多孔中空二氧化硅纳米颗粒、所述二氧化硅纳米颗粒的制备方法以及包含所述二氧化硅纳米颗粒的药物载体和药物组合物

摘要

本发明提供了多孔中空二氧化硅纳米颗粒。所述二氧化硅纳米颗粒各自包含具有大内腔的核心和围绕所述核心的多孔二氧化硅壳。由于所述核心中存在腔，所述多孔中空二氧化硅纳米颗粒表现出比用于药物载体的常规颗粒高得多的药物负载效率。此外，通过与所述二氧化硅壳键合的表面官能团和/或通过经表面官能团与所述二氧化硅壳键合的生物相容性聚合物而优化所述多孔二氧化硅壳的孔径范围，以保证药物从所述二氧化硅纳米颗粒中持续和稳定的释放。因此，所述多孔中空二氧化硅纳米颗粒可有效用于药物载体的制备。本发明还提供了所述二氧化硅纳米颗粒的制备方法和含有所述二氧化硅纳米颗粒的药物载体。

说明书

技术领域

本发明涉及多孔中空二氧化硅纳米颗粒，其各自包含具有大的内腔 的核心和围绕所述核心的二氧化硅壳，其中所述壳具有大小受控的孔以 允许大量药物以持续和稳定的方式释放。本发明还涉及所述二氧化硅纳 米颗粒的制备方法、以及含有所述二氧化硅纳米颗粒的药物载体和药物 组合物。

背景技术

自20世纪70年代以来，基于控制释放技术的药物递送系统的开发 已取得了显著进展。目前许多有关药物递送系统的产品可商业购得并且 处在开发中。

有关药物载体的广泛研究在多个领域中正积极进行，包括非胃肠外 药物递送系统(例如口服、经肺、经鼻和经眼的药物递送)以及胃肠外 药物递送系统。然而，迄今为止已知的药物载体的尺寸都非常大，这使 得难于通过粘膜或体循环而将药物递送至靶组织。在此情况下，由于纳 米级颗粒在药物控释递送系统中的潜在应用，与作为药物载体的纳米级 颗粒的制备相关的技术引起了高度关注。

近年来，研究了许多基于可生物降解聚合物的药物递送系统，其中 一些药物递送系统已经存在于市场中。根据新开发的基于溶胶-凝胶的 技术，可在室温下将生物活性剂引入二氧化硅干凝胶中，这提出了一种 新的可能性：控制药剂从凝胶基质中的释放特性(S.B.Nicoll.等In vitro release kinetics of biologically active transforming growth factor-β1 from a novel porous glass carrier，Biomaterial 18(1997)853-859，等)。 所述溶胶-凝胶技术在成本、简易性和多样性方面具有优势，所述二氧 化硅干凝胶由于其无毒性和生物相容性而具有吸引力(P.Kortesuo.等， Silica Xerogel as implantable carrier for controlled drug deliver evaluation of drug distribution and tissue effects after implantation， Biomaterial 21(2000)193-198)。基于这些优点，研究已集中在作为用 于多种治疗剂(比如肝素)的控制释放递送材料的二氧化硅干凝胶系统 上(M.S.Ahola.等，In vitro release of heparin from silica xerogels， Biomaterials 22(2001)2163-2170)。

大多数当前已知的利用二氧化硅干凝胶的系统是含有被捕获或吸附 于其中的治疗剂的载体或者是由在其表面上与治疗剂化学键合的聚合 物而制备的载体。因此，该系统的制备需要利用交联剂还涉及对工艺参 数(例如温度和pH)的控制。此工艺控制增加了所负载药物的不良作 用的风险，因此限制了该系统的临床应用。

作为解决这些问题的一种策略，可以考虑其中将通过多种方法(例 如模板法)制备的多孔中空二氧化硅颗粒用作药物载体的方法(F. Caruso.等，Nanoengineering of inorganic and hybrid hollow spheres by colloidal templating，Science 282(1998)1111-1114)。

在当前技术中利用模板所面临的缺点在于难以制备稳定形式的纳米 级中空颗粒。另一个缺点在于由于所述颗粒的内腔非常小而因此仅负载 非常有限量的药物。此外，在控制围绕所述腔的壳的孔径方面存在困难， 因此使得难以控制药物的释放特性。因此，所述纳米级中空颗粒不适于 用作药物载体。

发明内容

技术问题

本发明是考虑到现有技术中的问题而做出的，本发明的一个目的是 提供中空二氧化硅纳米颗粒，其各自含有具有大的内腔的核心和在其中 可稳定形成所述核心的多孔二氧化硅壳，所述腔的大小可自由控制，并 且所述二氧化硅壳的孔径可控，从而实现药物的有效释放特性。

本发明的另一个目的是提供一种制备所述二氧化硅纳米颗粒的方 法。

本发明的另一个目的是提供含有所述二氧化硅纳米颗粒的药物载 体。

本发明的又一个目的是提供含有所述二氧化硅纳米颗粒的药物组合 物。

技术方案

根据本发明用于实现上述目的的一个方面，提供了多孔中空二氧化硅 纳米颗粒，其各自含有具有直径1～100nm的腔的核心和在其表面上具有 官能团(下文简称为“表面官能团”)的多孔二氧化硅壳。

根据本发明的另一个方面，提供了多孔中空二氧化硅纳米颗粒，其各 自含有具有直径1～100nm的腔的核心和表面用生物相容性聚合物改性的 多孔二氧化硅壳。

在一个优选的实施方案中，所述生物相容性聚合物选自聚亚烷基二醇 (PAG)、聚醚酰亚胺(PEI)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、亲水性乙烯基聚 合物、其共聚物以及其混合物。

在一个优选的实施方案中，所述中空二氧化硅纳米颗粒的直径为 20～250nm。

根据本发明的另一个方面，提供了一种制备中空二氧化硅纳米颗粒的 方法，其包括将磁性纳米簇与二氧化硅前体混合(第一步)、用所述二氧 化硅前体在相应磁性纳米簇上形成二氧化硅壳(第二步)、除去存在于所 述二氧化硅壳内的磁性纳米簇(第三步)、以及在所述二氧化硅壳表面上 引入官能团(第四步)。

在一个实施方案中，所述中空二氧化硅纳米颗粒可以用生物相容性聚 合物进行表面改性(第五步)。

在一个实施方案中，所述磁性纳米簇可通过以下步骤制备：(1)将磁 性纳米颗粒溶于有机溶剂中以制备油相，(2)将两亲性化合物溶于水性溶 剂中以制备水相，(3)将所述油相与所述水相混合以制备乳液，以及(4) 从所述乳液中分离所述油相。

根据本发明的另一个方面，提供了药物载体，其含有所述中空二氧化 硅纳米颗粒和负载于所述核心的腔内或所述二氧化硅壳的孔内的药物活 性成分。

在一个优选实施方案中，所述药物活性成分具有按下式1计算的 1～100％的负载分数：

根据本发明的又一个方面，提供了一种包含所述中空二氧化硅纳米颗 粒和至少一种可药用载体的药物组合物。

在一个实施方案中，所述药物组合物还可包含负载于所述核心的腔内 或所述二氧化硅壳的孔内的药物活性成分。

有益效果

由于所述核心内存在大的腔，本发明的多孔中空二氧化硅纳米颗粒 表现出比用于药物载体的常规颗粒高得多的药物负载效率。此外，通过 与所述二氧化硅壳键合的表面团能团和/或通过经所述表面官能团与所 述二氧化硅壳键合的生物相容性聚合物来优化所述多孔二氧化硅壳的 孔径范围，以保证药物从所述二氧化硅纳米颗粒中持续和稳定的释放。 因此，本发明的多孔中空二氧化硅纳米颗粒可有效用于药物载体或药物 组合物的制备。此外，通过利用磁性纳米簇作为用于制备所述二氧化硅 纳米颗粒的模板可自由控制所述核心的腔大小。

附图说明

在附图中，

图1是描述实施例1中表面用聚乙二醇进行改性的中空二氧化硅纳米颗 粒的制备步骤的示意图；

图2显示了描绘实施例1中所制备的不同种类的纳米颗粒的图；

图3显示了(a)磁性纳米颗粒，(b)磁性纳米簇，(c)磁性二氧化硅 颗粒和(d)中空二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜照片(TEM)， 所有这些均是实施例1中制备的；

图4显示了(a)图示实施例1各步骤中所制备产品的粒径分布和ζ电 势的图，以及(b)实施例1中在除去存在于所述二氧化硅纳米颗粒内 的磁性物质之前和之后的二氧化硅纳米颗粒的照片；

图5是表明实施例1中制备的(a)磁性二氧化硅纳米颗粒和(b)中空 二氧化硅纳米颗粒的X射线衍射分析结果的图；

图6是显示实施例1各步骤中所制备产品(a)磁性纳米簇、(b)磁性 二氧化硅纳米颗粒、以及(c)中空二氧化硅纳米颗粒的傅立叶变换红 外光谱(FT-IR)结果的图；

图7是显示实施例1中所制备的(a)磁性二氧化硅纳米颗粒和(b)中 空二氧化硅纳米颗粒的热重分析(TGA)结果的图；

图8显示了举例说明实施例1中所制备的(a)磁性纳米簇(MKs)，(b) 磁性二氧化硅颗粒(MSNPs)和(c)中空二氧化硅纳米颗粒(HSNPs) 的X射线光电子谱结果的图，以及(d)显示了所述产品(a)、(b)和 (c)中Si和Fe的组成比例的图；

图9是显示实施例1中制备的颗粒中所吸附/解吸附的氮的量的图；

图10显示了举例说明从试验实施例3中所制备的药物载体中所释放药 物的量作为时间函数的(a)图和(b)半对数图；以及

图11显示了(a)试验实施例3中所制备的负载抗癌剂的纳米颗粒的荧 光显微镜照片，(b)通过离心沉淀而负载抗癌剂的纳米颗粒的照片，以 及(c)分散在水中的负载抗癌剂的纳米颗粒的照片。

缩写如下：

MKs＝磁性纳米簇

MSNPs＝磁性二氧化硅纳米颗粒

HSNPs＝中空二氧化硅纳米颗粒

HSNPs-PEG＝表面用聚乙二醇改性的中空二氧化硅纳米颗粒

最佳实施方式

本发明涉及多孔中空二氧化硅纳米颗粒(下文中也称为“PHSN” 或“HSNP”)，其各自包含具有直径1～100nm的腔的核心与在其表面 上具有官能团的多孔二氧化硅壳。由于所述核心中存在大的腔，本发明 的二氧化硅纳米颗粒表现出比用于药物载体的常规颗粒高得多的药物 负载效率。此外，通过表面官能团和/或通过经表面官能团与所述二氧 化硅壳键合的生物相容性聚合物来优化所述多孔二氧化硅壳的孔径范 围，以保证药物从所述多孔中空二氧化硅纳米颗粒中持续和稳定的释 放。因此，本发明的多孔中空二氧化硅纳米颗粒可有效用于药物载体的 制备。

现将更详细地描述本发明的多孔中空二氧化硅纳米颗粒。

所述核心被所述多孔二氧化硅壳所围绕并具有直径为1～100nm(优 选为40～100nm)的腔。术语“腔”指所述多孔中空二氧化硅纳米颗粒 由多孔二氧化硅构成的壳(即所述多孔二氧化硅壳)所围绕的内部空间。 由于与常规药物载体相比较而言，本发明的二氧化硅颗粒的内腔的体积 大，因此可用于制备药物负载效率显著提高的药物载体。如果所述腔的 直径小于1nm，则药物负载效率非常低，这可导致腔形成无意义。同 时，如果所述腔的直径大于100nm，则药物释放行为可能难以控制。

将官能团引入围绕所述中空核心的多孔二氧化硅壳的表面上，并可 通过所述表面官能团引入生物相容性聚合物。表面官能团或生物相容性 聚合物的引入使得能够控制所述二氧化硅壳的孔径，因此可以控制待引 入所述中空核心和/或所述孔内的药物的释放速率。对于表面官能团的 种类没有特别限制。可以使用能够与所述二氧化硅壳和所述生物相容性 聚合物进行化学键合的任何表面官能团，而对其没有任何特别限制。合 适的表面官能团的实例包括-COOH、-CHO、-NH₂、-SH、-CONH₂、 -PO₃H、-PO₄H、-SO₃H、-SO₄H、-OH、-NR₄⁺X^-、磺酸基(sulfonate)、 硝酸基(nitrate)、膦酸基(phosphonate)、琥珀酰亚胺基、马来酰亚 胺基(maleimide)和烷基。这些官能团可单独或者以其组合的形式引 入。具有表面官能团的二氧化硅纳米颗粒优选直径为10～200nm。如果 直径小于10nm，则存在孔径可能难以控制的风险。同时，如果直径大 于200nm，则体内适用性可能受到限制。

本发明还涉及多孔中空二氧化硅纳米颗粒，其各自包含具有直径 1～100nm的腔的核心和表面用生物相容性聚合物改性的多孔二氧化硅 壳。可通过二氧化硅壳的表面官能团利用生物相容性聚合物来改性所述 多孔二氧化硅壳的表面。这种表面改性使得能够另外控制所述壳的孔 径。

所述生物相容性聚合物的重均分子量为100～100,000是优选的。重 均分子量低于100的生物相容性聚合物可能表现出体内毒性。而不期望 的是，重均分子量高于100,000的生物相容性聚合物在其适用性方面遇 到困难。生物相容性聚合物的种类不受特别限制，只要所述生物相容性 聚合物的重均分子量在上述规定的范围内即可。例如，所述生物相容性 聚合物选自聚亚烷基二醇(PAG)、聚醚酰亚胺(PEI)、聚乙烯吡咯烷 酮(PVP)、亲水性乙烯基聚合物、其共聚物以及其混合物。使用聚亚 烷基二醇是更优选的。优选的聚亚烷基二醇的实例包括聚乙二醇(PEG) 和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。

所述生物相容性聚合物优选以基于所述二氧化硅颗粒重量的5wt％ 至50wt.％的量存在。所述生物相容性聚合物的量低于5wt.％可能不足 以控制所述二氧化硅壳的孔径，而所述生物相容性聚合物的量高于50 wt.％则可能导致内腔和孔尺寸过度减小。此外，表面用生物相容性聚 合物改性的纳米颗粒的中空核心的直径为1～100nm，优选为40～100 nm。如果所述腔的直径小于1nm，则其可能对于形成腔没有意义。而 如果所述腔的直径大于100nm，则药物释放行为可能难以控制。此外， 表面用生物相容性聚合物改性的二氧化硅壳优选孔径为1～100当所 述二氧化硅壳的孔径小于1时，存在着物质(例如药物)的释放效率 可能降低的风险。而当所述二氧化硅壳的孔径大小大于100时，则存 在着物质(例如药物)的释放效率可能难以控制的风险。所述多孔二氧 化硅壳的厚度为1～50nm是优选的。如果所述二氧化硅壳的厚度小于1 nm，则药物负载稳定性可能降低。而如果所述多孔二氧化硅壳的厚度 大于50nm，则药物释放速度可能非常慢。表面用生物相容性聚合物改 性的二氧化硅纳米颗粒优选直径为20～250nm，更优选为80～250nm。 如果所述二氧化硅纳米颗粒的直径小于80nm，则所述孔径可能难以控 制。而如果所述二氧化硅纳米颗粒的直径大于250nm，则体内适用性 可能受到限制。

本发明的二氧化硅纳米颗粒还可以包含引入到其表面上的组织特异 性结合物质。本文中所用的术语“组织特异性结合物质”意指能够与靶 标活组织进行特异性结合的物质。组织特异性结合物质的引入使得包含 二氧化硅纳米颗粒的药物载体能够更容易地到达所希望的部位。用于本 发明的合适的组织特异性结合物质的实例包括但不限于抗原、抗体、 RNA、DNA、半抗原、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物 素蛋白(neutravidin)、蛋白A、蛋白G、凝集素、选择素、放射性同 位素标记成分以及能够与肿瘤标志物特异性结合的物质。本文中所用的 术语“肿瘤标志物”指肿瘤细胞所表达和/或分泌的但在正常细胞中较 少或根本不产生的特定物质。多种肿瘤标志物和能与肿瘤标志物特异性 结合的物质是本领域中已知的。根据肿瘤标志物的作用机理，可将这些 肿瘤标志物分类为配体、抗体、受体和其编码核酸，如表1中所归纳的。

表1

在肿瘤标志物是配体的情况下，可将能够与所述配体特异性结合的 物质引入到所述二氧化硅纳米颗粒中，所述物质的一个实例可以是能够 与所述配体特异性结合的受体或抗体。这些配体和可用于本发明的能够 与所述配体特异性结合的受体的实例包括但不限于突触结合蛋白 (synaptotagmin)的C2结构域和磷脂酰丝氨酸、膜联蛋白(annexin V) 和磷脂酰丝氨酸、整合素及其受体、血管内皮生长因子(VEGF)及其 受体、促血管生成素和Tie2受体、生长激素释放抑制因子及其受体、以 及血管肠肽及其受体。

在肿瘤标志物是抗原的情况下，可将能够与所述抗原特异性结合的 物质引入到所述二氧化硅纳米颗粒中，所述物质的一个实例可以是抗 体。这些抗原和可用于本发明的能够与所述抗原特异性结合的抗体的实 例包括但不限于癌胚抗原(结直肠癌标志物抗原)和Herceptin (Genentech，美国)、HER2/neu抗原(乳癌标志物抗原)和美罗华、 以及前列腺特异性膜抗原(前列腺癌标志物抗原)和Rituxan (IDCE/Genentech，美国)。

作为肿瘤标志物的受体的一个代表性实例是在卵巢癌中表达的叶酸 受体。可将能够与所述受体(叶酸的叶酸受体)特异性结合的物质引入 到所述二氧化硅纳米颗粒中，所述物质的实例包括能够与所述受体特异 性结合的配体和抗体。

如上所述，抗体尤其优选为本发明中的组织特异性结合物质。抗体 具有仅与特定对象选择性和稳定地结合的能力。当旨在将抗体引入所述 二氧化硅纳米颗粒中时，抗体Fc结构域中赖氨酸的-NH₂、半胱氨酸的 -SH以及天冬氨酸和谷氨酸的-COOH是有用的位点。

这些抗体是可商购的或者可通过本领域已知的合适方法制得。例如， 通过以下方法制备抗体。首先，利用适量的抗原免疫哺乳动物(例如小 鼠、大鼠、山羊、兔、马或绵羊)一次或多次。经过一定时间后，当滴 度达到最佳水平时，从所述哺乳动物采集血清。需要时，可通过任何已 知方法纯化所述血清并存储在冷冻的缓冲液中备用。该方法的详细内容 是本领域中众所周知的。

术语“核酸”旨在包括编码上述配体、抗原、受体以及其至少一部 分的RNA和DNA。如本领域中所知，核酸具有在互补序列间形成碱基 对的能力。基于此能力，可利用具有与特定碱基序列互补的碱基序列的 核酸检测具有该特定碱基序列的核酸。在本发明中，具有与编码酶、配 体、抗原和受体中之一的核酸互补的碱基序列的核酸可用作二氧化硅纳 米颗粒的组织特异性结合物质。此外，位于核酸5’-和3’-末端的官能团 (比如-NH₂、-SH和-COOH)可用于将核酸引入到纳米颗粒中。可通 过本领域中已知的标准方法合成这些核酸，例如利用自动DNA合成仪 (可从Biosearch，Applied Biosystems等商购得到)。具体地，可通过 Stein et al.Nucl.Acids Res.1988，vol.16，p.3209中所描述的方法合成硫 代磷酸酯寡核苷酸，可利用可控玻璃(controlled glass)作为聚合物载 体合成甲基膦酸酯寡核苷酸(Sarin et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1988，vol.85，p.7448)。

如前所解释的，可通过本发明的二氧化硅纳米颗粒壳的表面官能团 引入所述组织特异性结合物质。或者，当利用生物相容性聚合物对二氧 化硅纳米颗粒壳进行表面改性时，将特异性结合结构域引入所述生物相 容性聚合物中，然后可通过所述特异性结合结构域引入组织特异性结合 物质。所述结合结构域由所引入的组织特异性结合物质的种类所决定， 所述结合结构域的非限定性实例是所述表面官能团的反官能团(counter functional group)。

本发明还涉及中空二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其包括将磁性纳 米簇与二氧化硅前体混合(第一步)、利用所述二氧化硅前体在各磁性 纳米簇上形成二氧化硅壳(第二步)、除去存在于所述二氧化硅壳内部 的磁性纳米簇(第三步)、以及在所述二氧化硅壳的表面上引入官能团 (第四步)。

本发明的方法还可包括用生物相容性聚合物改性所述中空二氧化硅 纳米颗粒的表面(第五步)。

在下文中将更详细阐述本发明方法的各个步骤。

在第一步中，将磁性纳米簇与二氧化硅前体混合。此混合导致二氧 化硅前体与磁性纳米簇的结合以及二氧化硅前体的水解。所述磁性纳米 簇用作形成最终的纳米颗粒的中空核心的模板。利用磁性纳米簇作为模 板能够在纳米颗粒内形成比常规方法所形成的腔更大的腔。此外，此模 板步骤提供了可自由控制腔大小的优点。

对于所述磁性纳米簇的制备方法没有特别限制。例如，可通过以下 方法制备所述磁性纳米簇。

首先，将磁性纳米颗粒溶于有机溶剂中以制备油相，将两亲性化合 物溶于水性溶剂中以制备水相。然后，将所述油相与所述水相混合以制 备乳液。从所述乳液中分离出油相，留下所期望的磁性纳米簇。

对该磁性纳米颗粒的制备方法也没有特别限制。例如，可通过(a) 使纳米颗粒前体与有机表面稳定剂在溶剂中反应以及(b)热分解所述 反应产物而制备所述磁性纳米颗粒。

在步骤(a)中，该反应允许所述有机表面稳定剂与纳米颗粒表面进 行配位。

对所述纳米颗粒前体的种类没有特别限制。就纳米颗粒前体而言， 作为示例其可以是与选自-CO、-NO、-C₅H₅、烷氧化物和其它已知配体 中的至少一种配体键合的金属化合物。这些有机金属化合物的具体实例 包括金属羰基化合物，如五羰基铁(Fe(CO)₅)、二茂铁和羰基锰 (Mn₂(CO)₁₀)；以及金属乙酰丙酮化合物，如乙酰丙酮铁(Fe(acac)₃)。 纳米颗粒前体的另一个实例是由金属离子和已知的反阴离子(例如Cl^-或NO₃^-)构成的盐。这些金属盐包括氯化铁(FeCl₃)、氯化亚铁(FeCl₂) 和硝酸铁(Fe(NO₃)₃)。需要时，可使用两种或更多种前述金属前体的 混合物来合成合金纳米颗粒或复合纳米颗粒。所述有机表面稳定剂可选 自烷基三甲基卤化铵、饱和与不饱和脂肪酸、三烷基氧化膦、烷基胺、 烷基硫醇、烷基硫酸钠和烷基磷酸钠。这些表面稳定剂可以单独或作为其 混合物而使用。

优选地，所述溶剂具有临近所述配位化合物(其中所述有机表面稳 定剂与所述纳米颗粒前体的表面配位)热分解温度的高沸点。适用于本 发明的溶剂的实例包括：醚化合物，如辛基醚、丁基醚、己基醚和癸基 醚；杂环化合物，如吡啶和四氢呋喃(THF)；芳香族化合物，如甲苯、 二甲苯、均三甲苯和苯；亚砜化合物，如二甲基亚砜(DMSO)；酰胺 化合物，如二甲基甲酰胺(DMF)；醇类，如辛醇和癸醇；烃类，如戊 烷、己烷、庚烷、辛烷、癸烷、十二烷、十四烷和十六烷；以及水。

对步骤(a)中的反应条件没有特别限制，可根据纳米颗粒前体和表 面稳定剂的种类而适当变化。例如，该反应可在室温或室温以下进行。 该反应通常在保持温度为约30至200℃的情况下进行。

在步骤(b)中，使所述配位化合物(其中有机表面稳定剂与纳米 颗粒前体的表面进行配位)热分解以生长纳米颗粒。所述反应条件可以 适当变化，从而使得纳米颗粒的大小和形状一致。所述热分解温度可根 据纳米颗粒前体和表面稳定剂的种类而适当变化。优选地，所述热分解 在约50至500℃下进行。可以通过已知方法将如此制得的纳米颗粒进 行分离和纯化。

所述磁性纳米簇的种类取决于所用纳米颗粒前体的种类。用于所述 磁性纳米簇的合适材料的实例包括但不具体限于金属材料、磁性材料和 磁性合金。合适的金属材料是Pt、Pd、Ag、Cu和Au，合适的磁性材 料是Co、Mn、Fe、Ni、Gd、Mo、MM’₂O₄和M_xO_y(M和M’各自独 立地代表Co、Fe、Ni、Mn、Zn、Gd或Cr，0＜x≤3，并且0＜y≤5)， 合适的磁性合金是CoCu、CoPt、FePt、CoSm、NiFe和NiFeCo。这些 材料可以单独或以其两种或更多种组合的方式使用。

在本发明的方法中，对利用磁性纳米颗粒制备磁性纳米簇的具体条 件没有特别限制。也就是说，可以利用有机溶剂(例如氯仿)、水性溶 剂(例如超纯水)或两亲性化合物(例如聚乙烯醇)通过本领域中已知 的乳化方法来制备所述磁性纳米簇。而且，所述磁性纳米簇还可以在存 在选自以下的合适的表面活性剂的情况下进行制备：肥皂，如油酸钾和 油酸钠；阴离子型去污剂，如OT、胆酸钠和辛酸钠；阳离子 型去污剂，如十六烷基氯化吡啶鎓、烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵和十 六烷基二甲基乙基溴化铵；两性离子型去污剂，如N-烷基-N，N-二甲基铵 基-1-丙磺酸盐和CHAPS；以及非离子型去污剂，如聚氧乙烯酯、聚氧 乙烯脱水山梨醇酯、脱水山梨醇酯和各种曲拉通(triton)类(例如 TX-100、TX-114)以及其混合物。这些表面活性剂起到降低水相和油 相间界面张力的作用，使得分散于乳液中的油相或水相在热力学上是稳 定的。

在第一步中，使磁性纳米簇与二氧化硅前体(其在随后步骤中组成 二氧化硅壳)在合适的溶剂中混合，以诱导二氧化硅前体与磁性纳米簇 的结合和二氧化硅前体的水解。

就溶剂而言，可使用本领域中已知的任何水性溶剂和有机溶剂，而 对其没有特别限制。优选使用水和醇的混合溶剂。所述混合溶剂中的水 用来水解二氧化硅前体。在该步骤中，将羟基引入二氧化硅前体的硅原 子中以参与缩合反应和凝胶化反应。通常，由于二氧化硅前体不溶于水， 因此预先将其与合适的有机溶剂(例如醇)混合。所述醇将水和二氧化 硅前体均溶解，以便使水和二氧化硅前体均匀混合，从而可将二氧化硅 前体充分水解。水和醇可以任意比例混合，其最佳混合比例可容易地由 本领域技术人员进行确定。

可将任何材料用作二氧化硅前体而没有特别限制，只要其能够在各 磁性纳米簇上形成二氧化硅壳即可。优选将烷氧基硅烷(如四甲氧基硅 烷、四乙氧基硅烷或其混合物)作为二氧化硅前体。更优选四乙氧基硅 烷。在第一步中，本领域技术人员可适当调整所用烷氧基硅烷的量以控 制待形成的壳的厚度。对用于水解二氧化硅前体的条件没有特别限制。 通常，在回流及搅拌下水解二氧化硅前体。可加入合适的催化剂(例如 酸催化剂(如HCl或CH₃COOH)或碱催化剂(例如KOH或NH₄OH)) 来加快二氧化硅前体的水解。

在第二步中，将二氧化硅前体的水解产物缩合并凝胶化以在各磁性 纳米簇上形成二氧化硅壳。作为缩合和凝胶化的结果，在所述簇的表面 上形成了硅氧键(-Si-O-Si-)。

缩合反应可分为脱水缩合和醇缩合。在脱水缩合中，在第一步水解 期间引入前体中的羟基(OH)之间形成氢键以形成硅氧键，并且从所 述前体消除水。在醇缩合中，羟基与烷氧基(OR)键合而形成硅氧键 并从前体中消除醇。对缩合反应和凝胶化反应的条件没有特别限制。例 如，在缩合和凝胶化的最佳温度下搅拌混合物。

在第三步中，除去存在于颗粒(二氧化硅壳在其上形成)内部的磁 性纳米簇而得到中空二氧化硅纳米颗粒。可使用任何方法除去磁性纳米 簇。例如，利用能够溶解磁性材料的材料(例如盐酸或硫酸)处理而除 去磁性纳米簇。在第三步中，需要时，中空二氧化硅纳米颗粒可在高温 下燃烧而除去残留的有机残留物。

在第四步中，将官能团引入到中空二氧化硅纳米颗粒的二氧化硅壳 的表面上。羟基保留在通过水解二氧化硅前体(例如烷氧基硅烷)而制 备的二氧化硅颗粒的表面上。在第四步中，利用能够在其上引入官能团 的前体材料处理颗粒表面。对于前体材料的种类没有特别限制，并且可 不受限制地使用与待引入的表面官能团相对应的一般前体材料。例如， 当旨在在二氧化硅壳表面上引入氨基基团时，可将氨基烷基烷氧基硅烷 用作前体材料。对所用前体材料的量没有特别限制。优选地，所述前体 材料以下述量使用：使得所期望的表面官能团的数目是在第三步后颗粒 表面上所引入羟基数目的5％或更多。

由此制备的中空二氧化硅纳米颗粒可通过本领域中已知的标准方法 进行分离和/或纯化。优选地，本发明的方法还包括利用生物相容性聚 合物改性中空二氧化硅纳米颗粒的表面(第五步)。

可通过任何合适的方法用生物相容性聚合物进行表面改性。例如， 将能够与存在于所述多孔中空二氧化硅纳米颗粒的二氧化硅壳上的表 面官能团键合的各种官能团引入所述生物相容性聚合物中，然后通过所 引入的官能团将所述生物相容性聚合物引入到中空二氧化硅纳米颗粒 的表面上。对于引入到所述生物相容性聚合物中的官能团的种类没有特 别限制。根据纳米颗粒的表面官能团的种类，本领域技术人员可以容易 地对反官能团的种类做出选择。存在于纳米颗粒表面上的表面官能团基 和反官能团的代表性种类以及它们的键合相互作用归纳在表2中。

表2

可使用任何合适的方法将所述反官能团引入到生物相容性聚合物 中。例如，可使用与待引入官能团相对应的合适交联剂将所述官能团自 由引入生物相容性聚合物中。这些交联剂的实例包括1，4-二异硫氰酸基 苯(1，4-phenylene diisocyanate)、1，4-亚苯基二异氰酸酯、1，6-二异氰酸 根合己烷(1，6-diisocyanatohexane)、4-(4-马来酰亚胺基苯基)丁酸N- 羟基琥珀酰亚胺酯、光气溶液、异氰酸4-(马来酰亚胺基)苯酯、1，6-己 二胺、氯甲酸对硝基苯酯、N-羟基琥珀酰亚胺、1，3-二环己基碳二亚胺、 1，1’-羰基二咪唑、3-马来酰亚胺基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、乙二胺、 双(4-硝基苯基)碳酸酯、琥珀酰氯、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二 亚胺盐酸盐、N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶 基二硫基)丙酸酯和琥珀酸酐。

本发明还涉及药物载体，其包含二氧化硅纳米颗粒和负载于核心的 腔内或二氧化硅壳的孔内的药物活性成分。与已知的药物载体相比较， 所述药物载体可将更大量的药物活性成分负载于二氧化硅纳米颗粒中。 此外，可控制所述二氧化硅纳米颗粒的孔，使得药物可从中持续和稳定 的释放。因此，所述二氧化硅纳米颗粒可有效用于制备药物载体。

如前所述，所述纳米颗粒可具有大的腔，如果需要，其大小可自由 控制。因此，纳米颗粒中所负载的药物的量可根据药物载体的期望应用 而自由决定。例如，所述药物具有如等式1计算的1至100％的负载分 数：

对于引入药物载体中的药物活性成分的种类没有特别限制。本领域 中已知具有药物活性的任何成分都可用在本发明中。例如，所述药物活 性成分可选自抗癌剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、白细胞介素、干扰 素、生长因子、肿瘤坏死因子、内毒素、淋巴毒素、尿激酶、链激酶、 组织纤维蛋白溶酶原激活剂、蛋白酶抑制剂、烷基磷酸胆碱、放射性同 位素标记成分、表面活性剂、心血管系统药物、胃肠道系统药物、神经 系统药物以及它们的混合物。抗癌剂的具体实例包括但不限于表柔比 星、多西他赛、吉西他滨、紫杉醇、顺铂、卡铂、泰素(taxol)、丙卡 巴肼、环磷酰胺、放线菌素D、柔红霉素、依托泊苷、他莫昔芬、阿霉 素、丝裂霉素、博来霉素、普卡霉素(plicomycin)、反铂、长春碱和甲 氨蝶呤。可通过任何合适的方法将药物活性成分引入到二氧化硅纳米颗 粒中。例如，可将在合适溶剂中的纳米颗粒和药物活性成分的混合物引 入到二氧化硅纳米颗粒中。

本发明的药物载体可用于疾病的治疗。应用本发明药物载体的疾病 的非限定性实例包括但不具体限于胃癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、肝癌、 支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠癌和宫颈癌。本发明 的药物载体中所包含的药物活性成分的种类可根据所期望的应用而变 化。也就是说，本发明的药物载体可用于多种医疗应用中。

本发明还涉及包含所述药物载体和至少一种可药用载体的药物组合 物。

对于负载于本发明药物组合物中的药物活性成分的种类和本发明药 物组合物所应用的疾病的种类没有特别限制，例如，它们与药物载体中 的那些相同。

对于可用于所述药物组合物中的载体的种类没有特别限制。医学应 用中可用的一般载体和赋形剂均可用于本发明中，它们的具体实例包括 但不限于离子交换树脂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如 人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、 饱和植物脂肪酸的偏甘油酯的混合物)、水、盐和电解质(例如硫酸鱼 精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠和锌盐)、胶体二氧化硅、三 硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的基质(cellulose-based substrate)、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸类、蜡和羊毛脂。 本发明的药物组合物还可包含选自润滑剂、润湿剂、乳化剂、助悬剂和 防腐剂的至少一种添加剂。

在一个实施方案中，本发明的药物载体或药物组合物可制备成用于 胃肠外施用的水溶性溶液。在一个优选实施方案中，所述水溶性溶液可 以是汉克斯液(Hanks’solution)、林格溶液或缓冲液如生理缓冲盐水。 在一个替代性实施方案中，本发明的药物载体或药物组合物可以是无菌 注射制剂的形式，例如为无菌注射用的水混悬剂或无菌注射用的油混悬 剂。所述注射用的水混悬液还可包含增稠剂，比如羧甲基纤维素钠、山 梨醇或葡聚糖。可根据本领域中已知的技术利用合适的分散剂或润湿剂 (例如Tween 80)以及助悬剂来制备所述混悬剂。所述无菌注射制剂还 可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混 悬液(例如作为在1，3-丁二醇中的溶液)。可用于本发明中的载体和溶 剂是甘露醇、水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油也 常作为溶剂或混悬介质使用。为此目的，可使用刺激性较小的不挥发油 产品，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。

【本发明实施方式】

在下文中，将参考以下实施例更详细地解释本发明。然而，这些实 施例不应视为是对本发明范围的限制。

实施例

实施例1

根据以下方法制备表面用聚乙二醇改性的中空二氧化硅纳米颗粒。 制备方法示于图1中。图2显示了通过以下各步骤制备的产品的示意图： (A)表面上具有羟基的中空二氧化硅纳米颗粒，(B)表面上具有氨基 的中空二氧化硅纳米颗粒，和(C)表面用聚乙二醇改性的中空二氧化 硅纳米颗粒。

(1)磁性纳米颗粒的制备

将三乙酰丙酮铁(0.2摩尔)、1，2-十六烷二醇(1摩尔)、十二烷酸 (0.6摩尔)和十二烷胺(0.6摩尔)进行热分解：在150℃下30分钟以 及在290℃下30分钟，以合成大小为12nm的磁铁矿(Fe₃O₄)。利用 纯乙醇纯化所述磁性纳米颗粒。所述磁铁矿的透射电子显微镜照片 (TEM)(3a)显示在图3(a)中。

(2)磁性纳米簇的制备

通过水包油(O/W)乳化法利用所述磁性纳米颗粒制备磁性纳米簇 (MKs)。具体地，将200mg聚乙烯醇作为两亲性聚合物溶解在作为水 性溶剂的100ml超纯水中，将5mg磁性纳米颗粒溶解在作为有机溶剂 的氯仿中。将这两种溶液混合以制备乳液。将所述乳液搅拌约6小时以 除去油相。通过反复离心除去杂质以制备高灵敏的磁性纳米簇。透射电 子显微镜分析表明MKs周围围绕有聚乙烯醇，并且MKs为圆形(图 3(b))。当利用粒径分析仪进行测量时发现MKs的粒径分布为45.3±5.9 nm，ζ电势接近零，这是因为MKs周围围绕有非离子型的聚乙烯醇。

(3)利用二氧化硅包覆MKs

将MKs分散在超纯水(1ml)、乙醇(4ml)和氨水(0.1ml)的混 合物中，然后向所述分散体系中缓慢注入0.1ml四乙氧基硅烷(TEOS) 以制备其中MKs被二氧化硅包覆的磁性二氧化硅纳米颗粒(MSNPs)。 MSNPs的透射电子显微镜分析(TEM)表明MKs完全被二氧化硅所围 绕(图3(c))。发现MSNPs的粒径分布为80.9±9.3nm，ζ电势为-35.6 ±7.8mV。MSNPs的ζ电势的负值比MKs的ζ电势的负值大的原因在 于溶胶-凝胶过程中在MSNPs表面上形成的羟基。通过X射线衍射 (XRD)分析测定MSNPs的结晶性(参见图5中“a”)。

(4)中空二氧化硅纳米颗粒的制备

将50mg MSNPs分散在超纯水(5ml)和盐酸(4ml)的混合物中。 一段时间后，存在于MSNPs内部的MKs开始溶解。这时，溶液颜色由 深褐色(图4(b)中“i”)变为浅黄色(图4(b)中“ii”)。在MKs完全溶 解后，反复离心数次。收集沉淀，以超纯水纯化，冻干，在300℃燃烧 以除去有机杂质。结果制得具有表面羟基的中空二氧化硅纳米颗粒 (HSNPs-OH)。图3(d)是HSNPs-OH的透射电子显微镜照片。该照片 证实了HSNPs-OH的内部完全是空的，形成球形腔(中空核心)。发现 HSNPs-OH的粒径分布为83.1±8.9nm，ζ电势为-43.0±3.2mV(图 4(a)。

(6)表面官能团的引入

在70℃下将10mg HSNPs-OH和0.05ml 3-氨基丙基三甲氧基硅烷 在超纯水中搅拌12小时，并通过反复离心而纯化，以用胺基取代二氧 化硅表面上的羟基。发现如此制得的纳米颗粒(HSNPs-NH₂)的粒径分 布为85.9±7.1nm，ζ电势为-4.2±2.2mV。

(6)利用生物相容性聚合物进行表面改性

将具有羧基的聚乙二醇(PEG-二COOH，0.05摩尔)加入到10ml 二噁烷中，然后向其中加入琥珀酸酐(0.2摩尔)、4-二甲基氨基吡啶(0.1 摩尔)和三乙胺(0.1摩尔)以活化所述PEG-二COOH。使混合物在 室温下反应24小时。使反应混合物通过过滤器，利用四氯化碳纯化， 利用乙醚沉淀，真空下干燥以制得标准缓冲液。将20mg HSNPs-NH₂分散在0.5ml羧基-聚乙二醇标准缓冲液(0.1摩尔)中，并向其中加入 N-3-二甲基氨基丙基-N-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺 (EDC/NHS，0.2摩尔)。将混合物孵育4小时。随着反应的进行，氨基 与二氧化硅壳表面上聚乙二醇的羧基反应而形成酰胺键(O＝C-N-H)， 这通过IR光谱得到证实。通过过滤和离心除去未反应的物质以得到利 用聚乙二醇进行表面改性的中空二氧化硅纳米颗粒(HSNPs-PEG)。发 现HSNPs-PEG的粒径分布为91.3±8.1nm，ζ电势为1.3±3.2mV。

试验实施例1

利用X射线衍射分析、IR光谱、热重分析和X射线光电子谱分析 来证实是否在所述各步骤中制得了所期望的中空二氧化硅纳米颗粒。

(1)X射线衍射分析

进行X射线衍射分析，以确定通过实施例1(4)中的酸处理和燃烧 已完全除去了存在于MSNPs内的MKs。图5显示了含有MKs的MSNPs (a)和已进行酸处理和燃烧的颗粒(b)的MSNPs的结果。从图5的 图中可以看出，在除去MKs之前存在硅酸盐和尖晶石磁性纳米颗粒， 但在酸处理和燃烧之后则不存在磁性纳米簇和有机物质，这证实存在于 MSNPs内的磁性物质已被完全除去。

(2)IR光谱

图6是显示(a)MKs、(b)MSNPs和(c)HSNPs的傅立叶变换红外光 谱(FT-IR)的结果的图。该图显示在不含有MKs的二氧化硅颗粒中未 观察到相应于磁铁矿Fe-O键的约580cm^-1的峰，这表明存在于MSNPs 内的磁性物质已被完全除去。

(3)热重分析

对MSNPs和HSNPs进行热重分析，结果显示在图7中。该图显示， 由于有机物比如十二烷酸和聚乙烯醇的分解，MSNPs的曲线(a)在260 ℃时陡降，而HSNPs的曲线(b)在300℃缓慢下降，这表明了有机物的 含量相对低。这些结果表明存在于MSNPs内的磁性物质已被除去。

(4)X射线光电子谱

通过能量色散X射线光谱法(EDX)测量在各步骤中制备的颗粒的 铁含量。图8显示了(a)MKs、(b)MSNPs和(c)HSNPs的EDX分析结 果以及Si/Fe组成比。如图8所示，MKs、MSNPs和HSNPs的铁含量 分别为96.92±1.13％、38.70±0.77％和2.86±0.46％。

试验实施例2

通过BET法测定HSNPs中所吸附/解吸附的氮的量以测定所述核心 的腔体积和所述壳的二氧化硅孔径。结果显示在图9中。由图9明显看 出，HSNPs-PEG和MSNPs中所吸附的氮的量分别≥198.7cm³/g和 92.7cm³/g。在表面改性前二氧化硅纳米颗粒(HSNPs)中所吸附的氮 的含量低于在表面改性后所述颗粒(HSNPs-PEG)中所吸附的氮的量。 这是因为孔径被存在于HSNPs-PEG上的聚乙二醇分子所降低的缘故。 所述氮吸附/解吸附实验结果还表明HSNPs-PEG和MSNPs的平均孔径 分别为约1.64nm和约2.3nm。相信这些结果是因为在用聚乙二醇进行 表面改性后孔径降低。也就是说，聚乙二醇分子降低了所述核心的内腔 的大小和所述二氧化硅壳的孔径。

试验实施例3

使10mg所述三种颗粒(即HSNPs-OH、HSNPs-NH₂和 HSNPs-PEG)各自与5mg作为抗癌剂的阿霉素在4ml标准缓冲溶液 中反应24小时，以将所述抗癌剂引入纳米颗粒中，然后离心。其后， 分别通过等式2和3计算纳米颗粒中抗癌剂的负载分数和负载效率：

结果显示在表3中。

表3

由表1可以看出，所述中空核心的腔大小和所述壳的孔径是通过利用 表面官能团(氨基)和生物相容性聚合物(聚乙二醇)对中空二氧化硅纳 米颗粒进行改性而受到控制，结果改变了药物(阿霉素)的负载分数和负 载效率。

随后，测试不同种类的负载抗癌剂的颗粒的药物释放。具体地，将2ml 负载抗癌剂的颗粒分散在透析管中，并向其中加入10ml标准缓冲液。利 用紫外可见分光光度计在480nm波长处测量抗癌剂的释放量，同时保持 温度在37℃。此时，在室温下进行超声以诱导抗癌剂从负载抗癌剂的颗粒 中释放出来，并通过离心收集所释放的抗癌剂。图10显示了从具有表3 中所示负载分数和负载效率的不同种类的纳米颗粒中抗癌剂的释放曲线。 具体地，图10显示了表明从各药物载体中所释放的药物量作为时间函数的 (a)图和(b)半对数图。

通过等式4计算不同种类的纳米颗粒的药物释放曲线：

X_t＝X_inf(1-e^-kt)    (4)

其中X_t和X_inf代表具体时间点，t代表药物释放时间，inf代表无穷大(即 药物的物理释放完成的时间)，k是速率常数。

结果显示在表4中。

表4

从图10和表4的结果可知，在一天内药物从HSNPs-OH中释放出来， 而HSNPs-NH₂则显示较慢的释放速率，HSNPs-PEG显示比HSNPs-OH慢 得多的释放速率。特别地，HSNPs-PEG显示在初始阶段没有突然释放曲线。 在试验第一天，抗癌剂从HSNPs-OH释放的速率是2.2956Ln％/天，其比 HSNPs-NH₂的释放速率(0.7108Ln％/天)高约两倍，比HSNPs-PEG的释 放速率(0.2270Ln％/天)高约九倍。从试验后第二天起，HSNPs-PEG显示 出零级反应曲线和0.0636Ln％/天的释放速率，该释放速率比HSNPs-OH 的释放速率(0.1040Ln％/天)低。这些结果证实了药物从所述中空二氧化 硅纳米颗粒中稳定释放，表明所述中空二氧化硅纳米颗粒可有效用作药物 载体。此外，利用抗癌剂(阿霉素)发射荧光的能力，在荧光显微镜下观 察到负载抗癌剂的二氧化硅颗粒的可分散性(图11)。由图11可以证实， 负载阿霉素的颗粒稳定地分散在水中。