假连翘提取物、假连翘杀菌微乳剂及该微乳剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种假连翘提取物，以假连翘的茎、叶、花或果实为原料，采用有机溶剂进行提取，对提取液进行浓缩，得假连翘提取物。该提取物再和溶剂、农药助剂配制成假连翘杀菌微乳剂。本发明的假连翘杀菌微乳剂兑水后叶面喷雾或灌根施用，使用方便，对多种热带经济作物上主要病害有较好防治效果，尤其是对胡椒瘟病保护效果突出。该制剂的活性成分是天然存在的物质，来源于自然，对人、畜无毒，无残留，对非把靶标生物相对安全，加工工艺简单，原料易得，成本低，符合目前农药发展的方向，具有良好的开发应用潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物提取物，尤其是假连翘提取物，还涉及该提取物的用途，以及由此提取物为组分的微乳剂。

背景技术

目前随着人们对植物的研究开发能力逐渐加强，从植物中寻找天然活性物质并用于病虫害防治是目前国际上农药开发的一种研究趋势。据统计，世界上至少有50万种不同植物，其中药用植物有11020种(含种下等级1208个)，隶属2313属，383种，目前已报道过具有控制有害生物活性的高等植物达2400余种，其中具有杀虫活性的1000多种，抗真菌的94种，抗细菌的11种，抗病毒的17种。

假连翘(Duranta repens Linn.)为马鞭草科植物，有刺或无刺，嫩枝有毛；叶片呈卵状椭圆形或倒卵形，长2～6.5厘米，宽1.5～3厘米，边缘在中部以上有锯齿；花冠呈蓝色或淡蓝紫色；果实成熟时橘黄色，有光泽。原产中、南美洲，我国华南地区广有栽培，由于其终年翠绿，树形美观，环境适应能力较强，近年来已成为一种重要的园林绿化植物。有研究报道假连翘的果实中含有二萜类和黄酮类化合物，有抑制凝血酶和脯氨酸基内肽酶(PEP)的活性。但迄今为止还未发现有以假连翘植物为原料，制造植物源杀菌剂的报道。

发明内容

本发明针对不足，提出一种假连翘的提取物，利用该提取物作为植物源杀菌剂的主要成分；同时还提出了以该提取物为主要成分的假连翘微乳剂和水乳剂，以及上述两种乳剂的制备工艺。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：假连翘提取物，以假连翘的茎、叶、花或果实为原料，采用有机溶剂进行提取，对提取液进行浓缩，得假连翘提取物。

本发明中采用假连翘药材的不同部位，如茎、叶、花或果实，作为提取的原料，经有机溶剂进行浸泡或其它处理方式来提取，将原料中的有效成分萃取出来，然后对提取液浓缩，如常压或减压蒸馏，即可得到假连翘的提取物。该假连翘提取物的原料来源广泛，提取方式简单，适宜于广泛使用和推广。

本发明还提出了假连翘提取物在制备预防和治疗胡椒瘟病菌、香蕉枯萎病菌或芒果炭疽病菌的药物中的应用。

本发明又提供了采用假连翘提取物作为主要有效成分的假连翘杀菌微乳剂，由重量百分比如下的组分构成：

假连翘提取物        10～30％

溶剂                5～20％

助溶剂              5～10％

乳化剂              10～20％

余量为水；

其中，所述溶剂或助溶剂选自石油醚、乙酸乙酯、丙酮、环己酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、无水乙醇、异丙醇、甲醇中的一种或几种；

所述乳化剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、二苄基联苯基聚氧乙烯醚、苯乙樟苯酚甲醛树脂聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基苯磺酸钙和十二烷基苯磺酸钠中的一种或几种。

在上述假连翘杀菌微乳剂的基础上，本发明还提供了该微乳剂的制备方法，包括以下步骤：

a、按配方称取各组分；

b、将假连翘提取物加入到溶剂和助熔剂中搅拌，制成油相液体待用；

c、将乳化剂和水混合均匀，在搅拌下，将步骤b中的油相液体缓慢加入水相，常温搅拌1h后停止，静置1h，即得假连翘杀菌微乳剂。

与现有技术相比，本发明的假连翘提取物对疫霉引起的病害具有较好的保护效果，尤其对胡椒瘟病保护效果显著。该杀菌剂中的活性化合物是天然存在的物质，来源于自然，在长期的进化过程中已形成了其固有的参与能量与物质循环代谢途径，所以施用于环境中或植物上，无残留，不会引起生物富集；对非把靶标生物相对安全；且制造工艺简单，原料易得，成本低廉，符合目前农药的发展趋势，具有广阔的推广应用潜力。

具体实施方式

一种假连翘提取物，以假连翘的茎、叶、花或果实为原料，采用有机溶剂进行提取，对提取液进行浓缩，得假连翘提取物。

优选的，所述原料在室温下晾5～10天后，放入55～60℃恒温箱内烘干至含水量小于10％，粉碎。将原料进行干燥粉化，增大了原料与有机溶剂的接触面，更有利于原料中的有效成分被提取出来。

优选的，所述提取为向原料中加入5～15倍量的有机溶剂，采用水浴加热提取。为使原料中有效成分能充分提取，有机溶剂的用量为原料重量的5～15倍体积量；采用水浴加热能避免局部过热现象，防止原料烧糊，影响产品最终质量。

优选的。所述提取分3次进行，每次提取时间分别为72小时，48小时，24小时，合并3次提取液。采用3次提取，能有效地将有效成分尽可能地完全提取。

优选的，所述有机溶剂选自石油醚、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇和甲醇中的一种或多种。上述有机溶剂由于具有微毒或无毒的特性，适宜于广泛应用。

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

实施例1  假连翘提取物的制备

将采自中国热带农业科学院香料饮料研究所内的新鲜假连翘，取其茎、叶、花或果实，在室温下晾5～10天后放入55～60℃恒温烘箱内烘干，至含水率低于10％，粉碎，过孔径60目筛，加入约10倍量(W/V)的溶剂，重复3次提取，合并提取液，经减压干燥浓缩得假连翘提取物浸膏。

上述原料还可采用假连翘的茎、叶、花和果实中的多种进行混合，操作步骤同上。

1.1提取溶剂的选择

准确称取等重量假连翘干粉样6份，分别加入10倍量(W/V)的丙酮、乙酸乙酯、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯和无水乙醇(混合I)、丙酮和甲醇(混合II)，采用水浴加热提取的方法分别提取72h，48h，24h，合并3次提取液，减压浓缩，得假连翘不同溶剂提取物，并测定其对胡椒瘟病菌菌丝生长的抑菌活性。

表1假连翘不同溶剂提取物对胡椒瘟病菌的抑菌率

结果见表1。从表1中可以看出，在供试浓度下，乙醇提取溶剂制备的假连翘提取物对胡椒瘟病菌的抑菌率最高，为28.62％。因此，制备假连翘提取物的提取溶剂选择无水乙醇。

1.2提取方法的筛选

准确称取等重量假连翘干粉样三份，分别加入10倍量(W/V)上述筛选的溶剂，采用水浴加热提取、超声波浸提、冷浸提三种方法制备假连翘提取物，并测定其对胡椒瘟病菌菌丝生长的抑菌活性。

表2假连翘不同提取方法对胡椒瘟病菌的抑菌率

结果见表2。从表2中可以看出，在无水乙醇为提取溶剂下采用水浴加热提取法制备的假连翘提取物对胡椒瘟病菌的抑菌活性较好，抑菌率达到了91.71％。因此，制备假连翘提取物的方法选择无水乙醇水浴加热提取法。

实施例2

由于提取过程不同只影响假连翘的提取程度，并不影响假连翘提取物的性能，下面就以假连翘无水乙醇提取物对供试病原菌的抑菌活性测定。

2.1对供试病原菌菌丝生长抑制活性的测定

2.1.1供试菌株

胡椒瘟病菌(Phytophthora capsici)由中国热带农业科学院香料饮料研究所植保中心提供；

香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)由中国热带农业科学院海口实验站提供；

芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。

2.1.2实验方法

采用菌丝生长速率抑制法，植物提取物重复3次。具体做法为：准确称取实施例1中制备的假连翘提取物0.5g，先用1ml无水乙醇溶解，再用无菌蒸馏水定容至10ml，制成浓度为50mg/ml的假连翘提取物乙醇溶液。然后将培养基融化并冷却至50℃左右时，把4ml浓度为50mg/ml的假连翘提取物乙醇溶液与36ml/瓶的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(简称为PDA培养基)混合，摇匀后，迅速倒入3个直径为9cm的培养皿中，待其凝固后，取菌落直径为5mm、培养好的各供试病原菌的外层菌块放置于培养皿中央，以加入等体积无水乙醇灭菌水的PDA培养平板为对照，每个处理做3个皿重复。接种后，在人工气候培养箱(25～28℃)下培养5天后，采用十字交叉法分别测量菌落直径，求其平均值，按下式计算抑菌率。

菌落直径(cm)＝测量菌落直径平均值

结果见表3。从表3可以看出，在假连翘无水乙醇提取物浓度为5mg/ml下，对胡椒瘟病菌菌丝生长的抑菌活性最好，抑菌率达到了86.87％；对香蕉枯萎病菌和芒果炭疽病菌抑菌活性较差，抑菌率分别为30.04％和24.17％；对芒果蒂腐病菌无抑菌活性。

表3假连翘提取物对供试病原菌的抑菌率测定

2.2对供试病原菌孢子萌发抑制活性的测定

2.2.1供试孢子悬浮液

由2.1结果可以看出假连翘无水乙醇提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长抑菌活性较好，因此，进一步测定其对胡椒瘟病菌孢子萌发的抑制作用。

首先将胡椒瘟病菌在PDA培养基上培养5天后，取边缘菌饼转接于燕麦培养基上使其产孢，并配置孢子悬浮液备用。

2.2.2实验方法

将实施例1中制备的假连翘提取物用灭菌水稀释至2个浓度，每浓度重复3次，具体方法为：将假连翘提取物用灭菌水稀释为100mg/ml和50mg/ml，以灭菌水为空白对照，每处理重复3次。将孢子悬浮液与供试药剂的不同浓度按1∶1的比例混合均匀后，滴加1滴于灭菌的凹玻片上，28℃培养6～12h，当空白对照的孢子萌发率达到80％以上时，在显微镜下检查200个孢子的萌发情况，计算各供试药剂的孢子萌发抑制率。

结果见表4。

表4  假连翘提取物对胡椒瘟病菌孢子萌发的抑制活性测定

从表4可以看出，假连翘提取物对胡椒瘟病菌孢子萌发也具有一定的抑制活性。在浓度为10mg/ml时对孢子萌发的抑制率达到了50％以上，为62.89％。

2.3对胡椒瘟病菌的室内抑菌毒力测定

准确称取实施例1中制备的假连翘提取物浸膏，用无水乙醇和灭菌水一定比例配成8、6、5、4、3、2mg/ml等6个系列浓度的药液，按上述的菌丝生长速率法进行测定。实验重复3次，建立毒力回归方程。将抑菌率转换成几率值，浓度转换成对数，进行几率值分析，求出假连翘无水乙醇提取物对胡椒瘟病菌的抑制中浓度(EC50)。

结果见表5。

表5假连翘提取物对胡椒瘟病菌的室内抑菌毒力测定

从表5可以看出，假连翘无水乙醇提取物对胡椒瘟病菌的抑菌毒力较低。在相关系数为0.9718时，提取物对胡椒瘟病菌的EC50为1.4951mg/ml，EC90为6.2522mg/ml。

实施例3  20％假连翘杀菌微乳剂的制备

准确称取实施例1中制备的假连翘提取物浸膏20kg，溶于15kg无水乙醇和5kg甲醇的混合溶液中，充分搅拌，然后加入20kg的乳化剂Tween-20，搅拌均匀后，在高剪切机的作用下，逐步加入自来水40kg，在常温搅拌一定时间后停止，静置，即得20％假连翘微乳剂。

实施例4  10％假连翘杀菌微乳剂的制备

准确称取实施例1中制备的假连翘提取物浸膏10kg，溶于20kg二甲基甲酰胺和10kg乙酸乙酯的混合溶液中，充分搅拌，然后加入20kg的乳化剂十二烷基苯磺酸钙和十二烷基苯磺酸钠，搅拌均匀后，在高剪切机的作用下，逐步加入自来水40kg，在常温搅拌一定时间后停止，静置，即得10％假连翘微乳剂。

实施例5  30％假连翘杀菌微乳剂的制备

准确称取实施例1中制备的假连翘提取物浸膏30kg，溶于10kg石油醚和5kg二甲亚砜的混合溶液中，充分搅拌，然后加入15kg的乳化剂苯乙樟苯酚甲醛树脂聚氧乙烯醚，搅拌均匀后，在高剪切机的作用下，逐步加入自来水40kg，在常温搅拌一定时间后停止，静置，即得30％假连翘微乳剂。

实施例6  假连翘杀菌乳剂的保护和治疗作用测定

6.1供试药剂

实施例3～5制备的假连翘杀菌微乳剂；

烯酰·锰锌WP(山东圣鹏农药有限公司生产)

6.2供试作物及防治对象

供试作物：胡椒(Piper nigrum Linn.)，品种为印尼大叶种；

防治对象：胡椒瘟病(Phytophthora capsici)。

6.3试验方法

保护作用测定方法：采摘健康、新鲜、叶龄相同的胡椒嫩叶(直径不大于9cm)，洗净放于吸水纸上晾干；将假连翘杀菌微乳剂分别稀释为50和100倍，烯酰·锰锌WP配制成2000和4000倍，以及不含有效成分的空白对照。先于嫩叶上施药，晾干药液后，用接种针将3块直径为5mm的胡椒瘟病菌菌饼等距离接在叶子正面，每皿1片嫩叶，正面朝上放于培养皿中，然后于人工气候培养箱中培养，5天后测量各处理的病斑生长直径。按下式计算保护效果。

病斑直径＝测量直径-5mm

治疗作用测定方法：先于嫩叶上接种菌饼，放于人工气候培养箱中培养2～3天，测量各嫩叶上病斑生长直径d1后施药，施药后再置于培养箱中培养。培养3天后测量各处理的病斑生长直径d2，按下式计算治疗效果。

病斑直径增长量(mm)=d₂-d₁

6.4结果与分析

结果见表6；

表6供试药剂对胡椒瘟病菌的保护和治疗效果

从表6可以看出，假连翘杀菌微乳剂在稀释50倍和100倍时，对胡椒瘟病的保护作用分别达到了77％以上和49％以上，说明假连翘杀菌微乳剂对胡椒瘟病具有较好的保护作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。