带有控制免疫原性融合基因的脊椎动物和杆状病毒双重启动子的杆状病毒载体

摘要

本发明提供了新的转化载体和重组杆状病毒，它们的产生方法，以及含有重组杆状病毒作为活性成分的药物，可用作传染性疾病例如疟疾和流感的预防或治疗药物。更具体来说，本发明提供了能够在双重启动子控制下表达与病毒基因融合的外源基因的重组转化载体，重组杆状病毒，它们的产生方法，以及含有重组杆状病毒作为活性成分的药物。

说明书

技术领域

本发明提供了新的转化载体，通过转化载体与杆状病毒DNA同源重组获得的重组杆状病毒，及其产生方法。

本发明还提供了含有重组杆状病毒作为活性成分的药物(例如疫苗，用于传染性疾病例如疟疾和流感的预防性或治疗性药物)。

背景技术

杆状病毒已经在使用昆虫细胞工业化生产所需蛋白的方法中用作载体。近年来，已经发现杆状病毒不仅能够将外源基因导入昆虫细胞，而且能够导入哺乳动物细胞，并且已经发现它们用作载体导入治疗性基因的可能性。专利文献1公开了含有多个独立的启动子的重组杆状病毒表达载体，所述多个独立的启动子包括源自于杆状病毒早期基因、具有包含了病毒的非结构蛋白编码基因的DNA区的启动子，以及源自于杆状病毒晚期基因、具有包含了病毒的结构蛋白编码基因的DNA区的启动子。

专利文献2公开了一种方法，包括将非哺乳动物DNA病毒载体导入哺乳动物细胞，所述载体含有多个受控表达与启动子相连的所需外源基因的独立启动子；以及在所述哺乳动物细胞中表达外源基因。

此外，专利文献3公开了使用杆状病毒通过基因重组技术生产蛋白的方法。方法包括表达通过将杆状病毒的gp64基因与编码所需蛋白的基因相连而获得的融合基因，以与病毒粒子融合的形式产生所需蛋白，收集与所需蛋白融合的病毒粒子，以及从病毒粒子上切下所需蛋白以收集蛋白。

在杆状病毒表达系统方面，专利文献4公开了具有多个独立启动子的重组杆状病毒表达载体，其含有第一个编码检测标记物的核酸序列，该序列以能够发挥功能的方式，与在宿主细胞中有活性而在非容许细胞中无活性的第一个启动子相连，以及第二个含有外源核酸序列的核酸序列，该序列以能够发挥功能的方式，与在非容许细胞中有活性的第二个启动子相连。

专利文献5公开了与源自于鸡β肌动蛋白的CAG启动子相连的、表达流感病毒血细胞凝集素(HA)抗原的重组杆状病毒载体，具有流感病毒感染预防效果，因此可用作疫苗制剂。

专利文献6公开了产生杆状病毒载体的方法，包括将含有其上分别已经连接有可以在细胞表面上表达的蛋白的编码基因的杆状病毒启动子和哺乳动物细胞来源的启动子的质粒，或含有两个其上已经连接有可以在细胞表面上表达的蛋白的编码基因的杆状病毒启动子的质粒，共转染到昆虫细胞中的步骤。

专利文献7描述了对在CAG启动子中整合有流感病毒HA的cDNA的重组杆状病毒的抗流感病毒活性，即对抗流感病毒感染活性进行的研究，并公开了不仅重组杆状病毒，而且野生型杆状病毒也具有抗流感病毒活性。

如上所示，近年来，已经开发了多种重组杆状病毒载体，并进行了许多尝试以开发用于哺乳动物的含有这样的重组杆状病毒载体作为活性成分的药物。

在该技术领域中，需要开发含有新的重组杆状病毒作为活性成分的药物制剂、特别是疫苗制剂，所述新的重组杆状病毒是具有新的结构的重组杆状病毒载体，能够有效对抗疟疾、流感、结核等传染疾病，或例如癌症这样的疾病。

专利文献1：日本专利No.3366328，多启动子杆状病毒表达系统以及缺陷的颗粒产物(Multiple Promoter Baculovirus Expression Systemand Defect Particle Products)。

专利文献2：WO98/011243，具有修饰的外壳蛋白的非哺乳动物DNA病毒(Non-mammalian DNA Virus Having Modified CoatingProtein)。

专利文献3：JP No.2002-235236-A，生产蛋白的方法(Methods ofProducing Proteins)。

专利文献4：JP No.2003-284557-A，新的杆状病毒转染载体和用于表达外源基因的重组杆状病毒(Novel Baculovirus-TransfectingVector and Recombinant Baculovirus for Expression of Foreign Gene)。

专利文献5：WO02/062381，杆状病毒载体疫苗(Baculovirus VectorVaccine)。

专利文献6：WO04/029259，杆状病毒载体、生产杆状病毒载体的方法以及导入基因的方法(Baculovirus Vector，Method of ProducingBaculovirus Vector，and Method of Introducing Gene)。

专利文献7：JP No.2005-15346-A，含有杆状病毒的抗病毒剂(B aculovirus-containing Anti-viral Agent)。

附图说明

图1显示了实施例3中从本发明的重组杆状病毒表达的疫苗抗原的试验结果。

通过gp64单克隆抗体(AcV5)检测。

第1道：AcNPV-WT

第2道：AcNPV-CAP-PfCSP

第3道：AcNPV-CAP-HA1/Anhui

第4道：AcNPV-CAP-HA1/Vietnam

图2(A)显示了Western印迹分析，显示了人类疟疾CSP基因(PfCSP)在从重组转化载体产生的重组杆状病毒的病毒粒子中的表达。

通过抗PfCSP单克隆抗体(2A10)检测。

第1道：AcNPV-CAP-PfCSP

第2道：AcNPV-CAP-PfCSP/272

第3道：AcNPV-CAP-PfC SP/467

图2(B)显示了Western印迹分析，显示了H5N1/HA1基因在从重组转化载体产生的重组杆状病毒的病毒粒子中的表达。

通过H5N1/Vietnam兔多克隆抗体(IT-003-005)检测。

第1道：AcNPV-WT(细胞裂解液)

第2道：AcNPV-CAP-HA1/Anhui(细胞裂解液)

第3道：AcNPV-CAP-HA1/Vietnam(细胞裂解液)

第4道：AcNPV-WT(病毒粒子)

第5道：AcNPV-CAP-HA1/Vietnam(病毒粒子)

第6道：纯化的H5N1/Anhui抗原(IT-003-0053p)

图3显示了用荧光标记抗体染色的HepG2细胞，显示出在HepG2细胞中抗原已经被含有PfMSP1基因和PfCSP基因的融合基因的重组杆状病毒表达。图3(A)的结果证实了PfCSP抗原已被表达。图3(B)的结果证实了PfMSP-1₁₉抗原已被表达。

图4显示了在实施例6中获得的抗体滴度的测量结果。

图5显示了本发明的转化载体。

发明内容

本发明待解决的问题

本发明的目的是提供新的重组转化载体，通过重组转化载体与杆状病毒DNA的同源重组获得的重组杆状病毒，及其产生方法。本发明的另一个目的是提供含有重组杆状病毒作为活性成分的药物制备物，特别是疫苗制剂。

解决问题的手段

本发明人发现了一种具有新的结构的转化载体，能够在昆虫细胞和脊椎动物(特别是哺乳动物和禽类)细胞中表达具有所需免疫原性的蛋白或其部分蛋白与病毒结构蛋白的融合蛋白；以及通过转化载体与杆状病毒DNA的同源重组获得的重组杆状病毒。使用获得的重组杆状病毒，本发明人对含有重组杆状病毒作为活性成分的具有传染病预防和治疗效力的药物，进行了深入研究。结果，本发明人发现获得的重组杆状病毒具有所需的药物效力。

因此，本发明的发明人发现了具有新的结构的重组转化载体，通过转化载体与杆状病毒DNA的同源重组获得的重组杆状病毒，及其产生方法，并确定了重组杆状病毒本身可用作能够在靶细胞中表达具有所需免疫原性的蛋白的药物，并且可用作预防传染病例如疟疾和流感的药物。根据这些发现，本发明得以完成。

本发明提供了在下面的第1到22项显示的发明：

项1.转化载体，其是下述的任一种：pCAP-PfCSP，pCAP-PfCSP/272，pCAP-PfCSP/467，pCAP-PfCSP(A361E)，pCAP-PfCSP(A361E)/272，pCAP-PfCSP(A361E)/467，pCAP-PfCSP-76，pCAP-PfCSP-76/467，pCAP-PfCSP+209，pCAP-PfCSP+209/467，pCAP-PfCSP+76/209，pCAP-PfCSP+76/209/467，pCAP-HA1/Anhui，pCAP-HA1/Anhui/272，pCAP-HA1/Anhui/467，pCAP-HA1/Vietnam，pCAP-HA1/Vietnam/51，pCAP-HA1/Vietnam/101，pCAP-HA1/Vietnam/154，pCAP-HA1/Vietnam/201，pCAP-HA1/Vietnam/272，pCAP-HA1/Vietnam/467，pCAP-AH/345，pCAP-AH/345/467，pCAP-AH/410，pCAP-AH/410/467，pCAP-AH/473，pCAP-AH/473/467，pCAP-AH/520，pCAP-AH/520/467，pCAP-VN/346，pCAP-VN/346/467，pCAP-VN/410，pCAP-VN/410/467，pCAP-VN/473，pCAP-VN/473/467，pCAP-VN/520，pCAP-VN/520/467，pCAP-CO/full，pCAP-CO/full/467，pCAP-CO/19，pCAP-CO/19/467，pCAP-CO/76，pCAP-CO/76/467，pCAP-CO/205，pCAP-CO/205/467，pCA39-HA1/Anhui，pCA64-HA1/Anhui，pCA39-PfCSP(A361E)，pCA64-PfCSP(A361E)，pCAP-CO/full/VSV，pCAP-CO/19/VSV，pCAP-CO/76/VSV，pCAP-CO/205/VSV，pDual-Pfs25-PfCSP-gp64和pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64。

项2.重组杆状病毒，其是下述的任一种：AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467，AcNPV-CAP-PfCSP-76，AcNPV-CAP-PfCSP-76/467，AcNPV-CAP-PfCSP+209，AcNPV-CAP-PfCSP+209/467，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467，AcNPV-CAP-HA1/Anhui，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467，AcNPV-CAP-AH/345，AcNPV-CAP-AH/345/467，AcNPV-CAP-AH/410，AcNPV-CAP-AH/410/467，AcNPV-CAP-AH/473，AcNPV-CAP-AH/473/467，AcNPV-CAP-AH/520，AcNPV-CAP-AH/520/467，AcNPV-CAP-VN/346，AcNPV-CAP-VN/346/467，AcNPV-CAP-VN/410，AcNPV-CAP-VN/410/467，AcNPV-CAP-VN/473，AcNPV-CAP-VN/473/467，AcNPV-CAP-VN/520，AcNPV-CAP-VN/520/467，AcNPV-CAP-CO/full，AcNPV-CAP-CO/full/467，AcNPV-CAP-CO/19，AcNPV-CAP-CO/19/467，AcNPV-CAP-CO/76，AcNPV-CAP-CO/76/467，AcNPV-CAP-CO/205，AcNPV-CAP-CO/205/467，AcNPV-CA39-HA1/Anhui，AcNPV-CA64-HA1/Anhui，AcNPV-CA39-PfCSP(A361E)，AcNPV-CA64-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-CO/full/VSV，AcNPV-CAP-CO/19/VSV，AcNPV-CAP-CO/76/VSV，AcNPV-CAP-CO/205/VSV，AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64和AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64。

项3.用于传染病的组合物，其含有项2的重组杆状病毒作为活性成分。

项4.用于传染病的组合物，其含有项2的重组杆状病毒作为活性成分，该组合物通过肌肉内、呼吸或经鼻途径给药。

项5.疫苗，其含有项2的重组杆状病毒作为活性成分。

项6.疫苗，其含有项3的重组杆状病毒作为活性成分，该组合物通过肌肉内、呼吸或经鼻途径给药。

项7.用于流感病毒感染的治疗或预防药剂，其含有下述的任一种作为活性成分：AcNPV-CAP-HA1/Anhui，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467，AcNPV-CAP-AH/345，AcNPV-CAP-AH/345/467，AcNPV-CAP-AH/410，AcNPV-CAP-AH/410/467，AcNPV-CAP-AH/473，AcNPV-CAP-AH/473/467，AcNPV-CAP-AH/520，AcNPV-CAP-AH/520/467，AcNPV-CAP-VN/346，AcNPV-CAP-VN/346/467，AcNPV-CAP-VN/410，AcNPV-CAP-VN/410/467，AcNPV-CAP-VN/473，AcNPV-CAP-VN/473/467，AcNPV-CAP-VN/520，AcNPV-CAP-VN/520/467，AcNPV-CA39-HA1/Anhui和AcNPV-CA64-HA1/Anhui。

项8.项7的用于流感病毒感染的治疗或预防药剂，其通过肌肉内、呼吸或经鼻途径给药。

项9.对抗流感病毒感染的疫苗，其包含下述的任一种作为活性成分：AcNPV-CAP-HA1/Anhui，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467，AcNPV-CAP-AH/345，AcNPV-CAP-AH/345/467，AcNPV-CAP-AH/410，AcNPV-CAP-AH/410/467，AcNPV-CAP-AH/473，AcNPV-CAP-AH/473/467，AcNPV-CAP-AH/520，AcNPV-CAP-AH/520/467，AcNPV-CAP-VN/346，AcNPV-CAP-VN/346/467，AcNPV-CAP-VN/410，AcNPV-CAP-VN/410/467，AcNPV-CAP-VN/473，AcNPV-CAP-VN/473/467，AcNPV-CAP-VN/520，AcNPV-CAP-VN/520/467，AcNPV-CA39-HA1/Anhui和AcNPV-CA64-HA1/Anhui。

项10.项7的对抗流感病毒感染的疫苗，其通过肌肉内、呼吸或经鼻途径给药。

项11.用于人类疟疾感染的治疗或预防药剂，其含有下述的任一种作为活性成分：AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467，AcNPV-CAP-PfCSP-76，AcNPV-CAP-PfCSP-76/467，AcNPV-CAP-PfCSP+209，AcNPV-CAP-PfCSP+209/467，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467，AcNPV-CAP-CO/full，AcNPV-CAP-CO/full/467，AcNPV-CAP-CO/19，AcNPV-CAP-CO/19/467，AcNPV-CAP-CO/76，AcNPV-CAP-CO/76/467，AcNPV-CAP-CO/205，AcNPV-CAP-CO/205/467，AcNPV-CA39-PfCSP(A361E)，AcNPV-CA64-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-CO/full/VSV，AcNPV-CAP-CO/19/VSV，AcNPV-CAP-CO/76/VSV，AcNPV-CAP-CO/205/VSV，AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gP64和AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64。

项12.项11的用于人类疟疾感染的治疗或预防药剂，其通过肌肉内、呼吸或经鼻途径给药。

项13.用于人类疟疾感染的治疗或预防药剂，其含有下述的任一种作为活性成分：AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467，AcNPV-CAP-PfCSP-76，AcNPV-CAP-PfCSP-76/467，AcNPV-CAP-PfCSP+209，AcNPV-CAP-PfCSP+209/467，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467，AcNPV-CAP-CO/full，AcNPV-CAP-CO/full/467，AcNPV-CAP-CO/19，AcNPV-CAP-CO/19/467，AcNPV-CAP-CO/76，AcNPV-CAP-CO/76/467，AcNPV-CAP-CO/205，AcNPV-CAP-CO/205/467，AcNPV-CA39-PfCSP(A361E)，AcNPV-CA64-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-CO/full/VSV，AcNPV-CAP-CO/19/VSV，AcNPV-CAP-CO/76/VSV，AcNPV-CAP-CO/205/VSV，AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64和AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64。

项14.项13的用于人类疟疾感染的治疗或预防药剂，其通过肌肉内、呼吸或经鼻途径给药。

项15.用于预防疟疾或流感感染或用于治疗疟疾或流感的方法，其包括向对象给药有效量的项2的重组杆状病毒，项3或4的用于传染病的组合物，或项5、6、9、10、13或14的疫苗。

项16.项15的方法，其中重组杆状病毒、组合物或疫苗作为脂质体制剂给药至对象。

项17.项15的方法，其中重组杆状病毒、组合物或疫苗通过肌肉内、呼吸或经鼻途径给药至对象。

项18.项16的方法，其中重组杆状病毒、组合物或疫苗通过肌肉内、呼吸或经鼻途径给药至对象。

项19.免疫刺激的方法，其包括向对象给药有效量的项2的重组杆状病毒，项3或4的用于传染病的组合物，或项5、6、9、10、13或14的疫苗。

项20.项19的方法，其中重组杆状病毒、组合物或疫苗作为脂质体制剂给药至对象。

项21.项19的方法，其中重组杆状病毒、组合物或疫苗通过肌肉内、呼吸或经鼻途径给药至对象。

项22.项20的方法，其中重组杆状病毒、组合物或疫苗通过肌肉内、呼吸或经鼻途径给药至对象。

发明效果

根据本发明，提供了新的重组转化载体，通过重组转化载体与杆状病毒DNA的同源重组获得的重组杆状病毒，及其产生方法。含有本发明的重组杆状病毒作为活性成分的药物，可用作传染病例如疟疾和流感的治疗或预防药物，或用作细胞药物和疫苗制剂。

本发明的最佳实施方案

在本说明书中用于氨基酸、肽、碱基序列以及核酸的缩写，是根据在IUPAC-IUB生物化学命名通讯(IUPAC-IUB Communication onBiochemical Nomenclature，Eur.J.Biochem.，138：9(1984))和“包含碱基序列和氨基酸序列的说明书准备指南”(Guideline for PreparingSpecifications Including Base Sequences and Amino Acid Sequences)(专利局)中指明的缩写，以及在本技术领域中常用的缩写。在本说明书中，DNA分子可以不仅包括双链DNA，而且包括单链DNA，即构成双链DNA的正义链和反义链，并且不限于其全长。除非另外提及，编码本发明的免疫原性外源基因的多核苷酸(DNA分子)包括含有基因组DNA的双链DNA，含有cDNA的单链DNA(正义链)，具有与正义链互补的序列的单链DNA(反义链)，合成的DNA及其片段。

本文使用的多核苷酸或DNA分子不限于功能区，可以包括表达抑制区、编码区、前导序列、外显子和内含子中的至少一个。

此外，多核苷酸的例子包括RNA和DNA。含有具体氨基酸序列的多肽和含有具体DNA序列的多核苷酸，包括多核苷酸的片段、同源物、衍生物以及突变体。

多核苷酸突变体的例子，例如突变的DNA，包括天然存在的等位基因突变体，人工突变体，以及具有缺失、取代、添加和/或插入的突变体。但是，应该理解，这样的突变体编码的多肽与由原始的未突变多核苷酸编码的多肽具有基本上相同的功能。

在本发明中，转化载体是指用于产生重组杆状病毒的质粒，在其结构中，由至少一个能够作为病毒粒子成分的蛋白的编码基因，与至少一个免疫原性外源基因相连而形成的融合基因，被整合在双重启动子的下游，该双重启动子包含两个相连的启动子，即一个脊椎动物启动子(例如哺乳动物启动子或禽类启动子)和一个杆状病毒启动子。

在本发明的一个优选实施方案中，免疫原性外源基因位于双重启动子的下游，以及能够作为病毒粒子成分的蛋白的编码基因的上游。本发明的重组杆状病毒被用作脊椎动物的药物或疫苗的活性成分。脊椎动物的例子包括哺乳动物例如人类、牛、马、猪、绵羊、山羊、猴、小鼠、狗和猫。禽类的例子包括鸡、鹌鹑、鹅、野鸭、鸽子、火鸡、珍珠鸡和鹦鹉。

在一个实施方案中，本发明提供了含有新结构的转化载体，在该结构中，一个免疫原性外源基因和可以在昆虫细胞中表达的病毒膜蛋白的编码基因的融合基因整合其中，所述融合基因在双重启动子的控制之下，双重启动子包含彼此连接的一个脊椎动物启动子和一个杆状病毒启动子。将该转化载体与杆状病毒DNA共转染到昆虫细胞中，诱导了同源重组，从而产生了重组杆状病毒，其中整合有在杆状病毒启动子控制之下、在昆虫细胞中表达、可以产生能够作为芽生病毒粒子的成分的融合蛋白的融合基因。

在本发明中，当将重组杆状病毒给药于脊椎动物时，能够作为芽生病毒粒子成分的蛋白与免疫原性蛋白的融合蛋白，似乎能够发挥作为成分疫苗的作用。此外，给药于脊椎动物的重组杆状病毒进入脊椎动物细胞，在脊椎动物细胞中从病毒基因组产生了与所需免疫原性外源抗原的融合抗原，并发挥DNA疫苗的作用。

因此，例如，当本发明的重组杆状病毒给药于哺乳动物时，能够作为病毒粒子成分的蛋白与免疫原性蛋白的融合蛋白，作为抗原呈递在病毒粒子的表面上，并在哺乳动物细胞中产生能够作为病毒粒子成分的蛋白与免疫原性蛋白的融合蛋白，该融合蛋白由于其免疫增强作用，似乎可以用作传染性疾病、例如病毒、原生动物和细菌感染的预防或治疗药剂。

与转化载体共转染的杆状病毒DNA可以是野生型、突变的或重组的杆状病毒DNA。被共转染的宿主细胞的例子包括昆虫细胞，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的细胞。

在本发明中，免疫原性外源基因是指在用于预防和治疗传染病、例如疟疾和流感的免疫疗法、例如疫苗疗法中用作免疫原的抗原性蛋白的氨基酸序列的编码基因。其具体的例子包括蛋白、例如疟疾抗原和流感病毒抗原的氨基酸序列的编码基因。

本文使用的“外源”基因是指从外部引入的基因。即使细胞中存在同样的基因，从外部引入的基因也被称为“外源基因”。

在本发明中，对用作免疫原的蛋白的氨基酸序列的编码基因没有具体限制，只要该基因能够编码抗原性蛋白的氨基酸序列，该抗原性蛋白对引起疾病例如传染病的物质具有免疫原性就行。编码具有免疫原性的抗原性蛋白的氨基酸序列的基因的例子如下。

编码疟疾抗原氨基酸序列的基因的例子，包括编码下列蛋白的氨基酸序列的基因：疟原虫的子孢子表面抗原CSP(环子孢子蛋白)，裂殖子表面膜蛋白MSP1(裂殖子表面蛋白1)，由疟疾感染的红细胞分泌的疟疾S抗原，出现在疟疾感染的红细胞的结节(knobs)中的PfEMP1蛋白，SERA蛋白，TRAMP蛋白，AMA1蛋白以及类似的蛋白。

编码流感病毒抗原氨基酸序列的基因的例子，包括编码下列蛋白的氨基酸序列的基因：HA抗原(血细胞凝集素抗原)，NA抗原(神经氨酸酶抗原)，M2抗原(基质蛋白抗原)，NP抗原(核蛋白抗原)，以及类似蛋白。

在脊椎动物基因中，哺乳动物基因的例子包括编码人类、牛、马、猪、绵羊、山羊、猴、小鼠、狗和猫中传染性疾病的抗原性蛋白的氨基酸序列的基因。禽类基因的例子包括鸡、野鸭、鸽子、火鸡、珍珠鸡和鹦鹉中传染性疾病的抗原基因(例如禽流感HA抗原)。

上面提到的在哺乳动物和禽类中与传染性疾病相关的病原体基因已经被报道，可以容易地从储存登记的病原体基因公共数据的机构例如Genbank获得。

本发明可以提供具有这种免疫原性外源基因的转化载体，以及通过转化载体的同源重组获得的重组杆状病毒。此外，本发明可以提供含有具有免疫原性外源基因的重组杆状病毒作为活性成分的药物组合物，以及药物组合物的疫苗制剂。

在本发明中使用的杆状病毒是指在昆虫中引起感染的昆虫病原体病毒，是一类具有环状双链DNA基因的DNA病毒(杆状病毒科(Baculoviridae))。其中，一类被称为核型多角体病毒(NPV)的病毒，在感染的末期在受感染细胞的核中产生被称为多角体的内含体。即使插入的待表达外源基因替换了多角体基因，病毒的感染和生长仍足以发生，产生大量所需外源基因产物。因此，近年来，这种病毒已被用于生产所需蛋白。

在本发明中使用的杆状病毒的例子，包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrosis virus)AcNPV，家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrosis virus)：BmNPV，柞蚕核型多角体病毒(Orgyia pseudotsugata nucleopolyhedrosis virus)：OpNPV，以及舞毒蛾核型多角体病毒(Lymantria dispernucleopolyhedrosis virus)：LdNPV。

杆状病毒DNA可以是任何可以与本发明的转化载体同源重组的DNA。更具体来说，可以与本发明的转化载体同源重组的杆状病毒DNA的病毒基因的尺寸可以达到130kbp，其中可以插入15kbp或以上的免疫原性外源基因。因为杆状病毒基因本身几乎不在脊椎动物中表达，因此几乎不需要考虑其细胞毒性。因此，据认为，不会诱导有害的免疫应答。

(1)本发明的转化载体以及转化载体的产生

免疫原性外源基因DNA的产生

能够与作为杆状病毒转化载体的成分之一的病毒基因融合的免疫原性外源基因DNA，可以在编码具有本说明书中公开的所需免疫原性的抗原性蛋白的氨基酸序列的多核苷酸的核酸序列信息的基础上通过合成，或在免疫原性外源基因的核酸序列信息的基础上，直接合成对应于免疫原性外源基因的编码区的核酸序列的DNA(化学DNA合成方法)，来容易地获得或产生。普通的基因工程技术可用于这种产生(参见例如《分子克隆》(第二版)(Molecular Cloning 2d Ed，ColdSpring Harbor Lab.Press(1989)；Zoku Seikagaku Jikken Kouza，“Idenshi Kenkyuho I，II，III”，日本生物化学学会(JapaneseBiochemistry Society)主编，1986)。

合成DNA的方法的例子包括化学合成手段，例如磷酸三酯方法和氨基磷酸酯方法(J.Am.Chem.Soc，89，4801(1967)；同上，91，3350(1969)；Science，150，178(1968)；Tetrahedron Lett.，22，1859(1981)；同上，24，245(1983))以及它们的组合方法。DNA也可以通过亚磷酰胺方法或三酯方法化学合成，或使用商业化的自动化寡核苷酸合成仪合成。双链片段的获得可以通过合成互补链，并将互补链与化学合成的单链在适合的条件下退火，或使用DNA聚合酶，利用适合的引物序列向化学合成的单链添加互补链来进行。

在本发明中产生的免疫原性外源基因DNA的具体例子，包括含有编码疟疾抗原蛋白的氨基酸序列的DNA序列，以及编码流感病毒抗原蛋白的氨基酸序列的DNA序列的DNA。

在本发明中使用的DNA，不限于编码具有免疫原性的抗原性蛋白多肽的氨基酸序列的全长DNA序列，它可以是编码其部分序列的DNA序列，只要DNA序列编码的氨基酸序列的蛋白具有免疫原性就行。

在本发明中使用的免疫原性外源基因的DNA，不限于具有这样的具体DNA序列的DNA分子，它可以是具有通过为每个氨基酸残基适合地选择密码子而产生的DNA序列的DNA分子。密码子的选择可以按照标准方法来进行，例如通过考虑在所用宿主中的密码子使用的频率(Nucleic Acids Res.，9，43(1981))。

在本发明中使用的免疫原性外源基因的DNA可以通过基因工程技术来生产，更具体来说通过按照标准方法从表达免疫原性外源基因的DNA的适合来源制备cDNA文库，以及使用适合的探针或针对免疫原性外源基因特异性的表达产物的抗体，从文库选择所需克隆(参见例如Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，78，6613(1981)；Science，222，778(1983))。

基因组DNA来源的例子包括表达免疫原性外源基因的DNA的各种不同细胞、组织以及从其衍生的培养细胞。特别优选的是用疟原虫感染的红细胞的提取物，以及用流感病毒感染的细胞的提取物。从来源提取和分离总DNA和RNA，mRNA的分离和纯化，以及cDNA的生产和克隆，按照标准方法进行。

如上所述，免疫原性外源基因的DNA，可以通过使用每种免疫原的cDNA文库来生产，该文库从上面提到的提取物通过提取、分离和纯化免疫原性组织或细胞的mRNA而制备。免疫原性外源基因的DNA也可以通过使用噬菌体文库来生产，该文库通过提取每种免疫原的mRNA，向RNA中加入poly A，收集添加有poly A的RNA，使用反转录酶生产cDNA，向cDNA的两个末端添加限制性酶位点，以及将cDNA整合到噬菌体中来制备。

对于从cDNA文库筛选免疫原性外源基因DNA的方法没有具体的限制，可以按照常用的方法来进行。这样的方法的具体的例子包括通过使用针对由cDNA产生的蛋白的特异性抗体(例如抗疟疾抗体，抗流感病毒抗体等)进行免疫筛选来选择相应cDNA克隆的方法；使用与靶DNA序列选择性结合的探针的噬斑杂交方法；菌落杂交方法；以及它们的组合。

在这些杂交方法中使用的探针，通常是根据免疫原性外源基因的DNA序列信息化学合成的DNA片段。已经获得的免疫原性外源基因的DNA序列或其片段，也可以被有利地用作探针。根据免疫原性外源基因的DNA序列信息设计的正义引物和反义引物，也可以用作进行筛选的探针。

用作探针的DNA(核苷酸)是对应于免疫原性外源基因的DNA序列的部分DNA(核苷酸)。DNA(核苷酸)具有至少15个连续的DNA，优选至少20个连续的DNA，更优选至少30个连续的DNA序列。用于生产上面提到的DNA的阳性克隆本身，也可以用作探针。

为了获得免疫原性外源基因的DNA，优选使用通过PCR(Science，230，1350(1985))的DNA/RNA扩增方法。尤其是，当很难从文库获得全长cDNA时，优选使用RACE方法(cDNA末端的快速扩增；JikkenIgaku 12(6)，35(1994))，尤其是5′-RACE方法(M.A.Frohman等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，8，8998(1988))。

用于PCR的引物可以根据免疫原性外源基因的DNA序列信息来设计，并按照标准方法来合成。正如在下面的实施例中描述的，作为引物，也可以使用添加到载体质粒两个末端的DNA部分(SP6启动子/引物和T7终止子/引物)，其中载体质粒整合有免疫原性外源基因的DNA。

通过PCR扩增的DNA/RNA片段的分离/纯化，可以按照标准方法来进行，例如通过凝胶电泳。

这样获得的免疫原性外源基因的DNA的DNA序列或其各种不同DNA片段，可以按照标准方法来测定，例如通过双脱氧方法(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，74，5463(1977))或Maxam-Gilbert方法(Methods inEnzymology，65，499(1980))，或通过简单地使用可商购的测序试剂盒。

能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸的编码基因，可以是任何能够在靶细胞中编码可以与上面提到的免疫原性外源基因形成融合蛋白的蛋白，并且在昆虫细胞中可以表达成能够作为病毒粒子的成分的蛋白的基因。

能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸的编码基因的例子，包括gp64蛋白的基因(GenBank登记号L22858)，水泡性口膜炎病毒糖蛋白G的基因(VSVG：GenBank登记号J02428)，单纯性疱疹病毒糖蛋白的基因(KOS：GenBank登记号K01760)，人类I型免疫缺陷病毒gp120的基因(GenBank登记号U47783)，人类呼吸道合胞病毒膜糖蛋白的基因(GenBank登记号M86651)，甲型流感病毒血细胞凝集素蛋白的基因(GenBank登记号U38242)，以及与杆状病毒密切相关的病毒的包膜蛋白的基因。在本发明中，可以优选使用在下面的实施例中描述的gp64基因。

能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸的编码基因的DNA，可以在编码多肽的氨基酸序列的多核苷酸的核酸序列信息的基础上，经合成编码能够作为病毒粒子成分的靶蛋白的氨基酸的基因，来容易地获得或产生；或在编码能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸的基因的氨基酸序列信息的基础上，直接合成对应于编码氨基酸序列的核苷酸序列的DNA(DNA化学合成)，与在生产免疫原性外源基因的DNA的情况相同。

对应于编码能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸的核酸序列的DNA序列，不限于全长的编码区，可以是含有其部分DNA序列的DNA。

与在生产免疫原性外源基因的DNA分子的情况下相同，能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸的编码基因的DNA，可以通过普通的基因工程技术来生产(参见例如《分子克隆》(第二版)(MolecularCloning 2d Ed，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989))；Zoku SeikagakuJikken Kouza，“Idenshi Kenkyuho I，II，III”，日本生物化学学会(Japanese Biochemistry Society)主编，1986)。

在本发明中，也可以使用可商购的载体质粒，其中已经整合了下文所述控制免疫原性外源基因表达的启动子的一部分，并且已经导入了能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸的(部分)编码基因。

脊椎动物启动子

在本发明中用作转移载体的成分之一的脊椎动物启动子(能够在脊椎动物细胞中发挥作用的启动子)的例子，包括哺乳动物启动子和禽类启动子。

哺乳动物启动子

在本发明中用作转移载体的成分之一的哺乳动物启动子(能够在哺乳动物细胞中发挥作用的启动子)的例子，包括细胞肥大病毒启动子、SV40启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白启动子、CAG启动子、延伸因子1α启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、白蛋白启动子和MHC启动子。

禽类启动子

禽类启动子的例子包括β-肌动蛋白启动子、热休克蛋白启动子、延伸因子启动子、泛素启动子和白蛋白启动子。

杆状病毒启动子

在本发明中作为杆状病毒转移载体的成分之一的杆状病毒启动子的例子，包括多角体启动子、p10启动子、ie1启动子、p35启动子、vp39启动子和gp64启动子。

重组转化载体的产生

本发明涉及了新的转化载体，具有能够在昆虫细胞和脊椎动物细胞、特别是哺乳动物细胞二者中，将所需免疫原性外源基因表达成抗原性蛋白的结构。在本发明中产生的新的转化载体的结构中，编码所需免疫原性蛋白的氨基酸序列的DNA序列，与编码能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸序列的DNA序列，被连接到相连的启动子的下游，该相连的启动子包含一个脊椎动物启动子、特别是哺乳动物启动子，以及一个杆状病毒启动子。含有两个启动子、即一个脊椎动物启动子、特别是哺乳动物启动子，以及一个杆状病毒启动子的DNA序列的DNA区，可以彼此直接相连，或在两个启动子的DNA序列之间可以存在间插的DNA序列(但是，要求两个启动子在昆虫细胞和脊椎动物细胞、特别是哺乳动物细胞中具有启动子活性)。在启动子区的结构中，彼此相连的脊椎动物启动子、特别是哺乳动物启动子和杆状病毒启动子中的任何一个，可以被放置在更接近待表达的基因。在后文描述的实施例中，杆状病毒启动子被放置在比哺乳动物启动子离待表达基因更近。

在上面的结构中，能够作为病毒粒子成分的蛋白的编码基因与所需免疫原性外源基因的融合基因的DNA序列，可以是这样的结构，即这两个基因彼此直接相连，或在基因之间存在间插的DNA序列(但是，要求必需不引起下游基因和上游基因的移码)。优选情况下，具有所需免疫原性的外源基因的蛋白的抗原呈递结构域，与能够作为病毒粒子成分的蛋白融合。因此，具有所需免疫原性的外源基因的蛋白，将不会从能够作为病毒粒子成分的蛋白上切下，而是将以与其融合的形式使用。

含有这两个基因的融合基因可以事先制备，然后整合到载体中。或者，可以先将一个基因整合到载体中，然后将另一个基因整合到载体中，在载体中形成融合基因。

为了生产这样的转化载体，可以使用已经具备本发明的转化载体的某些必需成分的可商购表达载体，这些成分即含有脊椎动物启动子、特别是哺乳动物启动子、和杆状病毒启动子的启动子区，以及编码能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸序列的基因区，所需成分的插入，可以通过任选地用限制性酶切开这种可商购表达载体，整合其他启动子，以便将具有所需免疫原性的外源基因和能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸序列的编码基因的融合DNA序列插入到载体的克隆区中，或通过将具有所需免疫原性的外源基因，插入到已经整合在质粒中的能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸序列的编码基因的DNA区的N末端侧。

在本发明中，具有能够在昆虫细胞和脊椎动物细胞，尤其是哺乳动物细胞，两者中将具有所需免疫原性的外源蛋白表达为抗原性蛋白的结构的质粒载体，可以通过使用已经具有其部分结构的可商购质粒来产生。可以插入用于在脊椎动物中通过酶切开融合蛋白的肽的氨基酸序列。在本发明的转化载体中，用于增加在脊椎动物细胞、特别是哺乳动物细胞中的转录活性的增强子，可以置于两个启动子的上游，或者编码用于促进被表达的蛋白从宿主细胞进行细胞外分泌的信号肽的氨基酸序列的DNA序列，可以与被融合和表达的基因结合。为了终止转录，可以将在脊椎动物细胞中有效的脊椎动物终止子区，例如兔β-球蛋白终止子，置于被融合和表达的基因的下游。

由此，产生了能够表达融合基因的转化载体，该融合基因是能够在杆状病毒粒子中表现出所需免疫原性的免疫原性外源基因，与能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸序列的编码基因的融合基因。

本发明的转化载体的具体例子以及用于产生它们的方法，显示在后面描述的实施例中。更具体来说，在转化载体的结构中，作为脊椎动物启动子、特别是哺乳动物启动子的从细胞肥大病毒(CMV)启动子修饰的CAG启动子，与作为杆状病毒启动子的多角体(polh)启动子、vp39启动子或gp64启动子彼此相连，并插入了作为外源基因的流感病毒抗原基因或疟疾抗原基因与作为能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸序列的编码基因的gp64抗原基因的融合的DNA序列，这样的转化载体可以提到的例子是pCAP-PfCSP，pCAP-PfCSP/272，pCAP-PfCSP/467，pCAP-PfCSP(A361E)，pCAP-PfCSP(A361E)/272，pCAP-PfCSP(A361E)/467，pCAP-PfCSP-76，pCAP-PfCSP-76/467，pCAP-PfCSP+209，pCAP-PfCSP+209/467，pCAP-PfCSP+76/209，pCAP-PfCSP+76/209/467，pCAP-HA1/Anhui，pCAP-HA1/Anhui/272，pCAP-HA1/Anhui/467，pCAP-HA1/Vietnam，pCAP-HA1/Vietnam/51，pCAP-HA1/Vietnam/101，pCAP-HA1/Vietnam/154，pCAP-HA1/Vietnam/201，pCAP-HA1/Vietnam/272，pCAP-HA1/Vietnam/467，pCAP-AH/345，pCAP-AH/345/467，pCAP-AH/410，pCAP-AH/410/467，pCAP-AH/473，pCAP-AH/473/467，pCAP-AH/520，pCAP-AH/520/467，pCAP-VN/346，pCAP-VN/346/467，pCAP-VN/410，pCAP-VN/410/467，pCAP-VN/473，pCAP-VN/473/467，pCAP-VN/520，pCAP-VN/520/467，pCAP-CO/full，pCAP-CO/full/467，pCAP-CO/19，pCAP-CO/19/467，pCAP-CO/76，pCAP-CO/76/467，pCAP-CO/205，pCAP-CO/205/467，pCA39-HA1/Anhui，pCA64-HA1/Anhui，pCA39-PfCSP(A361E)，pCA64-PfCSP(A361E)，pCAP-CO/full/VSV，pCAP-CO/19/VSV，pCAP-CO/76/VSV，pCAP-CO/205/VSV，pDual-Pfs25-PfCSP-gp64和pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64。

(2)重组杆状病毒的产生

本发明提供了用于产生重组杆状病毒的方法，包括产生转化载体的步骤，在该转化载体的结构中，含有至少一个能够作为病毒粒子成分的蛋白的编码基因与至少一个免疫原性外源基因的融合基因，被整合到双重启动子的下游，双重启动子包含两个相连的启动子，即一个脊椎动物启动子和一个杆状病毒启动子，以及将转化载体和杆状病毒DNA共转染到宿主细胞中和分离重组杆状病毒的步骤。

在上述产生重组杆状病毒的过程中，对于将所需重组DNA(转化载体)导入宿主细胞的方法及其转化方法，没有具体限制。可以使用本技术领域熟知和常用的各种不同方法。例如，通用的遗传重组技术(例如Science，224，1431(1984)；Biochem.Biophys.Res.Comm.，130，692(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，5990(1983))可用于制备重组杆状病毒。重组DNA(转化载体)可以参考Ohno等“Tanpaku Jikken方法1：功能分析”(Tanpaku Jikken Protocol 1Functional Analysis，Saibo Kogaku Bessatsu，Jikken Protocol Series，1997，Shujun-sha)进行表达和生产。用于操作昆虫细胞、基因重组和共转染的通用方法，可以与在昆虫细胞中生产重组病毒的众所周知的方法相同(《杆状病毒表达载体：实验指南》，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：ALABORATORY MANUAL，Oxford University Press，1994)。

得到的重组杆状病毒可以按照标准方法进行培养。通过培养杆状病毒，本发明的具有所需免疫原性的外源基因的DNA与编码能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸序列的DNA的融合产物(表达产物)，表达和生产(积累和分泌)在昆虫细胞内部、外部或细胞膜上。

对于培养所用的培养基来说，可以根据使用的宿主细胞选择使用各种不同的常用培养基。培养可以在适合于宿主细胞生长的条件下进行。

更具体来说，生产重组杆状病毒的方法包括制备用于与上述产生的转化载体进行同源重组的杆状病毒DNA的步骤，以及将转化载体和杆状病毒DNA共转染到作为宿主细胞的昆虫细胞中的步骤，昆虫细胞例如源自于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9细胞和Sf21细胞，以及源自于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的Tn5细胞(High Five细胞)。

这样产生的将与转化载体进行同源重组的杆状病毒DNA，可以是野生型、突变的或重组的杆状病毒DNA。杆状病毒DNA可以增加它与本发明的转化载体同源重组的可能性，只要它具有与源自于杆状病毒的DNA同源的DNA结构就行，该源自于杆状病毒的DNA含有双重启动子区的DNA，和通过免疫原性外源基因和能够作为病毒粒子成分的蛋白的编码基因的融合获得的融合基因的DNA。

为了诱导同源重组，转化载体与杆状病毒DNA的重量混合比优选为大约1∶1到大约10∶1。

在同时导入到昆虫细胞中的共转染步骤之后，对细胞进行培养，从培养上清液获得病毒噬斑，然后悬浮在培养基中。通过振荡将病毒从琼脂上洗脱并离心，产生含有重组病毒的溶液。

在上述过程中，可以使用可商购的产品作为杆状病毒DNA。例如，可以使用BacVector-1000DNA和BacVector-2000DNA(由Novagen供应)，其中已经从AcNPV中移除了多角体基因。

用于同源重组的获得的转化载体和杆状病毒DNA向昆虫细胞中的共转染，可以使用上述可商购的载体转染试剂盒(BacVector转染试剂盒，由Novagen供应)，按照与载体转染试剂盒一起包装的说明书来进行。因此，获得的转化载体可以与杆状病毒DNA一起共转染到昆虫细胞例如Sf9细胞中，以产生重组杆状病毒。

在本发明中，按照上述的生产重组杆状病毒的方法，下述的任一种转化载体：pCAP-PfCSP，pCAP-PfCSP/272，pCAP-PfCSP/467，pCAP-PfCSP(A361E)，pCAP-PfCSP(A361E)/272，pCAP-PfCSP(A361E)/467，pCAP-PfCSP-76，pCAP-PfCSP-76/467，pCAP-PfCSP+209，pCAP-PfCSP+209/467，pCAP-PfCSP+76/209，pCAP-PfCSP+76/209/467，pCAP-HA1/Anhui，pCAP-HA1/Anhui/272，pCAP-HA1/Anhui/467，pCAP-HA1/Vietnam，pCAP-HA1/Vietnam/51，pCAP-HA1/Vietnam/101，pCAP-HA1/Vietnam/154，pCAP-HA1/Vietnam/201，pCAP-HA1/Vietnam/272，pCAP-HA1/Vietnam/467，pCAP-AH/345，pCAP-AH/345/467，pCAP-AH/410，pCAP-AH/410/467，pCAP-AH/473，pCAP-AH/473/467，pCAP-AH/520，pCAP-AH/520/467，pCAP-VN/346，pCAP-VN/346/467，pCAP-VN/410，pCAP-VN/410/467，pCAP-VN/473，pCAP-VN/473/467，pCAP-VN/520，pCAP-VN/520/467，pCAP-CO/full，pCAP-CO/full/467，pCAP-CO/19，pCAP-CO/19/467，pCAP-CO/76，pCAP-CO/76/467，pCAP-CO/205，pCAP-CO/205/467，pCA39-HA1/Anhui，pCA64-HA1/Anhui，pCA39-PfCSP(A361E)，pCA64-PfCSP(A361E)，pCAP-CO/full/VSV，pCAP-CO/19/VSV，pCAP-CO/76/VSV，pCAP-CO/205/VSV，pDual-Pfs25-PfCSP-gp64和pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64，与杆状病毒DNA可以共转染到Sf9昆虫细胞中，产生下述的任一种重组杆状病毒：AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467，AcNPV-CAP-PfCSP-76，AcNPV-CAP-PfCSP-76/467，AcNPV-CAP-PfCSP+209，AcNPV-CAP-PfCSP+209/467，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467，AcNPV-CAP-HA1/Anhui，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467，AcNPV-CAP-AH/345，AcNPV-CAP-AH/345/467，AcNPV-CAP-AH/410，AcNPV-CAP-AH/410/467，AcNPV-CAP-AH/473，AcNPV-CAP-AH/473/467，AcNPV-CAP-AH/520，AcNPV-CAP-AH/520/467，AcNPV-CAP-VN/346，AcNPV-CAP-VN/346/467，AcNPV-CAP-VN/410，AcNPV-CAP-VN/410/467，AcNPV-CAP-VN/473，AcNPV-CAP-VN/473/467，AcNPV-CAP-VN/520，AcNPV-CAP-VN/520/467，AcNPV-CAP-CO/full，AcNPV-CAP-CO/full/467，AcNPV-CAP-CO/19，AcNPV-CAP-CO/19/467，AcNPV-CAP-CO/76，AcNPV-CAP-CO/76/467，AcNPV-CAP-CO/205，AcNPV-CAP-CO/205/467，AcNPV-CA39-HA1/Anhui，AcNPV-CA64-HA1/Anhui，AcNPV-CA39-PfCSP(A361E)，AcNPV-CA64-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-CO/full/VSV，AcNPV-CAP-CO/19/VSV，AcNPV-CAP-CO/76/VSV，AcNPV-CAP-CO/205/VSV，AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64和AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64。

除了上述的生产重组杆状病毒的方法之外，其他用于生产重组杆状病毒的方法，包括例如使用转座子作为噬粒(杆状病毒质粒)的方法，该噬粒中整合有完整的杆状病毒基因组，能够有效地将外源基因插入大肠杆菌(Escherichia coli)。

按照本方法，从细菌细胞提取带有病毒基因的杆状病毒质粒，并转染到昆虫细胞中，由此容易地生产和收集重组杆状病毒。

通过上述的生产重组杆状病毒的方法获得的本发明的重组杆状病毒的纯化，可以使用已知的病毒纯化方法来进行。

为了纯化重组杆状病毒，将例如0.5到1.0mL通过上述生产重组杆状病毒的方法获得的病毒储液接种到昆虫细胞(1x 10⁷个细胞/10cm平皿)例如Sf9细胞中，在感染几天后收集培养上清液，将通过离心获得的病毒沉淀悬浮在缓冲液例如PBS中。对获得的悬浮液施加10到60％的蔗糖梯度，然后离心(25,000rpm，60分钟，4℃)收集病毒区带。将收集的病毒进一步悬浮在PBS中，然后离心(在与上述相同的条件下进行)，将得到的纯化的重组病毒沉淀，在4℃下储存在缓冲液例如PBS中。

上面获得的纯化的重组病毒的感染性滴度，可以使用昆虫细胞例如Sf9细胞通过噬斑分析来测量(《杆状病毒表达载体：实验指南》，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORYMANUAL，Oxford University Press，1994)。

在实施例中描述的重组病毒中，杆状病毒蛋白gp64的N末端暴露在病毒粒子外部，而其C末端在粒子内部。因此，如果具有所需免疫原性的外源基因编码的蛋白与gp64的N-末端融合，其整体将作为病毒粒子的成分暴露在昆虫细胞中病毒蛋白粒子的外部，因此抗原更容易呈递，适合用作本发明的疫苗制剂。

(3)本发明的药物组合物(含有本发明的重组杆状病毒作为活性成分的药物)

作为本发明的药物组合物的活性成分的本发明的重组杆状病毒，可以通过在上面的(2)中显示的遗传工程技术获得。

本发明的药物组合物必需含有通过杆状病毒DNA和转化载体的同源重组获得的重组杆状病毒作为活性成分，该转化载体被构造成使得通过本发明的免疫原性外源基因与能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸序列的编码基因的融合而获得的融合基因，可以在昆虫细胞和脊椎动物细胞、特别是哺乳动物细胞、包括人类细胞中表达。

尤其是，本发明提供了含有特定重组杆状病毒作为活性成分的药物组合物，该重组杆状病毒是下列任一种：AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467，AcNPV-CAP-PfCSP-76，AcNPV-CAP-PfCSP-76/467，AcNPV-CAP-PfCSP+209，AcNPV-CAP-PfCSP+209/467，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467，AcNPV-CAP-HA1/Anhui，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467，AcNPV-CAP-AH/345，AcNPV-CAP-AH/345/467，AcNPV-CAP-AH/410，AcNPV-CAP-AH/410/467，AcNPV-CAP-AH/473，AcNPV-CAP-AH/473/467，AcNPV-CAP-AH/520，AcNPV-CAP-AH/520/467，AcNPV-CAP-VN/346，AcNPV-CAP-VN/346/467，AcNPV-CAP-VN/410，AcNPV-CAP-VN/410/467，AcNPV-CAP-VN/473，AcNPV-CAP-VN/473/467，AcNPV-CAP-VN/520，AcNPV-CAP-VN/520/467，AcNPV-CAP-CO/full，AcNPV-CAP-CO/full/467，AcNPV-CAP-CO/19，AcNPV-CAP-CO/19/467，AcNPV-CAP-CO/76，AcNPV-CAP-CO/76/467，AcNPV-CAP-CO/205，AcNPV-CAP-CO/205/467，AcNPV-CA39-HA1/Anhui，AcNPV-CA64-HA1/Anhui，AcNPV-CA39-PfCSP(A361E)，AcNPV-CA64-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-CO/full/VSV，AcNPV-CAP-CO/19/VSV，AcNPV-CAP-CO/76/VSV，AcNPV-CAP-CO/205/VSV，AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64和AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64。

用作本发明的药物组合物的活性成分的下述的任一种的本发明的重组杆状病毒：AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467，AcNPV-CAP-PfCSP-76，AcNPV-CAP-PfCSP-76/467，AcNPV-CAP-PfCSP+209，AcNPV-CAP-PfCSP+209/467，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467，AcNPV-CAP-HA1/Anhui，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467，AcNPV-CAP-AH/345，AcNPV-CAP-AH/345/467，AcNPV-CAP-AH/410，AcNPV-CAP-AH/410/467，AcNPV-CAP-AH/473，AcNPV-CAP-AH/473/467，AcNPV-CAP-AH/520，AcNPV-CAP-AH/520/467，AcNPV-CAP-VN/346，AcNPV-CAP-VN/346/467，AcNPV-CAP-VN/410，AcNPV-CAP-VN/410/467，AcNPV-CAP-VN/473，AcNPV-CAP-VN/473/467，AcNPV-CAP-VN/520，AcNPV-CAP-VN/520/467，AcNPV-CAP-CO/full，AcNPV-CAP-CO/full/467，AcNPV-CAP-CO/19，AcNPV-CAP-CO/19/467，AcNPV-CAP-CO/76，AcNPV-CAP-CO/76/467，AcNPV-CAP-CO/205，AcNPV-CAP-CO/205/467，AcNPV-CA39-HA1/Anhui，AcNPV-CA64-HA1/Anhui，AcNPV-CA39-PfCSP(A361E)，AcNPV-CA64-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-CO/full/VSV，AcNPV-CAP-CO/19/VSV，AcNPV-CAP-CO/76/VSV，AcNPV-CAP-CO/205/VSV，AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64和AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64，具有增强针对感染性抗原的感染预防效果以及降低感染性滴度的作用。利用这种作用和活性，重组杆状病毒可用于治疗与靶细胞和组织的感染相关的疾病。受到这种感染的影响的靶细胞的例子包括血细胞、肝细胞、肾细胞、脑细胞、肺细胞、上皮细胞和肌肉细胞。含有这样的细胞的组织的例子包括肺、肝、肾、脑、动脉和静脉、胃、肠、尿道、皮肤和肌肉。

药物组合物增强针对感染性抗原的感染预防效果，感染性抗原例如疟疾抗原例如疟原虫的子孢子表面抗原(CSP和TRAP)，裂殖子表面膜蛋白MSP1，由疟疾感染的红细胞分泌的疟疾S抗原，出现在疟疾感染的红细胞的结节(knob)中的PfEMP1蛋白，SERA蛋白，TRAMP蛋白，AMA1蛋白以及已知作为传染阻断抗原的Pfs25；以及流感抗原例如HA抗原，NA抗原，M2抗原和NP抗原，并降低感染性滴度(例如病毒感染性滴度)，从而增加哺乳动物包括人类与未给药本发明的药物组合物的组相比的存活时间和存活率。因此，药物组合物尤其可用作疟疾和流感病毒感染的预防性或治疗性药剂。

本发明的药物组合物具有增强针对感染性抗原的感染预防效果以及降低感染性滴度的作用，因此可用作由病原体例如流感病毒和疟疾引起的传染性疾病及其并发症的预防性或治疗性药剂。

通过使用对非人类脊椎动物具有免疫原性的基因作为转化载体的免疫原性外源基因来获得用作本发明的药物组合物的活性成分的重组杆状病毒，可以制备例如鸡流感疫苗，它具有增强针对感染性抗原的感染预防效果以及降低感染性滴度的作用。通过利用这种作用和活性，药物组合物可用于治疗与靶细胞和组织的感染相关的疾病。

本发明的药物组合物可以制备成含有药物有效量的本发明的重组杆状病毒和可药用载体的组合物。

本发明的重组杆状病毒在脊椎动物、特别是哺乳动物、包括人类或哺乳动物细胞中的感染预防效应，可以通过例如下列方法来提供，即将含有本发明的重组杆状病毒和用于药物给药的添加剂的药物组合物，通过肌肉内、皮下、皮内、腹膜内、经鼻或呼吸给药于脊椎动物特别是哺乳动物、包括人类，然后用含有本发明的重组杆状病毒作为活性成分的药物组合物免疫脊椎动物几次。本发明的药物组合物的呼吸给药是特别优选的。

可以通过将已经用本发明的药物组合物免疫几次、然后用靶病原体感染的脊椎动物、特别是哺乳动物、包括人类的存活率，与未给药药物组合物的动物的存活率进行比较，来评估感染预防效果。

(4)本发明的疫苗

用作本发明的药物组合物的活性成分的下列任一种重组杆状病毒：AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467，AcNPV-CAP-PfCSP-76，AcNPV-CAP-PfCSP-76/467，AcNPV-CAP-PfCSP+209，AcNPV-CAP-PfCSP+209/467，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467，AcNPV-CAP-HA1/Anhui，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam    ，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467，AcNPV-CAP-AH/345，AcNPV-CAP-AH/345/467，AcNPV-CAP-AH/410，AcNPV-CAP-AH/410/467，AcNPV-CAP-AH/473，AcNPV-CAP-AH/473/467，AcNPV-CAP-AH/520，AcNPV-CAP-AH/520/467，AcNPV-CAP-VN/346，AcNPV-CAP-VN/346/467，AcNPV-CAP-VN/410，AcNPV-CAP-VN/410/467，AcNPV-CAP-VN/473，AcNPV-CAP-VN/473/467，AcNPV-CAP-VN/520，AcNPV-CAP-VN/520/467，AcNPV-CAP-CO/full，AcNPV-CAP-CO/full/467，AcNPV-CAP-CO/19，AcNPV-CAP-CO/19/467，AcNPV-CAP-CO/76，AcNPV-CAP-CO/76/467，AcNPV-CAP-CO/205，AcNPV-CAP-CO/205/467，AcNPV-CA39-HA1/Anhui，AcNPV-CA64-HA1/Anhui，AcNPV-CA39-PfCSP(A361E)，AcNPV-CA64-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-CO/full/VSV，AcNPV-CAP-CO/19/VSV，AcNPV-CAP-CO/76/VSV，AcNPV-CAP-CO/205/VSV，AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64和AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64，可以如下面实施例中所描述增强病原体感染预防效果，本发明的通过将能够作为病毒粒子成分的蛋白的氨基酸序列的编码基因与具有所需免疫原性的外源基因进行融合而获得的DNA序列的能够降低感染性滴度的表达的融合产物，作为出芽病毒粒子从昆虫细胞产生。当本发明的药物组合物以病毒粒子的形式给药于脊椎动物、特别是哺乳动物、包括人类时，包含的作为病毒粒子成分的外源抗原蛋白启动获得性免疫(体液免疫和细胞免疫)，此外，作为融合的DNA序列的表达产物的抗原性蛋白，似乎在脊椎动物细胞、特别是哺乳动物包括人类的细胞中启动了获得性免疫(体液免疫和细胞免疫)。因此，本发明的重组杆状病毒可用作疫苗。

尤其是，本发明提供了含有下列任一种的具体重组杆状病毒作为活性成分的疫苗：AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467，AcNPV-CAP-PfCSP-76，AcNPV-CAP-PfCSP-76/467，AcNPV-CAP-PfCSP+209，AcNPV-CAP-PfCSP+209/467，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467，AcNPV-CAP-HA1/Anhui，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467，AcNPV-CAP-AH/345，AcNPV-CAP-AH/345/467，AcNPV-CAP-AH/410，AcNPV-CAP-AH/410/467，AcNPV-CAP-AH/473，AcNPV-CAP-AH/473/467，AcNPV-CAP-AH/520，AcNPV-CAP-AH/520/467，AcNPV-CAP-VN/346，AcNPV-CAP-VN/346/467，AcNPV-CAP-VN/410，AcNPV-CAP-VN/410/467，AcNPV-CAP-VN/473，AcNPV-CAP-VN/473/467，AcNPV-CAP-VN/520，AcNPV-CAP-VN/520/467，AcNPV-CAP-CO/full，AcNPV-CAP-CO/full/467，AcNPV-CAP-CO/19，AcNPV-CAP-CO/19/467，AcNPV-CAP-CO/76，AcNPV-CAP-CO/76/467，AcNPV-CAP-CO/205，AcNPV-CAP-CO/205/467，AcNPV-CA39-HA1/Anhui，AcNPV-CA64-HA1/Anhui，AcNPV-CA39-PfCSP(A361E)，AcNPV-CA64-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-CO/full/VSV，AcNPV-CAP-CO/19/VSV，AcNPV-CAP-CO/76/VSV，AcNPV-CAP-CO/205/VSV，AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64和AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64。

与在上面(3)的药物组合物中相同，疫苗增加了针对感染性抗原的感染预防效果，感染性抗原例如疟疾抗原例如疟原虫的子孢子表面抗原(CSP和TRAP)，裂殖子表面膜蛋白MSP1，由疟疾感染的红细胞分泌的疟疾S抗原，出现在疟疾感染的红细胞的结节中的PfEMP1蛋白，SERA蛋白，TRAMP蛋白，和AMA1蛋白；以及流感抗原例如流感病毒HA抗原，流感病毒NA抗原，流感病毒M2抗原和流感病毒NP抗原；疫苗还降低了感染性滴度(例如病毒感染性滴度)，从而增加了哺乳动物包括人类与未给药本发明的药物组合物的组相比的存活时间和存活率。因此，疫苗尤其可用作疟疾和流感病毒感染的预防性或治疗性药剂。

本发明的疫苗增强了针对感染性抗原的感染预防效果并降低了感染性滴度，因此可用作由病原体例如流感病毒和疟疾引起的传染性疾病及其并发症的预防性或治疗性药剂。

通过使用对非人类脊椎动物具有免疫原性的基因作为转化载体的免疫原性外源基因来获得用作本发明的药物组合物的活性成分的重组杆状病毒，可以制备例如鸡流感疫苗，它可以增强针对感染性抗原的感染预防效果并降低感染性滴度。通过利用这种活性，疫苗可用于治疗与靶细胞和组织的感染相关的疾病。

用作本发明的疫苗的活性成分的下列任一种重组杆状病毒：AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467，AcNPV-CAP-PfCSP-76，AcNPV-CAP-PfCSP-76/467，AcNPV-CAP-PfCSP+209，AcNPV-CAP-PfCSP+209/467，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467，AcNPV-CAP-HA1/Anhui，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467，AcNPV-CAP-AH/345，AcNPV-CAP-AH/345/467，AcNPV-CAP-AH/410，AcNPV-CAP-AH/410/467，AcNPV-CAP-AH/473，AcNPV-CAP-AH/473/467，AcNPV-CAP-AH/520，AcNPV-CAP-AH/520/467，AcNPV-CAP-VN/346，AcNPV-CAP-VN/346/467，AcNPV-CAP-VN/410，AcNPV-CAP-VN/410/467，AcNPV-CAP-VN/473，AcNPV-CAP-VN/473/467，AcNPV-CAP-VN/520，AcNPV-CAP-VN/520/467，AcNPV-CAP-CO/full，AcNPV-CAP-CO/full/467，AcNPV-CAP-CO/19，AcNPV-CAP-CO/19/467，AcNPV-CAP-CO/76，AcNPV-CAP-CO/76/467，AcNPV-CAP-CO/205，AcNPV-CAP-CO/205/467，AcNPV-CA39-HA1/Anhui，AcNPV-CA64-HA 1/Anhui，AcNPV-CA39-PfCSP(A361E)，AcNPV-CA64-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-CO/full/VSV，AcNPV-CAP-CO/19/VSV，AcNPV-CAP-CO/76/VSV，AcNPV-CAP-CO/205/VSV，AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64和AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64，可以增强针对感染性抗原的感染预防效果并降低感染性滴度。通过利用这种活性，重组杆状病毒可用于治疗与靶细胞和组织的感染相关的疾病。

受到这种感染的影响的靶细胞的例子包括血细胞、肝细胞、肾细胞、脑细胞、肺细胞、上皮细胞和肌肉细胞。含有这样的细胞的组织的例子包括肺、肝、肾、脑、动脉和静脉、胃、肠、尿道、皮肤和肌肉组织。

本发明的疫苗可以制备成上述(3)的药物组合物，所述药物组合物含有药物有效量的本发明的重组杆状病毒(下列任一种：AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467，AcNPV-CAP-PfCSP-76，AcNPV-CAP-PfCSP-76/467，AcNPV-CAP-PfCSP+209，AcNPV-CAP-PfCSP+209/467，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467，AcNPV-CAP-HA1/Anhui，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467，AcNPV-CAP-AH/345，AcNPV-CAP-AH/345/467，AcNPV-CAP-AH/410，AcNPV-CAP-AH/410/467，AcNPV-CAP-AH/473，AcNPV-CAP-AH/473/467，AcNPV-CAP-AH/520，AcNPV-CAP-AH/520/467，AcNPV-CAP-VN/346，AcNPV-CAP-VN/346/467，AcNPV-CAP-VN/410，AcNPV-CAP-VN/410/467，AcNPV-CAP-VN/473，AcNPV-CAP-VN/473/467，AcNPV-CAP-VN/520，AcNPV-CAP-VN/520/467，AcNPV-CAP-CO/full，AcNPV-CAP-CO/full/467，AcNPV-CAP-CO/19，AcNPV-CAP-CO/19/467，AcNPV-CAP-CO/76，AcNPV-CAP-CO/76/467，AcNPV-CAP-CO/205，AcNPV-CAP-CO/205/467，AcNPV-CA39-HA1/Anhui，AcNPV-CA64-HA1/Anhui，AcNPV-CA39-PfCSP(A361E)，AcNPV-CA64-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-CO/full/VSV，AcNPV-CAP-CO/19/VSV，AcNPV-CAP-CO/76/VSV，AcNPV-CAP-CO/205/VSV，AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64和AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64)，以及可药用的载体。

疫苗可以通过使用与在上述(3)的药物组合物中使用的相同的可药用载体，按照标准方法制备成药物组合物的形式。载体的例子包括生理可接受的溶液，例如无菌盐水和无菌缓冲盐水。

疫苗(在后文中制剂与药物组合物中相同)可以制备成含有本发明的重组杆状病毒(下列任一种：AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467，AcNPV-CAP-PfCSP-76，AcNPV-CAP-PfCSP-76/467，AcNPV-CAP-PfCSP+209，AcNPV-CAP-PfCSP+209/467，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467，AcNPV-CAP-HA1/Anhui，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467，AcNPV-CAP-AH/345，AcNPV-CAP-AH/345/467，AcNPV-CAP-AH/410，AcNPV-CAP-AH/410/467，AcNPV-CAP-AH/473，AcNPV-CAP-AH/473/467，AcNPV-CAP-AH/520，AcNPV-CAP-AH/520/467，AcNPV-CAP-VN/346，AcNPV-CAP-VN/346/467，AcNPV-CAP-VN/410，AcNPV-CAP-VN/410/467，AcNPV-CAP-VN/473，AcNPV-CAP-VN/473/467，AcNPV-CAP-VN/520，AcNPV-CAP-VN/520/467，AcNPV-CAP-CO/full，AcNPV-CAP-CO/full/467，AcNPV-CAP-CO/19，AcNPV-CAP-CO/19/467，AcNPV-CAP-CO/76，AcNPV-CAP-CO/76/467，AcNPV-CAP-CO/205，AcNPV-CAP-CO/205/467，AcNPV-CA39-HA1/Anhui，AcNPV-CA64-HA1/Anhui，AcNPV-CA39-PfCSP(A361E)，AcNPV-CA64-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-CO/full/VSV，AcNPV-CAP-CO/19/VSV，AcNPV-CAP-CO/76/VSV，AcNPV-CAP-CO/205/VSV，AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64和AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64)作为活性成分的脂质体制剂，并且可以与佐剂组合使用。

本发明的疫苗(药物组合物)的具体的例子包括脂质体制剂。脂质体制剂可以是其中本发明的重组杆状病毒保留在含有酸性磷脂作为膜成分、或含有中性磷脂和酸性磷脂作为膜成分的脂质体中。

对于用作膜成分的酸性磷脂和中性磷脂没有具体的限制，常用于脂质体制剂的各种不同脂类可以单独使用，或两种或多种组合使用。

脂质体膜按照标准方法，通过使用单独的酸性磷脂或与中性磷脂一起使用来生产。当酸性磷脂与中性磷脂一起使用时，脂质体膜成分中酸性磷脂的比例优选为大约0.1到大约100mol％，更优选为1到90mol％，更优选为大约10到大约50mol％。

为了制备脂质体，可以加入例如胆固醇等。这可以控制磷脂的流动性，有助于脂质体的制备。一般来说，胆固醇优选以与磷脂的重量相等或较少的量，优选以0.5倍量到相等的量添加。

脂质体制剂中酸性磷脂与活性成分的混合比是大约0.5到大约100当量，优选为大约1到大约60当量，更优选为大约1.5到大约20当量。

本发明的作为活性成分的重组杆状病毒，以基于脂类的总量计几mol％到几十mol％，优选为大约5到大约10mol％，通常在大约5mol％左右的量使用。

脂质体制剂的生产、浓度和颗粒直径控制可以按照标准方法进行。如果需要，如上所述的各种不同添加剂也可以掺入到脂质体制剂中。

为了生产脂质体制剂，本发明的作为活性成分的重组杆状病毒可以与脂肪酸(例如二十二烷酸，硬脂酸，棕榈酸，肉豆蔻酸和油酸)、烷基、胆固醇基等相结合的方式使用。含有这些结合成分的脂质体制剂也可以按照标准方法来生产(参见例如Long Circulating Liposomes：Old Drugs，New Therapeutics，M.C.Woodle，G.Storm主编，Springer-Verlag Berlin(1998))。

本发明的疫苗(药物组合物)优选情况下可用作疫苗组合物。疫苗优选与药物有效量的佐剂组合使用，以增加抗感染(抗疟疾或抗流感)效力。

任何通常用于这种类型疫苗的佐剂都可以用作佐剂。这样的佐剂的例子包括Freund′s完全佐剂，胞壁酰二肽，氢氧化铝，BCG，IL-12，N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-异葡萄糖胺(MDP)，胸腺素α1和QS-21。使用的佐剂的量可以根据症状的程度来适当地选择，例如皮肤的软化、疼痛、红斑、发烧、头痛和肌肉痛，这些在人类或动物中可能表现为这种类型的疫苗给药后的免疫应答的一部分。

本发明的疫苗(药物组合物)可以与其他公知的药物产品组合使用，例如免疫应答促进肽和抗细菌剂(合成的抗细菌剂)。

疫苗(药物组合物)还可以含有其他药物和添加剂。其例子包括辅助本发明的重组杆状病毒的细胞内摄取的药物，例如钙离子。也可以使用脂质体以及其他有助于转染的药物和添加剂，例如氟烃乳化剂、cochleate、小管、金粒子、生物可降解微球和阳离子聚合物。

对于在本发明的疫苗(药物组合物)(药物)中包含的活性成分的量没有具体的限制，可以在宽泛的范围内选择，只要它是药物有效的量就行。对疫苗(药物组合物)的剂量没有具体的限制，可以根据所需的治疗效果、给药方法(给药途径)、治疗时间、患者的年龄、性别和其他情况等在宽泛的范围内选择。

当作为本发明的疫苗(药物组合物)的活性成分的的重组杆状病毒被给药于人类时，重组杆状病毒以相当于每个患者按照重组病毒的PFU计算10²到10¹⁴ PFU，优选10⁵到10¹²PFU，更优选10⁶到10¹⁰PFU的量进行给药。

用作本发明的疫苗(药物组合物)的活性成分的重组杆状病毒(下列任一种：AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467，AcNPV-CAP-PfCSP-76，AcNPV-CAP-PfCSP-76/467，AcNPV-CAP-PfCSP+209，AcNPV-CAP-PfCSP+209/467，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467，AcNPV-CAP-HA1/Anhui，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467，AcNPV-CAP-AH/345，AcNPV-CAP-AH/345/467，AcNPV-CAP-AH/410，AcNPV-CAP-AH/410/467，AcNPV-CAP-AH/473，AcNPV-CAP-AH/473/467，AcNPV-CAP-AH/520，AcNPV-CAP-AH/520/467，AcNPV-CAP-VN/346，AcNPV-CAP-VN/346/467，AcNPV-CAP-VN/410，AcNPV-CAP-VN/410/467，AcNPV-CAP-VN/473，AcNPV-CAP-VN/473/467，AcNPV-CAP-VN/520，AcNPV-CAP-VN/520/467，AcNPV-CAP-CO/full，AcNPV-CAP-CO/full/467，AcNPV-CAP-CO/19，AcNPV-CAP-CO/19/467，AcNPV-CAP-CO/76，AcNPV-CAP-CO/76/467，AcNPV-CAP-CO/205，AcNPV-CAP-CO/205/467，AcNPV-CA39-HA1/Anhui，AcNPV-CA64-HA1/Anhui，AcNPV-CA39-PfCSP(A361E)，AcNPV-CA64-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-CO/full/VSV，AcNPV-CAP-CO/19/VSV，AcNPV-CAP-CO/76/VSV，AcNPV-CAP-CO/205/VSV，AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64和AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64)的剂量，可以根据导入到疫苗宿主中的可表达DNA的量或转录的RNA的量，在非常广泛的范围内选择。这些量也依赖于在本发明的转化载体中使用的转录和翻译启动子的强度。

本发明的疫苗(药物组合物)，通过直接将重组杆状病毒悬浮在PBS(磷酸缓冲盐水)或盐水中制备的重组杆状病毒悬液注射到局部位点中(例如肺组织、肝、肌肉或脑中)，或经鼻或者呼吸吸入，或通过血管内(例如动脉内、静脉内和门静脉)、皮下、皮内或腹膜内给药来进行给药。本发明的疫苗优选通过呼吸吸入给药。

本发明的疫苗(药物组合物)优选给药一次以上。更具体来说，在最初给药后，当观察到状况时优选进行一次到多次附加的免疫接种。这可以增强所需效应。在给药疫苗(药物组合物)后，可以用含有本发明的重组杆状病毒(下列任何一种：AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467，AcNPV-CAP-PfCSP-76，AcNPV-CAP-PfCSP-76/467，AcNPV-CAP-PfCSP+209，AcNPV-CAP-PfCSP+209/467，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467，AcNPV-CAP-HA1/Anhui，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467，AcNPV-CAP-AH/345，AcNPV-CAP-AH/345/467，AcNPV-CAP-AH/410，AcNPV-CAP-AH/410/467，AcNPV-CAP-AH/473，AcNPV-CAP-AH/473/467，AcNPV-CAP-AH/520，AcNPV-CAP-AH/520/467，AcNPV-CAP-VN/346，AcNPV-CAP-VN/346/467，AcNPV-CAP-VN/410，AcNPV-CAP-VN/410/467，AcNPV-CAP-VN/473，AcNPV-CAP-VN/473/467，AcNPV-CAP-VN/520，AcNPV-CAP-VN/520/467，AcNPV-CAP-CO/fu1l，AcNPV-CAP-CO/full/467，AcNPV-CAP-CO/19，AcNPV-CAP-CO/19/467，AcNPV-CAP-CO/76，AcNPV-CAP-CO/76/467，AcNPV-CAP-CO/205，AcNPV-CAP-CO/205/467，AcNPV-CA39-HA1/Anhui，AcNPV-CA64-HA1/Anhui，AcNPV-CA39-PfCSP(A361E)，AcNPV-CA64-PfC SP(A361E)，AcNPV-CAP-CO/full/VSV，AcNPV-CAP-CO/19/VSV，AcNPV-CAP-CO/76/VSV，AcNPV-CAP-CO/205/VSV，AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64和AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gpβ4)的药物组合物进行加强免疫。此外，如上所述与本发明的疫苗一起使用各种不同其他药物，可以增强通过给药疫苗(药物组合物)而获得的治疗效力。

在本发明的疫苗(药物组合物)的一个实施方案中，用作本发明的疫苗(药物组合物)的一种活性成分的重组杆状病毒，一般通过杆状病毒DNA与转化载体的同源重组制备，在该转化载体中已经导入了由具有所需免疫原性的外源基因与能够作为病毒粒子成分的蛋白的编码基因的融合而获得的融合基因。将重组杆状病毒与可药用的载体(即在使用的剂量和浓度下对人类和其他脊椎动物无毒，并与制剂中的其他成分相容)，以可注射的剂量形式(溶液，悬液或乳液)混合，产生制剂。优选情况下，这样获得的制剂不含氧化剂或任何其他公知的对重组杆状病毒有害的化合物。

载体可以含有痕量的添加剂，例如增加等渗性和化学稳定性的物质。这样的添加剂在使用的剂量和浓度下对于哺乳动物包括人类无毒，其例子包括缓冲液例如磷酸、柠檬酸、琥珀酸、乙酸和其它有机酸及其盐；抗氧化剂例如抗坏血酸；低分子量(例如少于大约10个残基)多肽(例如聚精氨酸和三肽)，蛋白(例如血清白蛋白，明胶和免疫球蛋白)；氨基酸(例如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸和精氨酸)；单糖，二糖和其它碳水化合物(例如纤维素及其衍生物，葡萄糖，甘露糖和糊精)，螯合剂(例如EDTA)；糖醇(例如甘露糖醇和山梨糖醇)；平衡离子(例如钠)；非离子表面活性剂(例如聚山梨酸酯和泊洛沙姆(poloxamer))；以及PEG。

含有重组杆状病毒的药物疫苗(组合物)典型情况下可以作为水溶液或冷冻干燥的产物储存在单位或多剂容器例如密封的安瓿或小管中。

本发明还提供了预防疟疾或流感感染的方法或治疗疟疾或流感的方法，包括向对象给药有效量的本发明的重组杆状病毒、疫苗、制剂和药物组合物。本发明还提供了进行免疫刺激的方法，包括向对象给药有效量的本发明的重组杆状病毒、疫苗、制剂和药物组合物。使用的对象的例子包括可能感染有疟原虫或流感病毒的对象，例如人类和其它动物(例如哺乳动物、禽类、爬行动物、鱼和两栖动物)，以及感染有疟原虫或流感病毒的对象。对象感染的流感病毒优选为甲型流感病毒，更优选为甲型H1亚型流感病毒或甲型H3亚型流感病毒。疟原虫的例子包括恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)。

本发明的重组杆状病毒单独地或与可药用载体一起形成疫苗、制剂或药物组合物，并给药至对象。

给药途径可以是例如任何上面提到的给药途径。用于本发明的可药用载体，可以根据被生产的药物组合物的形式，从本技术领域中常用的载体中适当地选择。

例如，当药物组合物在水溶液中形成时，可以使用纯水(无菌水)或生理缓冲溶液作为载体。当药物组合物在其它适合的溶液中形成时，可以使用能够被注射的有机酯类，例如乙二醇、甘油和橄榄油作为载体。组合物可以含有稳定剂、赋形剂等在本技术领域、特别是疫苗制剂领域中常用的物质。

对于本发明的疫苗、制剂或药物组合物中重组杆状病毒的量没有具体的限制，可以从广泛的范围内适合地选择。一般来说，组合物中重组杆状病毒的量优选为大约0.0002到大约0.2(w/v％)，更优选为0.001到0.1(w/v％)。对于本发明的重组杆状病毒、疫苗、制剂或药物组合物的给药方法没有具体的限制，可以根据剂量形式、患者的年龄、性别和其他状况、疾病的严重性等适合地进行选择。其优选的剂量形式是用于肠胃外给药的形式，例如注射剂、滴剂、滴鼻剂和吸入剂。当组合物形成为注射剂或滴剂时，注射剂在需要时可以与复溶流体例如葡萄糖溶液或氨基酸溶液混合后静脉内给药，或可以肌肉内、皮内、皮下或腹膜内给药。

本发明的重组杆状病毒、疫苗、制剂或药物组合物的每日剂量可以随着对象的状况、体重、年龄、性别等而变化，因此不能完全指定。但是，剂量通常为使得每天每公斤体重给药的重组杆状病毒的量为0.001到100mg。本发明的疫苗、制剂或组合物可以每天给药一次或多次。

当重组杆状病毒作为本发明的疫苗(制剂或药物组合物)的活性成分给药时，给药的重组杆状病毒的量相当于每个患者以重组病毒的PFU计算10²到10¹⁴PFU，优选为10⁵到10¹²PFU，更优选为10⁶到10¹⁰PFU。

本发明的疫苗(组合物)按照Good Medical Practice的描述，考虑到每个患者的临床病症(例如将要预防或治疗的病症)、含有重组杆状病毒的疫苗(组合物)的投送位点、靶组织、给药方法、剂量方案以及其他本技术领域的专业人员公知的因素，进行给药。因此，本发明的疫苗(组合物)的适合剂量在考虑到上述因素后确定。

实施例

下面将参考实施例对本发明进行更详细的描述。这些实施例仅仅是本发明的例子，不对本发明构成限制。

实施例1：本发明的转化载体质粒及其产生方法

(1)本发明的转化载体质粒pCAP-PfCSP、pCAP-PfCSP/272和pCAP-PfCSP/467的构建

(1.1)质粒pBACsurf-Hsp65的构建

通过使用QIAamp DNA Midi试剂盒(Qiagen)从结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv菌株提取基因组DNA，并通过PCR进行克隆，获得了Hsp65基因。更具体来说，从结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv菌株提取的基因组DNA，使用引物phsp65-F1(5′-AATAATAGATCTAATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGA-3′(SEQ ID NO：1)；BglII位点加下划线)和phsp65-R1(5′-AATCCAATGCGGCCGCGGGAATTCGATTCCTGCAGGTCAGAAATCCATGCCACCCATGTCGCC-3′(SEQ ID NO：2)；NotI位点加下划线)，通过PCR进行扩增。纯化PCR产物，用限制性酶BglII和NotI切开，连接到用BamHI和NotI消化的pcDNA3.1(+)(来自Invitrogen)中。得到的质粒被命名为pcDNA-hsp65。使用pcDNA-hsp65作为模板，使用引物phsp65-F2(5′-CACCCCTGCAGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGAATTCATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCC-3′(SEQ ID NO：3)；Sse8387I和EcoRI位点加下划线，FLAG序列为斜体)，和phsp65-R2(5′-CCCGGGCGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGCCACC-3′(SEQ ID NO：4)；Cfr9I位点加下划线)进行了PCR。将获得的Hsp65基因DNA片段克隆到pENTR/D-TOPO(来自Invitrogen)中，然后用Sse8387I/Cfr9I切开，插入到pBACsurf-CSP的PstI/Cfr9I位点中(Yoshida等，Virology 316：161-70，2003)。这样构建的质粒被命名为pBACsurf-Hsp65。

(1.2)质粒pENTR-gp64的构建

使用pBACsurf-1(来自Novagen)作为模板，使用引物pPolh-F2(5′-CACCCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAG-3′(SEQ ID NO：5)；RsrII位点加下划线)和pgp64-R2(5′-GGTACCATATTGTCTATTACGGTTTCTAATCATAC-3′(SEQ IDNO：6)；KpnI位点加下划线)进行了PCR。将获得的gp64基因DNA片段插入到pENTR/D-TOPO中，构建了质粒pENTR-gp64。这样构建的质粒被命名为pENTR-gp64。

(1.3)本发明的转化载体pDual-Hsp65-gp64的构建

将pBACsurf-Hsp65用PstI/Cfr9I切开，将hsp65基因DNA片段插入到pENTR-gp64的PstI/Cfr9I位点中，构建质粒pENTR-Hsp65-gp64。将pENTR-Hsp65-gp64用RsrII/KpnI切开，将由多角体启动子和hsp65-gp64基因构成的DNA片段插入到用RsrII和KpnI切开的pTriEx-3.1(Novagen)中，构建了转化载体质粒pDual-Hsp65-gp64，它能够在哺乳动物和昆虫细胞中，在由CMA启动子和多角体启动子构成的所需双重启动子的控制下，表达Hsp65抗原和gp64蛋白的融合蛋白。

(1.4)本发明的转化载体pDual-H1N1/HA1-gp64的构建

使用QIAamp MinElute Virus Spin试剂盒(来自Qiagen)，从用流感病毒PR/8/34株感染的MDCK细胞的培养上清液提取RNA，使用引物HA-f(5′-CCTGCAGGTATGAAGGCAAACCTACTGGTC-3’(SEQID NO：7)；SbfI位点加下划线)和HA-r(5′-GCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3(SEQ ID NO：8)；Sbfl位点加下划线)，通过RT-PCR进行扩增。将得到的流感病毒HA基因片段克隆到pCR-Blunt II-TOPO(来自Invitrogen)中。得到的质粒被命名为pCR-Blunt-HA。使用pCR-Blunt-HA作为模板，使用引物pHA-F1(5′-CACCGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACCATGCG-3′(SEQ ID NO：9)；EcoRI位点加下划线)和pHA-R1(5′-CCCGGGCACCTCTGGATTGGATGGACGGAATG-3′(SEQ ID NO：10)；Cf9I位点加下划线)，进行了PCR。将得到的H1N1/HA1基因DNA片段克隆到pENTR/D-TOPO中，然后用EcoRI/Cfr9I切开，并插入到pDual-Hsp65-gp64的EcoRI/Cfr9I位点中，构建了质粒pDual-H1N1/HA1-gp64。

(1.5)质粒pBACsurf-HA1的构建

将pDual-H1N1/HA1-gp64用EcoRI/CfrI切开，将H1N1/HA1基因的DNA片段插入到用EcoRI和CfrI消化的pBACsurf-Hsp65中，构建了质粒pBACsurf-HA1。

(1.6)质粒pCP-H1N1/HA1-gp64的构建

使用pBACsurf-HA1作为模板，使用Polh-f RsrII(5′-GGGCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCG-3′(SEQ ID NO：11)；RsrII位点加下划线)和GP64-r DraIII(5′-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3′(SEQID NO：12)；DraIII位点加下划线)，进行了PCR。将获得的DNA片段插入到用RsrII和DraIII消化的pDual-H1N1/HA1-gp64中，产生了pCP-H1N1/HA1-gp64。

(1.7)质粒pCAP-H1N1/HA1-gp64的构建

将pCP-H1N1/HA1-gp64用限制性酶RsrII和DraIII裂解，制备了HA1和gp64基因片段。将片段插入到用限制性酶RsrII和DraIII消化pTriEx-1.1(来自Novagen)而制备的载体中，产生了转化载体质粒pCAP-H1N1/HA1-gp64，它能够在哺乳动物和昆虫细胞中，在由CAG启动子和多角体启动子构成的所需双重启动子的控制下，表达HA1抗原和gp64蛋白的融合蛋白。

(1.8)质粒pCAP-H1N1/NP-gp64的构建

使用流感病毒PR/8/34株的基因组RNA作为模板，使用NP-fEcoRI(5′-ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3′(SEQ ID NO：13)；EcoRI  位点加下划线)和NP-r Cfr9I(5′-GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3′(SEQ ID NO：14)；Cfr9I位点加下划线)，进行了RT-PCR。将获得的片段用限制性酶EcoRI和Cfr9I消化，插入到用限制性酶EcoRI和Cfr9I消化的pCAP-H1N1/HA1-gp64中，产生了pCAP-H1N1/NP-gp64。

(1.9)质粒pCAP-H1N1/NP/272和pCAP-H1N1/NP/467的构建

使用gp64(272)-f(5′-GACTCCCCGGGTCGAGCACCGAGTCAAGAAG-3′(SEQ ID NO：15)；XmaI位点加下划线)，gp64(467)-f(5′-GACTCCCCGGGACATCACTTCCATGGCTGAA-3′(SEQ ID NO：16)；XmaI位点加下划线)和GP64-r DraIII(5′-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3′(SEQID NO：12)；DraIII位点加下划线)，对pCAP-H1N1/HA1-gp64进行PCR。将获得的片段用限制性酶XmaI和DraIII消化，插入到用XmaI和DraIII消化的pCAP-H1N1/NP-gp64中，产生pCAP-H1N1/NP/272和pCAP-H1N1/NP/467。

(1.10)本发明的转化载体pCAP-PfCSP、cCAP-PfCSP/272和pCAP-PfCSP/467的构建

使用QIAamp DNA Midi试剂盒(来自Qiagen)，从被恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)3D7株感染的人类红细胞中提取了恶性疟原虫基因组DNA。使用该基因组DNA作为模板，按照下面的方法通过PCR克隆PfCSP基因。使用引物PfCSP-f(19)(5′-GACTCTGCAGTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAG-3′(SEQ ID NO：17)；PstI位点加下划线)和PfCSP-r(373)(5′-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTCAATATC-3′(SEQ ID NO：18)；XmaI位点加下划线)进行了PCR。将获得的DNA片段插入到每个用PstI和XmaI消化的pCAP-H1N1/NP-gp64，pCAP-H1N1/NP/272和pCAP-H1N1/NP/467中。构建的质粒被命名为pCAP-PfCSP，pCAP-PfCSP/272和pCAP-PfCSP/467。

恶性疟原虫3D7环子孢子(CS)蛋白的氨基酸序列的GenBank登记号为XP_001351122。

(2)本发明的转化载体pDual-Pfs25-PfCSP-gp64的构建

(2.1)质粒pDual-PbAMA1D123-gp64的构建

从疟原虫伯氏疟原虫(P.berghei)ANKA株感染的BALB/c小鼠收集血样，使用QIAamp DNA Midi试剂盒(Qiagen)提取伯氏疟原虫的基因组DNA。使用该基因组DNA作为模板，按照下面的方法通过PCR克隆PbAMA1基因结构域123(D123)。使用引物pAMA-F1(5′-CACCGAATTCAATCCATGGGAAAAGTATACGGAAAAATAT-3′(SEQ ID NO：19)；EcoRI位点加下划线)和pAMA1-R1(5′-CCCGGGCTTCTCTGGTTTGATGGGCTTTCATATGCAC-3′(SEQ IDNO：20)；Cfr9I位点加下划线)进行了PCR。将得到的PbAMA1D123DNA片段克隆到pENTR/D-TOPO中，然后用EcoRI/Cfr9I切开，插入到用EcoRI和Cfr9I消化的pBACsurf-Hsp65中。构建的质粒被命名为pBACsurf-PbAMA1D123。

随后，将pBACsurf-PbAMA1D123用EcoRI/Cfr9I切开，将PbAMA1D123基因DNA片段插入到用EcoRI和Cfr9I消化的pDual-Hsp65-gp64中，产生了质粒pDual-PbAMA1D123-gp64。

(2.2)质粒Dual-PfCSP-gp64的构建

使用恶性疟原虫基因组DNA作为模板，按照下面的方法通过PCR克隆PfCSP基因。使用引物pPfCSP-F1(5′-CACCGAATTCTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAGT-3′(SEQ ID NO：21)；EcoRI位点加下划线)和pPfCSP-R1(5′-CCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTC-3′(SEQ ID NO：22)；Cfr9I位点加下划线)进行了PCR。将得到的PfCSP DNA片段克隆到pENTR/D-TOPO中，然后用EcoRI/Cfr9I切开，并插入到用EcoRI和Cfr9I消化的pDual-PbAMA1D123-gp64中。构建的质粒被命名为pDual-PfCSP-gp64。CGTGGATACTGTATGCAAAAGAGGA-3′(SEQ ID NO：23)；EcoRI位点加下划线)和pPfs25-R2(5′-CAATTGAGATCCGCCGCCACCGCCACCAGTACATATAGAGCTTTCATTATCTATTATAAATCCATC-3′(SEQ ID NO：24)；MunI位点加下划线)进行了PCR。将得到的Pfs25DNA片段克隆到pENTR/D-TOPO中，然后用EcoRI/MunI切开，并插入到用EcoRI消化的pDual-PfCSP-gp64中。构建的质粒被命名为pDual-Pfs25-PfCSP-gp64。

(3)本发明的转化质粒pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64的构建

使用恶性疟原虫基因组DNA作为模板，按照下述方法通过PCR克隆了PfMSP1基因。使用引物pPfMSP119-F1(5′-CACCGAATTCAACATTTCACAACACCAATGCGTAAAAAAAC-3′(SEQ ID NO：25)；EcoRI位点加下划线)和pPfMSP119-R2(5′-CAATTGAGATCCGCCGCCACCGCCACCGTTAGAGGAACTGCAGAAAATACCATCGAAAAGTGGA-3′(SEQ ID NO：26)；MunI位点加下划线)进行了PCR。将获得的PfMSPH9DNA片段克隆到pENTR/D-TOPO中，然后用EcoRI和MunI切开，插入到用EcoRI消化的pDual-PbCSP-gp64中。构建的质粒被命名为pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64。

(4)本发明的转化载体质粒pCAP-PfCSP(A361E)，pCAP-PfCSP(A361E)/272和pCAP-PfCSP(A361E)/467的构建

用pCAP-PfCSP，使用PfCSP-f(19)(5′-GACTCTGCAGTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAG-3′(SEQ ID NO：17)；PstI位点加下划线)和PfCSP-r(373A361E)(5′-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTCAATATCATTTTC-3′(SEQ ID NO：27)；XmaI位点加下划线)进行了PCR。将获得的DNA片段用PstI和XmaI消化，插入到各用PstI和XmaI消化的pCAP-H1N1/NP-gp64，pCAP-H1N1/NP/272和pCAP-H1N1/NP/467中。构建的质粒被命名为pCAP-PfCSP(A361E)，pCAP-PfCSP(A361E)/272和pCAP-PfCSP(A361E)/467。

(5)本发明的转化质粒pCAP-PfCSP-76和pCAP-PfCSP-76/467的构建

用pCAP-PfCSP(A361E)，使用PfCSP-f(76)(5′-GACTCTGCAGGATGATGGAAATAACGAAGACAACG-3′(SEQ ID NO：28)；PstI位点加下划线)和PfCSP-r(373A361E)(5′-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTCAATATCATTTTC-3′(SEQ ID NO：27)；XmaI位点加下划线)进行了PCR。将获得的DNA片段用PstI和XmaI切开，然后插入到各用PstI和XmaI切开的pCAP-H1N1/NP-gp64和pCAP-H1N1/NP/467中。构建的质粒被命名为pCAP-PfCSP-76和pCAP-PfCSP-76/467。

(6)转化质粒pCAP-PfCSP+209和pCAP-PfCSP+209/467的构建

使用在Sf9和人类细胞中常用的密码子，从恶性疟原虫3D7株的PfCSP的氨基酸序列(但是其中361位的A被E代替)制备人工基因序列(PfCSP+：SEQ ID NO：29)。使用获得的人工基因序列作为模板，使用PfCSP-f(+209)(5′-GACTCTGCAGAACGCTAATCCAAACGCTAATCCCAACGCTAATCCCAATGCC-3′(SEQ ID NO：30)；PstI位点加下划线)和PfCSP-r(+A361E)(5′-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTGCAAATTTTTTT-3′(SEQ IDNO：31)；XmaI位点加下划线)进行了PCR。将得到的DNA片段用PstI和XmaI切开，然后插入到用PstI和XmaI消化的pCAP-H1N1/NP-gp64和pCAP-H1N1/NP/467中。构建的质粒被命名为pCAP-PfCSP+209和pCAP-PfCSP+209/467。

(7)本发明的转化质粒pCAP-PfCSP+76/209和pCAP-PfCSP+76/209/467的构建

使用人工基因序列(PfCSP+：SEQ ID NO：29)作为模板，使用PfCSP-f(+76)(5′-GACTCTGCAGGACGACGGCAACAACGAAGACAACG-3′(SEQ ID NO：32)；PstI位点加下划线)，PfCSP-r(+128)(5′-CGTTAGGATCCACATTTGGGTTGGCATTTGGG-3′(SEQ ID NO：33)；BamHI位点加下划线)，PfCSP-f(+209)BamHI(5′-GACTGGATCCTAACGCTAATCCAAACGCTAATCCC-3′(SEQ ID NO：34)；BamHI位点加下划线)和PfCSP-r(+A361E)(5′-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTGCAAATTTTTTT-3′(SEQ IDNO：31)；XmaI位点加下划线)从获得的人工基因序列进行PCR。将得到的DNA片段分别用PstI/BamHI和BamHI/XmaI切开，然后插入到各用PstI和XmaI消化的pCAP-H1N1/NP-gp64和pCAP-H1N1/NP/467中。构建的质粒被命名为pCAP-PfCSP+76/209和pCAP-PfCSP+76/209/467。

(8)转化质粒pCAP-HA1/Anhui，pCAP-HA1/Anhui/272和pCAP-HA1/Anhui/467的构建

使用在Sf9和人类细胞中常用的密码子，从流感病毒H5N1/Anhui/1/05的血细胞凝集素HA1区域的氨基酸序列制备人工基因序列(SEQ ID NO：35)。使用获得的人工基因序列作为模板，使用AH-F1(5′-CAGTCTGCAGGACCAGATTTGCATC-3′(SEQ ID NO：36)；PstI位点加下划线)和AH-R4(5′-CAGTCCCGGGCTCTCTTGCGCCTGC-3′(SEQ ID NO：37)；XmaI位点加下划线)进行PCR。将获得的DNA片段用PstI和XmaI切开，然后插入到各用PstI和XmaI消化的pCAP-H1N1/NP-gp64，pCAP-H1N1/NP/272和pCAP-H1N1/NP/467中。构建的质粒被命名为pCAP-HA1/Anhui，pCAP-HA1/Anhui/272和pCAP-HA1/Anhui/467。

流感病毒A/H5N1/Anhui/1/05的血细胞凝集素的氨基酸序列的GenBank登记号为ABD28180。

(9)本发明的转化载体质粒pCAP-HA1/Vietnam，pCAP-HA1/Vietnam/51，pCAP-HA1/Vietnam/101，pCAP-HA1/Vietnam/154，pCAP-HA1/Vietnam/201，pCAP-HA1/Vietnam/272和pCAP-HA1/Vietnam/467的构建

使用在Sf9和人类细胞中常用的密码子，从流感病毒H5N1/Vietnam/1203/4的HA1区域的氨基酸序列制备了人工基因序列(SEQ ID NO：38)。使用获得的人工基因序列作为模板，使用VN-F1(5′-CAGTCTGCAGGACCAGATCTGTATC-3′(SEQ ID NO：39)；PstI位点加下划线)和VN-R4(5′-CAGTCCCGGGCTCTCTTCTTCCTGC-3′(SEQ ID NO：40)；XmaI位点加下划线)进行PCR。将获得的DNA片段用PstI和XmaI切开，插入到各用PstI和XmaI消化的pCAP-H1N1/NP-gp64，pCAP-H1N1/NP/272和pCAP-H1N1/NP/467中。构建的质粒被命名为pCAP-HA1/Vietnam，pCAP-HA1/Vietnam/272和pCAP-HA1/Vietnam/467。

此外，使用pCAP-HA1/Vietnam作为模板，使用gp64(51)-f(5′-GACTCCCCGGGTGGAAATCACCATCGTGGAGACG-3′(SEQ ID NO：41)；XmaI位点加下划线)或gp64(101)-f(5′-GACTCCCCGGGATTTGCTTATGTGGAGCATCAGG-3′(SEQ IDNO：42)；XmaI位点加下划线)或gp64(154)-f(5′-GACTCCCCGGGCGCACCACACGTGCAACAAATCG-3′(SEQ IDNO：43)；XmaI位点加下划线)或gp64(201)-f(5′-GACTCCCCGGGACACTGTGCTTCATCGAGACGGC-3′(SEQ ID NO：44)；XmaI位点加下划线)和GP64-r DraIII(5′-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3′(SEQ ID NO：12)；DraIII位点加下划线)进行PCR。将获得的DNA片段用XmaI和DraIII切开，插入到用XmaI和DraIII消化的pCAP-HA1/Vietnam中。构建的质粒被命名为pCAP-HA1/Vietnam/51，pCAP-HA1/Vietnam/101，pCAP-HA1/Vietnam/154和pCAP-HA1/Vietnam/201。

流感病毒A/H5N1/Vietnam/1203/2004的血细胞凝集素的氨基酸序列的GenBank登记号为AAW80717。

(10)本发明的转化载体质粒pCAP-AH/345，pCAP-AH/345/467，pCAP-AH/410，pCAP-AH/410/467，pCAP-AH/473，pCAP-AH/473/467，pCAP-AH/520，pCAP-AH/520/467的构建

使用可以从DNA2.0，Inc.公司获得的Gene Designer进行密码子最适化，从流感病毒A/H5N1/Anhui/1/05的血细胞凝集素的HA区域的氨基酸序列制备人工基因序列(SEQ ID NO：45)。使用该人工序列作为模板，使用AH17-F(5′-GACTCTGCAGGATCAGATCTGTATTGGGTACC-3′(SEQ ID NO：46)；PstI位点加下划线)和AH345-R(5′-CGATCCCGGGCTCTCTTTCTCCTCCGCTCGC-3′(SEQ ID NO：47)；XmaI位点加下划线)或AH410-R(5′-CGATCCCGGGCGGCCTCGAACTGGGTGTTCATT-3′(SEQ ID NO：48)；XmaI位点加下划线)或AH473-R(5′-CGATCCCGGGCGTCTCTGAGTTGAAGGCGCAC-3′(SEQ ID NO：49)；XmaI位点加下划线)或AH520-R(5′-CGATCCCGGGCACCACTAATTTCCTCTCGCTTC-3′(SEQ ID NO：50)；XmaI位点加下划线)进行PCR。将获得的DNA片段用PstI和XmaI切开，插入到用PstI和XmaI消化的pCAP-HA1/Anhui或pCAP-HA1/Anhui/467中。构建的质粒被命名为pCAP-AH/345，pCAP-AH/345/467，pCAP-AH/410，pCAP-AH/410/467，pCAP-AH/473，pCAP-AH/473/467，pCAP-AH/520和pCAP-AH/520/467。

(11)本发明的转化载体质粒pCAP-VN/346，pCAP-VN/346/467，pCAP-VN/410，pCAP-VN/410/467，pCAP-VN/473，pCAP-VN/473/467，pCAP-VN/520和pCAP-VN/520/467的构建

使用可以从DNA2.0，Inc.公司获得的Gene Designer进行密码子最适化，从流感病毒A/H5N1/Vietnam/1203/2004的血细胞凝集素的HA区域的氨基酸序列制备人工基因序列(SEQ ID NO：51)。使用该人工序列作为模板，使用VN17-F(5′-GACTCTGCAGGATCAGATCTGTATCGGATATC-3′(SEQ ID NO：52)；PstI位点加下划线)和VN346-R(5′-CGATCCCGGGCCCGCTTTTTCCTCCTCCGTTCG-3′(SEQ ID NO：53)；XmaI位点加下划线)或VN410-R(5′-CGATCCCGGGCCTCAAACTGCGTATTCATTTTG-3′(SEQ IDNO：54)；XmaI位点加下划线)或VN473-R(5′-CGATCCCGGGCTCTAAGCTGGAGCCTGACTTTGTC-3′(SEQ ID NO：55)；XmaI位点加下划线)或VN520-R(5′-CGATCCCGGGCACTAATCTCCTCTCTTTTAAGTC-3′(SEQ ID NO：56)；XmaI位点加下划线)进行PCR。将获得的DNA片段用PstI和XmaI切开，插入到用PstI和XmaI消化的pCAP-HA1/Anhui或pCAP-HA1/Anhui/467中。构建的质粒被命名为pCAP-VN/346，pCAP-VN/346/467，pCAP-VN/410，pCAP-VN/410/467，pCAP-VN/473，pCAP-VN/473/467，pCAP-VN/520和pCAP-VN/520/467。

(12)本发明的转化载体质粒pCAP-CO/full，pCAP-CO/full/467，pCAP-CO/19，pCAP-CO/19/467，pCAP-CO/76，pCAP-CO/76/467，pCAP-CO/205和pCAP-CO/205/467的构建

使用可以从DNA2.0，Inc.公司获得的Gene Designer进行密码子最适化，从恶性疟原虫3D7株的CSP的氨基酸序列制备了人工基因序列(SEQ ID NO：57)。使用该人工序列作为模板，使用引物对PfCSP opt-f(5′-GACTCTGCAGATGATGCGAAAATGGCCATACTG-3′(SEQ IDNO：58)；PstI位点加下划线)和PfCSP opt-r(397)(5′-CGATCCCGGGCATTGAGGAACAGAAAGGAAAGAACCATG-3′(SEQID NO：59)；XmaI位点加下划线)；PfCSP_opt-f(19)(5′-GACTCTGCAGCTGTTTCAGGAATACCAGTGCTATGG-3′(SEQ IDNO：60)；PstI位点加下划线和PfCSP_opt-r(373)(5′-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3′(SEQ ID NO：61)；XmaI位点加下划线)；PfCSP_opt-f(76)(5′-GACTCTGCAGGACGACGGAAATAATGAGGACAACG-3′(SEQID NO：62)；PstI位点加下划线)和PfCSP_opt-r(373)(5′-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3′(SEQ ID NO：61)；XmaI位点加下划线)；以及PfCSP_opt-f(205)(5′-GACTCTGCAGAATGCAAACCCAAATGCCAATCCAAACGC-3′(SEQ ID NO：63)；PstI位点加下划线)和PfCSP_opt-r(373)(5′-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3′(SEQ ID NO：61)；XmaI位点加下划线)进行了PCR。将获得的DNA片段用PstI和XmaI切开，插入到用PstI和XmaI消化的pCAP-HA1/Anhui或pCAP-HA1/Anhui/467中。构建的质粒被命名为pCAP-CO/full，pCAP-CO/full/467，pCAP-CO/19，pCAP-CO/19/467，pCAP-CO/76，pCAP-CO/76/467，pCAP-CO/205和pCAP-CO/205/467。

(13)本发明的转化载体质粒pCA64-HA1/Anhui和pCA64-PfCSP(A361E)的构建

使用BacVector-2000DNA(来自Novagen)的三重切割DNA，使用gp64-p-f(5′-GACTCGGACCGGCCAGATAAAAATAATCTTATCAATTAAG-3′(SEQ ID NO：64)；RsrII位点加下划线)和gp64-p-r(5′-CGATACTAGTAGCACTGAGGCTTCTTATATACCCG-3′(SEQ IDNO：65；SpeI位点加下划线)进行PCR。将获得的DNA片段用RsrII和SpeI切开，插入到用RsrII和SpeI消化的pCAP-HA1/Anhui或pCAP-PfCSP(A361E)中，构建转化载体质粒pCA64-HA1/Anhui和pCA64-PfCSP(A361E)，它们能够在哺乳动物和昆虫细胞中，在由CAG启动子和gp64启动子组成的所需双重启动子的控制之下，表达HA1抗原或PfCSP抗原与gp64蛋白的融合蛋白。

(14)本发明的转化载体质粒pCA39-HA1/Anhui和pCA39-PfCSP(A361E)的构建

使用BacVector-2000DNA(来自Novagen)的三重切割DNA，使用vp39-p-f(5′-GACTCGGACCGCGTCGTACAAATCGAAATATTGTTGTG-3′(SEQ ID NO：66)；RsrII位点加下划线)和vp39-p-r(5′-CGATACTAGTGTGATTGAGAAAGAAATCTCTTATTC-3′(SEQID NO：67)；SpeI位点加下划线)进行了PCR。将获得的DNA片段用RsrII和SpeI切开，插入到用RsrII和SpeI消化的pCAP-HA1/Anhui或pCAP-PfCSP(A361E)中，构建了转化载体质粒pCA39-HA1/Anhui和pCA39-PfCSP(A361E)，它们能够在哺乳动物和昆虫细胞中，在由CAG启动子和vp39启动子构成的所需双重启动子的控制之下，表达HA1抗原或PfCSP抗原与gp64蛋白的融合蛋白。

(15)本发明的pCAP-CO/full/VSV，pCAP-CO/19/VSV，pCAP-CO/76/VSV和pCAP-CO/205/VSV

使用pVSv-G(来自Clonetech)作为模板，使用VSV-G-f(5′-GACTCCCCGGGCGTTCGAACATCCTCACATTCAAG-3′(SEQ IDNO：68)；XmaI位点加下划线)，VSV-G-r(5′-GACTCACTTAGTGCTTTCCAAGTCGGTTCATCTC-3′(SEQ ID NO：69)；DraIII位点加下划线)进行了PCR。将获得的DNA片段插入到各用XmaI和DraIII消化的pCAP-CO/full，pCAP-CO/19，pCAP-CO/76和pCAP-CO/205中。构建的质粒被命名为pCAP-CO/full/VSV，pCAP-CO/19/VSV，pCAP-CO/76/VSV和pCAP-CO/205/VSV。

实施例2：本发明的重组杆状病毒及其产生方法

(1)使用用于产生重组杆状病毒的试剂盒(来自Novagen的BacVector-2000转染试剂盒)，通过将BacVector-2000DNA与实施例1中构建的每种下述转化载体共转染到Sf9细胞中，产生了重组杆状病毒，转化载体是：pCAP-PfCSP，pCAP-PfCSP/272，pCAP-PfCSP/467，pCAP-PfCSP(A361E)，pCAP-PfCSP(A361E)/272，pCAP-PfCSP(A361E)/467，pCAP-PfCSP-76，pCAP-PfCSP-76/467，pCAP-PfCSP+209，pCAP-PfCSP+209/467，pCAP-PfCSP+76/209，pCAP-PfCSP+76/209/467，pCAP-HA1/Anhui，pCAP-HA1/Anhui/272，pCAP-HA1/Anhui/467，pCAP-HA1/Vietnam，pCAP-HA1/Vietnam/51，pCAP-HA1/Vietnam/101，pCAP-HA1/Vietnam/154，pCAP-HA1/Vietnam/201，pCAP-HA1/Vietnam/272，pCAP-HA1/Vietnam/467，pCAP-AH/345，pCAP-AH/345/467，pCAP-AH/410，pCAP-AH/410/467，pCAP-AH/473，pCAP-AH/473/467，pCAP-AH/520，pCAP-AH/520/467，pCAP-VN/346，pCAP-VN/346/467，pCAP-VN/410，pCAP-VN/410/467，pCAP-VN/473，pCAP-VN/473/467，pCAP-VN/520，pCAP-VN/520/467，pCAP-CO/full，pCAP-CO/full/467，pCAP-CO/19，pCAP-CO/19/467，pCAP-CO/76，pCAP-CO/76/467，pCAP-CO/205，pCAP-CO/205/467，pCA39-HA1/Anhui，pCA64-HA1/Anhui，pCA39-PfCSP(A361E)，pCA64-PfCSP(A361E)，pCAP-CO/full/VSV，pCAP-CO/19/VSV，pCAP-CO/76/VSV，pCAP-CO/205/VSV，pDual-Pfs25-PfCSP-gp64和pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64。得到的重组杆状病毒被命名为AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272，AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467，AcNPV-CAP-PfCSP-76，AcNPV-CAP-PfCSP-76/467，AcNPV-CAP-PfCSP+209，AcNPV-CAP-PfCSP+209/467，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209，AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467，AcNPV-CAP-HA1/Anhui，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272，AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467，AcNPV-CAP-AH/345，AcNPV-CAP-AH/345/467，AcNPV-CAP-AH/410，AcNPV-CAP-AH/410/467，AcNPV-CAP-AH/473，AcNPV-CAP-AH/473/467，AcNPV-CAP-AH/520，AcNPV-CAP-AH/520/467，AcNPV-CAP-VN/346，AcNPV-CAP-VN/346/467，AcNPV-CAP-VN/410，AcNPV-CAP-VN/410/467，AcNPV-CAP-VN/473，AcNPV-CAP-VN/473/467，AcNPV-CAP-VN/520，AcNPV-CAP-VN/520/467，AcNPV-CAP-CO/full，AcNPV-CAP-CO/full/467，AcNPV-CAP-CO/19，AcNPV-CAP-CO/19/467，AcNPV-CAP-CO/76，AcNPV-CAP-CO/76/467，AcNPV-CAP-CO/205，AcNPV-CAP-CO/205/467，AcNPV-CA39-HA1/Anhui，AcNPV-CA64-HA1/Anhui，AcNPV-CA39-PfCSP(A361E)，AcNPV-CA64-PfCSP(A361E)，AcNPV-CAP-CO/full/VSV，AcNPV-CAP-CO/19/VSV，AcNPV-CAP-CO/76/VSV，AcNPV-CAP-CO/205/VSV，AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64和AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64。

实施例3：来自本发明的重组杆状病毒的疫苗抗原在昆虫细胞中表达的试验

将Sf9细胞以每个孔1x 10⁵个细胞的浓度在48孔板(来自Corning)中进行培养，使用在实施例2中获得的杆状病毒AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-HA1/Anhui和AcNPV-CAP-HA1/Vietnam或作为对照的野生型杆状病毒AcNPV-WT，以大约0.1的感染复数进行感染。5天后，从每个孔取出培养上清液，然后以每个孔0.05mL的量加入样品缓冲溶液(+2ME，x2)(来自Wako)，以完全裂解细胞。将细胞裂解液在100℃加热5分钟，在7.5％SDS-PAGE上进行电泳。电泳后，将蛋白转移到PVDF膜(来自Millipore的Immobilon-P)上，通过将膜浸泡在2.5％脱脂奶/SuperBlock(来自Pierce)中，在4℃进行阻断过夜。将其上已经转移有用每种杆状病毒感染的Sf9细胞的蛋白的膜，与作为第一抗体的抗gp64抗体(来自eBioScience的AcV5)温育，然后与作为第二抗体的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(来自BioRad)温育。使用ECLplus Western印迹检测试剂盒(来自GE Healthcare)显色以检测蛋白条带。图1显示了结果。

图1显示了Western印迹分析，显示了来自含有人类疟疾的PfCSP基因、流感病毒H5N1/Anhui/1/05株的HA1基因和H5N1/Vietnam/1203/04株的HA1基因的重组杆状病毒的融合抗原在昆虫细胞中的表达。在图1中，第1道显示了野生型杆状病毒(AcNPV-WT)的条带；第2道显示了含有插入到本发明的双重启动子下游的PfCSP基因和全长gp64基因的重组杆状病毒(AcNPV-CAP-PfCSP)的条带；第3道显示了含有插入到本发明的双重启动子下游的流感病毒H5N1/Anhui/1/05株的HA1基因和全长gp64基因的重组杆状病毒(AcNPV-CAP-HA1/Anhui)的条带；第4道显示了含有插入到本发明的双重启动子下游的流感病毒H5N1/Vietnam/1203/04株的HA1基因和全长gp64基因的重组杆状病毒(AcNPV-CAP-HA1/Vietnam)的条带。

正如在图1的第2、3和4道中显示的，在具有融合并表达在本发明的双重启动子下游的抗原基因和gp64基因的重组杆状病毒中，观察到了对应于表达的免疫原性外源基因和gp64基因的融合产物的条带。

上述结果证实了当使用本发明的重组病毒时，免疫原性外源基因和gp64基因可以融合并作为表达的融合产物在昆虫细胞中表达。

实施例4：呈递在本发明的重组杆状病毒的病毒粒子(毒粒)上的疫苗抗原中融合抗原的鉴定实验

将Sf9细胞培养到每个150mm细胞培养板(来自Sumilon)中1x10⁷个细胞的浓度，以大约0.1的感染复数用每种上述的杆状病毒进行感染。7天后，将培养基以3,000xg在4℃离心15分钟，共离心两次，将病毒溶液在25％蔗糖溶液上分层，使用超速离心机以25,000rpm在4℃离心90分钟，以产生病毒粒子。将0.05mL样品缓冲溶液(+2ME，x2)(来自Wako)加入到0.05mL每种通过超速离心收集的病毒浓缩物(1x10⁸PFU/mL)AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-HA1/Vietnam和AcNPV-WT中。将获得的混合物在100℃加热5分钟，在7.5％SDS-PAGE上进行电泳。电泳后，将获得的蛋白转移到PVDF膜(来自Millipore的Immobilon-P)上，浸泡在2.5％脱脂奶/SuperBlock(来自Pierce)中，在4℃进行阻断过夜。将其上已经转移有AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/272和AcNPV-CAP-PfCSP/467的病毒溶液的膜，与作为第一抗体的抗PfCSP抗体(2A10，MR-4)温育，然后与作为第二抗体的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(来自BioRad)温育。将其上已经转移有AcNPV-CAP-HA1/Vietnam的病毒溶液的膜，与作为第一抗体的抗H5N1抗体(来自Immune Technology的IT-003-005)温育，然后与作为第二抗体的HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(来自GE Healthcare)温育。使用ECLplus Western印迹检测试剂盒(来自GE Healthcare)显色以检测蛋白条带。图2显示了结果。

图2(A)显示了Western印迹分析，显示了人类疟疾的CSP基因(PfCSP)在使用重组转化载体制备的重组杆状病毒的病毒粒子中的表达。图2(A)左侧的第1道，显示了含有插入到本发明的双重启动子下游的PfCSP基因和全长gp64基因的重组杆状病毒(AcNPV-CAP-PfCSP)的条带；第2道显示了含有插入到本发明的双重启动子下游的PfCSP基因和部分长度的gp64基因(从C末端开始的241个氨基酸残基)的重组杆状病毒(AcNPV-CAP-PfCSP/272)的条带；第3道显示了含有插入到本发明的双重启动子下游的PfCSP基因和部分长度的gp64基因(从C末端开始的46个氨基酸残基)的重组杆状病毒(AcNPV-CAP-PfCSP/467)的条带。将杆状病毒进行电泳，检查PfCSP基因和gp64基因的表达的融合产物的存在。在图2(A)的所有道中，检测到了表明重组病毒粒子中存在PfCSP基因和gp64基因的融合抗原的强烈的条带。

图2(B)显示了Western印迹分析，显示了H5N1/HA1基因在使用重组转化载体制备的重组杆状病毒的病毒粒子中的表达。图2(B)左侧的第1道，显示了使用实施例3中制备的感染的AcNPV-WT细胞裂解液获得的结果；第2道显示了使用实施例3中制备的AcNPV-CAP-HA1/Anhui感染的细胞裂解液获得的结果；第3道显示了使用实施例3中制备的AcNPV-CAP-HA1/Vietnam感染的细胞裂解液获得的结果；第4道显示了野生型杆状病毒(AcNPV-WT)的病毒粒子的结果；第5道显示了含有插入到本发明的双重启动子下游的流感病毒H5N1/Vietnam/1203/04株的HA1基因和全长gp64基因的重组杆状病毒(AcNPV-CAP-HA1/Vietnam)的病毒颗粒的结果；第6道显示了纯化的H5N1的HA抗原(来自Immune Technology的IT-003-0053p)的结果。将杆状病毒进行电泳，检查PfCSP基因和gp64基因的表达的融合产物的存在。在图2(B)的第5道中，检测到了表明重组病毒粒子中存在H5N1/Vietnam/1203/04的HA1基因和gp64基因的融合抗原的强烈的条带。

上述实施例4的结果显示，具有所需免疫原性的外源基因和gp64基因可以融合和表达在通过使用本发明的重组转化载体生产的本发明的重组杆状病毒的重组病毒粒子中。

实施例5：来自本发明的重组杆状病毒的疫苗抗原在哺乳动物中的表达的试验

将HepG2细胞用AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP以感染复数为1进行感染。48小时后，取出培养上清液，将板用PBS清洗3次。加入冷却到-20℃的丙酮/乙醇溶液(混合比为7∶3)，将细胞在-20℃固定化5分钟。加入5％正常山羊血清(来自Sigma)，在室温进行1小时阻断。为了检测PfCSP的表达，加入用Alexa Flour 594标记的抗PfCSP抗体(2A10，MR-4)；为了检测PfMSP-1₁₉的表达，加入抗PfMSP-1₁₉抗体(5.2，MR-4)然后加入FITC标记的抗小鼠抗体。温育后，在荧光显微镜下检测反应的细胞。

图3显示了结果。

图3显示了使用荧光标记抗体染色的HepG2细胞，表明了抗原已经从含有PfMSP1基因和PfCSP基因的融合基因的重组杆状病毒表达在HepG2细胞中。图3(A)的结果证实了PfCSP抗原已经表达。图3(B)的结果证实了PfMSP-1₁₉抗原已经表达。因此，证实了融合抗原可以在哺乳动物细胞中表达。图3(A)和(B)的结果清楚地显示，通过使用含有本发明的双重启动子的转化载体产生的重组杆状病毒，可以在哺乳动物细胞中表达所需抗原。

这表明当使用本发明的重组转化载体生产的重组杆状病毒被给药于人类和其他哺乳动物时，病毒粒子进入哺乳动物细胞，哺乳动物启动子发挥作用，在哺乳动物细胞中产生了所需外源抗原基因和gp64基因的融合产物，从而诱导获得性免疫。

实施例6：通过PfCSP抗原重组病毒和H5N1/HA1抗原重组病毒诱导抗体

1.病毒溶液的接种

将通过超速离心浓缩的AcNPV-WT，AcNPV-CAP-PfCSP，AcNPV-CAP-PfCSP/467，AcNPV-CAP-HA1/Anhui和AcNPV-CAP-HA1/Vietnam的病毒溶液，以1x 10⁸PUF的量，两次，时间间隔为两周，接种到BALB/c雌性小鼠的大腿肌肉中。

2.抗体滴度的测量

在最后一次免疫接种后两周，对小鼠实施安乐死，从小鼠收集血清，用于测量抗原特异性抗体滴度。由AcNPV-CAP-PfCSP和AcNPV-CAP-PfCSP/467诱导的PfCSP抗原特异性抗体滴度，使用其上已经固定化有(NANP)₄NVDPC肽(来自Sigma)、即PfCSP的B细胞表位的板，通过ELISA进行测量。由AcNPV-CAP-HA1/Anhui和AcNPV-CAP-HA1/Vietnam诱导的H5N1/HA抗原特异性抗体滴度，使用其上已经固定化有H5N1病毒的纯化的HA抗原(来自ImmuneTechnology的IT-003-005p)的板，通过ELISA进行测量。使用MaxiSorp(来自NUNC)作为ELISA板，HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H&L)抗体(来自American Qualex)作为第二抗体，TMB(来自Calbiochem)用于颜色反应，测量了OD450nm的吸光度。

图4显示了结果。

图4(A)是当对小鼠血清进行连续的两倍稀释，从800倍到102,400倍稀释率时，对在OD450nm处获得的每组的平均吸光度进行的作图。在其血清不含针对抗原的抗体的PBS和AcNPV-WT接种的组中，甚至在800倍稀释率时的吸光度也仅为0.1或以下，表明了低的反应性。相反，在用AcNPV-CAP-PfCSP和AcNPV-CAP-PfCSP/467接种的组中，800倍稀释率时的吸光度分别为1.138和1.878，表明了强烈的反应性，并清楚地显示出诱导了抗原特异性抗体。图4(B)是当对小鼠血清进行连续的两倍稀释，从400倍到25,600倍稀释率时，对在OD450nm处获得的每组的平均吸光度进行的作图。在其血清不含针对抗原的抗体的PBS和AcNPV-WT接种的组中，甚至在800倍稀释率时的吸光度也仅为0.1或以下，表明了低的反应性。相反，在用AcNPV-CAP-HA1/Anhui和AcNPV-CAP-HA1/Vietnam接种的组中，3,200倍稀释率时的吸光度分别为1.551和2.503，表明了强烈的反应性，并清楚地显示出诱导了抗原特异性抗体。图4清楚地显示了使用含有本发明的双重启动子的转化载体产生的重组杆状病毒，可以在哺乳动物中诱导针对所需抗原的抗体。

3.中和值的测量

使用AcNPV-CAP-PiA1/Anhui接种的小鼠血清进行红细胞凝集素抑制(HI)试验。更具体来说，按照在与流感HI反应试剂“Seiken”(来自Denka Seiken Co.，Ltd.)包装在一起的说明书中描述的方法，使用纯化的H5N1病毒的HA抗原(来自Immune Technology的IT-003-0053p)进行了试验。非特异性凝集素的吸附使用红细胞进行，非特异性凝集抑制剂的移除使用“Seiken”的RDE(II)(来自DenkaSeiken Co.，Ltd.)进行。HI试验以下述方式进行。使用稀释剂将96孔板中的0.025mL稀释10倍的抗血清进行2倍的连续稀释。在含有稀释的抗血清的96孔板的每个孔中，加入0.025mL H5N1病毒的HA抗原，该抗原被稀释以获得在其每个0.025mL中4个HA的滴度。允许板在室温放置30分钟。加入0.05mL红细胞悬液以进行反应，并搅动孔。使混合物在室温放置60分钟。其中血细胞凝集被完全抑制的测试样品的最终稀释度被定义为HI抗体滴度。

结果显示，用PBS和AcNPV-WT接种的血清具有10或以下的HI抗体滴度，而用AcNPV-CAP-HA1/Anhui接种的血清具有40的HI抗体滴度。

结果似乎表明，当给药于人类或其他哺乳动物时，从本发明的重组转化载体产生的重组杆状病毒，可以诱导有效针对所需外源抗原基因的抗体，从而提供疫苗效力。

序列表非关键词文字：

SEQ ID NOS：1和2是用于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv的基因组DNA的PCR的引物phsp65-F1和phsp65-R1的序列。

SEQ ID NOS：3和4是使用pcDNA-hps65作为模板进行PCR的引物phsp65-F2和phsp65-R2的序列。

SEQ ID NOS：5和6是使用pBACsurf-1作为模板进行PCR以产生gp64基因DNA片段的引物pPolh-F2和pgp64-R2的序列。

SEQ ID NOS：7和8是进行PCR以产生流感病毒HA基因片段的的引物HA-f和HA-r的序列。

SEQ ID NOS：9和10是使用pCR-Blunt-HA作为模板进行PCR的引物pHA-F1和pHA-R1的序列。

SEQ ID NOS：11和12是使用pBACsurf-HA1作为模板进行PCR的引物Polh-fRsrII和GP64-r DraIII的序列。

SEQ ID NOS：13和14是用于流感病毒PR/8/34株的基因组RNA的RT-PCR的引物NP-fEcoRI和NP-r Cfr9I的序列。

SEQ ID NOS：15、16和12是用于pCAP-H1N1/HA1-gp64的PCR的引物gp64(272)-f、gp64(467)-f和GP64-r DraIII的序列。

SEQ ID NOS：17和18是使用恶性疟原虫(P.falciparum)基因组DNA作为模板进行PCR的引物PfCSP-f(19)和PfCSP-r(373)的序列。

SEQ ID NOS：19和20是使用伯氏疟原虫(P.berghei)基因组DNA作为模板进行PCR的引物pAMA-F1和pAMA1-R1的序列。

SEQ ID NOS：21和22是使用恶性疟原虫(P.falciparum)基因组DNA作为模板进行PCR的引物pPfCSP-F1和pPfCSP-R1的序列。

SEQ ID NOS：23和24是使用恶性疟原虫(P.falciparum)基因组DNA作为模板进行PCR的引物pPfs25-F1和pPfs25-R2的序列。

SEQ ID NOS：25和26是使用恶性疟原虫(P.falciparum)基因组DNA作为模板进行PCR的引物pPfMSP119-F1和pPfMSP119-R2的序列。

SEQ ID NOS：17和27是使用pCAP-PfCSP作为模板进行PCR的引物PfCSP-f(19)和PfCSP-r(373A361E)的序列。

SEQ ID NOS：28和27是使用pCAP-PfCSP作为模板进行PCR的引物PfCSP-f(76)和PfCSP-r(373A361E)的序列。

SEQ ID NO：29是使用在Sf9和人类细胞中常用的密码子，从恶性疟原虫(P.falciparum)3D7株的氨基酸序列产生的人工基因(PfCSP+)的序列(但是其中361位的A被E取代)。

SEQ ID NOS：30和31是使用PfCSP+作为模板进行PCR的引物PfCSP-f(+209)和PfCSP-r(+A361E)的序列。

SEQ ID NOS：32、33、34和31是使用PfCSP+作为模板进行PCR的引物PfCSP-f(+76)、PfCSP-r(+128)、PfCSP-f(+209)BamHI和PfCSP-r(+A361E)的序列。

SEQ ID NO：35是使用在Sf9和人类细胞中常用的密码子，从流感病毒H5N1/Anhui/1/05的红细胞凝集素的HA1区的氨基酸序列产生的人工基因的序列。

SEQ ID NOS：36和37是使用SEQ ID NO：35的人工基因序列作为模板进行PCR的引物AH-F1(5′-CAGTCTGCAGGACCAGATTTGCATC-3′(SEQ ID NO：36)；PstI位点加下划线)和AH-R4(5′CAGTCCCGGGCTCTCTTGCGCCTGC-3′(SEQ ID NO：37)；XmaI位点加下划线)的序列。

SEQ ID NO：38是使用在Sf9和人类细胞中常用的密码子，从流感病毒H5N1/Vietnam/1203/04的红细胞凝集素的HA1区的氨基酸序列产生的人工基因的序列。

SEQ ID NOS：39和40是使用SEQ ID NO：38的人工基因序列作为模板进行PCR的引物VN-F1(5′CAGTCTGCAGGACCAGATCTGTATC-3′(SEQ ID NO：39)；PstI位点加下划线)和VN-R4(5′CAGTCCCGGGCTCTCTTCTTCCTGC-3′(SEQ ID NO：40)；XmaI位点加下划线)的序列。

SEQ ID NOS：41、42、43、44和12是引物gp64(51)-f(5′-GACTCCCCGGGTGGAAATCACCATCGTGGAGACG-3′(SEQ IDNO：41)；XmaI位点加下划线)，gp64(101)-f(5′-GACTCCCCGGGATTTGCTTATGTGGAGCATCAGG-3′(SEQ ID NO：42)；XmaI位点加下划线)，gp64(154)-f(5′-GACTCCCCGGGCGCACCACACGTGCAACAAATCG-3′(SEQ IDNO：43)；XmaI位点加下划线)，gp64(201)-f(5′-GACTCCCCGGGACACTGTGCTTCATCGAGACGGC-3′(SEQ ID NO：44)；XmaI位点加下划线)，以及GP64-r DraIII(5′-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3′(SEQID NO：12)；DraIII位点加下划线)的序列。

SEQ ID NO：45是使用可以从DNA2.0，Inc.公司获得的GeneDesigner进行密码子最适化，从流感病毒H5N1/Anhui/1/05的红细胞凝集素的HA1区的氨基酸序列产生的人工基因的序列。

SEQ ID NOS：46、47、48、49和50是使用SEQ ID NO：45的人工基因序列作为模板进行PCR的AH17-F(5′-GACTCTGCAGGATCAGATCTGTATTGGGTACC-3′(SEQ ID NO：46)；PstI位点加下划线)和AH345-R(5′-CGATCCCGGGCTCTCTTTCTCCTCCGCTCGC-3′(SEQID  NO：47)；XmaI位点加下划线)，AH410-R(5′-CGATCCCGGGCGGCCTCGAACTGGGTGTTCATT-3′(SEQ IDNO：48)；XmaI位点加下划线)，AH473-R(5′-CGATCCCGGGCGTCTCTGAGTTGAAGGCGCAC-3′(SEQ ID NO：49)；XmaI位点加下划线)，以及AH520-R(5′-CGATCCCGGGCACCACTAATTTCCTCTCGCTTC-3′(SEQ ID NO：50)；XmaI位点加下划线)的序列。

SEQ ID NO：51是使用可以从DNA2.0，Inc.公司获得的GeneDesigner进行密码子最适化，从流感病毒H5N1/Vietnam/1203/04的红细胞凝集素的HA1区的氨基酸序列产生的人工基因的序列。

SEQ ID NOS：52、53、54、55和56是使用SEQ ID NO：51的人工基因序列作为模板进行PCR的引物VN17-F(5′-GACTCTGCAGGATCAGATCTGTATCGGATATC-3′(SEQ ID NO：52)；PstI位点加下划线)，和VN346-R(5′-CGATCCCGGGCCCGCTTTTTCCTCCTCCGTTCG-3′(SEQ ID NO：53)；XmaI位点加下划线)，VN410-R(5′-CGATCCCGGGCCTCAAACTGCGTATTCATTTTG-3′(SEQ ID NO：54)；XmaI位点加下划线)，VN473-R(5′-CGATCCCGGGCTCTAAGCTGGAGCCTGACTTTGTC-3′(SEQ IDNO：55)；XmaI位点加下划线)，和VN520-R(5′-CGATCCCGGGCACTAATCTCCTCTCTTTTAAGTC-3′(SEQ IDNO：56)；XmaI位点加下划线)的序列。

SEQ ID NO：57是使用可以从DNA2.0，Inc.公司获得的GeneDesigner进行密码子最适化，从恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)3D7株的CSP的氨基酸序列产生的人工基因的序列。

SEQ ID NOS：58、59、60、61和62是使用SEQ ID NO：57的人工基因序列作为模板进行PCR  的引物PfCSP_opt-f(5′-GACTCTGCAGATGATGCGAAAATTGGCCATACTG-3′(SEQ IDNO：58)；PstI位点加下划线)，PfCSP_opt-r(397)(5′-CGATCCCGGGCATTGAGGAACAGAAAGGAAAGAACCATG-3′(SEQ ID NO：59)；XmaI位点加下划线)，PfCSP_opt-f(19)(5′-GACTCTGCAGCTGTTTCAGGAATACCAGTGCTATGG-3′(SEQID NO：60)；PstI位点加下划线)，PfCSP_opt-r(373)(5′-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3′(SEQ IDNO：61)；(XmaI位点加下划线)，PfCSP_opt-f(76)(5′-GACTCTGCAGGACGACGGAAATAATGAGGACAACG-3′(SEQID NO：62)；PstI位点加下划线)，以及PfCSP_opt-f(205)(5′-GACTCTGCAGAATGCAAACCCAAATGCCAATCCAAACGC-3′(SEQ ID NO：63)；PstI位点加下划线)的序列。

SEQ ID NOS：64、65、66和67是使用杆状病毒基因组DNA作为模板进行PCR的引物gp64-p-f(5′-GACTCGGACCGGCCAGATAAAAATAATCTTATCAATTAAG-3′(SEQ ID NO：64)；RsrII位点加下划线)，gp64-p-r(5′-CGATACTAGTAGCACTGAGGCTTCTTATATACCCG-3′(SEQ ID NO：65)；SpeI位点加下划线)，和vp39-p-f(5′-GACTCGGACCGCGTCGTACAAATCGAAATATTGTTGTG-3′(SEQ ID NO：66)；RsrII位点加下划线)和vp39-p-r(5′-CGATACTAGTGTGATTGAGAAAGAAATCTCTTATTC-3′(SEQID NO：67)；SpeI位点加下划线)的序列。

SEQ ID NOS：68和69是使用pVSV-G作为模板进行PCR的引物VSV-G-f(5′-GACTCCCCGGGCGTTCGAACATCCTCACATTCAAG-3′(SEQ ID NO：68)；XmaI位点加下划线)和VSV-G-r(5′-GACTCACTTAGTGCTTTCCAAGTCGGTTCATCTC-3′(SEQ IDNO：69)；DraIII位点加下划线)的序列。

序列表

<110>学校法人自治医科大学

       大塚制药株式会社

 

<120>带有控制免疫原性融合基因的脊椎动物和杆状病毒双重启动子的杆状病毒载体

 

<130>SCT100189-70

 

<150>JP2007-205785

<151>2007-08-07

 

<160>79

 

<170>PatentIn version 3.4

 

<210>1

<211>42

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer phsp65-F1

 

<400>1

aataatagat ctaatggcca agacaattgc gtacgacgaa ga                       42

 

<210>2

<211>63

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer phsp65-R1

 

<400>2

aatccaatgc ggccgcggga attcgattcc tgcaggtcag aaatccatgc cacccatgtc    60

 

gcc                                                                  63

 

<210>3

<211>74

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer phsp65-F2

 

<400>3

cacccctgca ggactacaag gacgacgatg acaaggaatt catggccaag acaattgcgt    60

 

acgacgaaga ggcc                                                      74

 

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer phsp65-R2

 

<400>4

cccgggcgaa atccatgcca cccatgtcgc cgccacc                             37

 

<210>5

<211>48

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer pPolh-F2

 

<400>5

cacccggacc ggataattaa aatgataacc atctcgcaaa taaataag                 48

 

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer pgp64-R2

<400>6

ggtaccatat tgtctattac ggtttctaat catac                         35

 

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer HA-f

 

<400>7

cctgcaggta tgaaggcaaa cctactggtc                               30

 

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer HA-r

 

<400>8

gcccgggcga tgcatattct gca                                      23

 

<210>9

<211>37

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer HA-F1

 

<400>9

caccgaattc gacacaatat gtataggcta ccatgcg                       37

 

<210>10

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer pHA-R1

 

<400>10

cccgggcacc tctggattgg atggacggaa tg                         32

 

<210>11

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer Polh-f RsrII

 

<400>11

gggcggaccg gataattaaa atgataacca tctcg                      35

 

<210>12

<211>37

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer GP64-r DraIII

 

<400>12

gggcacttag tgatattgtc tattacggtt tctaatc                    37

 

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer NP-f EcoRI

 

<400>13

acggaattcc attcaattca aactgga                               27

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer NP-r Cfr9I

 

<400>14

gatcccgggc cttgtcaatg ctgaatggca a                                31

 

<210>15

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer gp64(272)-f

 

<400>15

gactccccgg gtcgagcacc gagtcaagaa g                                31

 

<210>16

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer gp64(467)-f

 

<400>16

gactccccgg gacatcactt ccatggctga a                                31

 

<210>17

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer PfCSP-f(19)

<400>17

gactctgcag ttattccagg aataccagtg ctatggaag          39

 

<210>18

<211>44

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>PfCSP-r(373)

 

<400>18

cgatcccggg ctttttccat tttacaaatt tttttttcaa tatc    44

 

<210>19

<211>40

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer pAMA-F1

 

<400>19

caccgaattc aatccatggg aaaagtatac ggaaaaatat         40

 

<210>20

<211>37

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer pAMA1-R1

 

<400>20

cccgggcttc tctggtttga tgggctttca tatgcac            37

 

<210>21

<211>40

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer pPfCSP-F1

 

<400>21

caccgaattc  ttattccagg aataccagtg ctatggaagt                         40

 

<210>22

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer pPfCSP-R1

 

<400>22

cccgggcttt ttccatttta caaatttttt tttc                                34

 

<210>23

<211>43

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer pPfs25-F1

 

<400>23

caccgaattc aaagttaccg tggatactgt atgcaaaaga gga                      43

 

<210>24

<211>66

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer pPfs25-R2

 

<400>24

caattgagat ccgccgccac cgccaccagt acatatagag ctttcattat ctattataaa    60

tccatc                                                               66

 

<210>25

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer pPfMSP119-F1

 

<400>25

caccgaattc aacatttcac aacaccaatg cgtaaaaaaa c                        41

 

<210>26

<211>64

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer pPfMSP119-R2

 

<400>26

caattgagat ccgccgccac cgccaccgtt agaggaactg cagaaaatac catcgaaaag    60

 

tgga                                                                 64

 

<210>27

<211>50

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer PfCSP-r(373A361E)

 

<400>27

cgatcccggg ctttttccat  tttacaaatt  tttttttcaa tatcattttc            50

 

<210>28

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer PfCSP-f(76)

 

<400>28

gactctgcag gatgatggaa ataacgaaga caacg                                35

 

<210>29

<211>1194

<212>DNA

<213>Plasmodium falciparum

 

<400>29

atgatgcgca aactggccat tctgagcgtg agcagctttc tgtttgtgga agccctgttt     60

caggaatacc agtgctacgg cagcagcagc aacacccgcg tgctgaacga actgaactac    120

gacaacgccg gcaccaacct gtacaacgaa ctggaaatga actactacgg caaacaggaa    180

aactggtaca gcctgaaaaa aaacagccgc agcctgggcg aaaacgacga cggcaacaac    240

gaagacaacg aaaaactgcg caaacccaaa cacaaaaaac tgaaacagcc cgccgacggc    300

aaccccgacc ccaacgccaa ccccaacgtg gaccccaatg ccaacccaaa tgtggaccca    360

aatgccaacc caaatgtgga tcctaacgcc aacccaaacg caaatcccaa tgccaaccct    420

aacgctaatc caaacgccaa ccccaacgct aaccctaatg ctaacccaaa cgctaaccct    480

aacgctaacc ctaacgccaa tcccaatgcc aaccccaacg ccaacccaaa cgctaaccca    540

aacgctaacc ctaacgccaa cccaaacgcc aatcccaacg ctaaccctaa cgtggacccc    600

aatgcaaatc ccaacgccaa tccaaacgct aatccaaacg ctaatcccaa cgctaatccc    660

aatgccaacc caaacgcaaa tccaaatgcc aaccccaacg ccaaccctaa cgccaaccct    720

aacgcaaacc caaacgccaa ccccaatgcc aaccctaacg ctaacccaaa cgccaatccc    780

aatgccaacc caaacgctaa ccctaacgcc aatcccaaca agaacaacca gggcaatggc    840

cagggccaca atatgccaaa tgaccccaac cgcaacgtgg acgaaaacgc caacgccaac    900

agcgccgtga aaaacaacaa caacgaagaa cccagcgaca aacacattaa agaatacctg     960

aacaaaattc agaacagcct gagcaccgaa tggagcccct gcagcgtgac ctgcggcaac    1020

ggcattcagg tgcgcattaa acccggcagc gccaacaaac ccaaagacga actggactac    1080

gaaaacgaca ttgaaaaaaa aatttgcaaa atggaaaaat gcagcagcgt gtttaacgtg    1140

gtgaacagca gcattggcct gattatggtg ctgagctttc tgtttctgaa ctag          1194

 

<210>30

<211>52

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer PfCSP-f(+209)

 

<400>30

gactctgcag aacgctaatc caaacgctaa tcccaacgct aatcccaatg cc             52

 

<210>31

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer PfCSP-r(+A361E)

 

<400>31

cgatcccggg ctttttccat tttgcaaatt ttttt                                35

 

<210>32

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer PfCSP-f(+76)

<400>32

gactctgcag gacgacggca acaacgaaga caacg                                35

 

<210>33

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer PfCSP-r(+128)

 

<400>33

cgttaggatc cacatttggg ttggcatttg gg                                   32

 

<210>34

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer PfCSP-f(+209)

 

<400>34

gactggatcc taacgctaat ccaaacgcta atccc                                35

 

<210>35

<211>987

<212>DNA

<213>Influenza virus

 

<400>35

gaccagattt gcatcggata ccacgccaac aacagcaccg agcaggtcga taccatcatg     60

gagaaaaacg tgaccgtcac ccacgctcag gacatcctgg agaagactca caatggaaag    120

ctctgcgacc tggacggcgt gaaacccctc atcctgagag attgttctgt ggccggatgg    180

ctgctgggaa accccatgtg cgatgaattt atcaacgtcc cagagtggag ttacatcgtg    240

gagaaggcca accctgccaa cgacctgtgt taccccggca acttcaacga ctacgaggag    300

ctgaagcacc tgctctcacg catcaaccac ttcgagaaga tccagattat ccctaagtct    360

agttggagtg accacgaggc cagttccggc gtgtcctctg cctgtccata ccagggcaca    420

cccagtttct tcagaaacgt cgtctggctg atcaagaaga acaacacata ccccaccatc    480

aagcgaagtt acaacaacac caaccaggag gacctcctca tcctgtgggg aatccaccac    540

tctaacgacg ctgccgaaca gacaaagctg taccagaatc ccaccaccta catctccgtg    600

ggaacaagca ccctcaacca gcgcctggtg cccaagatcg ctacacgatc aaaggtgaat    660

ggccagtccg gcaggatgga ctttttctgg accatcctca aacccaacga cgccatcaat    720

tttgagtcta atggcaactt catcgccccc gagtacgctt acaagatcgt caagaaagga    780

gactccgcca tcgtgaagtc cgaggtggag tacggcaact gcaacaccaa gtgccagacc    840

ccaattggag ccattaactc cagtatgccc ttccacaata tccacccact gacaattggc    900

gaatgcccca aatacgtgaa aagcaacaaa ctggtcctgg ctaccggact gcgcaacagc    960

cccctgcgcg agcgcaggcg caagaga                                        987

 

<210>36

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer AH-F1

 

<400>36

cagtctgcag gaccagattt gcatc                                           25

 

<210>37

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer AH-R4

<400>37

cagtcccggg ctctcttgcg cctgc                                           25

 

<210>38

<211>990

<212>DNA

<213>influenza virus

 

<400>38

gaccagatct gtatcggata ccacgccaac aacagtaccg aacaggtgga caccattatg     60

gagaagaatg tgaccgtgac ccacgcccag gatatcctgg agaagaagca caacggcaaa    120

ctgtgcgatc tggacggcgt gaagcccctg atcctgcgcg attgctccgt ggccggatgg    180

ctgctgggca accctatgtg cgacgaattt atcaacgtgc ccgaatggag ttacattgtg    240

gagaaggcta accccgtgaa tgacctgtgc taccccggag acttcaacga ctacgaagag    300

ctgaagcatc tgctgtcaag gattaaccac ttcgagaaga tccagattat tcccaagtct    360

agctggagct cccacgaggc ctcactggga gtgtccagcg cctgccccta ccagggcaag    420

tcaagcttct ttcgcaacgt ggtgtggctg atcaagaaga atagtaccta ccccacaatc    480

aagaggtcct acaacaacac caaccaggaa gacctgctgg tgctgtgggg aatccatcac    540

cccaatgacg ctgccgaaca gaccaagctg taccagaacc caactaccta catcagcgtg    600

ggcaccagca cactgaacca gcgcctggtg cctagaatcg ccaccagatc caaagtgaac    660

ggccagtccg gccgcatgga atttttctgg acaatcctga agcccaatga tgccatcaac    720

ttcgagagca atggaaactt catcgccccc gaatacgcct acaagattgt gaaaaaaggc    780

gattccacca tcatgaagtc agaactggag tacggcaact gtaacaccaa gtgccagact    840

cccatgggcg ccatcaactc cagcatgcca ttccacaaca tccatccact gaccatcggc    900

gagtgcccca agtacgtgaa gtccaacaga ctggtgctgg ctaccggact gcgcaattcc    960

ccacagaggg agagacgcag gaagaagaga                                     990

<210>39

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer VN-F1

 

<400>39

cagtctgcag gaccagatct gtatc                                            25

 

<210>40

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer VN-R4

 

<400>40

cagtcccggg ctctcttctt cctgc                                            25

 

<210>41

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer gp64(51)-f

 

<400>41

gactccccgg gtggaaatca ccatcgtgga gacg                                  34

 

<210>42

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer gp64(101)-f

 

<400>42

gactccccgg gatttgctta tgtggagcat cagg                                  34

 

<210>43

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer gp64(154)-f

 

<400>43

gactccccgg gcgcaccaca cgtgcaacaa atcg                                  34

 

<210>44

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer gp64(201)-f

 

<400>44

gactccccgg gacactgtgc ttcatcgaga cggc                                  34

 

<210>45

<211>1701

<212>DNA

<213>influenza virus

 

<400>45

atggagaaga tcgtgctgtt gctggcaata gttagtttgg tcaagtcaga tcagatctgt     60

attgggtacc acgctaataa ttctacagaa caggtagaca cgatcatgga gaaaaacgtg    120

accgtcactc atgcgcaaga tattttggag aagacacaca acgggaagct ctgcgatctg    180

gatggggtga agcctctgat tcttcgggac tgctccgtgg cggggtggtt gcttggcaac    240

cctatgtgtg atgagttcat caacgtgcct gaatggtctt atattgtgga aaaagcgaat     300

cccgctaacg acctttgtta ccctggtaac ttcaacgatt acgaagaact caaacacctc     360

ctcagcagaa tcaatcactt cgaaaaaata cagattattc ccaaatcttc ctggtccgac     420

catgaggcat ccagcggagt atcaagtgca tgcccgtacc agggcactcc ctcatttttc     480

cgcaacgtgg tgtggttgat caagaaaaat aacacttatc cgaccatcaa gagaagctac     540

aacaacacta accaggagga cctgttgatc ctttggggca tacatcatag caacgacgcg     600

gcagaacaga ccaagcttta ccagaaccct acaacatata tcagcgtggg caccagtact     660

cttaatcaac ggttggtgcc caagatcgct acaaggagta aggtgaatgg gcagagcggg     720

cgaatggatt tcttctggac cattcttaaa cccaatgacg ctataaactt tgagagcaac     780

ggcaacttta ttgcccccga atatgcatac aagattgtga agaagggtga cagcgccatt     840

gtaaaaagcg aggtggagta cggtaattgt aacacaaagt gccaaacacc tataggggcc     900

attaatagct caatgccttt ccacaacatt cacccactga ctatcggtga atgcccaaaa     960

tacgtgaagt caaacaaact ggtactggca acagggctcc ggaattctcc cctgcgcgag    1020

cggaggagaa agagaggact ttttggggcc attgcaggct tcattgaggg agggtggcag    1080

ggcatggtag acggatggta tgggtatcat catagtaacg aacagggatc cggctacgcg    1140

gccgataagg agtcaaccca gaaggcaatt gacggcgtca caaataaggt caactccata    1200

attgataaaa tgaacaccca gttcgaggcc gtagggcgcg aatttaacaa cctcgaaaga    1260

aggatcgaga acctgaataa gaagatggag gatgggttcc tcgacgtttg gacttataat    1320

gctgaactct tggtcctcat ggaaaacgaa cgaacacttg actttcacga tagtaacgtc    1380

aaaaatctgt atgataaagt gcgccttcaa ctcagagaca acgccaagga actcgggaac    1440

gggtgcttcg agttctatca caaatgcgac aacgaatgca tggagagcgt gagaaacggc    1500

acttatgact acccacaata ctctgaggaa gcccgactga agcgagagga aattagtggt    1560

gtgaagctgg aaagcatcgg aacctatcaa attttgagta tttactctac agtggcaagc    1620

tcactggcgc ttgcaatcat ggtggctggc cttagcttgt ggatgtgctc caatggaagc    1680

ttgcagtgcc gaatttgcat c                                              1701

 

<210>46

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer AH17-F

 

<400>46

gactctgcag gatcagatct gtattgggta cc                                   32

 

<210>47

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer AH345-R

 

<400>47

cgatcccggg ctctctttct cctccgctcg c                                    31

 

<210>48

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer AH410-R

 

<400>48

cgatcccggg cggcctcgaa ctgggtgttc att                                  33

 

<210>49

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer AH473-R

 

<400>49

cgatcccggg cgtctctgag ttgaaggcgc ac                                  32

 

<210>50

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer AH520-R

 

<400>50

cgatcccggg caccactaat ttcctctcgc ttc                                 33

 

<210>51

<211>1704

<212>DNA

<213>influenza virus

 

<400>51

atggagaaaa ttgtcctgct gttcgctatt gtttccctgg ttaaatccga tcagatctgt     60

atcggatatc acgcgaataa tagcacagag caagtggata ccattatgga aaagaatgtg    120

actgtgaccc acgctcagga cattctggag aaaaagcaca acggaaaatt gtgcgacctt    180

gatggggtga agccattgat tctgagagac tgctctgtgg ctggatggct gctggggaac    240

cctatgtgcg atgagttcat taatgttccc gagtggtcct acatagtcga aaaggctaat    300

cctgtcaatg atctttgcta ccctggggat tttaatgact atgaggagct gaaacatttg    360

ttgagtagaa tcaaccactt tgagaaaatc cagatcatcc ccaagagttc ctggtcatct    420

catgaagcaa gccttggtgt gagctcagcc tgcccttatc aaggcaaatc cagcttcttt    480

cggaacgtgg tctggctcat caagaaaaat tcaacctatc cgactatcaa gagatcctat     540

aacaacacaa atcaggagga tctgttggta ctgtggggca tccaccatcc taacgatgca     600

gcagagcaga ccaagctcta ccagaaccca actacctaca tctccgttgg aactagcaca     660

ctgaaccaga gattggtacc tagaattgct acccgatcca aagtcaatgg ccagtccgga     720

agaatggaat tcttctggac aattctgaaa cccaatgacg ccattaattt cgagtcaaac     780

ggcaatttca ttgctccaga gtatgcttac aagatcgtga aaaagggtga tagtacaatt     840

atgaagagtg agttggagta cggcaactgc aatacaaaat gtcaaacacc catgggcgct     900

atcaattcat ccatgccttt ccacaatatc caccccctta ctatcggaga gtgcccgaag     960

tatgtcaagt ccaacaggct ggtcctggca actggactgc ggaatagccc gcaacgcgaa    1020

cggaggagga aaaagcgggg actgtttgga gctattgcag gcttcatcga aggtggttgg    1080

cagggcatgg tggacggttg gtatgggtat catcactcca acgaacaggg gagcggttat    1140

gccgcagaca aagagtcaac tcagaaggca attgatggag ttacaaacaa agtgaatagc    1200

attatcgaca aaatgaatac gcagtttgag gctgtcggcc gcgagttcaa taatctggag    1260

cggagaatcg aaaacctgaa caaaaagatg gaggacggct tcctggacgt gtggacatat    1320

aacgcagaac tgctcgtgct tatggagaat gaacggaccc tcgattttca cgactccaac    1380

gtaaagaatc tgtatgacaa agtcaggctc cagcttagag ataacgccaa ggaattgggg    1440

aatggatgtt ttgaattcta ccataagtgc gacaacgagt gcatggagtc cgtaagaaac    1500

ggaacctatg actatcccca gtactcagag gaggcaagac ttaaaagaga ggagattagt    1560

ggtgtgaaac tcgagtccat aggcatctat cagatcctga gtatctactc tacggtggcg    1620

tcatccctgg ccctggccat catggttgct ggcttgtcac tctggatgtg tagtaacggg    1680

agtctgcaat gcagaatatg tatt                                           1704

<210>52

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer VN17-F

 

<400>52

gactctgcag gatcagatct gtatcggata tc                                  32

 

<210>53

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer VN346-R

 

<400>53

cgatcccggg cccgcttttt cctcctccgt tcg                                 33

 

<210>54

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer VN410-R

 

<400>54

cgatcccggg cctcaaactg cgtattcatt ttg                                33

 

<210>55

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer VN473-R

<400>55

cgatcccggg ctctaagctg gagcctgact ttgtc                                 35

 

<210>56

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>primer VN520-R

 

<400>56

cgatcccggg cactaatctc ctctctttta agtc                                  34

 

<210>57

<211>1191

<212>DNA

<213>Plasmodium falciparum

 

<400>57

atgatgcgaa aattggccat actgtcagtc agcagcttct tgttcgtgga ggccctgttt     60

caggaatacc agtgctatgg ttccagctct aatacgcgag ttctgaacga gctgaactac    120

gataacgccg gcaccaacct ctacaatgag ctggagatga attactacgg caagcaggag    180

aattggtact cactcaagaa gaactccaga agtctcgggg agaacgacga cggaaataat    240

gaggacaacg aaaaacttag aaaacccaaa cacaagaaac tgaaacaacc tgccgatggt    300

aatcctgatc ctaatgcaaa cccaaatgtg gaccccaatg ctaaccccaa cgtcgatccg    360

aacgcgaacc ctaatgtgga tcctaacgcc aatccaaacg cgaatccgaa tgccaaccca    420

aacgccaacc caaacgctaa ccccaacgcg aaccccaacg ctaatccgaa cgccaatccc    480

aatgctaatc ccaatgcgaa ccctaacgct aatcccaacg caaatccgaa cgcaaaccct    540

aacgcaaacc ccaatgccaa ccctaacgcc aacccgaatg ccaatcctaa tgtggacccg    600

aacgccaatc cgaatgcaaa cccaaatgcc aatccaaacg ctaatcctaa cgccaacccc    660

aacgccaacc ctaatgctaa tccgaatgcg aatccaaatg ctaacccgaa cgctaatcca     720

aatgcaaatc ccaatgcaaa tccaaatgcg aacccgaatg ctaaccctaa tgcaaatcct     780

aatgcaaacc ctaatgcgaa tcccaatgca aaccccaata agaataatca gggaaatggc     840

cagggacata atatgcctaa tgaccctaac aggaacgttg atgagaacgc gaatgcgaac     900

tctgctgtaa agaacaacaa caatgaagag ccctccgata aacatattaa ggagtatctg     960

aataagatcc agaactcctt gtctaccgaa tggtccccct gttctgtgac gtgtggtaac    1020

ggaatccagg taaggatcaa acccggcagt gccaacaagc caaaggacga gctcgattac    1080

gctaatgata ttgaaaagaa aatttgtaag atggagaagt gcagctccgt attcaatgtg    1140

gtcaacagct caattggcct catcatggtt ctttcctttc tgttcctcaa t             1191

 

<210>58

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

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<400>58

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cgatcccggg ccttctccat cttacaaatt ttcttttcaa tatcattagc    50

 

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gactctgcag aatgcaaacc caaatgccaa tccaaacgc                  39

 

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gactcggacc ggccagataa aaataatctt atcaattaag                 40

 

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cgatactagt agcactgagg cttcttatat acccg                     35

 

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gactcggacc gcgtcgtaca aatcgaaata ttgttgtg                 38

 

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<220>

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<400>67

cgatactagt gtgattgaga aagaaatctc ttattc                        36

 

<210>68

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

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<400>68

gactccccgg gcgttcgaac atcctcacat tcaag                         35

 

<210>69

<211>34

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

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<400>69

gactcactta gtgctttcca agtcggttca tctc                          34

 

<210>70

<211>397

<212>PRT

<213>Plasmodium falciparum 3D7

 

<400>70

Met Met Arg Lys Leu Ala Ile Leu Ser Val Ser Ser Phe Leu Phe Val

1               5                   10                  15

Glu Ala Leu Phe Gln Glu Tyr Gln Cys Tyr Gly Ser Ser Ser Asn Thr

            20                  25                  30

Arg Val Leu Asn Glu Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Gly Thr Asn Leu Tyr

        35                  40                  45

Asn Glu Leu Glu Met Asn Tyr Tyr Gly Lys Gln Glu Asn Trp Tyr Ser

    50                  55                  60

Leu Lys Lys Asn Ser Arg Ser Leu Gly Glu Asn Asp Asp Gly Asn Asn

65                  70                  75                  80

Glu Asp Asn Glu Lys Leu Arg Lys Pro Lys His Lys Lys Leu Lys Gln

                85                  90                  95

Pro Ala Asp Gly Asn Pro Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro

            100                 105                 110

Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro

        115                 120                 125

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

    130                 135                 140

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

145                 150                 155                 160

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

                165                 170                 175

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

            180                 185                 190

Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

        195                 200                 205

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

    210                 215                 220

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

225                 230                 235                 240

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

                245                 250                 255

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

            260                 265                 270

Asn Lys Asn Asn Gln Gly Asn Gly Gln Gly His Asn Met Pro Asn Asp

        275                 280                 285

Pro Asn Arg Asn Val Asp Glu Asn Ala Asn Ala Asn Ser Ala Val Lys

    290                 295                 300

Asn Asn Asn Asn Glu Glu Pro Ser Asp Lys His Ile Lys Glu Tyr Leu

305                 310                 315                 320

Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val

                325                 330                 335

Thr Cys Gly Asn Gly Ile Gln Val Arg Ile Lys Pro Gly Ser Ala Asn

            340                 345                 350

Lys Pro Lys Asp Glu Leu Asp Tyr Ala Asn Asp Ile Glu Lys Lys Ile

        355                 360                 365

Cys Lys Met Glu Lys Cys Ser Ser Val Phe Asn Val Val Asn Ser Ser

    370                 375                 380

Ile Gly Leu Ile Met Val Leu Ser Phe Leu Phe Leu Asn

385                 390                 395

 

<210>71

<211>567

<212>PRT

<213>Influenza A virus(A/Anhui/1/2005(H5N1))

 

<400>71

 

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser

1               5                   10                  15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

            20                  25                  30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

        35                  40                  45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

    50                  55                  60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65                  70                  75                  80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

                85                  90                  95

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn

            100                 105                 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

        115                 120                 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser

    130                 135                 140

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Thr Pro Ser Phe Phe

145                 150                 155                 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Thr Ile

                165                 170                 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp

            180                 185                 190

Gly Ile His His Ser Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

        195                 200                 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

    210                 215                 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

225                 230                 235                 240

Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

                245                 250                 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

            260                 265                 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Val Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly

        275                 280                 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser

    290                 295                 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305                 310                 315                 320

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

                325                 330                 335

Pro Leu Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

            340                 345                 350

Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly

        355                 360                 365

Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu

    370                 375                 380

Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile

385                 390                 395                 400

Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn

                405                 410                 415

Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly

            420                 425                 430

Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu

        435                 440                 445

Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr

    450                 455                 460

Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn

465                 470                 475                 480

Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser

                485                 490                 495

Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg

            500                 505                 510

Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr

        515                 520                 525

Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu

    530                 535                 540

Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser

545                 550                 555                 560

Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

                565

 

<210>72

<211>568

<212>PRT

<213>Influenza A virus(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))

 

<400>72

 

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser

1               5                   10                  15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

            20                  25                  30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

        35                  40                  45

Leu Glu Lys Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

    50                  55                  60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65                  70                  75                  80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

                85                  90                  95

Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn

            100                 105                 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

        115                 120                 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser

    130                 135                 140

Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe

145                 150                 155                 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile

                165                 170                 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

            180                 185                 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

        195                 200                 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

    210                 215                 220

Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

225                 230                 235                 240

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

                245                 250                 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

            260                 265                 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly

        275                 280                 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

    290                 295                 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305                 310                 315                 320

Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

                325                 330                 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile

            340                 345                 350

Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr

        355                 360                 365

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys

    370                 375                 380

Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser

385                 390                 395                 400

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe

                405                 410                 415

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp

            420                 425                 430

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met

        435                 440                 445

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu

    450                 455                 460

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly

465                 470                 475                 480

Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu

                485                 490                 495

Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala

            500                 505                 510

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly

        515                 520                 525

Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala

    530                 535                 540

Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly

545                 550                 555                 560

Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

                565

<210>73

<211>1720

<212>PRT

<213>Plasmodium falciparum 3D7

 

<400>73

 

Met Lys Ile Ile Phe Phe Leu Cys Ser Phe Leu Phe Phe Ile Ile Asn

1               5                   10                  15

Thr Gln Cys Val Thr His Glu Ser Tyr Gln Glu Leu Val Lys Lys Leu

            20                  25                  30

Glu Ala Leu Glu Asp Ala Val Leu Thr Gly Tyr Ser Leu Phe Gln Lys

        35                  40                  45

Glu Lys Met Val Leu Asn Glu Glu Glu Ile Thr Thr Lys Gly Ala Ser

    50                  55                  60

Ala Gln Ser Gly Ala Ser Ala Gln Ser Gly Ala Ser Ala Gln Ser Gly

65                  70                  75                  80

Ala Ser Ala Gln Ser Gly Ala Ser Ala Gln Ser Gly Ala Ser Ala Gln

                85                  90                  95

Ser Gly Thr Ser Gly Pro Ser Gly Pro Ser Gly Thr Ser Pro Ser Ser

            100                 105                 110

Arg Ser Asn Thr Leu Pro Arg Ser Asn Thr Ser Ser Gly Ala Ser Pro

        115                 120                 125

Pro Ala Asp Ala Ser Asp Ser Asp Ala Lys Ser Tyr Ala Asp Leu Lys

    130                 135                 140

His Arg Val Arg Asn Tyr Leu Phe Thr Ile Lys Glu Leu Lys Tyr Pro

145                 150                 155                 160

Glu Leu Phe Asp Leu Thr Asn His Met Leu Thr Leu Cys Asp Asn Ile

                165                 170                 175

His Gly Phe Lys Tyr Leu Ile Asp Gly Tyr Glu Glu Ile Asn Glu Leu

            180                 185                 190

Leu Tyr Lys Leu Asn Phe Tyr Phe Asp Leu Leu Arg Ala Lys Leu Asn

        195                 200                 205

Asp Val Cys Ala Asn Asp Tyr Cys Gln Ile Pro Phe Asn Leu Lys Ile

    210                 215                 220

Arg Ala Asn Glu Leu Asp Val Leu Lys Lys Leu Val Phe Gly Tyr Arg

225                 230                 235                 240

Lys Pro Leu Asp Asn Ile Lys Asp Asn Val Gly Lys Met Glu Asp Tyr

                245                 250                 255

Ile Lys Lys Asn Lys Thr Thr Ile Ala Asn Ile Asn Glu Leu Ile Glu

            260                 265                 270

Gly Ser Lys Lys Thr Ile Asp Gln Asn Lys Asn Ala Asp Asn Glu Glu

        275                 280                 285

Gly Lys Lys Lys Leu Tyr Gln Ala Gln Tyr Asp Leu Ser Ile Tyr Asn

    290                 295                 300

Lys Gln Leu Glu Glu Ala His Asn Leu Ile Ser Val Leu Glu Lys Arg

305                 310                 315                 320

Ile Asp Thr Leu Lys Lys Asn Glu Asn Ile Lys Lys Leu Leu Asp Lys

                325                 330                 335

Ile Asn Glu Ile Lys Asn Pro Pro Pro Ala Asn Ser Gly Asn Thr Pro

            340                 345                 350

Asn Thr Leu Leu Asp Lys Asn Lys Lys Ile Glu Glu His Glu Glu Lys

        355                 360                 365

Ile Lys Glu Ile Ala Lys Thr Ile Lys Phe Asn Ile Asp Ser Leu Phe

    370                 375                 380

Thr Asp Pro Leu Glu Leu Glu Tyr Tyr Leu Arg Glu Lys Asn Lys Lys

385                 390                 395                 400

Val Asp Val Thr Pro Lys Ser Gln Asp Pro Thr Lys Ser Val Gln Ile

                405                 410                 415

Pro Lys Val Pro Tyr Pro Asn Gly Ile Val Tyr Pro Leu Pro Leu Thr

            420                 425                 430

Asp Ile His Asn Ser Leu Ala Ala Asp Asn Asp Lys Asn Ser Tyr Gly

        435                 440                 445

Asp Leu Met Asn Pro His Thr Lys Glu Lys Ile Asn Glu Lys Ile Ile

    450                 455                 460

Thr Asp Asn Lys Glu Arg Lys Ile Phe Ile Asn Asn Ile Lys Lys Lys

465                 470                 475                 480

Ile Asp Leu Glu Glu Lys Asn Ile Asn His Thr Lys Glu Gln Asn Lys

                485                 490                 495

Lys Leu Leu Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Lys Lys Asp Tyr Glu Glu Leu

            500                 505                 510

Leu Glu Lys Phe Tyr Glu Met Lys Phe Asn Asn Asn Phe Asn Lys Asp

        515                 520                 525

Val Val Asp Lys Ile Phe Ser Ala Arg Tyr Thr Tyr Asn Val Glu Lys

    530                 535                 540

Gln Arg Tyr Asn Asn Lys Phe Ser Ser Ser Asn Asn Ser Val Tyr Asn

545                 550                 555                 560

Val Gln Lys Leu Lys Lys Ala Leu Ser Tyr Leu Glu Asp Tyr Ser Leu

                565                 570                 575

Arg Lys Gly Ile Ser Glu Lys Asp Phe Asn His Tyr Tyr Thr Leu Lys

            580                 585                 590

Thr Gly Leu Glu Ala Asp Ile Lys Lys Leu Thr Glu Glu Ile Lys Ser

        595                 600                 605

Ser Glu Asn Lys Ile Leu Glu Lys Asn Phe Lys Gly Leu Thr His Ser

    610                 615                 620

Ala Asn Gly Ser Leu Glu Val Ser Asp Ile Val Lys Leu Gln Val Gln

625                 630                 635                 640

Lys Val Leu Leu Ile Lys Lys Ile Glu Asp Leu Arg Lys Ile Glu Leu

                645                 650                 655

Phe Leu Lys Asn Ala Gln Leu Lys Asp Ser Ile His Val Pro Asn Ile

            660                 665                 670

Tyr Lys Pro Gln Asn Lys Pro Glu Pro Tyr Tyr Leu Ile Val Leu Lys

        675                 680                 685

Lys Glu Val Asp Lys Leu Lys Glu Phe Ile Pro Lys Val Lys Asp Met

    690                 695                 700

Leu Lys Lys Glu Gln Ala Val Leu Ser Ser Ile Thr Gln Pro Leu Val

705                 710                 715                 720

Ala Ala Ser Glu Thr Thr Glu Asp Gly Gly His Ser Thr His Thr Leu

                725                 730                 735

Ser Gln Ser Gly Glu Thr Glu Val Thr Glu Glu Thr Glu Glu Thr Glu

            740                 745                 750

Glu Thr Val Gly His Thr Thr Thr Val Thr Ile Thr Leu Pro Pro Thr

        755                 760                 765

Gln Pro Ser Pro Pro Lys Glu Val Lys Val Val Glu Asn Ser Ile Glu

    770                 775                 780

His Lys Ser Asn Asp Asn Ser Gln Ala Leu Thr Lys Thr Val Tyr Leu

785                 790                 795                 800

Lys Lys Leu Asp Glu Phe Leu Thr Lys Ser Tyr Ile Cys His Lys Tyr

                805                 810                 815

Ile Leu Val Ser Asn Ser Ser Met Asp Gln Lys Leu Leu Glu Val Tyr

            820                 825                 830

Asn Leu Thr Pro Glu Glu Glu Asn Glu Leu Lys Ser Cys Asp Pro Leu

        835                 840                 845

Asp Leu Leu Phe Asn Ile Gln Asn Asn Ile Pro Ala Met Tyr Ser Leu

    850                 855                 860

Tyr Asp Ser Met Asn Asn Asp Leu Gln His Leu Phe Phe Glu Leu Tyr

865                 870                 875                 880

Gln Lys Glu Met Ile Tyr Tyr Leu His Lys Leu Lys Glu Glu Asn His

                885                 890                 895

Ile Lys Lys Leu Leu Glu Glu Gln Lys Gln Ile Thr Gly Thr Ser Ser

            900                 905                 910

Thr Ser Ser Pro Gly Asn Thr Thr Val Asn Thr Ala Gln Ser Ala Thr

        915                 920                 925

His Ser Asn Ser Gln Asn Gln Gln Ser Asn Ala Ser Ser Thr Asn Thr

    930                 935                 940

Gln Asn Gly Val Ala Val Ser Ser Gly Pro Ala Val Val Glu Glu Ser

945                 950                 955                 960

His Asp Pro Leu Thr Val Leu Ser Ile Ser Asn Asp Leu Lys Gly Ile

                965                 970                 975

Val Ser Leu Leu Asn Leu Gly Asn Lys Thr Lys Val Pro Asn Pro Leu

            980                 985                 990

Thr Ile Ser Thr Thr Glu Met Glu Lys Phe Tyr Glu Asn Ile Leu Lys

        995                 1000                1005

Asn Asn Asp Thr Tyr Phe Asn Asp Asp Ile Lys Gln Phe Val Lys

    1010                1015                1020

Ser Asn Ser Lys Val Ile Thr Gly Leu Thr Glu Thr Gln Lys Asn

    1025                1030                1035

Ala Leu Asn Asp Glu Ile Lys Lys Leu Lys Asp Thr Leu Gln Leu

    1040                1045                1050

Ser Phe Asp Leu Tyr Asn Lys Tyr Lys Leu Lys Leu Asp Arg Leu

    1055                1060                1065

Phe Asn Lys Lys Lys Glu Leu Gly Gln Asp Lys Met Gln Ile Lys

    1070                1075                1080

Lys Leu Thr Leu Leu Lys Glu Gln Leu Glu Ser Lys Leu Asn Ser

    1085                1090                1095

Leu Asn Asn Pro His Asn Val Leu Gln Asn Phe Ser Val Phe Phe

    1100                1105                1110

Asn Lys Lys Lys Glu Ala Glu Ile Ala Glu Thr Glu Asn Thr Leu

    1115                1120                1125

Glu Asn Thr Lys Ile Leu Leu Lys His Tyr Lys Gly Leu Val Lys

    1130                1135                1140

Tyr Tyr Asn Gly Glu Ser Ser Pro Leu Lys Thr Leu Ser Glu Val

    1145                1150                1155

Ser Ile Gln Thr Glu Asp Asn Tyr Ala Asn Leu Glu Lys Phe Arg

    1160                1165                1170

Val Leu Ser Lys Ile Asp Gly Lys Leu Asn Asp Asn Leu His Leu

    1175                1180                1185

Gly Lys Lys Lys Leu Ser Phe Leu Ser Ser Gly Leu His His Leu

    1190                1195                1200

Ile Thr Glu Leu Lys Glu Val Ile Lys Asn Lys Asn Tyr Thr Gly

    1205                1210                1215

Asn Ser Pro Ser Glu Asn Asn Lys Lys Val Asn Glu Ala Leu Lys

    1220                1225                1230

Ser Tyr Glu Asn Phe Leu Pro Glu Ala Lys Val Thr Thr Val Val

    1235                1240                1245

Thr Pro Pro Gln Pro Asp Val Thr Pro Ser Pro Leu Ser Val Arg

    1250                1255                1260

Val Ser Gly Ser Ser Gly Ser Thr Lys Glu Glu Thr Gln Ile Pro

    1265                1270                1275

Thr Ser Gly Ser Leu Leu Thr Glu Leu Gln Gln Val Val Gln Leu

    1280                1285                1290

Gln Asn Tyr Asp Glu Glu Asp Asp Ser Leu Val Val Leu Pro Ile

    1295                1300                1305

Phe Gly Glu Ser Glu Asp Asn Asp Glu Tyr Leu Asp Gln Val Val

    1310                1315                1320

Thr Gly Glu Ala Ile Ser Val Thr Met Asp Asn Ile Leu Ser Gly

    1325                1330                1335

Phe Glu Asn Glu Tyr Asp Val Ile Tyr Leu Lys Pro Leu Ala Gly

    1340                1345                1350

Val Tyr Arg Ser Leu Lys Lys Gln Ile Glu Lys Asn Ile Phe Thr

    1355                1360                1365

Phe Asn Leu Asn Leu Asn Asp Ile Leu Asn Ser Arg Leu Lys Lys

    1370                1375                1380

Arg Lys Tyr Phe Leu Asp Val Leu Glu Ser Asp Leu Met Gln Phe

    1385                1390                1395

Lys His Ile Ser Ser Asn Glu Tyr Ile Ile Glu Asp Ser Phe Lys

    1400                1405                1410

Leu Leu Asn Ser Glu Gln Lys Asn Thr Leu Leu Lys Ser Tyr Lys

    1415                1420                1425

Tyr Ile Lys Glu Ser Val Glu Asn Asp Ile Lys Phe Ala Gln Glu

    1430                1435                1440

Gly Ile Ser Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Ala Lys Tyr Lys Asp Asp

    1445                1450                1455

Leu Glu Ser Ile Lys Lys Val Ile Lys Glu Glu Lys Glu Lys Phe

    1460                1465                1470

Pro Ser Ser Pro Pro Thr Thr Pro Pro Ser Pro Ala Lys Thr Asp

    1475                1480                1485

Glu Gln Lys Lys Glu Ser Lys Phe Leu Pro Phe Leu Thr Asn Ile

    1490                1495                1500

Glu Thr Leu Tyr Asn Asn Leu Val Asn Lys Ile Asp Asp Tyr Leu

    1505                1510                1515

Ile Asn Leu Lys Ala Lys Ile Asn Asp Cys Asn Val Glu Lys Asp

    1520                1525                1530

Glu Ala His Val Lys Ile Thr Lys Leu Ser Asp Leu Lys Ala Ile

    1535                1540                1545

Asp Asp Lys Ile Asp Leu Phe Lys Asn Pro Tyr Asp Phe Glu Ala

    1550                1555                1560

Ile Lys Lys Leu Ile Asn Asp Asp Thr Lys Lys Asp Met Leu Gly

    1565                1570                1575

Lys Leu Leu Ser Thr Gly Leu Val Gln Asn Phe Pro Asn Thr Ile

    1580                1585                1590

Ile Ser Lys Leu Ile Glu Gly Lys Phe Gln Asp Met Leu Asn Ile

    1595                1600                1605

Ser Gln His Gln Cys Val Lys Lys Gln Cys Pro Glu Asn Ser Gly

    1610                1615                1620

Cys Phe Arg His Leu Asp Glu Arg Glu Glu Cys Lys Cys Leu Leu

    1625                1630                1635

Asn Tyr Lys Gln Glu Gly Asp Lys Cys Val Glu Asn Pro Asn Pro

    1640                1645                1650

Thr Cys Asn Glu Asn Asn Gly Gly Cys Asp Ala Asp Ala Thr Cys

    1655                1660                1665

Thr Glu Glu Asp Ser Gly Ser Ser Arg Lys Lys Ile Thr Cys Glu

    1670                1675                1680

Cys Thr Lys Pro Asp Ser Tyr Pro Leu Phe Asp Gly Ile Phe Cys

    1685                1690                1695

Ser Ser Ser Asn Phe Leu Gly Ile Ser Phe Leu Leu Ile Leu Met

    1700                1705                1710

Leu Ile Leu Tyr Ser Phe Ile

    1715                1720

 

<210>74

<211>217

<212>PRT

<213>Plasmodium falciparum 3D7

 

<400>74

 

Met Asn Lys Leu Tyr Ser Leu Phe Leu Phe Leu Phe Ile Gln Leu Ser

1               5                   10                  15

Ile Lys Tyr Asn Asn Ala Lys Val Thr Val Asp Thr Val Cys Lys Arg

            20                  25                  30

Gly Phe Leu Ile Gln Met Ser Gly His Leu Glu Cys Lys Cys Glu Asn

        35                  40                  45

Asp Leu Val Leu Val Asn Glu Glu Thr Cys Glu Glu Lys Val Leu Lys

    50                  55                  60

Cys Asp Glu Lys Thr Val Asn Lys Pro Cys Gly Asp Phe Ser Lys Cys

65                  70                  75                  80

Ile Lys Ile Asp Gly Asn Pro Val Ser Tyr Ala Cys Lys Cys Asn Leu

                85                  90                  95

Gly Tyr Asp Met Val Asn Asn Val Cys Ile Pro Asn Glu Cys Lys Asn

            100                 105                 110

Val Thr Cys Gly Asn Gly Lys Cys Ile Leu Asp Thr Ser Asn Pro Val

        115                 120                 125

Lys Thr Gly Val Cys Ser Cys Asn Ile Gly Lys Val Pro Asn Val Gln

    130                 135                 140

Asp Gln Asn Lys Cys Ser Lys Asp Gly Glu Thr Lys Cys Ser Leu Lys

145                 150                 155                 160

Cys Leu Lys Glu Asn Glu Thr Cys Lys Ala Val Asp Gly Ile Tyr Lys

                165                 170                 175

Cys Asp Cys Lys Asp Gly Phe Ile Ile Asp Asn Glu Ser Ser Ile Cys

           180                 185                 190

Thr Ala Phe Ser Ala Tyr Asn Ile Leu Asn Leu Ser Ile Met Phe Ile

        195                 200                 205

Leu Phe Ser Val Cys Phe Phe Ile Met

    210                 215

 

<210>75

<211>1194

<212>DNA

<213>Plasmodium falciparum 3D7

<400>75

atgatgagaa aattagctat tttatctgtt tcttcctttt tatttgttga ggccttattc     60

caggaatacc agtgctatgg aagttcgtca aacacaaggg ttctaaatga attaaattat    120

gataatgcag gcactaattt atataatgaa ttagaaatga attattatgg gaaacaggaa    180

aattggtata gtcttaaaaa aaatagtaga tcacttggag aaaatgatga tggaaataac    240

gaagacaacg agaaattaag gaaaccaaaa cataaaaaat  taaagcaacc agcggatggt    300

aatcctgatc caaatgcaaa cccaaatgta gatcccaatg ccaacccaaa tgtagatcca     360

aatgcaaacc caaatgtaga tccaaatgca aacccaaatg caaacccaaa tgcaaaccca     420

aatgcaaacc caaatgcaaa cccaaatgca aacccaaatg caaacccaaa tgcaaaccca     480

aatgcaaacc caaatgcaaa cccaaatgca aacccaaatg caaacccaaa tgcaaaccca     540

aatgcaaacc ccaatgcaaa tcctaatgca aacccaaatg caaacccaaa cgtagatcct     600

aatgcaaatc caaatgcaaa cccaaacgca aaccccaatg caaatcctaa tgcaaacccc     660

aatgcaaatc ctaatgcaaa tcctaatgcc aatccaaatg caaatccaaa tgcaaaccca     720

aacgcaaacc ccaatgcaaa tcctaatgcc aatccaaatg caaatccaaa tgcaaaccca     780

aatgcaaacc caaatgcaaa ccccaatgca aatcctaata aaaacaatca aggtaatgga     840

caaggtcaca atatgccaaa tgacccaaac cgaaatgtag atgaaaatgc taatgccaac     900

agtgctgtaa aaaataataa taacgaagaa ccaagtgata agcacataaa agaatattta     960

aacaaaatac aaaattctct ttcaactgaa tggtccccat gtagtgtaac ttgtggaaat    1020

ggtattcaag ttagaataaa gcctggctct gctaataaac ctaaagacga attagattat    1080

gcaaatgata ttgaaaaaaa aatttgtaaa atggaaaaat gttccagtgt gtttaatgtc    1140

gtaaatagtt caataggatt aataatggta ttatccttct tgttccttaa ttag          1194

 

<210>76

<211>1704

<212>DNA

<213>Influenza A virus(A/Anhui/1/2005(H5N1))

 

<400>76

atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagccttg ttaaaagtga tcagatttgc     60

attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt    120

actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaagct ctgcgatcta    180

gatggagtga agcctctgat tttaagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac     240

ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaac     300

ccagccaatg acctctgtta cccagggaat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta     360

ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccgat     420

catgaagcct catcaggggt gagctcagca tgtccatacc agggaacgcc ctcctttttc     480

agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac aatacatacc caacaataaa gagaagctac     540

aataatacca accaggaaga tcttttgata ctgtggggga ttcatcattc taatgatgcg     600

gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca     660

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<210>77

<211>1707

<212>DNA

<213>Influenza A virus(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))

 

<400>77

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<212>DNA

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