一种编码甲型流感病毒NP蛋白和M2e多肽的融合基因

摘要

一种编码甲型流感病毒NP蛋白和M2e多肽的融合基因。所属技术领域：1.生物技术，2.基因工程疫苗。本发明提供一种根据大肠杆菌偏爱密码子优化的人工合成的编码甲型流感病毒核壳蛋白NP和基质蛋白2胞外区M2e多肽的融合基因NM2es，该基因可以在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒NP和M2e融合蛋白NM2e，使用纯化的NM2e蛋白制备的蛋白亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠，可以有效地保护小鼠抵御异型流感病毒的攻击，NM2es基因可以用于广谱甲型流感病毒基因工程疫苗和甲型流感病毒诊断试剂的研发。

说明书

技术领域 本发明总的涉及生物技术，特别涉及以甲型流感病毒NP和M2e为靶抗原的基因工程甲型流感病毒疫苗的研制技术。 

背景技术 流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的严重危害人类健康的呼吸道传染病，接种疫苗是预防流感传播最有效的措施。传统流感疫苗主要依赖表面抗原血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)诱发中和抗体发挥保护作用^[1]，但这两种抗原高度变异，不能诱发亚型间交叉保护，更难以预防未知甲型流感毒株引发的流感大流行^[2，3]。因此，使用新策略研发甲型流感病毒不同亚型间具有交叉保护作用的广谱流感大流行疫苗已成为流感疫苗研究的重要领域。研究表明，使用甲型流感病毒HA和NA之外的抗原研制的流感疫苗，通过诱发杀伤性T淋巴细胞(Cytotoxicity T lymphocytes，CTL)或抗体依赖的细胞杀伤(Antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)等作用，能在动物中产生明显亚型间交叉保护。其中基于高度保守的甲型流感毒内部抗原核壳蛋白(Nucleoprotein，NP)^[4]与基质蛋白2(Matrix 2，M2)^[5]构建的多种形式的疫苗，包括DNA疫苗^[6-11]、病毒载体疫苗^[12-14]、表位肽疫苗^[15，16]、蛋白亚单位疫苗^[17-20]、多抗原联合疫苗^[21-23]及佐剂疫苗^[24-28]等，可以在小鼠中产生高水平的亚型间交叉保护，甚至可以交叉保护高致病性禽流感病毒H5N1的攻击。NP主要通过诱导机体产生CTL，M2主要通过其胞外区(Extracellular domain ofM2，M2e)的ADCC发挥免疫保护作用，是较有发展前景的两种抗原^[29，30]。由于NP和M2e抗原在自然感染中诱发的免疫保护均较弱，因而增强这类抗原制备的疫苗的免疫强度，提高其交叉免疫保护效果，是这类疫苗研制中需要解决的关键问题。现有提高这类疫苗免疫效果的技术路线较为复杂，显示出较好免疫保护效果的疫苗均为联合疫苗，都使用两种不同类型疫苗分别进行初免和加强，生产成本高，免疫程序复杂，不适于疫苗大规模生产和广泛使用。联合疫苗中的病毒载体疫苗会产生针对载体的抗体，而载体抗体会影响疫苗再次使用。因此，研究出免疫保护效果好、成本低、易于大规模生产、能广泛使用和再次使用的疫苗是广谱流感大流行疫苗研究迫切需要解决的问题。多抗原疫苗和联合疫苗在动物实验中通常能显示出更为有效的交叉免疫保护^[21-28]，提示如果联合使用NP与M2e两种抗原作疫苗，同时诱发机体产生针对这两种抗原的有效免疫反应，将可能获得更为有效的免疫保护效果；原核表达系统具有基因工程操作简单、表达效率高、发酵工艺成熟、产量大、成本低等特点，如果这两种抗原能在原核系统中高效表达，则可以克服当前广谱流感疫苗研制路线中生产工艺复杂、生产周期长、产量低、成本高等缺陷^[31，32]；另外，如果原核系统表达的NP与M2e抗原能诱发机体产生有效免疫保护，则使用原核表达的NP与M2e抗原制备的广谱流感大流行蛋白亚单位疫苗将会明显简化免疫程序，并易于广泛使用和再次使用。这些问题的解决将会极大促进广谱流感大流行疫苗的研发，对流感大流行的防空具有重要意义。 

发明内容 基于以上分析，本发明目的是：以甲型流感病毒抗原中具有广谱交叉保护作用的保守抗原NP和M2e为疫苗靶抗原，将NP和M2e基因融合，按照大肠杆菌偏爱的密码子对该融合基因密码子进行优化，以期在大肠杆菌中高效表达NP和M2e融合蛋白，使用纯化的NP和M2e融合蛋白制备亚单位疫苗，期望大肠杆菌表达的NP和M2e融合蛋白制备的亚单位疫苗能诱发机体产生有效免疫保护。如果这一目标能够实现，则能根本解决目前广谱流感疫苗研制中存在的免疫效果差、生产成本高、免疫程序复杂、难于广泛使用等问题。 

实施原则本发明通过下列方法和原则实现：①选择甲型流感病毒抗原中具有广谱交叉保护的NP和M2e为靶抗原，构建NP和M2e融合基因；②按照大肠杆菌偏爱的密码子序列，对NP和M2e融合基因密码子进行优化；③人工合成密码子优化的NP和M2e的融合基因；④将人工合成的密码子优化的NP和M2e的融合基因插入原核表达载体进行目的蛋白的表达；⑤通过蛋白层析技术对目的蛋白进行纯化，使用纯化的NP和M2e融合蛋白制备亚单位疫苗；⑥将蛋白亚单位疫苗免疫小鼠，通过异型流感病毒的攻击确定NP和M2e融合蛋白亚单位疫苗的免疫保护效果。 

发明内容本发明选择甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)中具有广谱交叉保护作用的NP和M2e为靶抗原，将野生型病毒NP和M2e基因融合，命名为NM2e融合基因，NM2e融合基因序列全长1566脱氧核糖核苷酸，编码521个氨基酸，第1个至第1494个脱氧核糖核苷酸编码甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)完整核壳蛋白NP的498个氨基酸，第1495个至1563个脱氧核糖核苷酸编码甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)基质蛋白2胞外区多肽M2e的23个氨基酸；按照大肠杆菌偏爱的密码子序列，对融合基因NM2e密码子进行优化，密码子优化后的融合基因命名为NM2es，其编码的氨基酸序列与优化前的NM2e融合基因编码的完全一致，G+C百分含量由优化前的45.8％提高至52.8％，密码子适合指数CAI值由优化前的0.675提高至0.968；人工合成密码子优化的NM2es融合基因，并将NM2es基因片段插入原核表达载体pET-30a(+)，在大肠杆菌中高效表达了NM2e融合蛋白；通过离子交换和凝胶过滤层析技术，获得纯度约为90％的NM2e融合蛋白；使用大肠杆菌表达的NM2e融合蛋白作为亚单位疫苗免疫小鼠，利用异型甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)对实验小鼠进行攻毒，对照组小鼠全部死亡，NM2e亚单位疫苗10ug免疫组58％小鼠存活，说明大肠杆菌表达的NM2e具有较好的免疫保护效果，具有重要的广谱流感大流行疫苗开发前景。 

主要优点由于按照大肠杆菌的优势密码子对目的基因进行了优化，NM2e可以在大肠杆菌系统高效表达。由于疫苗中含有NP和M2e成分，NM2e融合蛋白亚单位疫苗免疫小鼠后可以同时诱发体液(M2e，ADCC)和细胞免疫反应(NP，CTL)，能够更有效地保护小鼠抵抗异型流感病毒的攻击。由于NM2e融合蛋白亚单位疫苗使用大肠杆菌发酵生产，疫苗生产工艺成熟、成本低、适合大规模生产。使用本项发明制备的广谱甲型流感疫苗将会明显简化疫苗免疫程序，易于广泛使用和再次使用。 

附图说明

图1：NM2e融合基因核苷酸序列和对应氨基酸序列，本图为甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)的NP和M2e融合的NM2e基因的核苷酸和氨基酸序列。NM2e融合基因序列全长1566脱氧核糖核苷酸，编码521个氨基酸，第1个至第1494个脱氧核糖核苷酸编码甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)完整核壳蛋白NP的498个氨基酸，第1495个至1563个脱氧核糖核苷酸编码甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)基质蛋白2胞外区多肽M2e的23个氨基酸。阴影部分为M2e基因及其对应氨基酸序列，阴影加斜体文字部分为翻译起始密码子ATG及对应的氨基酸序列和终止密码子TAA。 

2：NM2es融合基因核苷酸序列和对应氨基酸序列，本图为NM2e融合基因经密码子优化后的NM2es基因的核苷酸和氨基酸序列。NM2es基因序列是依据大肠杆菌偏爱的密码子序列对融合基因NM2e密码子进行优化所得，G+C百分含量由优化前的45.8％提高至52.8％，密码子适合指数CAI值由优化前的0.675提高至0.968，其编码的氨基酸序列与优化前的NM2e融合基因编码的完全一致。NM2es融合基因序列全长1566脱氧核糖核苷酸，编码521个氨基酸，第1个至第1494个脱氧核糖核苷酸编码甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)完整核壳蛋白NP的498个氨基酸，第1495个至1563个脱氧核糖核苷酸编码甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)基质蛋白2胞外区多肽M2e的23个氨基酸。阴影部分为密码子化的M2e基因及其对应氨基酸序列，阴影加斜体部分为翻译起始密码子ATG及其对应氨基酸序列和终止密码子TAA。 

图3：重组质粒pET30a-NM2e与pET30a-NM2es的构建与结构图，本图为重组质粒pET30a-NM2e和pET30a-NM2es的构建与结构示意图。图中pET-30a(+)是商品化的原核表达载体。 

质粒pET30a-NM2e的构建： 

经PCR扩增的NM2e基因片段(在PCR反应中通过设计引物对M2e序列进行了密码子优化，pET30a-NM2e与pET30a-NM2es中M2e基因序列相同)经过酶切、连接插入到表达质粒pET-30a(+)的NdeI和EcoRI酶切位点之间，获得重组质粒pET30a-NM2e。 

质粒pET30a-NM2es的构建： 

人工合成完整NM2es基因片段后经过酶切、连接插入到表达质粒pET-30a(+)的NdeI和EcoRI酶切位点之间，获得重组质粒pET30a-NM2es。 

质粒pET30a-NM2e的结构说明： 

该质粒为原核表达质粒pET-30a(+)经NdeI和EcoRI双酶切后，与相同酶切处理的NM2ePCR扩增片段连接而成，NM2e片段置于T7启动子下游，质粒序列长度为6,838bp。由于载体经过了限制性内切酶NdeI和EcoRI的酶切作用，去除了载体所带有的6×His标签，因而外 源基因NM2e为非融合性表达基因，它在表达时利用基因本身所带有的起始密码子ATG和终止密码子TAA，表达产物不含载体成分。 

质粒pET30a-NM2es的结构说明： 

该质粒为原核表达质粒pET-30a(+)经NdeI和EcoRI双酶切后，与相同酶切处理的人工合成的NM2es基因片段连接而成，NM2es片段置于T7启动子下游，质粒序列长度为6,838bp。同pET30a-NM2e的结构相同，由于载体经过限制性内切酶NdeI和EcoRI的酶切作用，去除了所带的6×His标签，外源基因NM2es为非融合性表达基因，它在表达时利用基因本身所带有的起始密码子ATG和终止密码子TAA，表达产物不含载体成分。 

该质粒为原核表达质粒pET-30a(+)经NdeI和EcoRI双酶切后，与相同酶切处理的人工合成的NM2es基因片段连接而成，NM2es片段置于T7启动子下游，质粒序列长度为6,838bp。同pET30a-NM2e的结构相同，由于载体经过限制性内切酶NdeI和EcoRI的酶切作用，去除了所带的6×His标签，外源基因NM2es为非融合性表达基因，它在表达时利用基因本身所带有的起始密码子ATG和终止密码子TAA，表达产物不含载体成分。 

4：重组质粒pET30a-NM2e与pET30a-NM2es的酶切鉴定，本图为对重组质粒pET30a-NM2e和pET30a-NM2es进行酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果，利用NdeI和EcoRI对质粒pET-30a(+)、pET30a-NM2e和pET30a-NM2es进行了双酶切鉴定。1、2和3道分别为质粒pET-30a(+)、pET30a-NM2e和pET30a-NM2es的双酶切鉴定结果，经过双酶切作用后pET30a-NM2e产生长度为1.6kb和5.4kb两个片段，分别对应于外源基因片段NM2e和载体pET-30a(+)；pET30a-NM2es经过双酶切作用后也产生了长度为1.6kb和5.4kb两个片段，对应于外源基因片段NM2es和载体pET-30a(+)。M1为DNA分子量标准λ-EcoT14 I digest，分子量从大到小依次为19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925、421和74bp。M2为DNA分子量标准DL2000，其分子量从大到小依次为2000、1000、750、500、250和100bp。 

5：重组蛋白NM2e在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达和溶解性质的SDS-PAGE分析，本图为重组蛋白NM2e在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达和溶解性质的SDS-PAGE分析。将质粒pET30a-NM2e和pET30a-NM2es转化大肠杆菌BL21(DE3)进行目的蛋白的诱导表达，在细菌培养至OD600＝0.8时加入0.1mM IPTG，在25℃进行诱导，诱导时间为4h。图中1道、2道分别为BL21(DE3)-pET30a-NM2e、BL21(DE3)-pET30a-NM2es诱导前的全菌样品，3道、4道、5道分别为BL21(DE3)-pET30a-NM2e以0.1mM IPTG 25℃诱导4h后的全菌、上清和沉淀样品，6道、7道、8道分别为BL21(DE3)-pET30a-NM2es以0.1mM IPTG 25℃诱导4h后的全菌、上清和沉淀样品，9道为BL21(DE3)-pET30a-NM2e未加诱导剂IPTG的全菌样品。M为蛋白分子量标准，从大到小依次为97.4、66.2、43.0、31.0和20.1kDa。NM2e以可溶性表达为主，NM2e基因表达的NM2e蛋白约占所有上清成分的10％，NM2es基因表达的NM2e蛋白占所有上清成分的20-30％，约为前者的2-3倍。 

图6：本图为利用阴离子交换层析(DEAE-Fast Flow sepharose)和凝胶过滤层析(Superdex200)纯化NM2e的SDS-PAGE凝胶电泳分析。将pET30a-NM2es转化大肠杆菌BL21(DE3)后在25℃以0.1mM IPTG诱导10h，超声破碎菌体离心后收获上清样品，利用阴离子交换和凝胶过滤进行NM2e的两步纯化。图中1道为BL21(DE3)-pET30a-NM2es在25℃以0.1mMIPTG诱导10h，超声破碎菌体离心后收获上清样品，2道为经过离子交换纯化获得的NM2e再经分子筛纯化所获得的样品，3道为离子交换纯化获得的NM2e样品。M为蛋白分子量标准，从大到小依次为97.4、66.2、43.0、31.0和20.1kDa。经过离子交换获得的样品中NM2e纯度可达到70-80％，再经凝胶过滤所获得样品中NM2e纯度可达到90％。 

7：Western-blot鉴定NM2e结果，本图为通过western-blot鉴定NM2e的结果。A图为SDS-PAGE凝胶电泳图，B图和C图为western-blot结果。B图所用抗体为甲型流感病毒NP蛋白免疫小鼠血清，为本科室制备。C图所用抗体为针对甲型流感病毒M2蛋白的小鼠单抗14C2，主要针对M2e，购自英国abcam公司。图中1道为经阴离子交换(DEAE-Fast Flowsepharose)和凝胶过滤(Superdex 200)纯化后所获得的NM2e样品，2道为将质粒pET-30a(+)转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达收获的全菌，M为蛋白分子量标准。A图中M的分子量从大到小依次为97.4、66.2、43.0、31.0、20.1kDa；B图和C图的M相同，分子量从大到小依次为175、83、62、47.5、32.5和25.0kDa。经阴离子交换(DEAE-Fast Flow sepharose)和凝胶过滤(Superdex 200)两步纯化的NM2e可以与甲型流感病毒NP蛋白免疫小鼠血清特异反应，说明其中含有NP成分，同时它也可以与M2e特异的单抗反应，说明其中含有M2e的成分，结果表明所纯化的目的蛋白为NP和M2e的融合蛋白。 

图8：ELISA检测小鼠血清抗NP特异性IgG抗体，为利用ELISA检测10μg NM2e诱发BALB/c小鼠产生NP特异性IgG的结果。 代表NS组， 代表NM2e组。以10μg NM2e经肌注免疫BALB/C小鼠，间隔2周免疫1次，共免疫3次。每次免疫后10天眼眶取血测定血清抗NP IgG。利用纯化的NP包被酶标板(200ng/100μl/孔)，在第一次免疫后10天(相当于免疫程序第2周)小鼠抗NP IgG滴度即可达到9.6×10³，第二次和第三次检测时其滴度均为8.6×10⁵，而对照组仅保持在较低的水平，说明NM2e免疫小鼠后诱发了NP特异性IgG，具有较强的免疫原性。 

9：ELISA检测NM2e免疫小鼠抗M2e特异性IgG抗体，为利用ELISA检测10μg NM2e诱发BALB/c小鼠产生M2e特异性IgG的结果。 代表NS组， 代表NM2e组。以M2e全长多肽包被酶标板(200ng/100μl/孔)，对上述获取血清进行检测，三次检测结果分别为28，106和176，对照组未检测到明显的抗体，说明NM2e免疫小鼠后诱发产生了针对M2e的IgG，融合蛋白NM2e较好地保持了M2e的免疫原性。 

10：甲型流感病毒PR8攻击NM2e免疫小鼠的存活率，为以10LD50甲型流感病毒PR8攻击10μg NM2e免疫BALB/c小鼠后的存活率。以10μg NM2e三针免疫BALB/c小鼠，每次间隔2周，第三针免疫后10天，以10LD50甲型流感病毒PR8攻击小鼠，对照NS免疫组全部死亡，而NM2e免疫组存活率为58％，说明NM2e具有有效的免疫保护作用。 

具体实施方式 下面结合图表对本发明作进一步阐述。 

一、以编码甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)NP蛋白和M2e多肽的基因序列为原始序列，设计和合成病毒自身密码子编码的NP蛋白和M2e多肽的融合基因NM2e 

将甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)自身密码子编码的核壳蛋白NP的全基因1494个核苷酸序列的“3′”端与M2e多肽的69个核苷酸序列的“5′”连接，在M2e基因末端加上终止密码子TAA，获得融合基因NM2e，该基因序列全长为1566bp，编码521个氨基酸，第1个至第1494个脱氧核糖核苷酸编码甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核壳蛋白NP的498个氨基酸，第1495个至1563个脱氧核糖核苷酸编码甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)基质蛋白2胞外区多肽M2e的23个氨基酸。NM2e融合基因及其编码的氨基酸序列见附图1。二、按大肠杆菌偏爱的密码子对NM2e融合基因的病毒自身密码子进行优化并人工合成优化后的融合基因NM2es。 

根据大肠杆菌密码子的偏爱性对NM2e融合基因的病毒自身密码子进行优化是实现或提高NM2e蛋白在大肠杆菌中高效表达的重要技术手段。我们依据CUTG数据库中细菌总体密码子使用频率的资料，参考碱基变化对mRNA二级结构的影响，在保证NM2e蛋白质序列不发生变化的前提下，调整了G+C含量和分布，避开常用的酶切位点，对NM2e基因进行了重新设计，得到一条可能在大肠杆菌中高效表达NM2e融合蛋白的基因序列，命名为NM2e-synthesized，简称为NM2es，并人工合成了这段基因。NM2es基因序列全长为1566bp，编码521个氨基酸，第1个至第1494个脱氧核糖核苷酸编码甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核壳蛋白NP的498个氨基酸，第1495个至1563个脱氧核糖核苷酸编码甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)基质蛋白2胞外区多肽M2e的23个氨基酸，NM2es融合基因及其编码的氨基酸序列见附图2。NM2es基因与改造前的NM2e基因核苷酸数量相同，所编码的氨基酸序列相同，但核苷酸的成分比例发生明显变化，G+C含量由改造前的45.8％提高至52.8％，密码子适合指数CAI值由0.675升至0.968。NM2e与NM2es融合基因的核苷酸及其编码的氨基酸序列比对结果见表1。该表是利用DAMBE软件同时对NM2es与NM2e融合基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行的比对，上排为核苷酸序列，下排为氨基酸序列，“*”表示核苷酸序列不同。阴影部分为编码M2e的基因及氨基酸序列，阴影斜体文字部分分别为起始密码子ATG及其翻译的蛋氨酸(M)和终止密码子TAA。 

表1.NM2e与NM2es融合基因的核苷酸和氨基酸序列比对结果 

三、使用NM2es和NM2e基因分别构建能在大肠杆菌中表达NM2e蛋白的重组质粒 

pET-30a(+)为商品化的原核表达载体，该载体利用T7启动子进行外源基因的表达。质粒pET-30a(+)经NdeI和EcoRI双酶切后，与相同酶切处理的NM2es基因片段连接，获得重组质粒pET30a-NM2es，质粒大小为6,838bp(结果见附图3)。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单个克隆培养，提取质粒后经酶切(结果见附图4)和测序鉴定(资料略)，序列正确，读码框架正确，NM2es基因片段准确插入到pET-30a(+)的NdeI和EcoRI酶切位点间。为便于对密码子优化前后蛋白的表达量进行比较，我们同时构建了含NM2e基因片段(NP基因密码子未优化，M2e 23个氨基酸密码子优化)的重组质粒pET30a-NM2e，其结构与pET30a-NM2es相同(结果见附图3)，酶切鉴定结果正确(结果见附图4)。 

四、分别含有NM2es和NM2e基因的重组质粒在大肠杆菌中表达NM2e蛋白效果的比较 

将表达质粒pET30a-NM2es和pET30a-NM2e分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落接种于3ml LB培养基中，37℃过夜培养，次日将菌液按1∶200转接于3ml 2×YT培养基中，37℃培养至OD600＝0.8时加入0.1mM的IPTG，25℃诱导4h，取菌液离心收获菌体，超声波破碎菌体后进行SDS-PAGE电泳，结果显示在约58.8kDa处有明显的表达蛋白带，与预期目的蛋白一致，且目的蛋白主要分布在上清中，以可溶性表达为主。NM2e基因表达的NM2e约占上清总蛋白的10％，NM2es基因表达的NM2e蛋白约占上清总蛋白的20-30％，为前者的2-3倍(结果见附图5)，说明密码子优化可以明显提高目的蛋白在大肠杆菌系统的表达量。 

五、大肠杆菌中NM2es基因表达的融合蛋白NM2e的纯化和鉴定 

将诱导表达的BL21(DE3)-pET30a-NM2es菌液离心，收获菌体后重悬于含0.1M NaCl的20mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(PB)(pH7.2)缓冲液中，冰上超声波破碎并离心后收取上清，上清用0.45μm滤膜过滤后进行阴离子交换纯化，所选用介质为DEAE Fast Flow sepharose(DEAE)。介质先用0.1M NaCl，20mM PB(pH7.2)平衡，控制流速2ml/min，上样后先用0.1MNaCl，20mM PB(pH7.2)冲洗介质，去除未结合蛋白，清洗3-4柱床后，继而用0.4M NaCl，20mM PB(pH7.2)洗脱杂蛋白，清洗3-4柱床后，用0.8M NaCl，20mM PB(pH7.2)洗脱目的蛋白。将所收集样品进行超滤和高速离心浓缩后，调整蛋白浓度≥1mg/ml，按照柱床体积1％上样通过凝胶过滤介质(Superdex 200)进行目的蛋白的第二次纯化。首先以含0.15M NaCl的PBS(pH7.2)平衡介质，上样后收集样品峰，高速离心浓缩样品后进行SDS-PAGE分析样品纯度。经过DEAE纯化后的NM2e纯度可达80％左右，再经Superdex 200进一步纯化后其纯度可以提高至90％左右(结果见附图6)。 

利用western-blot对经过两步纯化的NM2e进行了鉴定。NM2e可以与甲型流感病毒NP蛋白免疫小鼠血清进行反应，也可以与M2单抗14C2进行反应，说明NM2e包含了有效的NP和M2e成分(结果见附图7)。 

六、NM2es基因在大肠杆菌中表达的NM2e融合蛋白的免疫及免疫保护效果研究 

1、重组融合蛋白NM2e免疫BALB/c小鼠血清中NP特异性IgG的ELISA分析 

纯化的NM2e蛋白经肌肉注射免疫BALB/c小鼠，每次注射10μg，间隔2周免疫1次，共免疫3次。每次免疫后10天分别从眼眶取血(相当于免疫程序的第2周、第4周和第6周)，以纯化的NP蛋白包被酶标板(200ng/100μl/孔)测定血清抗NP的抗体IgG。结果表明，第2周小鼠抗NP抗体IgG滴度即可达到9.6×10³，第4周和第6周滴度均为升至8.6×10⁵，而对照组仅保持在较低的本底水平(结果见附图8)，说明NM2e蛋白免疫小鼠后能诱发针对NP特异性的IgG，具有较强的免疫原性。 

2、重组蛋白NM2e免疫BALB/c小鼠血清M2e特异性IgG的ELISA分析 

以M2e多肽包被96孔板(200ng/100μl/孔)，对上述所获取血清进行检测，第2周、4周和6周M2e特异性IgG滴度分别为28、106和176，对照组均未检测到明显的抗体反应(结果见附图9)，说明NM2e蛋白免疫小鼠后诱发产生了针对M2e特异的IgG，融合蛋白NM2e较好地保持了M2e的免疫原性。 

3、重组蛋白NM2e免疫保护效果研究 

上述免疫小鼠在第3次免疫后10天，以10LD50(10个半数致死剂量)的甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)进行攻毒，连续观察3周。结果显示，NS对照组小鼠全部死亡，NM2e蛋白10μg免疫组58％(7/12)小鼠存活(结果见附图10)，表明10ug源于甲3型流感病毒(A/京科/30/95(H3N2))的大肠杆菌表达的NM2e蛋白肌注3针可以有效地保护58％的小鼠抵抗10LD50的异型甲型流感病毒PR8的攻击，提示大肠杆菌表达的NM2e融合蛋白具有有效的不同亚型间交叉免疫保护作用。 

本发明提供一种根据大肠杆菌偏爱密码子优化的人工合成的编码甲型流感病毒核壳蛋白NP和基质蛋白2胞外区多肽M2e的融合基因NM2es，该基因可以在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒NP和M2e融合蛋白NM2e，使用纯化的NM2e蛋白制备的蛋白亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠，可以有效地保护小鼠抵御异型流感病毒的攻击，NM2es基因可以用于广谱甲型流感病毒基因工程疫苗和甲型流感病毒诊断试剂的研发。 

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SEQUENCE LISTING

<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120>一种编码甲型流感病毒NP蛋白和M2e多肽的融合基因

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1566

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1494)

<223>根据大肠杆菌偏爱密码子优化的人工合成的核苷酸序列，编码甲型流感病毒

A/京科/30/95（H3N2）完整核壳蛋白NP的498个氨基酸

<220>

<221>gene

<222>(1495)..(1563)

<223>根据大肠杆菌偏爱密码子优化的人工合成的核苷酸序列，编码甲型流感病毒

基质蛋白2胞外区M2e多肽的23个氨基酸

<400>1

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<210>2

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<222>(1)..(1494)

<223>依据甲型流感病毒A/京科/30/95（H3N2）天然密码子人工合成的核苷酸序列，

编码甲型流感病毒A/京科/30/95（H3N2）完整核壳蛋白NP的498个氨基酸

<220>

<221>gene

<222>(1495)..(1563)

<223>依据甲型流感病毒A/京科/30/95（H3N2）天然密码子人工合成的核苷酸序列，

编码甲型流感病毒A/京科/30/95（H3N2）基质蛋白2胞外区多肽M2e的23个氨

基酸

<400>2

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