调节花生抗逆能力DREB类转录因子及其应用

摘要

一种调节花生抗逆能力的DREB类转录因子及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了由花生中提取的具有植物抗逆能力的DREB类转录因子PNDREB1及编码该转录因子的基因，实验证明该转录因子及基因在植物抗逆方面具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种调节花生抗逆能力的DREB类转录因子及其编码基因与应用，具体涉及花生中提高植物抗旱、抗盐等综合抗逆能力的DREB类转录因子PNDREB1及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

干旱、高盐以及低温等极端条件又称为水分胁迫或渗透胁迫，是植物生长过程中所面临的主要的逆境胁迫因素。植物生长在土壤里，本身不能自由移动，以上多种非生物胁迫因素，极易通过影响气孔开度，细胞壁或细胞膜成分等生理、生化指标对植物造成伤害，严重影响了作物的产量和种植区域。目前，对植物抗逆机制的研究及培育作物抗逆新品种已成为广大植物学家和育种学家研究的主要任务之一。以对转录因子调控基因表达及转录因子对基因产物作用为主的研究，已成为从系统水平上探索胁迫生物学和提高植物胁迫耐性和抗性的有效手段。

研究证明，许多植物基因的表达受上述干旱、高盐及低温胁迫的诱导(参见Shinozakiand Yamaguchi-Shinozaki，1996；Bray，1997)，其中转录因子所介导的基因表达调控网络在植物抵御各种环境胁迫的反应中具有重要功能。植物中，转录因子主要通过与植物基因启动子中的顺式元件相互作用、或与其它转录因子的功能区域相互作用来调控一系列抗逆性相关基因的转录、表达，从而参与生物及非生物胁迫过程(参见Kazuo Shinozaki，Kazuko Yamaguchi，Sehi M.2003，Regulatory network of gene expression in the drought andcould stress responses.Current Opinion in Plant Biology，6，410-417)。近年来，相继从高等植物中分离出的调控干旱、高盐、低温、病原反应及发育等抗逆相关基因表达的转录因子已达数百种，大致可分为五个家族，其中，DREB类转录因子属于AP2/EREBP转录因子家族。DREB类转录因子特异存在于植物中，与植物发育密切相关，其家族成员的蛋白质序列均含有保守的AP2区，根据序列特性又可分为DREB、TINY等六个小类。其中，DREB类转录因子特异地与DRE顺式作用元件相结合，在调节低温、干旱和高盐等胁迫反应时具有重要作用。

自1998年首个DREB类转录因子在拟南芥中被分离以来，已从多种植物中分离到类似基因，经鉴定均具有增强植物抗性，调控下游一系列逆境应答基因的表达，增强植物对多种逆境的适应和抵抗能力。Yamaguch-Shmozakj等利用差示筛选法，从干旱处理的拟南芥中克隆了一批受干旱诱导的基因，并将其定名为RD(Responsive to dehydration)基因。其中，rd29A基因的表达，不仅受干旱、高盐、低温胁迫的诱导，而且还受到外源激素ABA的诱导(参见Liu et al.，2000)；其启动子区含有一个与干旱、高盐及低温胁迫应答有关的DRE顺式作用元件(序列位TACCGACAT)其核心序列为CCGAC。在一些同样受干旱、高盐或低温诱导的拟南芥基因如rd17、kin1、cor6.6基因的启动子中，也发现有DRE元件或DRE核心序列的元件(参见Iwasaki et al.，1997；Wang et al，1995)。拟南芥cor15a基因(cor为cold-regulated的缩写)只受低温诱导，在它的启动子中，也有与DRE元件极为相似的序列TGGCCGAC，称为C-repeat元件(参见Baker et al.，1994)。此外，DRE元件的核心序列CCGAC在低温诱导的甘蓝型油菜的BN115基因启动子中也存在，被定命名为LTRE元件(low temperature responsive element)，即低温应答元件(参见Jiang et al.，1996)。从这些研究结果分析，DRE顺式作用元件普遍存在于干旱、高盐或低温胁迫应答基因的启动子中，对在这些胁迫条件下的基因诱导表达起调控作用。由于植物抗逆性是由多基因控制的复杂性状，依靠导入单个功能基因很难达到抗逆性的综合改良，DREB类转录因子可通过与DRE干旱应答元件(DRE/CRT)及ERE元件相互作用，诱导并调控上文提到的启动子中含相应元件的基因在胁迫诱导条件下的表达，参与逆境信号传递的过程中。

目前已经从大麦、黑麦、水稻、番茄、油菜、玉米、大豆中得到了与拟南芥中的DREB转录因子序列上同源、功能上相同或者相似的基因。这些研究结果表明DREB转录因子在植物界中是广泛存在的，并且在不同的植物中，它们执行着相似或者相同的功能。同时，大量对转录因子研究的结果表明，一个转录因子可对一类性状相似的多个基因进行调控，从而改变植物相应特性，在对拟南芥、烟草、玉米等方面的研究中都有通过转入DREB类转录因子从而使植株抗逆性得到综合提高的报道，故通过转入DREB类转录因子从而提高植物综合抗逆能力具有普遍性及可行性。

根据已有的高等植物转录因子调控基因表达的信息，人们已在提高植物抗性，改良植物的农艺性状等方面进行了许多尝试，通过在植物中过量表达DREB类转录因子，在植物抗逆相关的品质育种方面取得了可喜的成绩。Yamaguch-Shmozakj等在拟南芥中成功表达了编码DREB1A的cDNA，从而在正常生长条件下就可诱导与抗旱、抗冻和抗盐等相关基因的表达，使拟南芥抗性大大提高。在拟南芥中过量表达DREB1A，转基因植株比没有转基因的植株对低温和干旱胁迫具有更强的耐受性(参见Liu Q，KasugaM，SakumaY，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K，Two transcription factors，DREB1and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signaltransduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell，1998，10：1391-1406)。由烟草花叶病毒CaMV 35S启动子驱动拟南芥DREB1B在转基因烟草中表达，提高了转基因烟草抗冷冻胁迫的能力(参见Jaglo KR，Kleff S，Amundsen KL，Zhang X，Haake V，Zhang JZ，Deits T，ThomashowMF，Components of the Arabidopsis C-repeat/dehydration-responsive element binding factorcold-response pathway are conserved in Brassica napus and other plant species.Plant Physiol，127：910一917)。国内也有类似研究，刘强等(2000)将含有2个DREB元件的rd29A基因的启动子连接上GUS报告基因导入水稻，在高盐胁迫处理下，观察到转基因水稻中GUS活性，说明水稻中也存在能识别DRE的元件，并与之结合促进GUS表达。

花生(Arachis hypogaea L.)是世界上第四大油料作物(参见Proite et al.，2007)，富含脂肪和蛋白质，既是主要食用植物油的来源，重要的营养保健品，又是大宗出口商品，在经济作物中占有重要地位。干旱是花生产量和质量提高的主要限制因素；而土壤盐碱化及低温气候的出现，也极大的限制了花生的种植及其产量的提高。随着全球性生态环境破坏不断加剧，提高植物抗逆性已成为农业增产、解决粮食危机的重要途径，提高花生自身抗逆、抗病能力，是花生育种所面临的新的挑战。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种调节花生抗逆能力的DREB类转录因子及其编码基因与应用。

一种调节花生抗逆能力的DREB类转录因子，它是一种具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的转录因子。

编码调节花生抗逆能力的DREB类转录因子的DNA，它编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的转录因子。

编码调节花生抗逆能力的DREB类转录因子的DNA，它具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

通过DREB类转录因子家族的保守区域AP2结构域，在已提交的花生种子EST数据库中进行同源检索，找到包含有AP2结构域的花生EST片断。经翻译显示这个EST片断都仅包含有一个阅读框，推测为花生中的DREB类转录因子，命名为PNDREB1。该基因片段具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，根据该基因片段序列及花生偏好密码子可以获得该基因编码的转录因子的氨基酸序列为SEQ ID NO.1中所示氨基酸序列。

以花生未成熟种子cDNA文库为模板，该cDNA文库可使用常规手段构建，通过PCR获得PNDREB1，具体步骤如下：用BamH I、Kpn I对花生未成熟种子cDNA文库的质粒pBluescript SK(+)-O37进行酶切得到一个长度为1182bp的片段，该片段包含一个阅读框长度为687bp的基因PNDREB1，编码产物为DREB类转录因子。其编码229个氨基酸残基，理论分子量(MW)为24.7kDa，理论等电点(pI)约为5.97。位于PNDREB1蛋白第45和108位氨基酸之间含有一个保守的AP2/EREBP结构域。在第34和第40位氨基酸之间的N端为碱性氨基酸富集区(KPRAKKR)，推测其可能是一个核定位信号序列。在第161和第227氨基酸之间的C端为酸性氨基酸富集区，推测其可能是转录激活区。

人工创造干旱、高盐、低温、ABA(脱落酸)胁迫环境诱导表达，结果PNDREB1在花生的根、茎、叶、花、种子中均有表达，在根中的表达量较高。

本发明还提供含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的载体。

该载体可购买市售的载体，经过酶切等常规手段，将目的基因SEQ ID NO.2导入载体，即可获得含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的载体。

上述具有SEQ ID NO.2序列的DNA在植物抗逆性育种、改良方面的应用。

该植物育种、改良可采用本领域常规手段将目的基因通过载体最终导入需要育种、改良的植物中，通过该目的基因的过量表达，达到增强改良植物抗逆性的目的。

本发明以花生为材料，克隆得到了DREB类转录因子基因PNDREB1，并对这类基因在逆境条件下的表达模式进行了研究，通过将该基因转化烟草并获得相应的转基因植株，对基因在逆境下响应能力进行分析比较，鉴定植物抗性关键基因并丰富植物抗逆相关的基因库，为进一步实现对花生进行有目的，有针对性的品质、性状改良，创新花生抗逆新种质，解决我国的粮食、资源和环境等问题具有积极的指导作用；同时还可为获得植物综合抗逆能力提高的作物新品种提供候选基因及理论指导、为进一步创新花生抗逆新品种打下基础。

附图说明

图1：RT-PCR分析PNDREB1在花生不同组织中表达模式的电泳结果；

图2：RT-PCR分析受干旱、高盐、低温和ABA短时间胁迫处理后基因PNDREB1的诱导表达模式的电泳结果；

图3：植物表达载体pROK II-PNDREB1构建过程示意图；

图4：植物表达载体pCAMBIA1301-PNDREB1-GUS的构建过程示意图；

图5：通过PCR分子检测法，对PNDREB1反义转基因烟草的鉴定，其中泳道1、2、3、5、6、7、8、9经PCR显示为阳性，为转基因植株；

图6：利用GUS组织化学染色法，对获得的转基因烟草的组织化学鉴定结果，其中WT为对照、AS代表反义转基因植株。

图7：蒸腾失水率测定，对对照及反义转基因植株叶片失水情况进行测定结果，其中WT为对照、AS代表反义转基因植株。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步阐述，以下实验步骤及涉及的培养基均为本领域常规技术，试剂均为市售产品。

实施例1：花生中DREB类转录因子PNDREB1的克隆

通过DREB类转录因子家族的保守区域AP2结构域，在已提交的花生种子EST数据库中进行同源检索，找到一个包含有AP2结构域的花生EST片断。经翻译显示这个EST片断仅包含有一个阅读框，推测属于DREB类转录因子，命名为PNDREB1。

以花生未成熟的种子构建的cDNA文库为模板，通过PCR获得PNDREB1，具体步骤如下：用BamH I、Kpn I对花生未成熟种子cDNA文库的质粒pBluescriptSK(+)-O37进行酶切得到一个长度为1182bp的片段，该片段包含一个阅读框长度为687bp的基因PNDREB1，编码产物为DREB类转录因子。其编码229个氨基酸残基，理论分子量(MW)为24.7kDa，理论等电点(pI)为5.97。位于PNDREB1蛋白第45和108位氨基酸之间含有一个保守的AP2/EREBP结构域。在第34和第40位氨基酸之间的N端为碱性氨基酸富集区(KPRAKKR)，推测其可能是一个核定位信号序列。在第161和第227氨基酸之间的C端为酸性氨基酸富集区，推测其可能是转录激活区。

实施例2：基因PNDREB1在花生不同组织的表达模式分析及其受干旱、高盐、低温、ABA胁迫后的诱导表达模式分析

一、PNDREB1在花生不同组织中的表达模式分析

1、植物中RNA的提取：

(1)参照CTAB-LiCl法，称取0.2g新鲜组织或-70℃保存的样品，在液氮中充分研磨至粉末状，研磨中不断缓慢加入液氮，防止材料解冻。

(2)将研好的组织迅速转移至预热(65℃)的含有600μl CTAB提取液的EP管中，立即剧烈涡旋振荡30s，使其混匀。

(3)65℃水浴2-5min，期间剧烈涡旋振荡3-5次。

(4)稍微冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡1min，混匀，4℃，12000rpm离心15min。

(5)将上清转移到另一新的EP管中，加入2微升的DNase I，37℃水浴15min。

(6)在加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡1min，混匀，4℃，12,000rpm离心15min。

(7)将上清转移到另一新的EP管中，加入1/3体积的gM LiCl，使其终浓度为2M，4℃过夜沉淀。

(8)4℃，12,000rpm离心20min，弃上清。

(9)分别用70％乙醇，无水乙醇洗沉淀，晾干，加30-50微升DEPC-H₂O，溶解沉淀。

2、单链cDNA的获得及表达模式分析：

以花生的根(25天)、茎(15天)、叶(15天)、花、种子的RNA为材料，利用PrimeScript^TM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)试剂盒反转录成单链cDNA，用于之后的RT-PCR。

以Actin为体系内标，引物序列为；T63(F)：5’-GCCCAACTAGCGAGTCGAAC-3’；T63(R)：5’-CAGAACCCAGAAGGCTCTCC-3’。用于PNDRRB1半定量的引物为LH14DREB(F)：5’-GCAAAAACCCCTTGTCTCTC-3’、LH14DREB(R)：5’-GGAAAGTAATCCAATGCGG-3’；PCR反应条件为：94℃ 4min；之后94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 45s，共进行35个循环；最后72℃ 10min，反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示：PNDREB1在花生的根、茎、叶、花、种子中均有表达，在根中的表达量较高(如图1所示)。

二、PNDREB1受干旱、高盐、低温、ABA胁迫后诱导表达模式分析

1、植物中RNA的提取：

将正常生长6周的花生(鲁花14)分成六个大组，分别用干旱(20％聚乙二醇)、高盐(250mM NaCl)、4℃的低温、100μM脱落酸(ABA)、乙烯(1mM)处理2小时，以野生型花生为对照(CK，不作任何处理)，处理结束后，剪取花生叶片，按照与实施例2(一)相同的方法提取经过不同胁迫处理植株的总RNA。

2、诱导表达模式分析：

以Actin为体系内标，分析PNDREB1经过短时间干旱、高盐、低温、脱落酸胁迫处理后的诱导表达模式。Actin引物序列为：1U15(F)：5’-GATTCTGATACTG CGTCTCCG-3’、1U15(R)：5’-ACGCCTGCAAGATCCAATC-3’。用于PNDRRB1进行RT-PCR的引物同实施例2(一)2中，RT-PCR反应条件为：94℃4min、之后94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 45s，共进行35个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

电泳结果显示：

PNDREB1在短时间内(2h)受4℃低温的强烈诱导，表达水平成倍迅速增加；其也受干旱的诱导，表达量也有较大幅度的增加，但较低温诱导的程度低；在高盐(250mMNaCl)处理后，PNDREB1的表达略受抑制；且不受脱落酸的诱导，且随反应循环数增加，表达量也逐渐增加(如图2所示)。

实施例3：PNDREB1正反义表达载体的构建

一、PNDREB1正义表达载体pROK II-PNDREB1的构建(如图3所示)

1、BamH1、Kpn1酶切pROKII质粒，37℃酶切4h

BamH1、Kpn1对质粒进行双酶切体系：质粒            7μl

                                 BamH1           2.5μl

                                 Kpn1            2.5μl

                                 0.5XK缓冲液     2.5μl

                                 加水至50μl

2、电泳后用博大泰克公司的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒进行回收，试剂盒进行回收如下：

(1)将凝胶放在紫外灯下用干净的刀片将条带切下，装入灭菌的离心管中，称取胶的重量，每个管中胶的重量不能超过300mg。

(2)按100mg胶加700μl溶胶液的比例，室温溶胶(或55℃溶胶)，其间偶尔摇动；装柱，9000rpm，离心30s；去掉废液。

(3)500μl漂洗液(wash buffer)漂洗，12000rpm离心30s。重复漂洗一次。倒掉废液以后，再于12000rpm离心2min；

(4)将柱子放入一个新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加入合适体积的洗脱缓冲液(Eloution buffer，通常用30μl-50μl)，室温放置2-5min，12000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。

3、BamH1、Kpn1酶切花生未成熟种子cDNA文库中相应克隆，双酶切体系同实施例3(一)1。电泳后有两条带，切取1182bp片段，用博大泰克公司的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒进行回收，回收步骤同实施例3(一)2。

4、将两个回收片段用T4连接酶连接，构建成PNDREB1正义表达载体pROK II-PNDREB1。

连接体系如下：

a、回收的DNA片段         7μl

b、载体                  1μl

c、T4 DNA连接酶          1μl

d、T4 DNA连接酶缓冲液    1μl

将上述a、b、c、d反应物混匀，16℃反应过夜，用于转化大肠杆菌DH5α。

5、大肠杆菌感受态细胞的制备

(1)挑取E.coil DH5α单菌落接种到约5ml的LB液体培养基，于37℃，250rpm震荡培养过夜。

(2)次日将此菌液以1％的接种量转移至100ml的液体培养基中，继续培养至吸光度(OD)₆₀₀＝0.4左右。

(3)将此菌液冰浴10min，在无菌条件下转移至预先冰冷的50ml离心管中，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

(4)重悬于10ml预冷的0.1mol/L的CaCl₂中，冰浴10min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

(5)重悬于2ml(含15％甘油)的预冷的0.1mol/L的CaCl₂中，分装成100μl/管，-70℃保存备用。

6、转化

(1)从-70℃冰箱取出感受态细胞置于冰上溶解。

(2)将PNDREB1与载体pROK II的连接产物5μl加至感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30min。

(3)42℃热激90s，在此过程中不要晃动离心管。

(4)热激完毕后立即取出放于冰上2min。

(5)加入800μl的LB液体培养基，37℃，200rpm孵育1h。

(6)将菌液涂布在卡那(Kan)抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。

(7)将平板放入4℃保存。

7、阳性克隆的菌液PCR检测

(1)从转化的平板上挑取白色菌落接种到LB液体培养基中，37℃，250rpm震荡培养3-4h。

(2)PCR反应体系：Taq酶缓冲液(含有Mg²⁺)2.5μl，dNTP(2.5mM)1μl，LH14DREB(F)引物、LH14DREB(R)引物(10μM)各1μl，菌液2μl，Taq酶(博大泰克公司产)0.3μl，加灭菌双蒸水至25μl。

(3)PCR反应程序：98℃ 10min，94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 45s，30循环，72℃ 10min，4℃保存。取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，有一400bp左右的条带。

8、质粒的提取

(1)将菌液PCR阳性的菌液于37℃，250rpm震荡培养过夜。

(2)将菌液转移到离心管中，室温8000rpm离心2min，收集菌体。

(3)倒取上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，使残余的液体流出。

(4)加入100μl预冷的溶液I，在涡旋振荡器上剧烈震荡重悬菌体，其中所述溶液I配方为：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)、10mmol/L EDTA(pH8.0)。

(5)加入200μl新鲜配制的溶液II，快速颠倒混匀10次，冰浴5min，其中所述溶液II配方为：0.2mol/L NaOH、1％SDS。

(6)加入150μl预冷的溶液III，温和地颠倒10次，冰浴5min，4℃ 12000rpm离心10min，其中所述溶液III配方为：5mol/L乙酸钾60ml、3mol/L冰乙酸11.5ml、H₂O 28.5ml、pH 5.2。

(7)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，反复混匀，4℃12000rpm离心10min。

(8)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)，反复混匀，4℃ 12000rpm离心10min。

(9)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积预冷(-20℃)的异丙醇，混匀后-20℃沉淀1h，4℃ 12000rpm离心10min。

(10)倒掉上清，加入500μl 70％的乙醇洗涤沉淀两次，空气中干燥。

(11)加入适当体积的TE溶液和2μl RNaseA，37℃消化0.5h。

9、质粒的酶切检测

(1)BamH1、Kpn1对质粒进行双酶切体系：质粒            3μl

                                    BamH1           0.5μl

                                    Kpn1            0.5μl

                                    0.5倍K缓冲液    0.75μl

                                    加水至15μl

(2)37℃酶切2h，取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，有一条1200bp左右的条带和12Kb左右的条带。

10、序列测定

以上步骤中获得的阳性克隆pROKII-PNDREB1由山东省农科院高新技术研究中心测序。

二、PNDREB1反义表达载体pCAMBIA1301-PNDREB1-GUS的构建(如图4所示)

1、BamHI、KpnI酶切pCAMBIA1301′质粒，37℃酶切4h，酶切体系同实施例3(一)1。

2、电泳后用博大泰克公司的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒进行回收，回收步骤同实施例3(一)2。

3、BamHI、KpnI酶切花生未成熟种子cDNA文库中相应克隆，双酶切体系同实施例3(一)1。电泳后有两条带，切取1182bp片段，用博大泰克公司的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒进行回收，回收步骤同实施例3(一)2。

4、将两个回收片段用T4连接酶连接，构建成反义表达载体pCAMBIA1301-PNDREB1-GUS，连接体系同实施例3(一)4。

5、大肠杆菌感受态细胞的制备，步骤同实施例3(一)5。

6、转化大肠杆菌DH5α，步骤同实施例3(一)6。

7、阳性克隆的菌液PCR检测，步骤同实施例3(一)7。

8、质粒的提取，步骤同实施例3(一)8。

9、质粒的酶切检测

(1)BamHI、KpnI对质粒进行双酶切体系，步骤同实施例3(一)9。

(2)37℃酶切2h，取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，有一条1200bp左右的条带和11Kb左右的条带。

10、序列测定

上述检测阳性的克隆pCAMBIA1301-PNDREB1-GUS由山东省农科院高新技术研究中心测序。

实施例4：PNDREB1正、反义植物表达载体转化农杆菌

1、农杆菌感受态细胞的制备

(1)挑取单菌落(EHA105)接种到约3ml的YEB液体培养基中，于28℃，220rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.5。

(2)吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min。

(3)5000rpm离心30S，弃去上清液。

(4)沉淀用1.5ml 0.5M NaCl悬浮，冰浴20min。

(5)5000rpm离心30S，弃去上清液。

(6)每管用100μl 20mM CaCl₂悬浮，用于转化，-70℃保存备用。

2、DNA直接转化农杆菌

(1)50μl农杆菌感受态细胞中分别加入PNDREB1正、反义表达载体质粒DNA 0.1-1μg(5-10μl)，之后冰浴30min。

(2)放入液氮中5min(或1min)然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min。

(3)取出离心管，加入0.5ml的YEB，于28℃，220rpm震荡培养3至5小时。

(4)取出菌液于含有相应抗生素的YEB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养，2天左右菌落可见。

3、重组农杆菌鉴定

(1)挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃震荡培养过夜。

(2)菌液PCR鉴定步骤同实施例3(一)7。

实施例5：农杆菌介导转化烟草植株

1、烟草外植体的培养

1)种子先用75％的乙醇消毒1min，无菌水冲洗3-5次；将次氯酸钠和水以1∶4的比例稀释，对种子消毒10min，再用无菌水冲洗3-5次。

2)将种子均匀铺洒在1/2MS₀生长培养基上，使其发芽。

3)待种子发芽(约两周)后，将其转移到单独的瓶中(1/2MS₀)，要在生长4-5周，植株才能长出足够的叶子以供转化。

2、摇菌

1)在250ml的三角瓶中加入50mlYEP液体培养基，培养基中卡那霉素(Kan)、利福霉素(Rif)的终浓度均为50mg/ml，PNDREB1正、反义植物表达载体的农杆菌菌液以1∶100的比例分别加入培养基中，待其长至对数生长期(12小时左右)即可用。

2)菌液6000rpm离心后，MS₀液体培养基重悬备用。

3、转化及植株的获得

1)取烟草叶片，打孔。

2)将叶盘分别放入以上不同菌液中侵染1.5min，取出后用滤纸吸干水分，将其整齐紧密地排列在MS分化培养基上，暗培养两天。

3)暗培养两天后，将叶片松散地排列在MS选择培养基上于光下培养(每瓶大约7-10片)，每隔2周更换一次培养基。

4)待其长出丛生芽时，将其切下放入生长培养基上，使其生长；长至3-5cm时，将其移入生根培养基中，使其生根。

5)生根一段时间后，将苗洗根栽入土中，于小盆中保水3天(盖地膜)，生长至一定大小，将其放到光下培养并移栽到大盆中，于温室中培养至成熟。

实施例6：转基因烟草植株的鉴定

1、植物DNA的简易提取

1)取2cm长植物叶片放入1.5ml EP管中，加入200μl TPS(100mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM EDTA(pH 8.0)、1M KCl)抽提液，用1ml枪头将叶片捣碎。

2)75℃，20min水浴。

3)12000rpm，10min。

4)取120μl上清，于0.5ml EP管，加入等体积异丙醇，冰上15min，12000rpm离心10min。

5)弃上清，取沉淀，加120μl 70％乙醇，12000rpm，5min。

6)弃上清，沉淀干燥，加入20μl水。

2、以上述简易法提取的植物DNA为模板，以实施例2(一)2中RT-PCR引物进行PCR，扩增出相应大小特异条带的为转基因株系(如图5所示)。

3、对PCR方法鉴定为转基因的株系，如转化载体中含有GUS报告基因，则可进一步用组织化学染色法进行确认。(如图6所示)

实施例7：对照及转基因烟草植株叶片蒸腾失水率测定

1、取天平称量盘，称取空盘重量。

2、在待测植株上相似位置选区面积大约一致的叶片放入空的议程重的称量盘中，立刻称重，将测得重量减去空盘重量即为叶片起始鲜重。

3、称重后记录时间和重量并迅速放回原处，3min或5min后迅速取下重新称重，准确记录3或5min内的蒸腾失水量。称重要快。

4、用纪录的每次称重后的重量减去第一次称得的重量，即为叶片(蒸腾组织)在称重过程中损失的水分的重量，以下式求出蒸腾速率。

蒸腾速率＝(叶片起始鲜重量-每次称得重量)/叶片起始鲜重量

由图7可知，经过反义表达的转基因烟草植株叶片的蒸腾速率明显高于对照组，表明转基因烟草植株的蒸腾作用高于对照组，证明该转基因烟草植株在干旱环境下保水能力较差，其抗逆能力低于对照组，从而可以得出本发明目的基因与植物抗逆能力相关、反义表达会减弱植株抗逆能力、过量表达可以提高植物抗逆性能的结论。

SEQUENCE LISTING

<110>山东省农业科学院高新技术研究中心

<120>调节花生抗逆能力DREB类转录因子及其应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>228

<212>PRT

<213>Arachis hypogaea.L

<400>1

Met Asp Val Asp Pro Pro Gln Lys Pro Leu Val Ser Pro Ile Ile Val

1               5                   10                  15

Asn Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ser Pro Asp Gln Ser Ser Pro Pro Pro

            20                  25                  30

Pro Lys Pro Arg Ala Lys Lys Arg Ala Ala Ala Ser Gly Tyr Cys Gly

        35                  40                  45

Val Arg Met Arg Gln Trp Gly Lys Trp Val Ser Glu Ile Arg Glu Pro

    50                  55                  60

Lys Lys Arg Asn Arg Ile Trp Leu Gly Thr Tyr Ala Thr Ala Glu Met

65                  70                  75                  80

Ala Ala Arg Ala His Asp Ala Ala Ala Leu Ala Ile Lys Gly Arg Ala

                85                  90                  95

Ala Ile Leu Asn Phe Pro Glu Leu Gly Pro His Leu Pro Arg Pro Pro

            100                 105                 110

Thr Asn Ser Pro Lys Asp Ile Gln Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala

        115                 120                 125

Leu Asp Tyr Phe Pro Ser His Glu Ala Val Ala Asn Pro Ser Arg Ile

    130                 135                 140

Val Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser His Pro

145                 150                 155                 160

Lys Asp Lys Glu Glu Ser Pro Asn Ser Ser Met Asp Lys Asp Asp Asp

                165                 170                 175

Met Phe Val Asp Leu Pro Asp Leu Ile Ile Asp Leu Asp His Gly Gly

            180                 185                 190

Arg Gly Ser Glu Phe Asp Tyr Ser Thr Arg Trp Leu Val Asn Glu Ala

        195                 200                 205

Asp Gln Leu Asp Ser Ala Phe Gln Leu Ala Glu Pro Phe Gln Trp Glu

    210                 215                 220

Ser Val Pro Tyr

225

<210>2

<211>687

<212>DNA

<213>Arachis hypogaea.L

<400>2

atggacgtgg acccgccgca aaaacccctt gtctctccca tcattgtcaa ctccgccgct     60

tcctcatctt cccccgatca atcttcacct ccaccaccca aaccacgcgc caaaaagagg    120

gccgctgcta gtggatactg cggagtacgc atgcgccaat ggggcaaatg ggtctctgaa    180

attagagagc ccaagaagag aaacagaatc tggctcggaa cttacgccac tgctgaaatg    240

gcggctcgag cccacgacgc cgcggctcta gcaatcaaag gccgcgctgc tatccttaac    300

ttccccgaac tcggcccgca ccttccacgt ccgccgacca attcccctaa ggacatacaa    360

gccgccgcag ccaaggcagc cgcattggat tactttccaa gccatgaagc cgtagccaat    420

cccagccgaa tcgtgtccgc gtcgtcctca tcgtcctcct catcctcttc ctcccaccct    480

aaggacaagg aagaatcacc gaattcatcg atggacaagg atgatgacat gtttgtggac    540

ctccctgacc tgataattga cttggatcac ggtggtcgag gaagtgaatt tgattactcg    600

acgcgttggc ttgtaaacga agccgaccaa ctcgactcgg ctttccagct cgcagagcct    660

ttccagtggg agtcagttcc ctactaa                                        687