一种测定法罗培南钠原料及制剂中法罗培南聚合物杂质含量的方法

摘要

本发明属于药物分析领域，具体涉及高效液相色谱法测定法罗培南钠原料及其制剂中法罗培南聚合物含量的方法。本发明的测定方法为凝胶色谱法，使用高效液相色谱检测，色谱条件为：(1)凝胶色谱柱：排阻分子量为600～800道尔顿；(2)流动相：两种流动相，流动相A：pH值为5.5-8.5，浓度为0.01-0.2mol/L之间的水相溶液；流动相B：水或0.005-0.02％之间的十二烷基硫酸钠水溶液或甘氨酸溶液；(3)柱温：室温(4)流速：0.5-1.0ml/min；(5)检测波长：210-300nm。本发明的方法特异性强，重复性好，自动化程度高，可以对法罗培南钠原料及制剂中的聚合物进行准确定量。

说明书

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及高效液相色谱法测定法罗培南钠原料及其制剂中法罗培南聚合物含量的方法。

背景技术

法罗培南是一个非典型β-内酰胺类抗生素，属于青霉烯类的衍生物。碳青霉烯类及青霉烯类两大类化合物已吸引人们极大的兴趣，青霉烯类更有独特的优点，现有五个青毒烯类衍生物在开发之中，法罗培南便是其中之一。除对抑制绿脓杆菌较弱外，其抗菌谱广、对厌氧菌特别有效，胜过碳青霉烯类抗生素。它对需氧和厌氧的革兰阳性菌、革兰阴性菌显示出广谱的抗菌活性，特别是对耐药的葡萄球菌、肠球菌等革兰阳性菌和拟杆菌等厌氧菌的活性都优于现有的口服抗菌药。法罗培南与青霉素结合蛋白有很好的亲合力及良好的β-内酰胺酶稳定性，较少产生耐药，主要用于敏感细菌所致的呼吸系统感染、泌尿系统感染、生殖系统感染和胆道感染等。

随着抗生素广泛应用，抗生素引起的不良反应越来越引起人们的重视。β-内酰胺类抗生素引发的速发型过敏反应是临床最常见的不良反应，对患者的危害及大，研究表明β-内酰胺类抗生素本身只是半抗原，而其中存在的各类高分子聚合杂质才是引发速发型过敏反应的真正过敏原，因此控制其聚合物限量是极其重要的。法罗培南钠与同类其他药物一样，它们在临床上常引发过敏性休克反应，严重威胁着患者的安全。研究证明，引发β-内酰胺类抗生素速发型过敏反应的过敏原是与其中存在的高分子聚合物含量有关，所以对此类药物中高分子聚合物的测定越来越引起人们的重视。

凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。利用凝胶色谱的分子筛机制，让药物分子自由地进入凝胶颗粒内部，而让高分子杂质被排阻；由于溶质分子和凝胶介质间存在多种次级相互作用，溶质分子可被吸附于凝胶介质的表面；在凝胶颗粒内部，凝胶颗粒有较大的比表面积和较小的自由空间，故溶质分子更易和凝胶介质接触，因而溶质分子在凝胶颗粒内部较凝胶颗粒外部更易被吸附，即色谱过程中除分子排阻作用外，凝胶对药物的吸附作用大于对高分子杂质的吸附作用。据此原理可使高分子杂质和药物分子间的分离度增加。

目前已经有多种β-内酰胺类抗生素的聚合物含量测定的报道，其中2005年片药典对头孢他啶、头孢曲松钠、头孢哌酮钠、头孢噻肟钠、头孢拉定、头孢唑林钠、头孢呋辛钠、青霉素钠、青霉素钾、青霉素V钾、阿莫西林等11抗生素的聚合物测定方法进行了收录，也有文献对头孢地嗪钠、头孢噻肟钠和头孢替唑钠聚合物的测定方法进行了研究，杨鹏飞等在《以葡聚糖凝胶G-10系统考察8种注射用头孢菌素中的聚合物》中对注射用头孢尼西钠、注射用头孢硫脒钠、注射用头孢西丁、注射用头孢唑肟钠、注射用头孢唑兰、注射用头孢地嗪钠、注射用头孢替坦钠等8种注射用头孢菌素中的聚合物进行了系统研究。目前并无对法罗培南聚合物的具体测定方法的报道，因此对于建立法罗培南聚合物测定的方法对于进行碳青霉烯类抗生素的质量控制和安全用药有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定法罗培南钠原料及制剂中法罗培南聚合物含量的方法。我们建立了一种对法罗培南钠原料及制剂中法罗培南钠聚合物的含量进行测定的高效液相凝胶色谱法。发明人通过对水溶液种类、离子强度、溶液浓度、溶液pH、流速、柱温、色谱柱及波长等条件进行摸索，使法罗培南聚合物的测定方法分离度好，柱效高，重复性好。

本发明提供的测定法罗培南钠原料及制剂中法罗培南聚合物杂质含量的方法，该方法为凝胶色谱法，使用高效液相色谱仪进行检测，色谱条件为：

①凝胶色谱柱：排阻分子量为600-800道尔顿；

②流动相具有两种：流动相A：浓度为0.01-0.2mol/L之间的水相溶液，用pH调节剂调节pH值为6.5-8.5；流动相B：水或0.005-0.02％之间的十二烷基硫酸钠溶液或甘氨酸溶液；

③柱温：室温；

④流速：0.5-1.0ml/min；

⑤检测波长：210-300nm。

其中上述所述测定法罗培南钠原料及制剂中法罗培南钠聚合物含量的方法，所述的凝胶色谱柱选自葡聚糖凝胶G-10凝胶色谱柱。

其中上述所述测定法罗培南钠原料及制剂中法罗培南聚合物含量的方法，所述的葡聚糖凝胶G-10凝胶色谱，内径为：5～20mm；长度：200～500mm；粒度：40～60um；孔径：50～70A；柱床：1.5～3.5mL/g。

其中上述所述测定法罗培南钠原料及制剂中法罗培南聚合物含量的方法，所述的流动相A的水相溶液为NaH₂PO₄、NH₄CL、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、NH₄H₂PO₄、(NH₄)₂HPO₄一种或两种以上的混合水溶液，优选NaH₂PO₄和Na₂HPO₄的混合水溶液，NaH₂PO₄的浓度为0.01-0.2mol/L，Na₂HPO₄的浓度为0.01-0.2mol/L。

其中上述所述测定法罗培南钠原料及制剂中法罗培南聚合物含量的方法，所述的流动相A的pH调节剂选自NaOH、磷酸、氨水和HCL等。

波长选取的标准与待检物质的光吸收性质有关，对头孢类抗生素，其最大吸收波长是固定的，通过紫外扫描，发现法罗培南钠聚合物210～300nm处波长均有较强的紫外吸收，均可作为检测波长。

其中上述所述测定法罗培南钠原料及制剂中法罗培南聚合物含量的方法，其中所述的方法为标准曲线法或外标法。

1)所述的标准曲线包括如下步骤：

①作标准曲线：取含量已知的法罗培南对照品为对照，梯度稀释，以流动相B为流动相，过凝胶色谱柱，在检测波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，得到标准曲线；

②标准曲线法测定法罗培南聚合物含量：将待测原料或制剂用水作为溶剂配制成一定浓度的溶液，以流动相A为流动相，过凝胶柱色谱柱，在检测波长下检测，记录色谱图，获取峰高和峰面积等参数，并将法罗培南聚合物对应的相关参数代入标准曲线，计算得到法罗培南聚合物的含量。

2)所述的外标法包括如下步骤：

①标准曲线和线性范围：取含量已知的法罗培南对照品为对照，梯度稀释，以流动相B为流动相，过凝胶色谱柱，在检测波长下检测，记录色谱图，获取峰高和峰面积等参数，得到标准曲线和线性范围；

②外标法测定法罗培南聚合物含量：在线性范围内选择合适的浓度，配制对照溶液和样品溶液，在选定的色谱条件下进行测定，记录色谱图，按外标法以相关参数进行计算，得到法罗培南聚合物的含量。

本发明具备如下有益效果和显著进步性：

①本发明的测定法罗培南钠原料及制剂中法罗培南聚合物含量的方法，首次采用高效液相凝胶色谱法对法罗培南钠聚合物进行定量测定，本方法自动化程度高，利于操作，为更好的控制罗培南钠原料及制剂中聚合物的量提供了一种可靠的方法。

②本发明的测定法罗培南钠原料及制剂中法罗培南聚合物含量的方法，特异性高，分离度好，柱效高、重复性好能够正确的定量法罗培南钠原料及其制剂中法罗培南聚合物的杂质，确保了保证产品质量，提高了用药的安全性。

附图说明

图1为法罗培南对照品在流动相B中的HPLC谱图

图2为法罗培南钠原料在流动相A中的HPLC谱图

具体实施例

实施例1：标准曲线法测定法罗培南钠原料及其制剂中法罗培南聚合物含量

一、色谱条件

仪器：美国Agilent 1100系列高效液相色谱仪；

凝胶色谱柱：Sephadex G-10，15.0mm×400mm；

流动相：流动相A：NaH₂PO₄1.08g和Na₂HPO₄4.38g至1000ml水中，用H₃PO₄调pH到7.0；

流动相B：0.01％十二烷基硫酸钠

流速：1.0ml/min

柱温：室温；

波长：254nm

二、实验步骤：

1、作标准曲线：

①法罗培南对照品62.5mg，置于50ml容量瓶中，用水将其稀释成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.4mg/ml的溶液，摇匀；

②取各稀释点对照品溶液各20ul依次通过凝胶柱，以流动相B为流动相，在254nm波长下检测，记录色谱图，HPLC色谱图见图1，获取保留峰面积，以浓度(C)对峰面积(A)进行线性回归，得到标准曲线和线性方程，计算回归系数；

③经计算得到回归方程为：C＝58253A-19.734  R²＝0.9997

2、测定法罗培南钠聚合物的含量

取相当于法罗培南50mg的法罗培南钠原料或的制剂置于100ml容量瓶中，加纯化水配制成待测溶液，过凝胶色谱柱，在254nm波长下检测，记录色谱图，HPLC谱图见图2，获取聚合物峰面积，并将法罗培南钠聚合物的峰面积代入线性方程，得到聚合物的含量值。

三、结果

如图2所示，色谱图上保留时间为24.827分钟的吸收峰为法罗培南聚合物的特征峰，直接将检测出的峰面积值代入回归方程，即可测得法罗培南聚合物的含量为0.24％。

重复检测5次，结果见表法罗培南聚合物的峰面积的RSD值为0.06％，说明本方法有很好的重现性。

实施例2：标准曲线法测定法罗培南钠原料及其制剂中法罗培南聚合物含量

一、色谱条件

同实施例1

二、实验步骤：

1、作标准曲线：

①法罗培南对照品62.5mg，置于50ml容量瓶中，用水将其稀释成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.4mg/ml的溶液，摇匀；

②取各稀释点对照品溶液各20ul依次通过凝胶柱，以流动相B为流动相，在254nm波长下检测，记录色谱图，获取保留峰面积，以浓度(C)对峰面积(A)进行线性回归，得到标准曲线和线性方程，计算回归系数；

③经计算得到回归方程为：C＝57203A+76.287R²＝0.9999

3、测定法罗培南钠聚合物的含量

①对照溶液和供试溶液的配制：取法罗培南钠对照品31.25mg至，加纯化水配制成对照品溶液；取相当于法罗培南50mg的法罗培南钠原料或的制剂置于100ml容量瓶中，加纯化水配制成待测溶液。

②对照溶液以流动相B为流动相，过凝胶色谱柱，在254nm波长下检测，记录色谱图，获取对照品的峰面积；供试液以流动相A为流动相，过凝胶色谱柱，记录色谱图，获取聚合物峰面积。

③按照外标法计算公式聚合物的含量值。

三、结果

按外标法计算得罗培南聚合物的含量0.24％。RSD值为0.05％。

实施例3：标准曲线法测定法罗培南钠原料及其制剂中法罗培南聚合物含量

一、色谱条件

仪器：美国Agilent 1100系列高效液相色谱仪；

凝胶色谱柱：Sephadex G-10，15.0mm×400mm；

流动相：流动相A：取NH₄Cl 0.54g至1000ml水中，用NaOH调pH到7.0

流动相B：0.01％十二烷基硫酸钠

流速：1.0ml/min

柱温：室温；

波长：254nm

二、实验步骤同实施例1

三、结果

按标准曲线法计算得罗培南聚合物的含量0.25％。RSD值为0.06％。

实施例4：外标法测定法罗培南钠原料及其制剂中法罗培南聚合物含量

一、色谱条件

仪器：美国Agilent 1100系列高效液相色谱仪；

凝胶色谱柱：Sephadex G-10，15.0mm×400mm；

流动相：流动相A：取NH₄H₂PO₄1.15g至1000ml水中，用NaOH调pH到7.0

流动相B：0.01％十二烷基硫酸钠

流速：1.0ml/min

柱温：室温；

波长：254nm

二、实验步骤同实施例2

三、结果

按外标法计算得罗培南聚合物的含量0.27％。RSD值为0.08％。