聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹氧化锌量子点及制备和应用

摘要

本发明公开了一种聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹氧化锌量子点荧光示踪转基因载体的制备方法和应用，属于转基因载体的制备。该方法过程包括用N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯及甲基丙烯酸锌为单体，以自由基聚合技术，制备了聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹氧化锌量子点。本发明的优点在于其制备方法简单，合成条件温和，以该方法制备的聚N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹的氧化锌量子点具有转基因的能力并能通过光学方法实现对于DNA运输过程的跟踪。

说明书

技术领域

本发明涉及基于氧化锌量子点的非病毒转基因载体的制备，特别是一种聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹氧化锌量子点(ZnO@PDMAEMA-co-PMAA)及制备和应用，它是一种具有转导基因和生物成像功能的非病毒载体的制备。

背景技术

基因治疗(gene therapy)是分子生物学与现代医学相结合的产物，是利用最先进的生命科学和临床医学的技术，通过导入人的正常基因或有治疗作用的基因从而发挥治疗作用的一种治疗方法。目前应用于基因治疗的载体主要有病毒载体(viral vector)和非病毒载体(nonviral vector)两种。可采用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)等，但病毒载体存在免疫原反应和肿瘤化危险。非病毒载体包括裸DNA、脂质体、阳离子高聚物等。阳离子聚合物作为非病毒载体的一大类，除了存在非病毒载体的特点(即低毒性，低免疫源性和低致病性)以外，还有自身的优势，就是对转导的基因的尺寸没有限制，有利于其作为转基因载体的应用。

量子点(Quantum Dot)是近年来新兴的一种纳米材料，由于其具有优良的随尺寸变化的性质，尤其是光学性质，无论在基础研究还是在实际应用方面都具有重要的价值。半导体量子点多指基于II-VI族(如CdSe，ZnS)、III-V族(如GaAs，InP)及IV-VI族(如PbS、PbSe)三个系列的纳米晶体材料，是准零维的纳米材料。量子点表面粗糙，直径介于1-10nm之间，是由相对少数目的原子与分子组成的纳米级团簇，其性能既不同于块状固体又有别于单一的原子或分子的性质，而是表现出其独特的物理、化学性能。当半导体晶体颗粒的直径小于该半导体材料体相的激子波尔半径时，其电子能级由准连续变为分立，晶体颗粒处于量子受限(quantum confinement)状态，因此称为量子点。由于量子受限，量子点的带隙随晶粒尺寸变化，呈现量子尺寸效应(quantum size effect)，最直接的表现为光学性质随着晶粒尺寸的变化而变化。与通常应用为标记物的有机荧光染料相比，量子点具有发射波长可调、激发波长宽、发射波长窄、光稳定性好和易于修饰等优势。由于其出众的性能，量子点在包括生物标记在内的多个领域有广阔的应用前景。

以量子点为基体进行表面修饰，包括多肽、氨基酸，或与聚合物进行偶联并应用于生物标记、体内体外成像、基因测序、基因治疗等是当前的一个研究热点。由于目前应用范围最广、制备最为成熟的CdX(X＝S、Se、Te)量子点具有极大的生物毒性，其在基因治疗领域的应用受到了严重限制。作为其替代物，生物友好的氧化锌量子点越来越受到人们的重视。ZnO量子点是一种直接带隙的宽禁带半导体材料，其一般具有两个典型的荧光发射峰：340-380nm处的紫外发射峰和500-600nm处的可见发射峰。对于生物医用领域，ZnO的可见发射峰具有重要的意义。但是ZnO量子点本身不具备复合DNA的能力，因而无法用于介导基因的转染中。目前的文献和公开的专利尚无ZnO量子点作为转基因载体的报道。

本发明的目的在于提供一种聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹氧化锌量子点及制备和应用。它具有荧光示踪能力，并且能够有效复合DNA并进行基因转染，其合成条件温和，制备简单，一步法完成，不涉及常用的ZnO量子点后修饰的繁琐工艺。以该方法制备的聚N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹的氧化锌量子点具有转基因能力，并能通过光学方法实现对于DNA运输过程的跟踪，即基因转染和生物标记和成像可在单一的生物相容性良好的ZnO量子点上实现。

本发明提供的一种聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹氧化锌量子点结构如下式所示：

其中，m＝20-200，n＝50-200。

本发明提供的一种聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹氧化锌量子点是以单体N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯与甲基丙烯酸锌为原料共聚而成，两单体的共聚摩尔比为1-30∶1。

聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹氧化锌量子点的制备方法包括以下步骤：

甲基丙烯酸锌(Zn(MAA)₂)、N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯(DMAEMA)溶于无水乙醇中，搅拌均匀。加热至80℃后加入偶氮二异丁腈(AIBN)，反应进行两分钟后反应体系变为乳白色，此时加入水合氢氧化锂乙醇溶液，于80℃条件下回流反应1小时。反应完成后，待产物冷却至室温，于5000rpm条件下离心5分钟。弃去上清液，将所得白色沉淀溶解于去离子水中，并于去离子水中透析3天(透析袋截留分子量3500)。使用0.22微米孔径滤膜过滤所得溶液，冻干即得最终产物。其中偶氮二异丁腈的加入量为单体总量的0.5％-5％；水合氢氧化锂与甲基丙烯酸锌等摩尔。

本发明的优点在于所制备的聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹氧化锌量子点能够有效复合压缩DNA，并成功将DNA导入细胞并使其成功表达。在转基因过程中能够通过荧光作用随时跟踪DNA/载体的位置并确定其胞内分布。步骤是：将上述载体溶于原子级水中得到不同浓度的载体溶液，并用0.22μm滤器过滤除菌。为制备复合比为1-60∶1(复合比均为载体与DNA的质量比，简称为复合比)的载体/pDNA复合物溶液，将一定浓度的载体溶液加入到等体积的质粒(pGL3)DNA溶液中，20-37℃复合30分钟。将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞不含血清的培基中，转染4小时后将培养基换为包含血清的培养基后继续培养48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性。转染过程中可随时用激光扫描共聚焦显微镜定位DNA/载体复合物的位置并观察其胞内分布，激发波长350nm，发射波长570nm。

本发明用N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯及甲基丙烯酸锌为单体，以自由基聚合技术，制备了聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹氧化锌量子点。本发明的优点在于其制备方法简单，合成条件温和，以该方法制备的聚N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹的氧化锌量子点具有转基因的能力并能通过光学方法实现对于DNA运输过程的跟踪。

附图说明

图1是激光扫描共聚焦显微镜对DNA/载体复合物胞内分布的观察。

具体实施方式

实施例一：

取59mg甲基丙烯酸锌(Zn(MAA)₂)、0.84ml N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯(DMAEMA)溶于10毫升无水乙醇中，搅拌均匀。加热至80℃后加入8.2mg偶氮二异丁腈(AIBN)，反应进行两分钟后反应体系变为乳白色，此时加入含10.5mg水合氢氧化锂的乙醇溶液10毫升，于80℃条件下回流反应1小时。反应完成后，待产物冷却至室温，于5000rpm条件下离心5分钟。弃去上清液，将所得白色沉淀溶解于30毫升去离子水中，并于去离子水中透析3天(透析袋截留分子量3500)。使用0.22微米孔径滤膜过滤所得溶液，冻干即得最终产物。由核磁共振氢谱确定其摩尔共聚比(DMAEMA/MAA)为4.95。

将上述载体溶于原子级水中得到不同浓度的载体溶液，并用0.22μm滤器过滤除菌。为制备复合比为25∶1的载体/pDNA复合物溶液，将一定浓度的载体溶液加入到等体积的质粒(pGL3)DNA溶液中，20-37℃复合30分钟。将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞不含血清的培基中，转染4小时后将培养基换为包含血清的培养基后继续培养48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为7.69×10⁶RLU/mg protein。

实施例二：

取118mg甲基丙烯酸锌(Zn(MAA)₂)、0.84ml N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯(DMAEMA)溶于10毫升无水乙醇中，搅拌均匀。加热至80℃后加入8.2mg偶氮二异丁腈(AIBN)，反应进行两分钟后反应体系变为乳白色，此时加入含21mg水合氢氧化锂的乙醇溶液10毫升，于80℃条件下回流反应1小时。反应完成后，待产物冷却至室温，于5000rpm条件下离心5分钟。弃去上清液，将所得白色沉淀溶解于30毫升去离子水中，并于去离子水中透析3天(透析袋截留分子量3500)。使用0.22微米孔径滤膜过滤所得溶液，冻干即得最终产物。由核磁共振氢谱确定其摩尔共聚比(DMAEMA/MAA)为2.95。

将上述载体溶于原子级水中得到不同浓度的载体溶液，并用0.22μm滤器过滤除菌。为制备复合比为25∶1的载体/pDNA复合物溶液，将一定浓度的载体溶液加入到等体积的质粒(pGL3)DNA溶液中，20-37℃复合30分钟。将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞不含血清的培基中，转染4小时后将培养基换为包含血清的培养基后继续培养48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为1.27×10⁷RLU/mg protein。在转染过程进行3小时采用激光扫描共聚焦显微镜进行DNA/载体复合物分布观察，激发波长350nm，发射波长570nm(如下图1所示，DNA/载体复合物进入细胞并分布于细胞质中)。

实施例三：

取236mg甲基丙烯酸锌(Zn(MAA)₂)、0.84ml N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯(DMAEMA)溶于10毫升无水乙醇中，搅拌均匀。加热至80℃后加入8.2mg偶氮二异丁腈(AIBN)，反应进行两分钟后反应体系变为乳白色，此时加入含42mg水合氢氧化锂的乙醇溶液10毫升，于80℃条件下回流反应1小时。反应完成后，待产物冷却至室温，于5000rpm条件下离心5分钟。弃去上清液，将所得白色沉淀溶解于30毫升去离子水中，并于去离子水中透析3天(透析袋截留分子量3500)。使用0.22微米孔径滤膜过滤所得溶液，冻干即得最终产物。由核磁共振氢谱确定其摩尔共聚比(DMAEMA/MAA)为1.41。

将上述载体溶于原子级水中得到不同浓度的载体溶液，并用0.22μm滤器过滤除菌。为制备复合比为25∶1的载体/pDNA复合物溶液，将一定浓度的载体溶液加入到等体积的质粒(pGL3)DNA溶液中，20-37℃复合30分钟。将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞不含血清的培基中，转染4小时后将培养基换为包含血清的培养基后继续培养48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为2.89×10⁶RLU/mg protein。

实施例四：

取1180mg甲基丙烯酸锌(Zn(MAA)₂)、0.84ml N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯(DMAEMA)溶于10毫升无水乙醇中，搅拌均匀。加热至80℃后加入8.2mg偶氮二异丁腈(AIBN)，反应进行两分钟后反应体系变为乳白色，此时加入含210mg水合氢氧化锂的乙醇溶液10毫升，于80℃条件下回流反应1小时。反应完成后，待产物冷却至室温，于5000rpm条件下离心5分钟。弃去上清液，将所得白色沉淀分散于30毫升去离子水中，并于去离子水中透析3天(透析袋截留分子量3500)。冻干即得最终产物。所的产物水溶性大大降低，未用于基因转染研究。

对比例：

取0.84ml N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯(DMAEMA)溶于10毫升无水乙醇中，搅拌均匀。加热至80℃后加入8.2mg偶氮二异丁腈(AIBN)，反应进行两分钟后加入含21mg水合氢氧化锂的乙醇溶液10毫升，于80℃条件下回流反应1小时。反应完成后，待产物冷却至室温，于去离子水中透析3天(透析袋截留分子量3500)。使用0.22微米孔径滤膜过滤所得溶液，冻干即得最终产物。

将上述载体溶于原子级水中得到不同浓度的载体溶液，并用0.22μm滤器过滤除菌。为制备复合比为25∶1的载体/pDNA复合物溶液，将一定浓度的载体溶液加入到等体积的质粒(pGL3)DNA溶液中，20-37℃复合30分钟。将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞不含血清的培基中，转染4小时后将培养基换为包含血清的培养基后继续培养48小时后裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为1.41×10⁷RLU/mg protein。