利用新鲜羊膜制备组织工程人工角膜内皮载体支架的方法

摘要

本发明涉及一种利用新鲜羊膜制备组织工程人工角膜内皮载体支架的方法，采用1∶1000硫酸妥布霉素液对新鲜羊膜进行浸泡消毒，经胰蛋白酶-EDTA消化液倒置消化后，用细胞刮刀轻刮羊膜上皮面以全部去除残留上皮细胞，获得去上皮层羊膜，平铺在培养板孔中牢固干贴后，用去上皮层羊膜专用包被液进行包被处理，吸出包被液晾干后即可作为组织工程人工角膜内皮的载体支架使用。本发明工艺科学合理，所制备的载体支架可批量生产，以满足组织工程人工角膜内皮规模化重建对载体支架的大量需求，为角膜内皮盲通过临床角膜移植而复明创造条件，且该载体支架制备方法应用于组织工程人工角膜内皮体外重建和临床治疗的成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用新鲜羊膜制备组织工程人工角膜内皮载体支架的方法，属于组织工程人工角膜内皮技术。

背景技术

人角膜内皮在维持角膜厚度、透明度及为角膜提供养分等方面具有至关重要的作用。当角膜受到感染或手术创伤后，角膜内皮细胞便发生不同程度的减少，一旦角膜内皮细胞的密度低于形成完整角膜内皮层和维持角膜内皮生理功能的临界密度后，角膜内皮将出现不可逆病变，即角膜内皮盲。据不完全统计，我国目前约有角膜内皮盲患者80余万人，绝大多数患者可以通过角膜移植来治愈，但由于捐献角膜的高度匮乏致使绝大部分患者得不到角膜移植而无法复明。近年来，角膜组织工程的兴起为组织工程人工角膜内皮的体外重建及其临床应用创造了条件，也为角膜内皮盲患者通过组织工程人工角膜内皮的移植和重见光明带来了新的希望。

对组织工程人工角膜内皮的体外重建研究开始于1990年初，如何获得足量的人角膜内皮细胞和理想的载体支架是目前组织工程人工角膜内皮体外重建研究的热点。国内外学者们分别利用癌基因转染的永生化人角膜内皮细胞、原代培养的人角膜内皮细胞或体外培养至第4-5代的人角膜内皮细胞作为种子细胞，分别利用角膜后弹力层、去上皮层羊膜、胶原-壳聚糖共混膜、聚羟乙基丙烯酸甲酯、无细胞猪角膜基质和N-(1-甲基乙基)-2-丙烯酰胺均聚物等作为载体支架，在体外成功重建出形态、透明度和组织结构与正常角膜内皮近似的人角膜内皮组织类似物，为组织工程人工角膜内皮的体外重建开辟了道路，但由于所用种子细胞或者是转染了癌基因的永生化细胞或者是来自眼库角膜的原代培养细胞或者是在24孔培养板中仅传4-5代的细胞，由于种子细胞具有潜在致瘤性或数量极其有限，因而限制了组织工程人工角膜内皮的规模化体外重建及其临床应用。现有组织工程人工角膜内皮体外重建的研究报道，仍局限于实验研究，根本无法满足我国80余万、全世界1000余万角膜内皮盲患者临床移植的大量需要。

2005年，樊廷俊等首次成功建立了国际上唯一1个没有任何致瘤性的非转染人角膜内皮细胞系，成功解决了组织工程人工角膜内皮规模化重建无法获得大量种子细胞的问题。因此，尽早建立理想载体支架的规模化制备技术，进而为组织工程人工角膜内皮规模化重建创造条件，已成为各国学者们开展角膜组织工程研究的主攻目标，也是全世界角膜内皮盲患者重见光明的希望之所在。

发明内容

本发明的目的就是利用新鲜羊膜制备组织工程人工角膜内皮的载体支架，提供一种组织工程人工角膜内皮载体支架的制备方法。

本发明的方法：首先用眼科镊撕除低温保存的新鲜羊膜的纤维细胞层和海绵层，用0.9％生理盐水冲洗干净后，放入1∶1000硫酸妥布霉素液(500万单位，用0.9％生理盐水配制)中，放置在无菌操作台内浸泡消毒20～30分钟，用无菌D-Hanks溶液漂洗3～5分钟。

将已灭菌滤纸平铺于无菌玻璃板上，滴加0.1％～0.3％胰蛋白酶和0.01％～0.02％EDTA消化液(1∶1)使滤纸充分湿润，将漂洗后的羊膜按上皮面朝下的方向平铺于滤纸上，放置至37℃培养箱中消化30～60分钟，即倒置消化法。

然后，用细胞刮刀轻刮羊膜的上皮面，以全部去除残留的上皮细胞，用无菌D-Hanks溶液冲洗3～5次，获得去上皮层羊膜，用打孔器将羊膜打成直径15.6毫米的圆片，按上皮面朝上平铺于24孔培养板孔中，放入5％CO₂培养箱中、37℃进行干贴15～25小时。

最后，在无菌条件下向干贴有羊膜的24孔培养板孔中，按1毫升/孔的量轻轻加入去上皮层羊膜专用包被液，将培养板置37℃培养箱中包被处理15～25小时，无菌吸出包被液并晾干，即可作为组织工程人工角膜内皮的载体支架使用。

本发明所用去上皮层羊膜专用包被液的配方为：D-Hanks溶液，0.075‰～0.125‰IV型胶原；

为了提高人角膜内皮细胞在去上皮层羊膜载体支架上的贴附效果，本发明又添加了0.075‰～0.125‰纤连蛋白；

为了进一步提高人角膜内皮细胞在去上皮层羊膜载体支架上的贴附效果，本发明又添加了0.0075‰～0.0125‰层粘连蛋白。

本发明的方法所制备出的组织工程人工角膜内皮载体支架具有透明性好、机械性强、通透性好、与人角膜内皮细胞生物相容性好、可降解性好等特点，本发明制备的载体支架与人角膜内皮种子细胞所重建的组织工程人工角膜内皮移植到撕除后板层的新西兰兔眼中，可使角膜保持透明160天以上。本发明的主要特点是：利用新鲜羊膜制备的去上皮层羊膜，经包被修饰后便可直接用作组织工程人工角膜内皮的载体支架材料，从而满足组织工程人工角膜内皮批量生产所用大量载体支架的需要，而且抗原性小、易于人角膜内皮细胞贴附和生长；且其生产和用作组织工程人工角膜内皮载体支架的成本低。

具体实施方式

1、去上皮层羊膜专用包被液的配制：取D-Hanks溶液80毫升，加入IV型胶原蛋白7.5～12.5毫克，完全溶解后用D-Hanks溶液定容至100毫升，用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，即为本发明的去上皮层羊膜专用包被液。

为了提高人角膜内皮细胞在去上皮层羊膜载体支架上的贴附效果，本发明又添加了0.075‰～0.125‰纤连蛋白；

为了进一步提高人角膜内皮细胞在去上皮层羊膜载体支架上的贴附效果，本发明又添加了0.0075‰～0.0125‰层粘连蛋白。

2、新鲜羊膜的处理与消毒：取500万单位硫酸妥布霉素注射液，加入500毫升0.9％生理盐水，混匀后即为1∶1000硫酸妥布霉素消毒液。用眼科镊撕除低温保存的新鲜羊膜的纤维细胞层和海绵层，用0.9％生理盐水冲洗干净后，放入上述消毒液中，在无菌操作台内浸泡消毒20～30分钟后，用无菌D-Hanks溶液漂洗3～5分钟。

3、羊膜上皮面的倒置消化：取0.2％～0.6％胰蛋白酶25毫升，加入0.02％～0.04％EDTA溶液25毫升，混匀后即为0.1％～0.3％胰蛋白酶-0.01％～0.02％EDTA消化液(1∶1)。将已灭菌滤纸平铺于无菌玻璃板上，滴加上述消化液使滤纸充分湿润，将漂洗后的羊膜按上皮面朝下的方向平铺于滤纸上，放至37℃培养箱中倒置消化30～60分钟。

4、去上皮层羊膜的制备：用细胞刮刀轻刮羊膜的上皮面，以全部去除残留的上皮细胞，用无菌D-Hanks溶液冲洗3～5次，获得去上皮层羊膜。

5、去上皮层羊膜片的干贴：用打孔器或眼科剪将去上皮层羊膜打成或剪成直径15.6毫米的圆片，按上皮面朝上平铺于24孔培养板孔中，放入5％CO₂培养箱中、37℃进行干贴15～25小时。

6、去上皮层羊膜片的包被修饰：在无菌条件下向干贴有羊膜的24孔培养板孔中按1毫升/孔的量轻轻加入去上皮层羊膜专用包被液，将培养板置37℃培养箱中包被处理15～25小时，使用前无菌吸出包被液，晾干后即可作为组织工程人工角膜内皮的载体支架使用。

实施例1

取500万单位硫酸妥布霉素注射液，加入500毫升0.9％生理盐水，混匀后即为1∶1000硫酸妥布霉素消毒液。用眼科镊撕除低温保存的新鲜羊膜的纤维细胞层和海绵层，用0.9％生理盐水冲洗干净，放入上述消毒液中，在无菌操作台内浸泡消毒20分钟，再用无菌D-Hanks溶液漂洗3分钟。

取0.6％胰蛋白酶25毫升，加入0.04％EDTA溶液25毫升，混匀后即为0.3％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液。将已灭菌滤纸平铺于无菌玻璃板上，滴加上述消化液使滤纸充分湿润，将漂洗后的羊膜按上皮面朝下的方向平铺于滤纸上，放置至37℃培养箱中消化30分钟，即倒置消化法。然后，用细胞刮刀轻刮羊膜的上皮面，以全部去除残留的上皮细胞，用无菌D-Hanks溶液冲洗3次，获得去上皮层羊膜，用打孔器将羊膜打成直径15.6毫米的圆片，按上皮面朝上平铺于24孔培养板孔中，放入5％CO₂培养箱中、37℃进行干贴15小时。

取D-Hanks溶液80毫升，加入IV型胶原蛋白7.5～12.5毫克，完全溶解后用D-Hanks溶液定容至100毫升，用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，即为本发明的去上皮层羊膜专用包被液。在无菌条件下向干贴有羊膜的24孔培养板孔中按1毫升/孔的量轻轻加入去上皮层羊膜专用包被液，将培养板置37℃培养箱中包被处理15小时，使用前无菌吸出包被液，晾干后即可作为组织工程人工角膜内皮的载体支架使用。

实施例2

取500万单位硫酸妥布霉素注射液，加入500毫升0.9％生理盐水，混匀后即为1∶1000硫酸妥布霉素消毒液。用眼科镊撕除低温保存的新鲜羊膜的纤维细胞层和海绵层，用0.9％生理盐水冲洗干净，放入上述消毒液中，在无菌操作台内浸泡消毒25分钟，再用无菌D-Hanks溶液漂洗4分钟。

取0.4％胰蛋白酶25毫升，加入0.02％EDTA溶液25毫升，混匀后即为0.2％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化液。将已灭菌滤纸平铺于无菌玻璃板上，滴加上述消化液使滤纸充分湿润，将漂洗后的羊膜按上皮面朝下的方向平铺于滤纸上，放置至37℃培养箱中消化50分钟，即倒置消化法。然后，用细胞刮刀轻刮羊膜的上皮面，以全部去除残留的上皮细胞，用无菌D-Hanks溶液冲洗4次，获得去上皮层羊膜，用打孔器将羊膜打成直径15.6毫米的圆片，按上皮面朝上平铺于24孔培养板孔中，放入5％CO₂培养箱中、37℃进行干贴20小时。

取D-Hanks溶液80毫升，加入IV型胶原蛋白7.5～12.5毫克，完全溶解后用D-Hanks溶液定容至100毫升，用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，即为本发明的去上皮层羊膜专用包被液。在无菌条件下向干贴有羊膜的24孔培养板孔中按1毫升/孔的量轻轻加入去上皮层羊膜专用包被液，将培养板置37℃培养箱中包被处理20小时，使用前无菌吸出包被液，晾干后即可作为组织工程人工角膜内皮的载体支架使用。

实施例3

取500万单位硫酸妥布霉素注射液，加入500毫升0.9％生理盐水，混匀后即为1∶1000硫酸妥布霉素消毒液。用眼科镊撕除低温保存的新鲜羊膜的纤维细胞层和海绵层，用0.9％生理盐水冲洗干净，放入上述消毒液中，在无菌操作台内浸泡消毒30分钟，再用无菌D-Hanks溶液漂洗5分钟。

取0.5％胰蛋白酶25毫升，加入0.02％EDTA溶液25毫升，混匀后即为0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化液。将已灭菌滤纸平铺于无菌玻璃板上，滴加上述消化液使滤纸充分湿润，将漂洗后的羊膜按上皮面朝下的方向平铺于滤纸上，放置至37℃培养箱中消化60分钟，即倒置消化法。然后，用细胞刮刀轻刮羊膜的上皮面，以全部去除残留的上皮细胞，用无菌D-Hanks溶液冲洗5次，获得去上皮层羊膜，用打孔器将羊膜打成直径15.6毫米的圆片，按上皮面朝上平铺于24孔培养板孔中，放入5％CO₂培养箱中、37℃进行干贴25小时。

取D-Hanks溶液80毫升，加入IV型胶原蛋白7.5～12.5毫克，完全溶解后用D-Hanks溶液定容至100毫升，用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，即为本发明的去上皮层羊膜专用包被液。在无菌条件下向干贴有羊膜的24孔培养板孔中按1毫升/孔的量轻轻加入去上皮层羊膜专用包被液，将培养板置37℃培养箱中包被处理25小时，使用前无菌吸出包被液，晾干后即可作为组织工程人工角膜内皮的载体支架使用。