检测人前列腺癌中17β一羟基类固醇脱氢酶7表达量的试剂盒

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测人前列腺癌样本中17β一羟基类固醇脱氢酶7(17β-HSD7)mRNA表达量的实时荧光定量PCR试剂盒。本试剂盒含有2×逆转录反应液，20×逆转录酶，焦碳酸乙二酯处理的水，2×聚合酶链反应液，20×检测用引物、荧光探针，标准品。本发明建立了利用Taqman技术检测17β-HSD7表达的方法，并经检测实践表明，本发明试剂盒及检测方法切实可行。由于本方法采用了PCR扩增技术，使得17β-HSD7表达的检测敏感性大大提高，可以在极少的标本中获得足够的信息，由于荧光探针的应用使得特异性也大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种检测人前列腺癌样本中17β一羟基类固醇脱氢酶7(17β-HSD7)mRNA表达量的实时荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一。根据资料显示，前列腺癌发病率和病死率存在明显的地区差异，美国、北欧、西欧和澳洲是前列腺癌的高发地区，而亚洲和北非是相对低发地区。但前列腺癌低发地区从20世纪70年代起发病率也有大幅度上升的趋势.。过去，我国前列腺癌发病率较低，但随着人均寿命的延长、膳食结构的改变及诊断技术的进步，其发病率在逐年提高，已跃居为男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的第三位。

临床目前的诊断技术主要有前列腺的肿瘤标志物、直肠指检(DRE)、影像学检查和前列腺穿刺活检等。目前前列腺特异性抗原(PSA)作为一种无创简便的检测手段已被广泛应用于前列腺癌的诊治。然而一个理想的前列腺癌肿瘤标志物应具有前列腺特异性、能够早期诊断肿瘤并能够同良性前列腺增生症相鉴别、便于检测和随访等特点。显然这些并不是PSA就能够全部满足的，因此，寻找更多的肿瘤标志物，对于前列腺癌的早期诊断和治疗有重要意义。

人17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD7)是一个膜相关还原酶，它是催化低生物活性的雌酮生成为与高生物活性的雌二醇的关键酶之一，并能转化双氢睾酮为5α-雄烷-3β，17β-二元醇，其催化还原的部位为底物17位点或3位点的酮基团。17β-HSD7对黄体酮和20a一羟基孕酮次要的3β-HSD样活性也被检测到。人17β-HSD7存在于生成类固醇的组织和一些周缘组织，象肝、肺和胸腺，除了性激素外17β-HSD7也有其它的底物，在胆固醇的生物合成中，17β-HSD7起酮类固醇还原酶作用。将酵母甾酮转化为酵母甾醇。

17β-HSD7作为性激素代谢的关键酶之一与前列腺癌的发生与发展有着密切的关系，其表达量在在前列腺癌的病程中呈现规律的变化，因此检测17β-HSD7的表达量对于前列腺癌的早期诊断，治疗，预后评估都有着潜在的价值。

传统的基因检测技术主要运用聚合酶链反应(PCR)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法大量扩增待测基因，然后通过溴化乙锭染色和琼脂糖凝胶电泳定量待测基因。以上方法有着极高的高灵敏度，但基于PCR反应的特点，反应终点的产物量往往无法正确反映反应初始阶段DNA的含量，因此定量不够精确，同时其检测的分辨率也不高，DNA的量的差异如果低于五倍，往往检测不出。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测人前列腺癌样本中17β一羟基类固醇脱氢酶7(17β-HSD7)mRNA表达量的实时荧光定量PCR试剂盒。

本发明的试剂盒包含：2×逆转录反应液，20×逆转录酶，DEPC-H2O，2×PCR反应液，20×检测用引物、荧光探针，标准品。

其中2×逆转录反应液含有RT缓冲液、DEPC-H2O、Oligo(dT)、dNTPs、Rnasin。

其中2×PCR反应含有PCR缓冲液，MgCl₂，dNTPs，Taq酶。

所述的检测用引物包括：

17β-HSD7上游引物序列：5′-GCGAAGATGCGAAAGGTGG-3′

17β-HSD7下游引物序列：5′-CATGTTCCTGCACGCCAAAC-3′

GAPDH上游引物序列：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′

GAPDH下游引物序列：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′

所述的荧光探针包括：

17β-HSD7荧光探针：5′-FAM-GAAAGGTGGTTTTGATCACCG-TAMRA-3′

GAPDH荧光探针：5′-FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA-3′

本发明中，2×逆转录反应液，2×PCR反应液，DEPC-H2O保存于4℃；

20×逆转录酶，20×检测用引物、荧光探针保存于-20℃。

标准品为人前列腺癌细胞系LNCaP的cDNA。

本发明试剂盒具有如下特点：

近年来不断完善的实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信号的积累监控整个PCR的进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA精确定量。由于只对指数期反应的产物进行检测和荧光基团的信号放大作用，它克服了传统PCR的定量不精确，分辨率低的缺点。

本发明建立了利用Taqman技术检测17β-HSD7表达的方法，并经检测患者表明该方法切实可行。由于本方法采用了PCR扩增技术，使得17β-HSD7表达的检测敏感性大大提高，使得临床实践中可以在极少的标本中获得足够的信息，而且由于荧光探针的应用使得特异性也大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率。

本方法所设计的引物、探针以及检测结果可以为荧光定量PCR检测试剂盒的开发提供可靠的依据。

在本发明中，采用了目前特异性最高的的荧光探针杂交定量PCR检测技术，在保持高敏感性的前提下能尽量减少假阳性干扰。在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的无法精确定量，都是通过PCR产物电泳，再将电泳结果进行计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物的量，即使PCR条件以最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定因素仍会给结果分析带来影响。实时荧光定量PCR技术的出现，临床检验中可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。

本发明试剂盒使用方法如下：

每次检测应设立阳性和阴性对照。标准品可做阳性对照，也可使用自行制备的前列腺癌DNA样本，阴性对照用DEPC-H2O即可。

逆转录：总体积20μl，其中2μl待测RNA，10μl 2×逆转录反应液，1μl 20×逆转录酶，7μl DEPC-H2O。25℃10分钟，37℃120分钟。

扩增：在荧光定量PCR以上进行，总体积为10μl，其中2μl检测样品，5μl 2×PCR反应液，0.5μl 20×检测用引物、荧光探针，2.5μl DEPC-H2O。反应条件：95℃10分钟变性，95℃15秒、60℃1分钟进行40个循环。

附图说明

图1是HSD17B7标准曲线。

图2是GAPDH标准曲线。

具体实施方式

本发明结合具体实施例做进一步说明。应理解，实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1

荧光定量RT-PCR检测人前列腺癌样本中17β-HSD7的表达量

一、实验材料

Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；MMLV逆转录酶，Taq DNA聚合酶，OligodT购自美国Promega公司；7900HT荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

二、引物及探针设计与合成：

以17β-HSD7，GAPDH全长cDNA序列为模板，使用Primer Express^TM 2.0软件分析TaqMan引物和探针位点，选取最佳组合。

检测用引物：

17β-HSD7上游引物序列：5′-GCGAAGATGCGAAAGGTGG-3′

17β-HSD7下游引物序列：5′-CATGTTCCTGCACGCCAAAC-3′

GAPDH上游引物序列：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′

GAPDH下游引物序列：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′

荧光探针：

17β-HSD7荧光探针：5′-FAM-GAAAGGTGGTTTTGATCACCG-TAMRA-3′

GAPDH荧光探针：5′-FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA-3′

均由Invitrogen公司合成。

三、标准曲线的绘制：

取标准品按十倍梯度进行稀释，浓度依次为5000ng/μl，500ng/μl，50ng/μl，5ng/μl，0.5ng/μl，各取2μl，在10μl总反应体积内用7900HT荧光定量PCR仪进行扩增检测，反应条件为95℃10分钟变性，95℃15秒、60℃1分钟进行40个循环。通过检测得到的Ct值绘制标准曲线。

四、样本检测：

采集10例前列腺癌患者的癌组织待测样本和1例健康男性的前列腺样本，用Trizol试剂提取细胞总RNA，取2μlRNA在20μl反应体积内用OligodT进行逆转录，之后分别用17β-HSD7和GAPDH的引物，荧光探针在7900HT荧光定量PCR仪进行扩增检测，反应条件为95℃10分钟变性，95℃15秒、60℃1分钟进行40个循环。得到每个样本针对17β-HSD7和GAPDH的Ct值。

五、样品检测结果：

检测结果用待测样本和健康样本的比值(Ratio)表示，计算公式如下：

Ratio＝2-ΔΔCt＝2(Ct，h-Ct，g)control-(Ct，h-Ct，g)test

其中(Ct，h-Ct，g)control表示健康组样本17β-HSD7 Ct值与GAPDH Ct的差值；(Ct，h-Ct，g)test表示待测样本17β-HSD7 Ct值与GAPDH Ct的差值，Ct，h表示17β-HSD7 Ct值，Ct，g表示GAPDH基因Ct值。

检测结果显示，本方法可以真正地做到对PCR模板的精确定量，该定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且被检测基因的特异性明显提高。

表1为检测结果。

表1

  待测样本号  Ratio  1  4.56  2  4.21  3  2.63  4  4.21  5  4.21  6  5.26  7  3.86  8  4.9  9  3.68  10  5.08

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。