一种培育菊芋杂交种子获得菊芋杂交种植株和块茎的方法

摘要

本发明涉及一种繁殖菊芋杂交种子获得菊芋杂交种植株和块茎的方法。该方法包括如下步骤：组织培养菊芋杂交种子获得菊芋实生苗。本发明方法克服了菊芋杂交种子结实率低、常规条件下不易发芽、难以获得有效植株个体、且由于受生育期的影响从种子到获得杂交种块茎应用于大田鉴定周期长的缺陷。本发明方法可有效的保留菊芋杂交变异，极大缩短变异进入大田鉴定的周期，可为菊芋杂交育种提供较多的可供选择的变异来源，加速杂交育种的选育进程，在菊芋杂交育种中具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种培育菊芋杂交种子获得菊芋杂交种植株和块茎的方法。

背景技术

菊芋(Helianthus tuberosus L.)又名洋姜，鬼子姜，姜不辣，原产北美，在我国各地均有栽培，是菊科向日葵属多年生草本植物。菊芋喜温，耐盐，耐瘠，抗逆高产，是高密度能源植物以及新型经济作物、饲料作物。

菊芋为头状花序，花序小，花数量多。花序的结构如图1所示(A表示头状花序的部分纵切，B管状花，C舌状花。1花序托、2总苞、3管状花、4舌状花、5苞片、6子房、7冠毛、8花冠管膨大部分、9花瓣、10聚药雄蕊、11柱头)，花成簇状排列。花瓣：5枚，互相连合成管状或舌状，舌状花呈无性，淡黄色，着生于花序边缘；管状花为两性花，着生于花序中间。雄蕊：5枚，花丝互相分离而花药边缘互相连合形成空筒形，即聚药雄蕊。同一朵管状花上雄蕊早于雌蕊成熟，每当花药成熟时，将花粉粒撒在聚药雄蕊的“筒”中，待雌蕊花柱生长时，将它们“推”出筒外。雌蕊：子房下位，二心皮构成，一室，一枚倒生胚珠，基底着生。花柱一条，伸于花药管中，顶端柱头2裂，但在雌蕊尚未成熟时，柱头不张开。在花柱上部，常生有一圈毛，叫“扫粉毛”，每当花柱发育而伸长的过程中，此“扫粉毛”即可将雄蕊花药“撒”在花药管中的花粉粒“推”出，便于来访的昆虫传粉。菊科植物花一般都是雄蕊先熟，花柱伸长过程中将花粉粒“推”出后，顶端的柱头再张开来接受其它花传来的花粉，接受花粉完成受精。

菊芋花期为8-9月，其同一头状花序上的管状花的开放时间不一致，随着花序生长，舌状花最先开放，随后四周的管状花开放，依次由外向中央开放，并伴随柱头的生长和花粉散粉。雄蕊雌蕊未成熟的管状花如图2所示，雄蕊顶端封闭，未见黑色花药丝。四周雌蕊雄蕊先开始成熟的花朵如图3所示，可见雄蕊黑色花药丝，顶端可见黄色花粉散出。头状花序中间雌蕊雄蕊开始成熟花朵如图4所示。

菊芋块茎富含菊糖，占其块茎干重的70-80％，是目前我国工业化提取菊糖的主要原料之一。菊糖作为一种纯天然的功能性配料，具有可溶性膳食纤维、低聚糖的双重特性和功能，同时也是双歧杆菌增殖因子、优异的脂肪替代物，是对糖尿病人安全的食品，已被世界20多个国家批准为营养增补剂，广泛应用于乳制品、饮料、低脂低热量食品、烘培食品、保健食品中，我国卫生部已批准菊粉、多聚果糖作为新资源食品。因此菊芋产业在我国具有良好的发展空间；同时菊芋还是良好的能源植物，以菊芋块茎作为原料生产生物乙醇的亦见于报道。菊芋的抗旱抗寒，耐瘠，耐盐碱的特性使其在我国北方具有广阔的推广空间，可充分利用北方大面积的盐碱地、贫瘠地、边坡地、荒地等边际地资源和丰富的光热资源，同时具有良好的生态效益。

目前我国菊芋产业尚处于起步阶段，已在青海、宁夏、甘肃、湖北等地形成产业规模。目前国内对菊芋的研究主要集中在引种、栽培、生理、生态、下游产品加工及利用等方面。相对菊芋产业的发展菊芋杂交品种选育工作严重滞后，尚未见菊芋杂交品种选育的相关报道。为保证应菊芋产业的可持续发展，必须开展系统的品种选育工作，尤其是杂交品种的选育，为菊芋产业的发展提供良好的品种保证。

生产中，菊芋以无性繁殖为主，自然开放授粉结实率极低，杂交结实率更低；菊芋种子直播或者发芽播种大部分不能正常发芽或者发芽率极低。菊芋的这些特性使其利用自然变异选育新品种的可能性极低，更无法满足品种选育工作的需求，因此必须通过人工杂交的手段人工创造更多的变异，而菊芋极低的结实率和种子较低的发芽率使杂交种子的获得、繁殖都极其困难，限制了通过人工杂交的方式创造、保存、利用变异的可能；同时菊芋杂交种子繁殖植株长势弱，易受病害、环境等影响而死亡，使人工杂交得到的变异丧失；并且由于受菊芋生育期和杂交种子繁殖植株块茎产量低的限制由单粒菊芋杂交种子扩繁成大田鉴定群体最少需2-3年以上的时间，周期长；因此必须寻找合适的方法尽最大可能保留杂交种子并使其在最短的时间内扩繁得到较大的群体，应用于杂交育种中。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种培育菊芋杂交种子获得菊芋实生苗的方法。

本发明所提供的培育菊芋杂交种子获得菊芋实生幼苗的方法，包括如下步骤：组织培养菊芋杂交种子获得菊芋实生苗。

上述方法中，所述组织培养的方法包括如下步骤：

1)将所述菊芋杂交种子消毒，获得消毒的菊芋杂交种子；

2)将所述消毒的菊芋杂交种子接种于MS培养基中，4℃处理12-36h，然后在温度为20℃-23℃且避光的条件下培养10-30天，得到菊芋杂交种实生苗。

上述方法中，在所述步骤2)后，包括如下扩繁的步骤：将所述菊芋实生幼苗切成具芽的茎段，将具芽的茎段转接于添加α-萘乙酸的1/2MS培养基中，在温度为20℃-25℃、光强2500-3000lux且光照时间为14h/天的条件下培养，得到菊芋实生苗；

所述生添加萘乙酸(NAA)的1/2MS培养基由1/2MS培养基和α-萘乙酸NAA组成，1/2MS培养基和NAA的配比为1L∶(0.05mg-0.15mg)，具体为1L∶0.1mg。

上述方法中，所述消毒包括如下步骤：将所述菊芋杂交种子去皮，置于洗涤剂和水的混合溶液中浸泡1-2h，流水冲洗1-3h，然后用75％(体积百分含量)的乙醇水溶液浸泡10-30s，无菌水冲洗，再用有效氯含量为5％的次氯酸钠水溶液消毒3-6min，无菌水冲洗，再用0.1％(质量百分含量)氯化汞水溶液灭菌1-4min，无菌水冲洗；所述洗涤剂和水的混合溶液中洗涤剂和水的体积比为(0.5-4)∶100。

本发明的另一个目的是提供一种培育菊芋杂交种子获得菊芋植株的方法。

本发明所提供的培育菊芋杂交种子获得菊芋植株的方法，包括如下步骤：

a)按照上述方法培养菊芋杂交种子，获得菊芋杂交种实生苗；

b)将所述菊芋杂交种实生苗进行炼苗和移栽，得到菊芋杂交种植株。

上述方法中，在所述步骤b)后，包括将所述菊芋植株进行田间栽培的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种培育菊芋杂交种子获得菊芋杂交种块茎的方法。

本发明所提供的培育菊芋杂交种子获得菊芋杂交种块茎的方法，包括如下步骤：按照上述任一所述的方法获得田间生长的菊芋植株，继续田间栽培至收获菊芋块茎。

上述培育菊芋杂交种子获得菊芋实生幼苗、上述培育菊芋杂交种子获得菊芋植株的方法、上述培育菊芋杂交种子获得菊芋杂交种块茎的方法在菊芋品种选育中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明方法成功的将菊芋杂交种子培育成完整植株，移栽于田间栽培并收获了块茎。实验证明，本发明方法在培养基上进行杂交种子繁殖，种子污染率低，种子发芽率高，种子到大田植株繁殖系数高；周期短，从开始培养杂交种子至田间收获较多块茎，仅需8-12个月，实现了菊芋杂交种子的高效繁殖。本发明方法克服了菊芋杂交种子结实率低、常规条件下不易发芽、难以获得有效植株个体、且由于受生育期的影响从种子到获得杂交种块茎应用于大田鉴定周期长的缺陷。本发明方法可有效的保留菊芋杂交变异，极大缩短变异进入大田鉴定的周期，可为菊芋杂交育种提供较多的可供选择的变异来源，加速杂交育种的选育进程，在菊芋杂交育种中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为菊芋花序的解剖结构图。

图2为雄蕊雌蕊未成熟花朵，雄蕊顶端封闭，未见黑色花药丝。

图3为四周雌蕊雄蕊开始成熟的花朵，可见雄蕊黑色花药丝，顶端可见黄色花粉散出。

图4为头状花序中间雌蕊雄蕊开始成熟花朵。

图5为剪掉中间管状花后涂上胶水的花序。

图6为最适授粉花粉。

图7为最适授粉柱头。

图8为菊芋杂交种子。

图9为无菌条件下发芽的菊芋种子。

图10为快繁阶段菊芋幼苗的根及幼苗。

图11培养间菊芋组培苗。

图12为移栽于营养钵种的菊芋组培苗。

图13为大田种的菊芋苗。

图14为菊芋杂交种块茎。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、菊芋人工杂交种子的获得

本实施例中选择紫色块茎的菊芋进行人工杂交。

一、杂交方法

(一)菊芋母本的去雄

1、待去雄的花序的选择

菊芋花序中的管状花成簇状排列，其开花特点是由四周往中间依次开放。早晨气温上升以前，菊芋花序中同一朵管状花上的雌蕊花柱和雄蕊花药丝会迅速生长且两者生长速度存在差异，雄蕊花药丝伸长较快并先于雌蕊成熟；雌蕊花柱生长速度慢，从而雌蕊柱头与雄蕊顶端之间形成一定距离。根据此特点选择花盘周边边缘的管状小花雄蕊即将成熟但未散粉、雌蕊花柱尚未伸长，中间管状花尚未成熟的花序作为母本，去雄。去雄时选择的花序是介于图2之后而在图3的之前的发育状态的花序。

具体选择花期处于如下阶段的菊芋花序进行去雄，该时期花序的结构如下述(1)和(2)：将菊芋花序中花盘周边边缘先开放的管状花记作四周管状花，将除四周管状花之外的所有管状花记作中间管状花；在四周管状花具有下述(1)中所述的结构时，花序中的中间管状花自然就有下述(2)中所述结构。

(1)四周管状花的结构：雄蕊为聚药雄蕊，由花丝、花药构成，花丝分离，花药互相连合成管状，花药未散粉；雌蕊由柱头、花柱和子房构成，花柱和柱头位于花药内底部中央处且花柱未伸长，柱头与所述花药的顶端相距2mm-3mm；所述花药的顶端为花药中远离花盘的一端。

此时，四周管状花的雄蕊已经伸长，可以看见黑色的花丝长出而且较中间未发育的小花长约2-3mm，但其顶端尚是封闭状态，未见黄色的花粉散出，也就是花药尚未完全成熟；此时与其同一朵小花上的雌蕊柱头还未伸长，雌蕊柱头顶端离雄蕊花药管顶端有一定距离(2-3mm)。

花药就是被膜包的花粉团，去雄时花粉未成熟(即花药未散粉)，所以花药并不会破裂散出花粉。而花粉附着于花药管内壁，直接去除花药管即可去除所有的花粉；

只有这一时期，柱头与花药的顶端才相距2mm-3mm，随着雌蕊花柱的发育柱头会越来越接近雄蕊顶端，最后顶破雄蕊花药顶端，伸出柱头同时推出花粉。

(2)中间管状花：雄蕊为聚药雄蕊，雄蕊由花丝和花药构成，花丝分离，管状花药是由单独的花药互相连合成管状，但是管状花花药、花丝尚在发育中，未见伸长；雌蕊中的子房、花柱和柱头处于发育过程中，还没有分化完全。

2、去雄

(1)四周管状花的去雄：

用镊子夹住花药的1/3处，垂直于所述管状花的花盘的方向将所述雄蕊拽掉，留有雌蕊且露出柱头；所述花药的1/3处自花药远离花盘的一端向花盘方向计。

这一时期雌蕊花柱还未伸长，伸长的只是雄蕊花丝，两者之间有一定距离，因此不会伤及雌蕊，去掉雄蕊后露出的是雌蕊的柱头。

(2)中间管状花的去雄：

用剪刀在中间管状花的1/2至1/4处剪掉中间管状花；所述中间管状花的1/2至1/4处自中间管状花与花盘连接端计起。此步骤要注意掌握剪除部位，剪除过多易造成花序死亡，过少易造成花粉污染。实际操作中，有的自1/2处、有的自1/4处、有的介于两者之间，统计结果表明在1/2至1/4的范围内，均无显著差异。

用小毛笔蘸取胶水涂抹在刀口部位，以抑制其花药再生长和抑制散粉(图5)；在操作过程中避免胶水接触到待授粉的柱头。此方法可有效防止生长迟缓的管状花散粉，减少去雄次数，避免了去雄后暴露的柱头受同一花序的花粉的污染。

上述步骤(1)和(2)将雄蕊彻底去除，防止自交，产生自交种子，也就是防止自己的花粉给自己授粉。

至此，获得去雄的花序，将其作为母本。

3、套袋

为了防止去雄后的花序与其它花粉杂交，随后将去雄后的花序套上硫酸纸袋，并让雌蕊继续发育。

(二)父本的选择

选取未开花且与母本花期相遇的花序，套上硫酸纸杂交袋，作为父本花序。花期相遇具体是指父本的管状花散粉时间与母本去雄后柱头展开时间相遇。只要是父本花开花时间与母本去雄后的花的开花时间一致即可，无所谓父本的四周花序或中间花序，因为父本只是提供花粉。

(三)授粉

选择如下时期和状态的母本与父本进行人工授粉：

父本：父本的管状花中柱头刚露出雄蕊花药管顶端且花粉刚被顶出花药(图6)。

母本：母本去雄后，花柱伸长，当柱头前端分裂且裂片展平的时候为最佳接受花粉时间(图7)；此时授粉面裸露，顶端乳突充分篷展，内容物充盈透明，柱头可授性最好，更易结实。

一般是去雄当天下午4点左右至第二天上午就可以进行授粉，此时柱头可授性最好。使用小毛笔粘住花粉，在选好的柱头上进行授粉，授粉完毕后套上硫酸纸袋，标上标牌。

(四)授粉后的培育

授粉完毕4-7天后，去掉硫酸纸袋，正常田间管理，获得杂交种子。

菊芋杂交种子的形态如图8所示。

MS培养基：产品编号HB8469生产商：青岛高科园海博生物技术有限公司。氯化汞：分析纯(AR)，氯化汞含量不少于99.5％，生产商：天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

次氯酸纳溶液(有效氯含量为10.0％)，生产商：天津市巴斯夫化工有限公司，许可证号：津Q/AG3-333-2001。将购买的有效氯含量为10％的次氯酸钠溶液用蒸馏水稀释，得到有效氯含量为5％的次氯酸钠溶液。用有效氯含量为5％的次氯酸钠溶液进行实验。

洗涤剂为市售的普通雕牌洗洁精。

下述每个实施例中均用200粒杂交种子进行实验。

实施例2、菊芋杂交种子的培养

一、组织培养

1、种子消毒

将菊芋杂交种子去皮，置于洗涤剂和水的混合溶液(洗涤剂和水的体积比为2∶100)中浸泡1.5h，流水冲洗3h，然后用75％(体积百分含量)的乙醇水溶液浸泡20s，无菌水冲洗3次，再用有效氯含量为5％的次氯酸钠溶液消毒4min，无菌水冲洗3次，再用0.1％(质量百分含量)氯化汞水溶液灭菌2min，无菌水冲洗3次。

将消毒后的种子用无菌滤纸吸干水分，接种于MS培养基中，3天后，统计种子的污染率。长出菌斑的种子认为是污染的。

污染率(％)＝(出现污染种子数/接种的种子数)×100％

3次重复的结果为：平均污染率为7.5％。

2、获得完整幼苗

将步骤1消毒后的种子用无菌滤纸吸干水分，接种于MS培养基中，4℃处理24h，然后在温度为22℃且避光的条件下培养20天，得到的菊芋杂交种子实生幼苗，并统计种子发芽率(图9)；MS培养基组成如表1所示。种子直接发芽长下的就是实生幼苗。

发芽率(％)＝(发芽种子数/接种种子数)×100％

3次重复的结果为：平均种子发芽率为75％。

3、幼苗扩繁

将步骤2得到的菊芋杂交种子实生幼苗切成具芽的茎段，接种于添加α-萘乙酸(NAA)的1/2MS培养基中，在温度为23℃、光强3000lux且光照时间为14h/天的条件下培养20天，得到组培幼苗(图10和图11，图10A为根，图10B为组培幼苗)，并统计组培苗生根率。扩繁步骤中获得的幼苗大部分都是具有根的，但是少量不带根，本实验统计带根的幼苗的数量，计算组培苗生根率。

添加α-萘乙酸(NAA)的1/2MS培养基由α-萘乙酸和1/2MS培养基组成，1/2MS培养基和NAA的配比为1L∶0.1mg。

组培苗生根率(％)＝(生根茎段数/接种茎段数)×100％

3次重复的结果为：平均组培苗生根率为95％。

在上述的各个阶段中，阶段2获得的由种子直接发芽得到的幼苗为实生苗。阶段3中通过对阶段2实生幼苗切段，扦插到培养基上长成的植株是克隆植株；通过阶段2，阶段3两个阶段的组织培养可以将一粒种子发芽长成一株幼苗，并通过切断转接于培养基上，使其一个带芽的茎段就可以发育成一个完整的植株，从而使一株植株在较短的时间内繁殖成十几株甚至几十株植株。因为这十几株或者是几十株植株来自同一个实生苗，或者说来自于同一个种子，因此叫来自于同粒种子的克隆体。而对于传统的种子繁殖一粒种子只能得到一个植株。

表1、MS培养基的组成

1/2MS培养基组成：1/2MS培养基中的组成成分与MS培养基相同，其中，大量元素和微量元素浓度均为MS培养基的1/2，蔗糖、琼脂、铁盐和有机成分的浓度与MS培养基相同，pH为5.8。

MS，1/2MS均是煮沸溶解后分装至150ml三角瓶中，然后115℃，高压蒸汽灭菌20min。

二、炼苗和移栽

(一)炼苗

将步骤一获得组培幼苗进行炼苗，具体炼苗步骤如下：将培养瓶(三角瓶)封口膜揭开1/3，锻炼3天，然后将三角瓶封口膜全部揭开，锻炼5天。此炼苗过程是使组培苗逐步适应外界环境，提高组培苗的移栽成活率。

(二)移栽

1、将炼苗后的组培苗取出，洗净根部残余的培养基，移栽至装有基质的营养钵中，在温度为23℃、环境湿度为75％、光强3000lux且光照时间为14h/天的条件下培养7天；此过程中在保证基质湿润的前提下少浇水但绝对避免干旱，并严禁营养钵内积水和强光照射。

2、再在温度为23℃、环境湿度为70％且自然光照条件下培养20天，统计移栽植株成活率；得到的植株如图12所示。

上述过程中所用的基质由草炭土和沙土组成，草炭土∶沙土＝1∶1.5(体积比)。

上述过程中，炼苗是使植株逐渐适应外界环境，移栽于营养钵中是在培养室内使植株得到适应性锻炼。此炼苗和移栽可提高组培苗的移栽成活率。

移栽植株成活率(％)＝(移栽成活植株数/营养钵移栽植株数)×100％

3次重复的结果为：平均营养钵移栽成活率为87％。

三、田间栽培

将步骤二得到的菊芋植株带培养土移栽于大田中，浇水，遮光(拿遮阳网遮住)5天。定植后，前期勤浇水保持土壤湿润；植株完全成活长大后适当减少浇水。统计移栽植株成活率(％)；移栽当年十月份即可收获大量杂交种子植株块茎。田间种植的植株如图13所示。收获的块茎如图14所示。

其中，浇水且适当遮光5天的处理能促进幼苗的成活。

移栽植株成活率(％)＝(大田成活植株数/大田移栽植株数)×100％

3次重复的结果为：平均大田移栽成活率为85％。

实验完毕后，统计繁殖系数和繁育周期。

繁殖系数：定义为每粒杂交种子通过实验一、二和三的步骤后，获得的能够存活并能产生块茎的植株数。

繁育周期：从将种子消毒至收获块茎的时间。

3次重复的结果为：繁殖系数为7，繁育周期为10个月。

实施例3、菊芋杂交种子的培养

一、组织培养

1、种子消毒

将菊芋杂交种子去皮，置于洗涤剂和水的混合溶液(洗涤剂和水的体积比为0.5∶100)中浸泡1h，流水冲洗1h，然后用75％(体积百分含量)的乙醇水溶液浸泡10s，无菌水冲洗3次，再用有效氯含量5％的次氯酸钠水溶液消毒3min，无菌水冲洗3次，再用0.1％(质量百分含量)氯化汞水溶液灭菌1min，无菌水冲洗3次。

将消毒后的种子用无菌滤纸吸干水分，接种于MS培养基中，3天后，统计种子的污染率。

污染率(％)＝(出现污染种子数/接种的种子数)×100％

3次重复的结果为：平均污染率为12％。

2、获得完整幼苗

将步骤1消毒后的种子用无菌滤纸吸干水分，接种于MS培养基中，4℃处理12h，然后在温度为20℃且避光的条件下培养10天，得到的菊芋杂交种子实生幼苗(具有根和子叶)，并统计种子发芽率；MS培养基组成如表1所示。

发芽率(％)＝(发芽种子数/接种种子数)×100％

3次重复的结果为：平均种子发芽率为71％。

3、幼苗扩繁

将步骤2得到的菊芋杂交种子实生幼苗切成具芽的茎段，接种于添加α-萘乙酸(NAA)的1/2MS培养基中，在温度为20℃、光强2500lux且光照时间为14h/天的条件下培养15天，得到组培幼苗，并统计组培苗生根率。

添加α-萘乙酸(NAA)的1/2MS培养基由α-萘乙酸和1/2MS培养基组成，1/2MS培养基和NAA的配比为1L∶0.05mg。

组培苗生根率(％)＝(生根茎段数/接种茎段数)×100％

3次重复的结果为：平均组培苗生根率为89％。

MS培养基组成、1/2MS培养基组成均与实施例1中所述相同。

二、炼苗和移栽

(一)炼苗

将步骤一获得组培幼苗进行炼苗，具体炼苗步骤如下：将培养瓶(三角瓶)封口膜揭开1/3，锻炼1天，然后将三角瓶封口膜全部揭开，锻炼3天。此炼苗过程是使组培苗逐步适应外界环境，提高组培苗的移栽成活率。

(二)移栽

1、将炼苗后的组培苗取出，洗净根部残余的培养基，移栽至装有基质的营养钵中，在温度为20℃、环境湿度为70％、光强2000lux且光照时间为14h/天的条件下培养5天；此过程中在保证基质湿润的前提下少浇水但绝对避免干旱，并严禁营养钵内积水和强光照射。。

2、再在温度为20℃、环境湿度为60％且自然光照条件下培养15天，统计移栽植株成活率。

上述过程中所用的基质由草炭土和沙土组成，草炭土∶沙土＝1∶1.5。

上述过程中，炼苗是使植株逐渐适应外界环境，移栽于营养钵中是在培养室内使植株得到适应性锻炼。此炼苗和移栽可提高组培苗的移栽成活率。

移栽植株成活率(％)＝(成活植株数/营养钵移栽植株数)×100％

3次重复的结果为：平均营养钵移栽成活率为76％。

三、田间栽培

将步骤二得到的菊芋植株带培养土移栽于大田中，浇水，遮光(拿遮阳网遮住)3天。定植后，前期勤浇水保持土壤湿润；植株完全成活长大后适当减少浇水。统计移栽植株成活率(％)；移栽当年十月份即可收获杂交种子植株块茎。

其中，浇水且适当遮光3天的处理能促进苗的成活。

移栽植株成活率(％)＝(大田成活植株数/大田移栽植株数)×100％

3次重复的结果为：平均大田移栽成活率为79％。

实验完毕后，统计繁殖系数和繁育周期。

繁殖系数：定义每粒杂交种子通过实验一、二和三的步骤后，获得的能够存活并能产生块茎的植株数目。

繁育周期：从将种子消毒至收获块茎的时间。

3次重复的结果为：繁殖系数为5，繁育周期为10个月。

实施例4、菊芋杂交种子的培养

一、组织培养

1、种子消毒

将菊芋杂交种子去皮，置于洗涤剂和水的混合溶液(洗涤剂和水的体积比为4∶100)中浸泡2h，流水冲洗3h，然后用75％(体积百分含量)的乙醇水溶液浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用有效氯含量为5％的次氯酸钠水溶液消毒6min，无菌水冲洗3次，再用0.1％(质量百分含量)氯化汞水溶液灭菌4min，无菌水冲洗3次。

将消毒后的种子用无菌滤纸吸干水分，接种于MS培养基中，3天后，统计种子的污染率。

污染率(％)＝(出现污染种子数/消毒并接种的种子数)×100％

3次重复的结果为：平均污染率为3％。

2、获得完整幼苗

将步骤1消毒后的种子用无菌滤纸吸干水分，接种于MS培养基中，4℃处理36h，然后在温度为23℃且避光的条件下培养30天，得到的菊芋杂交种子实生幼苗并统计种子发芽率；MS培养基组成如表1所示。

发芽率(％)＝(发芽种子数/接种种子数)×100％

3次重复的结果为：平均种子发芽率为68％。

3、幼苗扩繁

将步骤2得到的菊芋杂交种子实生幼苗切成具芽的茎段，接种于添加α-萘乙酸(NAA)的1/2MS培养基中，在温度为25℃、光强3000lux且光照时间为14h/天的条件下培养25天，得到组培幼苗，并统计组培苗生根率。

添加α-萘乙酸(NAA)的1/2MS培养基由α-萘乙酸和1/2MS培养基组成，1/2MS培养基和NAA的配比为1L∶0.15mg。

组培苗生根率(％)＝(生根茎段数/接种茎段数)×100％

3次重复的结果为：平均组培苗生根率为80％。

MS培养基组成、1/2MS培养基组成均与实施例1中所述相同。

二、炼苗和移栽

(一)炼苗

将步骤一获得组培幼苗进行炼苗，具体炼苗步骤如下：将培养瓶(三角瓶)封口膜揭开1/3，锻炼5天，然后将三角瓶封口膜全部揭开，锻炼5天。此炼苗过程是使组培苗逐步适应外界环境，提高组培苗的移栽成活率。

(二)移栽

1、将炼苗后的组培苗取出，洗净根部残余的培养基，移栽至装有基质的营养钵中，在温度为25℃、环境湿度为80％、光强3000lux且光照时间为14h/天的条件下培养10天；此过程中在保证基质湿润的前提下少浇水但绝对避免干旱，并严禁营养钵内积水和强光照射。

2、再在温度为25℃、环境湿度为75％且自然光照条件下培养25天，统计移栽植株成活率。

上述过程中所用的基质由草炭土和沙土组成，草炭土∶沙土＝1∶1.5。

上述过程中，炼苗是使植株逐渐适应外界环境，移栽于营养钵中是在培养室内使植株得到适应性锻炼。此炼苗和移栽可提高组培苗的移栽成活率。

移栽植株成活率(％)＝(移栽成活植株数/营养钵移栽植株数)×100％

营养钵移栽成活率85％以上；

3次重复的结果为：平均营养钵移栽成活率为89％。

三、田间栽培

步骤二得到的菊芋植株带培养土移栽于大田中，浇水，遮光(拿遮阳网遮住)5天。定植后，前期勤浇水保持土壤湿润；植株完全成活长大后适当减少浇水。统计移栽植株成活率(％)；移栽当年十月份即可收获大量杂交种子植株块茎。

其中，浇水且适当遮光7天的处理能促进幼苗的成活。

移栽植株成活率(％)＝(大田成活植株数/大田移栽植株数)×100％

3次重复的结果为：平均大田移栽成活率为87％。

实验完毕后，统计繁殖系数和繁育周期。

繁殖系数：定义为每粒杂交种子通过实验一、二和三的步骤后，获得的能够存活并能产生块茎的植株数目。

繁育周期：从将种子消毒至收获块茎的时间。

3次重复的结果为：繁殖系数为5，繁育周期为11个月。