∶700，所述乙腈和二甲基甲酰胺的体积比为10∶1，形成的溶液在75℃～80℃下回流70h～80h；反应结束后，将反应液过滤，滤去反应液中残留的叠氮化钠固体，然后将滤液减压蒸馏，除去大部分溶剂；将浓缩液在冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤；收集固体，采用二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂，浓缩收集到的溶液，然后在冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温下真空干燥至恒重，得到叠氮基封端的聚环氧乙烷(PEG-N₃)；得到叠氮基封端的聚环氧乙烷(PEG-N₃)用红外光谱表征。

(1.3)将PEG-N₃及三苯基膦(Ph₃P)按摩尔比：1∶3～1∶10的比例溶解于四氢呋喃(THF)中，所述PEG-N₃与四氢呋喃的摩尔比为1∶500～1∶1000，室温下搅拌20h～30h；常压10⁵Pa蒸馏浓缩溶液，浓缩液在冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤后得固体；将固体溶解在二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中形成溶液，以硅胶作固定相的层析柱，简称为硅胶层析柱，然后将此溶液移入硅胶层析柱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂；浓缩收集到的溶液，在冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温下真空干燥至恒重，得到双氨基封端的聚环氧乙烷(PEG-NH₂)；得到双氨基封端的聚环氧乙烷(PEG-NH₂)采用红外光谱和核磁共振氢谱(¹H-NMR)表征。

第二步，聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的制备

采用两步法将聚多巴胺-g-聚环氧乙烷聚合物键合在毛细管内壁，具体反应过程见图2。

(2.1)将新的毛细管(永年锐沣色谱仪器有限公司，河北)用0.1～1mol/L的HCl和0.1～1mol/L的NaOH分别冲洗，然后用去离子水冲洗；采用氧气干燥上述预处理的毛细管；干燥后的毛细管用注射器注入浓度为5mg/ml～20mg/mL的多巴胺溶液，多巴胺溶解于10mM，pH＝8.0～9.0的Tris-HCl缓冲溶液，将毛细管两端用硅胶密封，在室温下反应20h～35h，反应结束后用去离子水清洗毛细管，以除去残余的多巴胺溶液；

(2.2)通入浓度5mg/mL～50mg/mL的PEG-NH₂溶液，PEG-NH₂溶解于10mM，pH＝8.0～9.0的Tris-HCl缓冲溶液，毛细管两端用硅胶密封，45℃～55℃反应20h～40h，反应结束后的毛细管用去离子水冲洗，以除去残余溶液，然后用空气吹干，得到聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层。

图2中的化学名称说明：

多巴胺；

PEG-NH₂：氨基聚环氧乙烷；

Polydopamine：聚多巴胺。

所述步骤(2.1)中的冲洗时间为10～30分钟。

所述步骤(2.1)和(2.2)中的去离子水冲洗时间为5～15分钟。

所述步骤(1.1)、(1.2)和(1.3)中的二氯甲烷的用量刚好能使固体溶解。

所述步骤(1.1)、(1.2)和(1.3)中的冷乙醚的用量至少为浓缩液的5～10倍。

所述室温为20℃～35℃。

3.电渗流的测量

电渗流根据Williams的方法(Williams B A，Vigh C，Anal.Chem，1996，68：1174-1180)，在P/ACE MDQ毛细管电泳仪(Beckman Coulter Instruments，Fullerton，CA，USA)上进行，配备有UV-Vis检测器，检测波长为214nm。所用的单根毛细管(永年锐沣色谱仪器有限公司，河北)总长为40cm，有效长度为30cm，内径和外径比分别为75/365μm，在距毛细管一端11cm处用火烧去长度约2～5mm毛细管外壁上的聚合物涂层作为检测窗口。以2×10^-4g/mL苯甲醇作为中性标记物，在25℃进行测量。电渗流的测量分别在不同pH值的缓冲液中进行，缓冲体系由磷酸氢二钠/柠檬酸组成，缓冲液经微孔过滤器(0.45μm pore size)过滤后再使用。

新的空毛细管先在20psi压力下用1M HCl和1M NaOH分别冲洗15分钟，然后用去离子水冲洗5分钟。在测量预处理的空毛细管和涂层的毛细管的电渗流之前，先用所用的缓冲液冲洗毛细管10分钟，并预电泳5分钟，以平衡毛细管内壁的pH值。

电渗流值由下式计算：

$>\mathrm{EOF}=\frac{L_{\mathrm{eo}}{L}_t}{V_{\mathrm{prog}}(t_{\mathrm{migr}}-t_{\mathrm{ramp}-\mathrm{up}}/2-t_{\mathrm{ramp}-\mathrm{down}}/2)}$>

其中：

L_eo＝[(t_N3-t_N2)-(t_N2-t_N1)]v_m

$>v_m=\frac{L_d}{t_{N3}+t_{\mathrm{inj}}/2-t_d}$>

式中L_d为毛细管的有效长度，L_t是毛细管的总长度，t_N1，t_N2，t_N3分别是第一次、第二次和第三次进样的苯甲醇的电泳迁移时间，V_prog是电泳电压，t_migr是电压推动中性标记物的时间。t_ramp-up是电泳仪设定值：0.17min，t_ramp-down数值非常小，可忽略不记。t_d是滞后时间，仪器中一般设定为1s，t_inj是进样时间。

4.蛋白质的分离

蛋白质的分离是在P/ACE MDQ毛细管电泳仪(Beckman Coulter Instruments，Fullerton，CA，USA)上进行，电泳仪配备有UV-Vis检测器，检测波长为214nm。所用毛细管(永年锐沣色谱仪器有限公司，河北)总长为40cm，有效长度为30cm，内径和外径比分别为75/365μm，在距毛细管一端11cm处用火烧去长度约2～5mm毛细管外壁上的聚合物涂层为检测窗口。碱性蛋白质的电泳分离分别在不同pH值的缓冲液中进行，缓冲体系由磷酸氢二钠/柠檬酸组成，而混合蛋白的电泳分离是在pH＝3.38的磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲溶液中进行，缓冲溶液经微孔过滤器(0.45μm pore size)过滤后再使用。

三种碱性蛋白质(Cytochrome C，Lysozyme，Ribonuclease A)和六种混合蛋白(Cytochrome C，Lysozyme，Ribonuclease A，Myoglobin，Albumin，Trypsin inhibitor)分别用去离子水配制成0.5mg/mL。空毛细管的预处理方法同电渗流测量的空毛细管预处理方法一样。处理后的空毛细管和涂层管在进蛋白质样品之前，先用所采用pH值的磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲液冲洗10分钟，预电泳5分钟。然后在0.5psi压力下将蛋白质样品注入毛细管，进样时间为5s。蛋白质进样以后在20kV的电压下电泳分离。蛋白质分离的理论塔板数(N)由以下公式计算：

N＝5.54(t/w)²

其中N是分离的理论塔板数，t是蛋白质信号峰的出峰时间，w为蛋白质信号峰的半峰宽。

重现性是用分离时间的相对标准偏差(RSD)来表征的，采用以下公式计算：

$>\mathrm{SD}=\sqrt{\frac{1}{n-1}\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}{(A_i-\bar{A})}^2}$>

$>\mathrm{RSD}=\frac{\mathrm{SD}}{\bar{A}}\times 100\%$>

其中，SD是标准偏差；n是测量次数；A_i是每次测量值；是平均值；i为测量序号。

5.实际生物样品的分离

为了考察聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的实用性，分别用预处理后的空毛细管和涂层毛细管分离实际的生物样品，对比其分离效果。

(1)奶粉样品的分离

奶粉蛋白的提取过程参照文献(Gutierrez J E N，Jakovovits L，J.Agric.FoodChem，2003，51：3280-3286)，具体步骤如下：将250mg新鲜粉末奶粉(光明香浓脱脂奶粉，购买于本地超市)溶于5mL 50mM乙酸(pH＝4.6)中，搅匀振荡1min，3000rpm离心15min，提取上层清液，用0.22μm微滤膜过滤。所得滤液置于冰箱中冷冻保存，待用。奶粉样品的分离采用pH＝3.38的磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲溶液，奶粉样品的其他分离条件与标准蛋白质的分离条件一致。

(2)花生样品的分离

无脂花生蛋白的提取参照文献(Basha S M，J.Agric.Food Chem.1997，45：400-402)，具体操作过程如下：将购买的花生种子(从本地超市购买)剥皮后用研磨机研磨成粉，用正己烷溶解花生粉末，在-20℃环境下过夜脱脂，然后在3000rpm转速离心15min，除去上层清液，将得到的固体再次用正己烷溶解三次。脱脂花生粉末真空干燥。干燥后的脱脂花生用pH＝8.30的硼酸钠缓冲液溶解(浓度为1.2％，m/v)，搅拌均匀后在3000rpm转速离心15min。提取上层清液用于花生蛋白的分析。花生蛋白的分析采用pH＝8.30的硼酸钠缓冲液作为电泳分离介质，其他分离条件与标准蛋白质的分离条件一致。

(3)鸡蛋清蛋白的分离

参照文献(Hsieh Y，Chen T，Liu C，Electrophoresis，2006，27：4288-4294)提取鸡蛋清蛋白：将新鲜鸡蛋(从本地超市购买)的蛋清和蛋黄分离，然后用20mM，pH＝7.4Tris-HCl将鸡蛋清稀释20倍，搅拌均匀后用0.22μm微滤膜过滤，所得滤液置于冰箱中冷冻保存，待用。鸡蛋清蛋白的电泳分离采用pH＝3.20磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲溶液作为分离介质，其他分离条件与标准蛋白质的分离条件一致。

本发明与现有技术相比的优点在于：本发明采用两步法(即权利要求中的2.1以及2.2)将具有抗蛋白质吸附的亲水性聚合物(如聚环氧乙烷)通过强粘附性的聚合物涂层(如聚多巴胺涂层)键合在毛细管内壁，形成稳定的阻抗蛋白质吸附的涂层。涂层制备过程简单易行，避免了制备共价涂层的繁琐步骤及其制备过程中出现的一些负面影响，同时又具有共价涂层的各种优点，如：涂层寿命长、稳定性好及分离效率高等。涂层的表面材料是亲水性聚合物PEG，其具有很强的抗蛋白质吸附性能，能有效地阻抗蛋白质的吸附，同时又利用聚多巴胺涂层的强粘附性能提高涂层的稳定性，延长毛细管的使用寿命，扩大了涂层管的使用范围。

附图说明

图1是氨基聚环氧乙烷的合成原理图。

图2是聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层制备的原理图。

图3是空管和聚多巴胺涂层、PEG-NH₂涂层、聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管在不同pH值的电渗流。

图4是聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层在不同pH值下对碱性蛋白质的电泳分离谱图。1.lysozyme；2.cytochrome c；3.ribonuclease A.

图5是聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层分别在pH＝3.05(a)，5.38(b)下连续分离碱性蛋白质200次的电泳谱图。1.cytochrome c；2.lysozyme；3.ribonuclease A.

图6是聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管对比空毛细管分离混合蛋白质的电泳谱图。(a)空毛细管；(b)聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管。1.cytochrome c；2.lysozyme；3.myoglobin；4.ribonuclease A；5.albumin；6.trypsin inhibitor.

图7是聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管对比空毛细管分离奶粉中蛋白质的电泳谱图。(a)空毛细管；(b)聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管。

图8是聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管对比空毛细管分离无脂花生蛋白的电泳谱图。(a)空毛细管；(b)聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管。1-7是非花生球蛋白(non-arachin protein)；8是花生球蛋白质(arachin protein)

图9是聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管对比空毛细管分离鸡蛋清蛋白的电泳谱图。

具体实施方式举例

实施例1

氨基聚环氧乙烷(PEG-NH₂)的制备

将干燥后的PEG(9.20g，2mmol)和三乙胺(NEt₃)(2.78mL，20mmol)以及25.00mL(391mmol)二氯甲烷加入到洁净干燥的100mL圆底烧瓶中，形成溶液A。在洁净干燥的50mL烧杯中加入对甲苯磺酰氯(TyCl)(3.81g，20mmol)和10mL(157mmol)二氯甲烷，形成溶液B。在冰水浴的条件下，将溶液B逐滴滴入溶液A中，反应体系在室温20℃搅拌的条件下反应24小时。反应结束后，减压蒸馏除去大部分溶剂，浓缩液在600mL冷乙醚中沉淀，可除去反应产物中过量的对甲苯磺酰氯，抽滤，并用冷乙醚洗涤三次。收集的固体用10mL二氯甲烷溶解后过中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂，可除去反应中产生的三乙胺盐及对甲苯磺酸。溶液再次浓缩，在600mL的冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温20℃下真空干燥至恒重。得到苯磺酸酯封端的聚环氧乙烷(PEG-Ty)(7.60g，产率为82％)。¹H NMR(CDCl₃)：δ7.81(d，4H，ArH)，7.35(d，4H，ArH)，4.18(m，4H，TsO-CH₂-)，3.66(m，-OCH₂CH₂-)，2.46(s，6H，CH₃Ar-)。红外谱图中在1177cm^-1出现磺酸酯中SO₂的对称伸缩特征峰。

在100mL洁净干燥的圆底烧瓶中加入7.40g PEG-Ty(1.5mmol)，50mL(963mmol)的乙腈以及5mL二甲基甲酰胺，PEG-Ty完全溶解后溶液呈无色透明状。然后加入叠氮化钠(NaN₃)(1.95g，30mmol)，溶液由无色透明转变为橙黄色，有部分叠氮化钠无法溶解。反应液在80℃回流72小时。反应结束后，过滤，滤去反应液中残留的叠氮化钠固体，滤液减压蒸馏，浓缩液在600mL的冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤。收集固体，采用6mL二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂。溶液再次浓缩，在600mL冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温20℃下真空干燥至恒重。得到叠氮基封端的聚环氧乙烷(PEG-N₃)(3.70g，产率为：50％)。红外谱图中在1177cm^-1处磺酸酯中SO₂的对称伸缩特征峰消失，而在2108cm-1处出现叠氮基的特征吸收峰。

在100mL洁净干燥的圆底烧瓶中加入3.70g PEG-N₃(0.74mmol)及0.65g(2.48mmol)的三苯基膦，然后加入50mL(617mmol)的四氢呋喃，溶液为无色透明状，并有大量小气泡产生。在烧瓶口上装入导出管。溶液在室温23℃环境下搅拌24小时。反应结束后将反应液常压蒸馏浓缩溶液，浓缩液在500mL冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤。固体溶解在5mL二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中(体积比：20∶1)形成溶液，将此溶液移入硅胶层析柱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(体积比：20∶1)以除去反应中产生的氧化三苯基膦。浓缩收集到的溶液，在500mL冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温23℃下真空干燥至恒重。得到双氨基封端的聚环氧乙烷(PEG-NH₂)(3.10g，产率为83％)。¹H NMR(CDCl₃)：3.66(m，-OCH₂CH₂-)，2.82(t，4H，-CH₂-N-)。与PEG-N₃红外谱图相比，2108cm^-1处叠氮基的特征峰消失。末端的胺基在3500cm^-1和3400cm^-1附近有两条弱的吸收带，同时PEG的各种特征峰都存在，包括亚甲基的伸缩振动特征峰以及相应的剪切振动特征吸收峰，和C-O-C的伸缩振动特征峰。

聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的制备

新的毛细管预处理：用1M HCl和1M NaOH分别冲洗15分钟，然后用去离子水冲洗5分钟。用氧气干燥预处理的毛细管。干燥后的毛细管用注射器注入6mg/mL的多巴胺溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.20)。注入时间为30s，然后将毛细管两端用硅胶密封，室温23℃反应24小时。反应结束后用去离子水清洗毛细管5分钟，以除去残余的多巴胺溶液。毛细管用空气吹干后通入25mg/mL PEG-NH₂溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.60)，注入时间为30s，毛细管两端用硅胶密封，50℃反应30小时。反应结束后的毛细管用去离子水冲洗5分钟，以除去残余溶液，然后用空气吹干，得到聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层。

下面制备聚多巴胺毛细管涂层和PEG-NH₂毛细管涂层，目的是和本发明的聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层进行比较，以便进一步说明本发明的聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的优越性能。

聚多巴胺毛细管涂层的制备

预处理好的毛细管经氧气干燥后，用注射器注入6mg/mL的多巴胺溶液，多巴胺溶解于10mM，pH＝8.20的Tris-HCl缓冲溶液里。注入时间为30s，然后将毛细管两端用硅胶密封，室温反应24小时。反应结束后用去离子水清洗毛细管5分钟，以除去残余的多巴胺溶液。然后用空气吹干，得到聚多巴胺毛细管涂层。

PEG-NH₂毛细管涂层的制备

预处理好的毛细管经氧气干燥后，用注射器注入25mg/mL的PEG-NH₂溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.60)，注入时间为30s，毛细管两端用硅胶密封，50℃反应30小时。反应结束后的毛细管用去离子水冲洗5分钟，以除去残余溶液，然后用空气吹干，得到PEG-NH₂毛细管涂层。

上述制备聚多巴胺毛细管涂层及PEG-NH₂毛细管涂层的目的是为了和聚多巴胺-g-PEG毛细管涂层进行比较。通过对各种不同毛细管涂层电渗流的比较，进一步说明本发明的聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层能够更有效地抑制硅羟基的解离，从而得到稳定的电渗流。

毛细管电泳测量电渗流的实施条件如下：

预处理的空毛细管和涂层毛细管有效长度/总长：40/30cm；毛细管内径/外径：75/365μm；中性标记物苯甲醇的浓度为2×10^-4g/mL，在25℃进行测量。测量电渗流所采用的磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲液的pH值分别为：3.05、4.38、5.10、6.40、7.23、8.26。电渗流测量的具体步骤如下：(a)预处理好的空毛细管或各种涂层毛细管先用缓冲液在20psi压力下冲洗10min；(b)在0.2psi压力下注入苯甲醇3s；(c)在0.5psi压力下用缓冲液冲洗1min；(d)在0.2psi压力下注入苯甲醇3s；(e)在0.5psi压力下用缓冲液冲洗1min；(f)在10kV电压下预电泳1min；(g)在0.2psi压力下注入苯甲醇3s；(h)在0.5psi压力下用缓冲液分离10min。预处理的空毛细管和各种涂层毛细管在不同pH值下所测的电渗流如图3所示。空毛细管以及PEG-NH₂涂层的毛细管电渗流具有非常强的pH值依赖性，随着pH的增大而显著增大；当pH＝3-5时，聚多巴胺涂层毛细管的电渗流随pH值的增加而增加，当pH＝5-8时，聚多巴胺涂层毛细管的电渗流虽然较稳定，但相对于聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管来说，其对电渗流的抑制程度较小；聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管在pH＝3-8时，不仅能很好地稳定电渗流，而且也能抑制电渗流。

实施例2

氨基聚环氧乙烷(PEG-NH₂)的制备

将干燥后的PEG(9.20g，2mmol)和三乙胺(NEt₃)(2.35mL，16mmol)以及20mL(313mmol)二氯甲烷加入到洁净干燥的100mL圆底烧瓶中，形成溶液A。在洁净干燥的50mL烧杯中加入对甲苯磺酰氯(TyCl)(3.06g，16mmol)和10mL(157mmol)二氯甲烷，形成溶液B。在冰水浴的条件下，将溶液B逐滴滴入溶液A中，反应体系在25℃环境搅拌的条件下反应24小时。反应结束后，减压蒸馏除去大部分溶剂，浓缩液在600mL冷乙醚中沉淀，可除去反应产物中过量的对甲苯磺酰氯，抽滤，并用冷乙醚洗涤三次。收集的固体用10mL二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂，可除去反应中产生的三乙胺盐及对甲苯磺酸。溶液再次浓缩，在600mL的冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温25℃下真空干燥至恒重。得到苯磺酸酯封端的聚环氧乙烷(PEG-Ty)(7.80g，产率为84％)。¹H NMR(CDCl₃)：δ7.81(d，4H，ArH)，7.35(d，4H，ArH)，4.18(m，4H，TsO-CH₂-)，3.66(m，-OCH₂CH₂-)，2.46(s，6H，CH₃Ar-)。红外谱图中在1177cm^-1出现磺酸酯中SO₂的对称伸缩特征峰。

在100mL洁净干燥的圆底烧瓶中加入7.80g(1.6mmol)PEG-Ty，55mL(1058mmol)的乙腈以及5.5mL二甲基甲酰胺，PEG-Ty完全溶解后溶液呈无色透明状。然后加入叠氮化钠(NaN₃)(2.42g，37mmol)，溶液由无色透明转变为橙黄色，有部分叠氮化钠无法溶解。反应液在80℃回流72小时。反应结束后，过滤，滤去反应液中残留的叠氮化钠固体，滤液减压蒸馏，浓缩液在500mL的冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤。收集固体，用6mL二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂。溶液再次浓缩，在500mL冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温25℃下真空干燥至恒重。得到叠氮基封端的聚环氧乙烷(PEG-N₃)(4.20g，产率为：54％)。红外谱图中在1177cm^-1处磺酸酯中SO₂的对称伸缩特征峰消失，而在2108cm^-1处出现叠氮基的特征吸收峰。

在100mL洁净干燥的圆底烧瓶中加入4.20g(0.84mmol)PEG-N₃及0.89g(3.4mmol)的三苯基膦，然后加入50mL(617mmol)的四氢呋喃，溶液为无色透明状，并有大量小气泡产生。在烧瓶口上装入导出管。溶液在室温25℃环境下搅拌24小时。反应结束后将反应液常压蒸馏浓缩溶液，浓缩液在400mL冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤。固体溶解于5mL二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中(体积比：20∶1)形成溶液，将此溶液移入硅胶层析柱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(体积比：20∶1)以除去反应中产生的氧化三苯基膦。浓缩收集到的溶液在400mL冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温25℃下真空干燥至恒重。得到双氨基封端的聚环氧乙烷(PEG-NH₂)(3.50g，产率为83％)。¹H NMR(CDCl₃)：3.66(m，-OCH₂CH₂-)，2.82(t，4H，-CH₂-N-)。与PEG-N₃红外谱图相比，2108cm^-1处叠氮基的特征峰消失。末端的胺基在3500cm^-1和3400cm^-1附近有两条弱的吸收带，同时PEG的各种特征峰都存在，包括亚甲基的伸缩振动特征峰以及相应的剪切振动特征吸收峰，和C-O-C的伸缩振动特征峰。

聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的制备

新的毛细管预处理：用0.1M HCl和0.1M NaOH分别冲洗30分钟，然后用去离子水冲洗10分钟。用氧气干燥预处理的毛细管。干燥后的毛细管用注射器注入10mg/mL的多巴胺溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.50)。注入时间为30s，然后将毛细管两端用硅胶密封，室温25℃反应30小时。反应结束后用去离子水清洗毛细管10分钟，以除去残余的多巴胺溶液。毛细管用空气吹干后通入25mg/mL PEG-NH₂溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.60)，注入时间为30s，毛细管两端用硅胶密封，50℃反应40小时。反应结束后的毛细管用去离子水冲洗10分钟，以除去残余溶液，然后用空气吹干，得到聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层。

毛细管电泳分离碱性蛋白质的实施条件如下：

预处理的空毛细管和涂层毛细管有效长度/总长：40/30cm；毛细管内径/外径：75/365μm；检测器为UV-Vis，检测波长：214nm。三种碱性蛋白(Cytochrome C，Lysozyme，Ribonuclease A)的浓度为0.5mg/mL，分离温度为25℃。碱性蛋白电泳分离所采用的磷酸/柠檬酸缓冲液的pH值分别为：3.05、4.00、4.38、5.10、6.40。碱性蛋白质的电泳分离具体步骤如下：(a)在20psi压力下用缓冲液冲洗10min；(b)在20kV电压下预电泳5min；；(c)在0.5psi压力下注入蛋白质样品，进样时间为5s；(d)20kV电压下电泳分离碱性蛋白。

聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管在不同pH值电泳分离碱性蛋白质的电泳谱图如4所示。

聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管能在pH＝3-8范围内有效地将三种碱性蛋白(细胞色素C、溶菌酶和核糖核酸酶A)基线分离。细胞色素C在pH＝3.05、4.00时其迁移速度比溶菌酶快，在pH＞5.0的迁移速度却比溶菌酶慢。在pH＝4.38时溶菌酶与细胞色素C同时出峰。蛋白质表面电荷和构象会随着pH值变化而变化，从而导致了这两种蛋白质迁移率的变化。随着pH值的增加，蛋白质表面的净正电荷逐渐减少，迁移率逐渐降低，而毛细管表面负电荷逐渐增加，从而使毛细管壁和碱性蛋白质之间的静电作用增强引起吸附的增加。随着pH值的增加，蛋白质的出峰时间延长。

实施例3

氨基聚环氧乙烷(PEG-NH₂)的制备

将干燥后的PEG(9.20g，2mmol)和三乙胺(NEt₃)(3.40mL，24mmol)以及25mL(391mmol)二氯甲烷加入到洁净干燥的100mL圆底烧瓶中，形成溶液A。在洁净干燥的50mL烧杯中加入对甲苯磺酰氯(TyCl)(4.00g，21mmol)和15mL(235mmol)二氯甲烷，形成溶液B。在冰水浴的条件下，将溶液B逐滴滴入溶液A中，反应体系在室温28℃搅拌的条件下反应22小时。反应结束后，减压蒸馏除去大部分溶剂，浓缩液在600mL冷乙醚中沉淀，可除去反应产物中过量的对甲苯磺酰氯，抽滤，并用冷乙醚洗涤三次。收集的固体用9mL二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂，可除去反应中产生的三乙胺盐及对甲苯磺酸。溶液再次浓缩，在600mL的冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温28℃下真空干燥至恒重。得到苯磺酸酯封端的聚环氧乙烷(PEG-Ty)(7.60g，产率为82％)。¹H NMR(CDCl₃)：δ7.81(d，4H，ArH)，7.35(d，4H，ArH)，4.18(m，4H，TsO-CH₂-)，3.66(m，-OCH₂CH₂-)，2.46(s，6H，CH₃Ar-)。红外谱图中在1177cm^-1出现磺酸酯中SO₂的对称伸缩特征峰。

在100mL洁净干燥的圆底烧瓶中加入7.60g(1.54mmol)PEG-Ty，45mL(866mmol)的乙腈以及4.5mL二甲基甲酰胺，PEG-Ty完全溶解后溶液呈无色透明状。然后加入叠氮化钠(NaN₃)(1.75g，27mmol)，溶液由无色透明转变为橙黄色，有部分叠氮化钠无法溶解。反应液在78℃回流72小时。反应结束后，过滤，滤去反应液中残留的叠氮化钠固体，滤液减压蒸馏，浓缩液在600mL的冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤。收集固体，用10mL二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂。溶液再次浓缩，在600mL冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温28℃下真空干燥至恒重。得到叠氮基封端的聚环氧乙烷(PEG-N₃)(4.30g，产率为：56％)。红外谱图中在1177cm^-1处磺酸酯中SO₂的对称伸缩特征峰消失，而在2108cm^-1处出现叠氮基的特征吸收峰。

在100mL洁净干燥的圆底烧瓶中加入4.30g(0.9mmol)PEG-N₃及1.32g(5.0mmol)的三苯基膦，然后加入45mL(555mmol)的四氢呋喃，溶液为无色透明状，并有大量小气泡产生。在烧瓶口上装入导出管。溶液在室温28℃环境下搅拌22小时。反应结束后将反应液常压蒸馏浓缩溶液，浓缩液在500mL冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤。固体溶解在5mL二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中(体积比：20∶1)形成溶液，将此溶液移入硅胶层析柱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(体积比：20∶1)以除去反应中产生的氧化三苯基膦。浓缩收集到的溶液在400mL冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温28℃下真空干燥至恒重。得到双氨基封端的聚环氧乙烷(PEG-NH₂)(3.60g，产率为83％)。¹H NMR(CDCl₃)：3.66(m，-OCH₂CH₂-)，2.82(t，4H，-CH₂-N-)。与PEG-N₃红外谱图相比，2108cm^-1处叠氮基的特征峰消失。末端的胺基在3500cm^-1和3400cm^-1附近有两条弱的吸收带，同时PEG的各种特征峰都存在，包括亚甲基的伸缩振动特征峰以及相应的剪切振动特征吸收峰，和C-O-C的伸缩振动特征峰。

聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的制备

新的毛细管预处理：用1M HCl和0.1M NaOH分别冲洗30分钟，然后用去离子水冲洗10分钟。用氧气干燥预处理的毛细管。干燥后的毛细管用注射器注入15mg/mL的多巴胺溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.30)。注入时间为30s，然后将毛细管两端用硅胶密封，室温30℃反应30小时。反应结束后用去离子水清洗毛细管10分钟，以除去残余的多巴胺溶液。毛细管用空气吹干后通入25mg/mL PEG-NH₂溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.60)，注入时间为30s，毛细管两端用硅胶密封，48℃反应30小时。反应结束后的毛细管用去离子水冲洗10分钟，以除去残余溶液，然后用空气吹干，得到聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层。

毛细管电泳分离碱性蛋白质的实施条件如下：

毛细管涂层稳定性的考察采用pH值分别为3.05和5.38的磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲液的条件下，涂层毛细管连续分离碱性蛋白质200次，每次分离结束用缓冲液在20psi压力下冲洗毛细管5min，每分离50次后换新鲜的缓冲溶液。其他的分离条件和分离方法同实施例二。

聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管在pH＝3.05，5.38下连续分离碱性蛋白质200次的电泳谱图如图5所示。由图5可知，同一根毛细管在连续分离碱性蛋白质(细胞色素C、溶菌酶和核糖核酸酶A)200次后，分离时间和峰型没有太大的变化。说明该涂层能很好地覆盖毛细管内表面的硅羟基，抑制蛋白质的吸附，涂层的稳定性非常好。

实施例4

氨基聚环氧乙烷(PEG-NH₂)的制备

将干燥后的PEG(8.50g，1.8mmol)和三乙胺(NEt₃)(2.21mL，15mmol)以及20mL(313mmol)二氯甲烷加入到洁净干燥的100mL圆底烧瓶中，形成溶液A。在洁净干燥的50mL烧杯中加入对甲苯磺酰氯(TyCl)(4.00g，21mmol)和15mL(235mmol)二氯甲烷，形成溶液B。在冰水浴的条件下，将溶液B逐滴滴入溶液A中，反应体系在室温30℃搅拌的条件下反应20小时。反应结束后，减压蒸馏除去大部分溶剂，浓缩液在800mL冷乙醚中沉淀，可除去反应产物中过量的对甲苯磺酰氯，抽滤，并用冷乙醚洗涤三次。收集的固体用8mL二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂，可除去反应中产生的三乙胺盐及对甲苯磺酸。溶液再次浓缩在800mL的冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温30℃下真空干燥至恒重。得到苯磺酸酯封端的聚环氧乙烷(PEG-Ty)(7.30g，产率为85％)。¹H NMR(CDCl₃)：δ7.81(d，4H，ArH)，7.35(d，4H，ArH)，4.18(m，4H，TsO-CH₂-)，3.66(m，-OCH₂CH₂-)，2.46(s，6H，CH₃Ar-)。红外谱图中在1177cm^-1出现磺酸酯中SO₂的对称伸缩特征峰。

在100mL洁净干燥的圆底烧瓶中加入7.30g(1.49mmol)PEG-Ty，50mL(962mmol)的乙腈以及5mL二甲基甲酰胺，PEG-Ty完全溶解后溶液呈无色透明状。然后加入叠氮化钠(NaN₃)(1.95g，30mmol)，溶液由无色透明转变为橙黄色，有部分叠氮化钠无法溶解。反应液在76℃回流75小时。反应结束后，过滤，滤去反应液中残留的叠氮化钠固体，滤液减压蒸馏，浓缩液在大量800mL的冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤。收集固体，用8mL二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂。溶液再次浓缩在800mL冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温30℃下真空干燥至恒重。得到叠氮基封端的聚环氧乙烷(PEG-N₃)(4.10g，产率为：56％)。红外谱图中在1177cm^-1处磺酸酯中SO₂的对称伸缩特征峰消失，而在2108cm^-1处出现叠氮基的特征吸收峰。

在100mL洁净干燥的圆底烧瓶中加入4.10g(0.8mmol)PEG-N₃及2.00g(7.6mmol)的三苯基膦，然后加入40mL(494mmol)的四氢呋喃，溶液为无色透明状，并有大量小气泡产生。在烧瓶口上装入导出管。溶液在室温30℃环境下搅拌20小时。反应结束后将反应液常压蒸馏浓缩溶液，浓缩液在大量的600mL冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤。固体溶解在6mL二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中(体积比：20∶1)形成溶液，将此溶液移入硅胶层析柱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(体积比：20∶1)以除去反应中产生的氧化三苯基膦。浓缩收集到的溶液在600mL冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温30℃下真空干燥至恒重。得到双氨基封端的聚环氧乙烷(PEG-NH₂)(3.50g，产率为85％)。¹H NMR(CDCl₃)：3.66(m，-OCH₂CH₂-)，2.82(t，4H，-CH₂-N-)。与PEG-N₃红外谱图相比，2108cm^-1处叠氮基的特征峰消失。末端的胺基在3500cm^-1和3400cm^-1附近有两条弱的吸收带，同时PEG的各种特征峰都存在，包括亚甲基的伸缩振动特征峰以及相应的剪切振动特征吸收峰，和C-O-C的伸缩振动特征峰。

聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的制备

新的毛细管预处理：用0.1M HCl和1M NaOH分别冲洗20分钟，然后用去离子水冲洗5分钟。用氧气干燥预处理的毛细管。干燥后的毛细管用注射器注入10mg/mL的多巴胺溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.50)。注入时间为30s，然后将毛细管两端用硅胶密封，室温35℃反应35小时。反应结束后用去离子水清洗毛细管10分钟，以除去残余的多巴胺溶液。毛细管用空气吹干后通入20mg/mL PEG-NH₂溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.70)，注入时间为30s，毛细管两端用硅胶密封，50℃反应30小时。反应结束后的毛细管用去离子水冲洗10分钟，以除去残余溶液，然后用空气吹干，得到聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层。

毛细管电泳分离混合蛋白质的实施条件如下：

混合蛋白质(Cytochrome C，Lysozyme，Ribonuclease A，Myoglobin，Albumin，Trypsin inhibitor)用去离子水配制成浓度为0.5mg/mL。电泳分离缓冲液采用磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲溶液pH＝3.38。其他的分离条件和分离方法同实施例二。

聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管对比空毛细管分离混合蛋白质的电泳谱图如图6所示。三种碱性蛋白质(溶菌酶、细胞色素C和核糖核酸酶A)、两种酸性蛋白质(卵清蛋白和胰蛋白酶抑制剂)以及中性蛋白质(肌球素)在pH＝3.38的环境下均低于其等电点，此时，这六种蛋白质均带正电。而没有涂层的毛细管在pH＝3.38时内壁的硅羟基几乎全部解离而带负电。因此，空毛细管分离这六种混合蛋白时，存在严重的静电吸附作用，从而不能有效地分离混合蛋白。然而，采用聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层的毛细管在相同的分离条件能够高效分离这六种混合蛋白。由分离结果可知，聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层能够有效地屏蔽毛细管硅羟基，抑制蛋白质的吸附。

实施例5

氨基聚环氧乙烷(PEG-NH₂)的制备

将干燥后的PEG(11.50g，2.5mmol)和三乙胺(NEt₃)(3.12mL，21mmol)以及35mL(548mmol)二氯甲烷加入到洁净干燥的100mL圆底烧瓶中，形成溶液A。在洁净干燥的50mL烧杯中加入对甲苯磺酰氯(TyCl)(5.12g，27mmol)和18mL(282mmol)二氯甲烷，形成溶液B。在冰水浴的条件下，将溶液B逐滴滴入溶液A中，反应体系在室温35℃搅拌的条件下反应20小时。反应结束后，减压蒸馏除去大部分溶剂，浓缩液在1000mL冷乙醚中沉淀，可除去反应产物中过量的对甲苯磺酰氯，抽滤，并用冷乙醚洗涤三次。收集的固体用15mL二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂，可除去反应中产生的三乙胺盐及对甲苯磺酸。溶液再次浓缩，在1000mL的冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温35℃下真空干燥至恒重。得到苯磺酸酯封端的聚环氧乙烷(PEG-Ty)(9.60g，产率为83％)。¹H NMR(CDCl₃)：δ7.81(d，4H，ArH)，7.35(d，4H，ArH)，4.18(m，4H，TsO-CH₂-)，3.66(m，-OCH₂CH₂-)，2.46(s，6H，CH₃Ar-)。红外谱图中在1177cm^-1出现磺酸酯中SO₂的对称伸缩特征峰。

在100mL洁净干燥的圆底烧瓶中加入9.60g(1.9mmol)PEG-Ty，60mL(1155mmol)的乙腈以及6mL二甲基甲酰胺，PEG-Ty完全溶解后溶液呈无色透明状。然后加入叠氮化钠(NaN₃)(2.08g，32mmol)，溶液由无色透明转变为橙黄色，有部分叠氮化钠无法溶解。反应液在80℃回流75小时。反应结束后，过滤，滤去反应液中残留的叠氮化钠固体，滤液减压蒸馏，浓缩液在700mL的冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤。收集固体，用6mL二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂。溶液再次浓缩，在700mL冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温35℃下真空干燥至恒重。得到叠氮基封端的聚环氧乙烷(PEG-N₃)(5.20g，产率为：54％)。红外谱图中在1177cm^-1处磺酸酯中SO₂的对称伸缩特征峰消失，而在2108cm-1处出现叠氮基的特征吸收峰。

在100mL洁净干燥的圆底烧瓶中加入5.15g(1.0mmol)PEG-N₃及2.54g(9.7mmol)的三苯基膦，然后加入50mL(617mmol)的四氢呋喃，溶液为无色透明状，并有大量小气泡产生。在烧瓶口上装入导出管。溶液在35℃环境下搅拌30小时。反应结束后将反应液常压蒸馏浓缩溶液，浓缩液在700mL冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤。固体溶解在8mL二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中(体积比：20∶1)形成溶液，将此溶液移入硅胶柱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(体积比：20∶1)以除去反应中产生的氧化三苯基膦。浓缩收集到的溶液，在700mL冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温35℃下真空干燥至恒重。得到双氨基封端的聚环氧乙烷(PEG-NH₂)(4.38g，产率为84％)。¹H NMR(CDCl₃)：3.66(m，-OCH₂CH₂-)，2.82(t，4H，-CH₂-N-)。与PEG-N₃红外谱图相比，2108cm^-1处叠氮基的特征峰消失。末端的胺基在3500cm^-1和3400cm^-1附近有两条弱的吸收带，同时PEG的各种特征峰都存在，包括亚甲基的伸缩振动特征峰以及相应的剪切振动特征吸收峰，和C-O-C的伸缩振动特征峰。

聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的制备

新的毛细管预处理：用0.1M HCl和1M NaOH分别冲洗15分钟，然后用去离子水冲洗7分钟。用氧气干燥预处理的毛细管。干燥后的毛细管用注射器注入15mg/mL的多巴胺溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.30)。注入时间为30s，然后将毛细管两端用硅胶密封，室温35℃反应33小时。反应结束后用去离子水清洗毛细管10分钟，以除去残余的多巴胺溶液。毛细管用空气吹干后通入25mg/mL PEG-NH₂溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.60)，注入时间为30s，毛细管两端用硅胶密封，49℃反应36小时。反应结束后的毛细管用去离子水冲洗10分钟，以除去残余溶液，然后用空气吹干，得到聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层。

毛细管电泳分离奶粉蛋白质的实施条件如下：

将250mg新鲜粉末奶粉(购买于本地超市)溶于5mL 50mM乙酸(pH＝4.6)中，搅匀振荡1min，3000rpm离心15min，提取上层清液，用0.22μm微滤膜过滤。所得滤液置于冰箱中冷冻保存，待用。奶粉样品的分离采用pH＝3.38的磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲溶液，其他的分离条件和分离方法同实施例二。

聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管对比空毛细管分离奶粉中蛋白质的电泳谱图如图7所示。用pH＝4.6的乙酸处理后的牛奶中主要含有三种蛋白质：α-乳白蛋白、β-乳球蛋白A以及β-乳球蛋白B。对比空毛细管和聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管分离奶粉样品的电泳图，涂层毛细管能将奶粉中的三种蛋白质分离出来，而空毛细管却由于存在严重的吸附现象不能分离这三种蛋白。通过对奶粉中乳清蛋白的分离，说明聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层可以用作毛细管电泳分析各种复杂样品的涂层，有着广泛的应用前景。

实施例6

氨基聚环氧乙烷(PEG-NH₂)的制备

将干燥后的PEG(1.50g，2.5mmol)和三乙胺(NEt₃)(4.21mL，29mmol)以及25mL(391mmol)二氯甲烷加入到洁净干燥的100mL圆底烧瓶中，形成溶液A。在洁净干燥的50mL烧杯中加入对甲苯磺酰氯(TyCl)(4.45g，23mmo l)和15mL(235mmol)二氯甲烷，形成溶液B。在冰水浴的条件下，将溶液B逐滴滴入溶液A中，反应体系在室温30℃搅拌的条件下反应30小时。反应结束后，减压蒸馏除去大部分溶剂，浓缩液用900mL冷乙醚中沉淀，可除去反应产物中过量的对甲苯磺酰氯，抽滤，并用冷乙醚洗涤三次。收集的固体用20mL二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂，可除去反应中产生的三乙胺盐及对甲苯磺酸。溶液再次浓缩，浓缩液在900mL的冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温30℃下真空干燥至恒重。得到苯磺酸酯封端的聚环氧乙烷(PEG-Ty)(9.80g，产率为85％)。¹H NMR(CDCl₃)：δ7.81(d，4H，ArH)，7.35(d，4H，ArH)，4.18(m，4H，TsO-CH₂-)，3.66(m，-OCH₂CH₂-)，2.46(s，6H，CH₃Ar-)。红外谱图中在1177cm^-1出现磺酸酯中SO₂的对称伸缩特征峰。

在100mL洁净干燥的圆底烧瓶中加入9.80g(2.0mmol)PEG-Ty，65mL(1251mmol)的乙腈以及6.5mL二甲基甲酰胺，PEG-Ty完全溶解后溶液呈无色透明状。然后加入叠氮化钠(NaN₃)(2.23g，34mmol)，溶液由无色透明转变为橙黄色，有部分叠氮化钠无法溶解。反应液在80℃回流80小时。反应结束后，过滤，滤去反应液中残留的叠氮化钠固体，滤液减压蒸馏，浓缩液在500mL的冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤。收集固体，用5mL的二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂。溶液再次浓缩，浓缩液在500mL冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温30℃下真空干燥至恒重。得到叠氮基封端的聚环氧乙烷(PEG-N₃)(5.37g，产率为：54％)。红外谱图中在1177cm^-1处磺酸酯中SO₂的对称伸缩特征峰消失，而在2108cm^-1处出现叠氮基的特征吸收峰。

在100mL洁净干燥的圆底烧瓶中加入5.37g(1.1mmol)PEG-N₃及2.1g(8.0mmol)的三苯基膦，然后加入50mL(617mmol)的四氢呋喃，溶液为无色透明状，并有大量小气泡产生。在烧瓶口上装入导出管。溶液在室温30℃环境下搅拌30小时。反应结束后将反应液常压蒸馏浓缩溶液，浓缩液在500mL冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤。固体溶解在5mL二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中(体积比：20∶1)形成溶液，将此溶液移入硅胶层析柱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(体积比：20∶1)以除去反应中产生的氧化三苯基膦。浓缩收集到的溶液在500mL冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温30℃下真空干燥至恒重。得到双氨基封端的聚环氧乙烷(PEG-NH₂)(4.57g，产率为85％)。¹H NMR(CDCl₃)：3.66(m，-OCH₂CH₂-)，2.82(t，4H，-CH₂-N-)。与PEG-N₃红外谱图相比，2108cm^-1处叠氮基的特征峰消失。末端的胺基在3500cm^-1和3400cm^-1附近有两条弱的吸收带，同时PEG的各种特征峰都存在，包括亚甲基的伸缩振动特征峰以及相应的剪切振动特征吸收峰，和C-O-C的伸缩振动特征峰。

聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的制备

新的毛细管预处理：用0.1M HCl和1M NaOH分别冲洗10分钟，然后用去离子水冲洗5分钟。用氧气干燥预处理的毛细管。干燥后的毛细管用注射器注入10mg/mL的多巴胺溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.70)。注入时间为30s，然后将毛细管两端用硅胶密封，室温35℃反应25小时。反应结束后用去离子水清洗毛细管10分钟，以除去残余的多巴胺溶液。毛细管用空气吹干后通入25mg/mL PEG-NH₂溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.90)，注入时间为30s，毛细管两端用硅胶密封，45℃反应40小时。反应结束后的毛细管用去离子水冲洗5分钟，以除去残余溶液，然后用空气吹干，得到聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层。

毛细管电泳分离无脂花生蛋白质的实施条件如下：

剥皮的花生种子用研磨机研磨成粉，用正己烷溶解粉末花生，在-20℃环境下过夜脱脂，然后在3000rpm转速离心15min，除去上层清液，将得到的固体再次用正己烷溶解三次。脱脂花生粉末真空干燥。干燥后的脱脂花生用pH＝8.30的硼酸钠缓冲液溶解(溶解后花生蛋白质浓度为1.2％，m/v)，搅拌均匀后在3000rpm转速离心15min。提取上层清液用于花生蛋白的分析。花生蛋白的分析采用pH＝8.30的硼酸钠缓冲液作为电泳分离介质，其他的分离条件和分离方法同实施例二。

聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管对比空毛细管分离无脂花生蛋白的电泳谱图如图8所示。无脂花生种子主要有花生球蛋白和非花生球蛋白两类蛋白质。对比空毛细管和聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管分离无脂花生蛋白质的电泳图，涂层毛细管能将花生种子中8种蛋白质分离出来，而空毛细管却由于存在严重的吸附现象不能分离这些蛋白质。

实施例7

氨基聚环氧乙烷(PEG-NH₂)的制备

将干燥后的PEG(11.50g，2.5mmol)和三乙胺(NEt₃)(4.35mL，30mmol)以及30mL(470mmol)二氯甲烷加入到洁净干燥的100mL圆底烧瓶中，形成溶液A。在洁净干燥的50mL烧杯中加入对甲苯磺酰氯(TyCl)(5.45g，29mmol)和20mL(313mmol)二氯甲烷，形成溶液B。在冰水浴的条件下，将溶液B逐滴滴入溶液A中，反应体系在室温30℃搅拌的条件下反应20小时。反应结束后，减压蒸馏除去大部分溶剂，浓缩液在1000mL冷乙醚中沉淀，可除去反应产物中过量的对甲苯磺酰氯，抽滤，并用冷乙醚洗涤三次。收集的固体用15mL二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂，可除去反应中产生的三乙胺盐及对甲苯磺酸。溶液再次浓缩，浓缩液在1000mL的冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温30℃下真空干燥至恒重。得到苯磺酸酯封端的聚环氧乙烷(PEG-Ty)(9.78g，产率为85％)。¹H NMR(CDCl₃)：δ7.81(d，4H，ArH)，7.35(d，4H，ArH)，4.18(m，4H，TsO-CH₂-)，3.66(m，-OCH₂CH₂-)，2.46(s，6H，CH₃Ar-)。红外谱图中在1177cm^-1出现磺酸酯中SO₂的对称伸缩特征峰。

在100mL洁净干燥的圆底烧瓶中加入9.78g(2.0mmol)PEG-Ty，60mL(1154mmol)的乙腈以及6mL二甲基甲酰胺，PEG-Ty完全溶解后溶液呈无色透明状。然后加入叠氮化钠(NaN₃)(3.10g，47mmol)，溶液由无色透明转变为橙黄色，有部分叠氮化钠无法溶解。反应液在80℃回流72小时。反应结束后，过滤，滤去反应液中残留的叠氮化钠固体，滤液减压蒸馏，浓缩液在800mL的冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤。收集固体，用8mL二氯甲烷溶解后移入中性氧化铝层析柱，二氯甲烷作为洗脱剂。溶液再次浓缩，浓缩液在800mL冷乙醚中沉淀，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温30℃下真空干燥至恒重。得到叠氮基封端的聚环氧乙烷(PEG-N₃)(5.40g，产率为：55％)。红外谱图中在1177cm^-1处磺酸酯中SO₂的对称伸缩特征峰消失，而在2108cm^-1处出现叠氮基的特征吸收峰。

在100mL洁净干燥的圆底烧瓶中加入5.40g(1.1mmol)PEG-N₃及1.95g(7.4mmol)的三苯基膦，然后加入50mL(617mmol)的四氢呋喃，溶液为无色透明状，并有大量小气泡产生。在烧瓶口上装入导出管。溶液在室温30℃环境下搅拌24小时。反应结束后将反应液常压蒸馏浓缩溶液，浓缩液在600mL冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤。固体溶解在6mL二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中(体积比：20∶1)形成溶液，将此溶液移入硅胶柱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(体积比：20∶1)以除去反应中产生的氧化三苯基膦。浓缩收集到的溶液，浓缩液在600mL冷乙醚中沉淀，洗涤，抽滤，得到的固体以五氧化二磷为干燥剂在室温30℃下真空干燥至恒重。得到双氨基封端的聚环氧乙烷(PEG-NH₂)(4.60g，产率为85％)。¹H NMR(CDCl₃)：3.66(m，-OCH₂CH₂-)，2.82(t，4H，-CH₂-N-)。与PEG-N₃红外谱图相比，2108cm^-1处叠氮基的特征峰消失。末端的胺基在3500cm^-1和3400cm^-1附近有两条弱的吸收带，同时PEG的各种特征峰都存在，包括亚甲基的伸缩振动特征峰以及相应的剪切振动特征吸收峰，和C-O-C的伸缩振动特征峰。

聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层的制备

新的毛细管预处理：用1M HCl和1M NaOH分别冲洗30分钟，然后用去离子水冲洗15分钟。用氧气干燥预处理的毛细管。干燥后的毛细管用注射器注入6mg/mL的多巴胺溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.00)。注入时间为30s，然后将毛细管两端用硅胶密封，室温35℃反应35小时。反应结束后用去离子水清洗毛细管10分钟，以除去残余的多巴胺溶液。毛细管用空气吹干后通入25mg/mL PEG-NH₂溶液(溶解于10mM Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.50)，注入时间为30s，毛细管两端用硅胶密封，50℃反应35小时。反应结束后的毛细管用去离子水冲洗8分钟，以除去残余溶液，然后用空气吹干，得到聚多巴胺-g-聚环氧乙烷毛细管涂层。

毛细管电泳分离鸡蛋清蛋白质的实施条件如下：

从新鲜鸡蛋中分离出鸡蛋清，然后用20mM，pH＝7.4 Tris-HCl将鸡蛋清稀释20倍，搅拌均匀后用0.22μm微滤膜过滤，所得滤液置于冰箱中冷冻保存，待用。鸡蛋清蛋白的电泳分离采用pH＝3.20磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲溶液作为分离介质，其他的分离条件和分离方法同实施例二。

聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管对比空毛细管分离鸡蛋清蛋白的电泳谱图如图9所示。鸡蛋清中主要含有两种酸性蛋白(卵清蛋白(OVA，pI＝5)、刀豆蛋白A(ConA，pI＝6))以及碱性蛋白质溶菌酶(Lysozyme，pI＝11)。对比空毛细管和聚多巴胺-g-聚环氧乙烷涂层毛细管分离鸡蛋清样品的电泳图，涂层毛细管能将鸡蛋清中的三种主要蛋白质分离出来，而空毛细管却由于存在严重的吸附现象不能分离这三种蛋白。通过对乳清蛋白的分离说明聚多巴胺-g-聚环氧乙烷可以用作毛细管涂层电泳分析各种复杂的蛋白质样品，有着广泛的应用前景。