局部抗凝及细胞捕获的脱细胞骨基质复合材料及制备方法

摘要

本发明涉及一种局部抗凝及细胞捕获的脱细胞骨基质复合材料，其骨基质材料为在脱细胞的骨基质表面组装有具有抗凝作用的硫酸多聚糖与壳聚糖或纤维连接蛋白。其方法为先制备脱细胞骨基质材料，然后将具有抗凝作用的硫酸多聚糖(等)通过分子间静电作用或配体间作用方式与壳聚糖或纤维连接蛋白在脱细胞骨基质表面(内、外表面)层层组装形成缓释涂层。该材料仍保留骨组织的天然结构、生物学特性及低免疫原性，同时复合涂层具有良好的局部抗凝功能及对种子细胞的捕获作用。复合材料作为骨缺损充填材料或组织工程骨支架具有明显的促进血管化作用，加工制作科学合理、简便易行。

说明书

技术领域

本发明涉及一种骨缺损、骨不连修复需要的植入材料及构建组织工程骨的支架材料，特别涉及一种局部抗凝及细胞捕获的脱细胞骨基质复合材料及制备方法。

背景技术

临床上，因各种原因所致骨缺损十分常见，其修复一直以来是骨科难题，理想的骨缺损修复方法不断地探索中。组织工程骨这种再生修复方式给骨缺损修复带来新的希望，经过20年的发展，在3个主要研究方面取得了丰富的成果。然而，种子细胞与支架复合物植入机体后，血管新生需要数天时间，细胞耐受缺氧为数小时；细胞存活需要的氧和营养仅能靠机体组织液渗透供应，而氧的扩散距离局限于0.2mm内，这就决定种子细胞的成活及体外构建组织工程化骨不能按照实际骨缺损的大小预购，尤其是大块骨缺损，即构建组织工程骨的厚度不能大于0.5mm，否则其中的种子细胞因得不到氧和营养物质的供应而死亡。现有的组织工程骨植入体内后，其血液供应均为渗透方式进行；而材料与血液接触后将启动机体的凝血机制，使植入物周围形成血凝块从而进一步加剧植入组织工程骨的氧和营养供应障碍。

因此，血管化仍是组织工程骨研究和临床应用所面临的瓶颈之一。虽然生物反应器内构建的组织工程骨植入体内有成骨作用，但植入初期与受区血液循环没有直接衔接，种子细胞成活及代谢产生的各种物质与受体间交换仍靠渗透进行，距离有限，效果难以保证；另一方面，组织损伤创面或手术切口会启动机体凝血系统产生保护反应，在骨缺损局部被血凝块包围的移植物及内部营养物质和氧的运送极其有限。

发明内容

本发明的目的是提高一种局部抗凝及细胞捕获的复合脱细胞的骨基质材料及制备方法，采用本发明所述方法制备的骨基质复合材料具有骨组织的天然结构和特性，其抗凝效果在局部发挥且可以控制，通过抗凝该材料能为种子细胞的存活提供更多血液。

本发明的技术方案是：局部抗凝及细胞捕获的复合脱细胞骨基质材料，其特征在于：所述骨基质材料为在脱细胞的骨基质表面组装有具有抗凝作用的硫酸多聚糖与壳聚糖或纤维连接蛋白。

硫酸多聚糖为肝素或硫酸软骨素。

所述骨基质材料为猪骨或人骨。

局部抗凝及细胞捕获的复合脱细胞骨基质材料的制备方法，有以下步骤：

1)取脱细胞的骨基质材料，放在质量百分比浓度为0.05％-0.1％的肝素溶液中浸泡，所述肝素溶液用PH＝4.0的醋酸缓冲液配置，浸泡时间为1.5～3小时，浸泡后，用PH＝4.0的醋酸缓冲液冲洗3次，每次3～8min；

2)离心，去除多余液体，得到表面形成结合肝素涂层的脱细胞骨基质材料；

3)步骤2)所得材料浸入质量百分比浓度为0.05％-0.1％的壳聚糖或纤维连接蛋白溶液中，浸泡时间为1.5～3小时后，浸泡后，用PH＝4.0的醋酸缓冲液冲洗3次，每次3～8min，得到壳聚糖或纤维连接蛋白与肝素复合形成涂层的脱细胞骨基质材料；

4)重复步骤1)-3)若干次，再用磷酸缓冲液冲洗所得材料至PH＝7.4，37℃干燥，⁶⁰Co消毒，即得若干层由壳聚糖或纤维连接蛋白与肝素复合形成涂层的具有局部抗凝及细胞捕获功能的脱细胞骨基质复合材料。

本发明以申请人于专利号为200310110871.0发明专利所述的方法制得的脱细胞骨基质(ACBM)材料为基础，以肝素/壳聚糖(或纤维连接蛋白)间带有不同静电或生物大分子配体间结合的原理，使二者逐层组装到ACBM表面形成由若干层壳聚糖或纤维连接蛋白与肝素复合形成涂层的薄膜层。复合材料在一定时间内对肝素的缓释在脱细胞骨基质(ACBM)材料的局部(有复合层的)产生抗凝作用。再结合显微外科技术使血管束植入材料内部，从而使血液在组织工程骨内部实现持续“灌注”，为构建的“植入体”即时、持续提供氧气和营养物质，并排出代谢产物。

采用本发明方法，使脱细胞骨基质局部抗凝(即有复合层的脱细胞骨基质具有抗凝作用)，预防血凝块的形成将延长渗透距离和时间，为种子细胞存活提供环境，结合其它手术方法(如血管植入)，使血液灌注进入组织工程骨内部，加速血管化的进程。同时，在本发明所述复合材料上的生物大分子对渗透或灌注血液中的种子细胞具有选择性的捕获并结合到材料上，在局部微环境中细胞因子的影响下表达生物活性物质，发挥再生修复作用。两种作用的发挥是组织修复的方向，因此该方法构建的复合材料是未来发展的趋势。

本发明与现有的复合材料有以下不同

1.本发明所述方法制备的复合材料除具备脱细胞骨基质的特性外，与现有复合材料不同的是：本发明利用静电或分子间配体作用实现生物大分子的自组装结合，而不是采用蛋白胶、胶原或明胶等组成网孔结构包裹细胞因子的方式。

2.现有的组织工程骨支架材料不具抗凝功能，可至血液凝固，使血液渗透距离降低；本发明所述复合材料的抗凝功能可增加本发明复合材料及内部血液灌注。

3.现有材料为释放细胞因子，而本发明所述复合材料具有种子细胞捕获功能。

本发明所述复合材料仍保留骨组织的天然结构、生物学特性及低免疫原性，同时复合涂层具有良好的局部抗凝功能及对种子细胞的捕获作用。复合材料作为骨缺损充填材料或组织工程骨支架具有明显的促进血管化作用，加工制作科学合理、简便易行。

附图说明

图1为扫描电镜ACBM材料复合前后变化，其中图1a表示复合前材料仍保持骨组织天然结构，图1b表示材料局部放大，表面粗糙；图1c为复合后材料表面变光滑，表明有涂层形成；图1d为图1c的局部放大。

图2为x线衍射光电子能普分析(XPS)检测本发明所述复合材料肝素复合结果；

图3为红外光谱仪分析本发明所述复合材料静电作用及结果；

图4为复合材料对肝素的缓释效应及抗凝效果；检测肝素释放随时间变化图，2周时仍有效释放肝素(可有效抗凝)；

图5为复合前后的两种材料对种子细胞的捕获及影响；

图6为本发明所述复合材料体内血流灌注及血管化观察，其中图6a为HC-ACBM组(箭头指1处为实验侧，2为对照侧)；图6b为ACBM植入组，其结果显示a组血液灌注3-10天显著高于b组(p＝0.01)；

图7为本发明所述复合材料植入骨缺损局部后不同时间组织学观察，其中图7a为植入后第3天组织学观察，可见材料周围轻度炎性细胞浸润；图7b为植入后第7天组织学观察，可见材料中骨小梁周围见毛细血管形成(箭头)。

具体实施方式

1.材料和试剂

脱细胞骨基质ACBM(采用申请人的专利号为200310110871.0发明专利所述的方法制备)，所述脱细胞骨基质采用猪骨或人骨均可，本实施例采用猪骨和人骨分别做下述实验。

肝素钠(Sigma，180u/mg)，壳聚糖(Sigma，脱乙酰化大于85％)；

纤维连接蛋白(Sigma)，新生牛血清(gibco)，胰酶(Sigma)，采用市售的为生物制品；

脐静脉内皮细胞(自制)；方法参见《复旦学报(医学版)》2004-09-1，蒋红军，贾兵，陈张根等“脐静脉内皮细胞分离及冷冻保存技术”。

Dispase酶，RPMI1640完全培养基(hyclone)采用市售的生物制剂；

氯仿、甲醇、30％H2O2、无水乙醇、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，亚甲胺蓝(Sigma)溶液均，采用市售的化学纯试剂；

仪器：负压仓、真空泵、环钻、钢锯、通风橱、烧杯(国产)，紫外分光光度计，细胞培养箱(Thermo)

实施例1制备复合肝素-壳聚糖的脱细胞骨基质(Heparin chitosan coated ACBM，HC/ACBM)

1)取脱细胞的骨基质材料(猪骨或人骨)一份，放在质量百分比浓度为0.05％-0.1％的肝素溶液(PH＝4.0的醋酸缓冲液)中浸泡，浸泡时间为1.5～3小时，浸泡后，用PH＝4.0的醋酸缓冲液冲洗3次，每次3～8min；浸泡时间为1.5～3小时后，用PH＝4.0的醋酸缓冲液冲洗3次，每次3～8min；，共12～25min左右。利用脱细胞骨基质胶原暴露并带正电荷，肝素在PH＝4.0醋酸缓冲液条件下带负电荷，利用脱细胞骨基质材料表面的胶原纤维带正电荷与肝素等(在特定PH条件下)带负电荷的大分子物质通过电荷间作用结合，形成结合肝素的涂层。

2)离心，去除多余液体，得到表面形成结合肝素涂层的脱细胞骨基质材料。从图1中可以看到网孔率无明显差异，仍保持骨组织天然结构；复合后可见材料表面变光滑(表明有复合物涂层形成)。

3)步骤2)所得材料浸入0.05％-0.1％的壳聚糖或纤维连接蛋白溶液中浸泡，与肝素复合形成涂层。浸泡时间为1.5～3小时后，用PH＝4.0的醋酸缓冲液冲洗3次，每次3～8min；，共12～25min左右。

4)重复步骤1)-3)若干次，如本实施例重复8次，再用磷酸缓冲液冲洗所得材料至PH＝7.4，37℃干燥，⁶⁰Co消毒，即得若干层(本实施例为8层)壳聚糖或纤维连接蛋白与肝素复合形成涂层的具有局部抗凝及细胞捕获功能的脱细胞骨基质复合材料。即上述步骤重复多少次，再用磷酸缓冲液冲洗使所得材料至PH＝7.4，37℃干燥，⁶⁰Co消毒，即可得到多少层局部抗凝及细胞捕获功能的脱细胞骨基质复合材料。

实施例2检测

1.材料形态结构

扫描电镜结果显示复合前后材料仍保持骨组织天然结构；其网孔大小，网孔率无明显差异，材料的孔隙率为69.9％±8.8％，孔径大小为458.16±117.87μm，而且微孔之间相通(参见图1)。复合后可见材料表面变光滑(图1：表明有涂层形成)；X线衍射光电子能谱分析(XPS)结果表明，随着复合涂层增多，材料表面的硫元素增多(仅肝素中含有的硫元素在材料中可检测)，即肝素含量更多(参见图2)。红外光谱分析表明涂层成份中的肝素带负电荷与壳聚糖中正电荷通过静电作用结合而成复合涂层，复合后肝素羟基负电荷降低(3420nm处特征性吸收峰减低)；同时1860nm处胺基吸收峰也降低。(参见图3)。

2.肝素体外释放

有8层壳聚糖或纤维连接蛋白与肝素复合形成涂层的复合材料，肝素释放可在2周内维持在有效剂量(参见图4)；此时测定结果显示部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)在复合材料组显著大于ACBM组(p＝0.02)，并高于正常。

3.材料对种子细胞的影响

复合材料中的大分子物质肝素对细胞的增值在各时间点与单纯ACBM材料比较无统计学差异；流式细胞法检测结果显示材料对细胞增值周期无明显影响，无促进或抑制作用。材料中的壳聚糖或纤维连接蛋白可促进脂肪源干细胞的早期粘附，与ACBM材料比较可提前6小时。参见图5

4.体内血液灌注及血管化观察

复合材料植入骨缺损局部后4周内HC-ACBM组血流量显著高于ACBM组，尤其是在植入后的初期；组织学观察可见HC-ACBM材料植入后7天既有毛细血管出现，早于单纯材料植入组。参见图6和图7

结论

局部抗凝及细胞捕获的脱细胞骨基质复合材料经体内外检测结果显示，均可以达到良好的抗凝效果，有利于脂肪来源干细胞的粘附，对其增值无明显影响；体内植入后初期即可促进材料局部血液灌注并使材料早期血管化。

采用本发明方法制备的复合材料可有效缓释肝素达2-4周，APTT等试验检测结果表明可延长凝血时间，且不影响全身情况。体内植入后可以显著促进微血管形成。