钌的配合物单体、由其制备的聚合物、包括该聚合物的电化学发光材料、其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种钌的配合物单体、由其制备的聚合物、包括该聚合物的电化学发光材料、其制备方法和用途。所述钌的配合物单体具有以下结构：

说明书

技术领域

本发明属于电化学发光材料领域，涉及到钌的配合物单体和由其制备的聚合物类发光材料、其制备方法及用途。

背景技术

在免疫分析检测的领域中，电化学发光获得越来越大的关注，这归因于这种方法的简单、高感度(high sensitive)、高效以及可控制性。电化学发光被发现能够应用于开发商业化仪器去进行许多临床的诊断，基于该方法对生化材料的可监测浓度达10^-9M(见文献Richter M.M.et al.，Chem.Rev.2004，104，3003-3036)。

电化学发光用于免疫分析检测时很多是通过溶液来检测抗原的含量，首先连接钌的配合物到一种抗体中，但是这种方法需要不停的补充电化学发光材料的溶液(见文献Wu T.et al.，Clin.Chem.1991，37，1534-1539)。通过将钌的配合物单体连接到高分子链上从而把发光材料涂在电极表面做成膜的系统有一些明显的好处，电极表面有高浓度的反应中心，电化学发光会只产生在固定的位置，从而有利于提高电化学的感度(见文献Forster R.J.etal.，Anal.Chem.2000，72，5576-5582)。

通过电聚合的方法，可以在电极的表面获得好的稳定的薄膜，但是膜不具有胶体的特点，所以水溶性的化学和生化物质不容易吸附在电极的表面(见文献Lee J.-K.et al.，Chem.Commun.2003，1602-1603)。

通过化学方法可以将钌的配合物单体引入到高分子材料中，如利用高分子聚4-乙烯吡啶中的吡啶环与钌的配合物单体Ru(bpy)₂³⁺反应，获得[Ru(bpy)₂(PVP)₁₀]²⁺(以下简称为RuPVP)，其重复单元如下：

其中n＝1。

这种方法的反应时间长，获得的产物涂在电极表面的膜容易被洗掉，而且该产物的电化学发光效率低，这可能归因于最终配合物的配位结构受高分子链影响而不稳定(见文献Forster R.J.et al.，Macromolecules 1990，23，4372-4377)。

一般情况下，通过化学键的连接把钌的配合物单体连接到高分子体系中会受到高分子的溶解度的影响。

至今，据我们所了解的知识，被测试的生化的物质通过和电极表面的膜发生亲电作用而吸附到电极表面。这种吸附是没有选择性的。基于电极材料，ITO会是常用的，如果电化学发光的材料上有羧基，材料和电极表面的吸附会增加膜的吸附性和稳定性，同时通过化学键的结合使得被测试的生化材料连接在膜的表面，从而增加对被测试生化材料的选择性。

发明内容

为了解决上述的问题，即获得一种容易吸附在电极表面、电化学发光稳定且发光效率高的电化学发光材料，我们首先设计了以下式(I)(以下简称为Ru2mono)或式(II)(以下简称为Ru1mono)所示的钌的配合物单体：

并制备了以下三种聚合物：

第一种聚合物，其具有以下重复单元(A)：

和重复单元(B)：

其中，重复单元(A)和重复单元(B)的摩尔比为1∶5～1∶15，所述聚合物的重均分子量为40,000-150,000。

上述第一种聚合物，所述重复单元(A)和重复单元(B)的摩尔比优选为1∶9(以下简称为Ru2MVP)。

第二种聚合物(以下简称Ru2MP)，其具有以下重复单元：

所述聚合物的重均分子量为40,000-50,000。

第三种聚合物，其具有以下重复单元(C)：

和重复单元(D)：

其中，重复单元(C)和重复单元(D)的摩尔比为1∶5～1∶15，所述聚合物的重均分子量为40,000-145,000。

上述第三种聚合物，所述重复单元(C)和重复单元(D)的摩尔比优选为1∶9(以下简称为Ru1MVP)。

所述钌的配合物单体的制备方法，其通过2，2’-联吡啶-4，4’-二羧基-二[2，2’-吡啶]二价钌的高氯酸盐(以下简称为Ru2COOH)和4-氨基甲基苯乙烯反应制得，Ru2COOH和4-氨基甲基苯乙烯的摩尔比例1∶2和1∶1不同从而分别获得式(I)所示的钌的配合物单体和式(II)所示的钌的配合物单体。

所述聚合物的制备方法，其通过上述式(I)所示的钌的配合物单体或式(II)所示的钌的配合物单体与4-乙烯吡啶经自由基引发聚合而制得，或者通过上述式(I)所示的钌的配合物单体经自由基引发聚合而制得。

一种电化学发光材料，其包括上述的聚合物。

上述聚合物在制备电化学发光材料中的应用。

所述的电化学发光材料，其为薄膜。

上述电化学发光材料的用途，其用于免疫分析检测。

由上述聚合物制备的薄膜，所获的电化学发光效率和RuPVP进行对照，它们的有效的电化学发光效率增加约20-100倍。它们的高效的电化学发光性非常持久而且稳定。用这种方法制备的发光材料具有反应时间短和容易以及可以制备不同浓度的钌的配合物的高分子材料。

在所述第三种聚合物的重复单元中有一个羧基，从而会更容易和ITO电极表面发生作用而增强吸附，对电极的强的吸附性将直接影响到这种不动相的电化学发光材料在免疫分析检测中的应用。这种材料可被涂在电极的表面，通过和溶液中的药物，如氨基酸、多肽、蛋白质、核酸及血糖等发生作用后电化学发光的改变从而可检测分析其含量至10^-9M。

这种材料可用于ELECSYS系列全自动电化学发光免疫分析仪及其临床应用。

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。

附图说明

图1是钌的配合物单体Ru2mono和Ru1mono的合成路径。

图2是聚合物Ru2MVP、Ru2MP和Ru1MVP的合成路径。

图3是通过在电化学的材料的表面形成三明治结构而精确的检测抗原生化的诊断和分析手段(模型1)。

图4是钌的配合物单体和聚合物在0.05M Bu₄NClO₄溶液中的紫外和发光图谱。

图5是激发波长在458nm时Ru2COOH，Ru2mono和Ru2MVP的拉曼图谱。

图6是伴有共同-还原剂的三丙基胺/草酸钠存在时电化学发光的过程。

图7是样品Ru1MVP、Ru2MP和参照物RuPVP的膜的电化学发光(Electrochemical Luminescence，以下简称为ECL)，样品被溶解在3ml 0.01MTPA/0.01M Pbs，在感度2e-3和增幅电压-650V下进行ECL测定；左边是ECL的强度，右边是电流。

图8是样品Ru2MVP和参照物RuPVP的膜的ECL，样品被溶解在3ml0.01M TPA/0.01M Pbs，在感度2e-3和增幅电压-550V下进行ECL测定；左边是ECL的强度，右边是电流。

图9是在2ml 0.05M H₂SO₄溶液中在0.9-1.3V下测定的氧化还原的循环电位，其扫描速度为5mV/s。

图10是所有的钌的配合物单体和聚合物样品在溶液中的ECL，样品被溶解在3ml 0.01M TPA/0.01M Pbs中，然后在感度2e-3和增幅电压-650V下进行ECL测定；左边是ECL的强度，右边是电流。

图11是膜中分子内的吡啶环和羧基的氢键作用以及溶液中被羧基和TPA分子间的氢键所取代的过程(模型2)。

图12是对照ECL的发光机理和紫外激发诱导的发光的过程(模型3)。

图13是ECL测定前后电极表面的膜的形状的对照表明经过ECL测定后Ru1MVP的膜有明显的胶体形成的现象。

图14是在10^-4M还原剂草酸钠/0.01M Pbs的存在下在感度2e-3和增幅电压-650V下测定Ru2MVP和RuPVP的ECL。

图15是Ru2COOH在d⁶-DMSO中的¹H-NMR，其中(a)是Ru2COOH的分子结构式，(b)是Ru2COOH在d⁶-DMSO中的¹H-NMR，(c)是Ru2COOH在d⁶-DMSO中的¹H-¹H Cosy。

图16是Ru2mono在d⁶-DMSO中的¹H-NMR。其中(a)是Ru2mono的分子结构式，(b)是Ru2mono在d⁶-DMSO中的¹H-NMR，(c)是Ru2mono在d⁶-DMSO中的¹H-¹H Cosy。

图17是Ru2mono的质谱。

图18是Ru2mono的元素分析。

图19是Ru1mono在d⁶-DMSO中的¹H-NMR。其中(a)是Ru2mono的分子结构式，(b)是Ru2mono在d⁶-DMSO中的¹H-NMR。

图20是Ru1mono的质谱。

图21是Ru1mono的元素分析。

图22是Ru2MVP在d⁶-DMSO中的¹H-NMR。

图23是Ru2MP在d⁶-DMSO中的¹H-NMR。

图24是Ru1MVP在d⁶-DMSO中的¹H-NMR。

具体实施方式

本发明中我们设计了2种钌的配合物单体，即下述式(I)和式(II)所示的钌的配合物单体：

所述钌的配合物单体的制备方法，其通过2，2’-联吡啶-4，4’-二羧基-二[2，2’-吡啶]二价钌的高氯酸盐(以下简称为Ru2COOH)和4-氨基甲基苯乙烯反应制得，Ru2COOH和4-氨基甲基苯乙烯的摩尔比例1∶2和1∶1不同从而分别获得式(I)所示的钌的配合物单体和式(II)所示的钌的配合物单体。

其中Ru2COOH是已知产品，其合成方法见文献Greenway G.M.et al.，Chem.Commun.2006，85-87，具体步骤如下：2，2’-联吡啶-4，4’-二羧基和顺式-二[2，2’-吡啶]二价钌的氯配合物溶解在乙醇和水的混合溶剂中，氮气下回流反应2天后，浓缩后加入高氯酸钠得到固体沉淀，即Ru2COOH。

Ru2COOH和4-氨基甲基苯乙烯的反应是在催化剂4-(4，6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(以下简称为DMTMM)存在下于氮，氮-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中进行的(反应式见图1)。粗产物经硅胶柱纯化。具体的条件可参考文献Friesen D.A.，Inorg.Chem.1998，37，2756-2762。

通过上述式(I)所示的钌的配合物单体或式(II)所示的钌的配合物单体与4-乙烯吡啶经自由基引发聚合或通过上述式(I)所示的钌的配合物单体经自由基引发聚合制备了下述三种聚合物：

第一种聚合物，其具有以下重复单元(A)：

和重复单元(B)：

其中，重复单元(A)和重复单元(B)的摩尔比为1∶5～1∶15，所述聚合物的重均分子量为40,000-150,000。

上述第一种聚合物，所述重复单元(A)和重复单元(B)的摩尔比优选为1∶9。

第二种聚合物，其具有以下重复单元：

所述聚合物的重均分子量为40,000-50,000。

第三种聚合物，其具有以下重复单元(C)：

和重复单元(D)：

其中，重复单元(C)和重复单元(D)的摩尔比为1∶5～1∶15，所述聚合物的重均分子量为40,000-145,000。

上述第三种聚合物，所述重复单元(C)和重复单元(D)的摩尔比优选为1∶9。

所述自由基引发聚合属于常规的方法(反应式见图2)。聚合反应的条件可参照文献Lara-Ceniceros A.C.et al.，Polymer Bulletin 2007，59，499-508。

在上述第一种聚合物的分子结构中，钌的配合物的中心通过两个手臂连接在高分子链上。它的分子的结构与报到的RuPVP相似，通过比较和对照表明，以这种方法获得的材料的电化学发光的感度远大于RuPVP的电化学发光的感度。

在上述第三种聚合物的分子结构中，钌的配合物的中心仅通过一个手臂连接在高分子链上。和第一种聚合物比较，第二种聚合物的旋转程度较大。更主要的是它有个自由的羧基，从而能更好的通过化学键或亲和力与被检测的蛋白质抗体等发生作用从而能实现有效的免疫分析检测。

通过上述第二种聚合物表明，钌的配合物的掺杂的浓度的提高对电化学发光的性质的影响不大。

从这一类聚合物制备的薄膜，具有稳定性和高感度的电化学发光性能。结果表明，当钌的配合物单体Ru2mono和4-乙烯吡啶的摩尔比例是1比9时，在三乙胺中，Ru2MVP的电化学发光是RuPVP的110倍，在草酸钠中，其电化学发光是RuPVP的40倍；在三乙胺中，Ru1MVP的电化学发光是RuPVP的17倍。Ru2MP仅从一种单体Ru2mono聚合而来，在三乙胺中其电化学发光和RuPVP的一样大小。重要的是上述所有的材料，它们的高效的电化学发光性非常持久而且稳定。用这种方法制备的材料具有反应时间短和容易以及可以制备不同浓度的钌的配合物的高分子材料。

用这种方法制备的材料具有反应时间短和容易控制连接不同浓度的钌的配合物单体。

如模型1所示(见图3)，这一类配合物通过亲和作用或者通过化学反应与抗体蛋白质的氨基发生作用从而把抗体吸附到电极的表面，在此基础上抗体结合一种抗原和另一种被修饰的抗体形成一种三明治的结构。电化学发光的效率取决于形成的三明治结构的数量。通过和空白样品的对照，这种方法能准确的测试免疫系统的抗原体蛋白质的含量。

已有文献报道(见文献Mara S.et al.，Inorg.Chem.2003，42，7789-7798)，在表面活性剂的存在下，钌的配合物单体的聚合物材料的电化学发光性能在水溶液中会增强。本发明中发现，在有机溶液相中，制备的第三种聚合物制备的电化学发光材料具有高效的电化学发光性能。因此可以预计，在表面活性剂的存在下，上述第三种聚合物制备的电化学发光材料在水溶液中也应具有高效的电化学发光性能。

实施例

以下实施例进一步说明本发明，然而，这些实施例并不意在以任何方式限制本发明的范围，并且不应该被理解为提供必须专门使用以实践本发明的条件、参数或者数值。

除本发明的单体外，其他的反应原料从Aldrich公司购买，未经过处理即使用。所有反应的中间产物和最终产物分子结构都被核磁400MHz Bruker和质谱Bruker Daltonics Data Analysis和元素分析所确证。d⁶-DMSO和乙腈被用作核磁的溶剂。Chi760B-Potentiostat仪器伴有光增幅仪Photomultiplier(PMT)用来检测电化学发光。电位的测定参照Ag/AgCl电极。样品溶液的浓度大约为10^-6M，其发光寿命用Nanoharp 250multichannelscaler来测试。

Perkin-Elmer Lambda 900spectrometer用来测UV-Vis吸收。CaryEclipse Fluorescence spectrophotometer用来测定发光图谱。拉曼光谱是Horiba Jobin Yvon HR800UV confocal microscope来测试。参照物Ru(bpy)₃2ClO₄简化成Ru(bpy)₃²⁺，溶液中，它的发光收率和电化学发光的收率作为标准。

制备例1：Ru2COOH合成

Ru2COOH通过以下步骤合成：2，2’-联吡啶-4，4’-二羧基(178mg，0.7mmol)和顺式-二[2，2’-吡啶]二价钌的氯配合物(350mg，0.6mmol)溶解在300ml乙醇∶水＝1∶1的混合溶剂中，反应通氮气两个小时后，加热到回流温度90℃并保温48小时。溶液干燥到只剩下30ml后，加入高氯酸钠371毫克得到405毫克的黑色的固体沉淀。收率是80％。

核磁¹H-NMR在溶剂d⁶-DMSO(见图15)：9.23(s，Ary-H，2H)，8.86-8.84(dd，Ary-H，4H)，8.28-8.16(m，Ary-H，4H)，7.98-7.92(d，Ary-H，2H)，7.88-7.86(dd，Ary-H，2H)，7.75-7.70(m，Ary-H，4H)，7.58-7.48(m，Ary-H，4H)；

质谱TOF MS ES：[Mw-2ClO₄]²⁺/2：328；

元素分析：理论44.80，2.80，9.80，实际：41.98，2.91，9.06，误差，-6.0，3.90，-7.5(％)。

实施例1：Ru2mono合成

Ru2mono合成：制备例1制得的配合物Ru2COOH(250mg，0.3mmol)和催化剂4-(4，6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(184mg，0.66mmol)和4-氨基甲基苯乙烯(85mg 0.64mmol)溶于15ml DMF。在室温下搅拌2天。溶液部分蒸干，硅胶柱纯化，乙腈和二氯甲烷用来洗脱产物，210毫克的产物被获得，收率65％。

核磁¹H-NMR在溶剂d⁶-DMSO(见图16)：9.67(t，-C(＝O)-NH，2H)，9.23(s，Ary-H，2H)，8.87-8.84(dd，Ary-H，4H)，8.20-8.17(m，Ary-H，4H)，7.95-7.94(d，Ary-H，2H)，7.91-7.90(d，Ary-H，2H)，7.78-7.71(m，Ary-H，4H)，7.57-7.49(m，Ary-H，4H)，7.45-7.43(d，Ary-H，4H)，7.33-7.31(d，Ary-H，4H)，6.75-6.68(dd，Ary-H，2H)，5.83-5.78(d，-CH＝CH₂，2H)，5.25-5.22(d，-CH＝CH₂，2H)，4.56-4.54(d，-CH₂-NH-C＝O，4H)；

质谱TOF MS ES(见图17)：[Mw-2ClO₄]²⁺/2：444；

元素分析(见图18)：理论：55.19，3.86，10.30，实际：54.62，4.05，10.13，误差，-1.03，4.92，1.65(％)。

实施例2：Ru1mono合成

Ru1mono合成：Ru1mono制备方法和实施例1的Ru2mono的制备方法类似。

制备例1制得的配合物Ru2COOH(450mg，0.54mmol)和催化剂4-(4，6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐DMTMM(162mg，0.59mmol)和4-氨基甲基苯乙烯(76.5mg 0.58mmol)溶于30ml DMF。在室温下搅拌2天。溶液部分蒸干，硅胶柱纯化，乙腈和二氯甲烷用来洗脱产物，205毫克的产物被获得，收率40％。

核磁¹H-NMR在溶剂d⁶-DMSO(见图19)：9.65-9.70(t，-C(＝O)-NH，1H)，9.35(s，Ary-H，1H)，9.17(s，Ary-H，1H)，8.85-8.88(m，Ary-H，4H)，8.18-8.23(td，Ary-H，4H)，7.89-7.98(m，Ary-H，4H)，7.71-7.77(dd，Ary-H，4H)，7.45-7.56(m，Ary-H，6H)，7.31-7.38(d，Ary-H，2H)，6.69-6.76(dd，Ary-H，1H)，5.79-5.84(dd，-CH＝CH₂，1H)，5.24-5.26(d，-CH＝CH₂，1H)，4.58-4.60(d，-CH₂-NH-C＝O，2H)；

质谱TOF MS ES(见图20)：[Mw-2ClO₄]²⁺/2：386；

元素分析(见图21)：理论：50.72，3.20，10.11，实际：48.92，3.39，9.63，误差，-3.50，5.90，7.4(％)。

实施例3：Ru2MVP聚合物的制备

Ru2MVP聚合物的制备：实施例1的Ru2mono(56mg，0.05mmol)和4-乙烯吡啶(54mg，0.45mmol)(Ru2mono与4-乙烯吡啶的摩尔比为1∶9)溶解在10毫升四氢呋喃中。加入1.4毫克引发剂AIBN。反应回流过夜。冷却和蒸干，经二氯甲烷洗涤、干燥得75毫克固体。聚合物的核磁证明双键完全消失(见图22)。Ru2MVP聚合物的重均分子量用溶胶渗透色谱法测定(以聚4-乙烯吡啶为标准)约为95,000。

实施例4：Ru2MP的制备

采用实施例3中类似的方法制备聚合物Ru2MP。

Ru2MP聚合物的制备：实施例1的Ru2mono(90mg，0.08mmol)溶解在20毫升四氢呋喃中。加入2.2毫克引发剂AIBN。反应回流过夜。冷却和蒸干，经二氯甲烷洗涤、干燥得61毫克固体。聚合物的核磁证明双键完全消失(见图23)。Ru2MP聚合物的重均分子量用溶胶渗透色谱法测定(以聚4-乙烯吡啶为标准)约为45,000。

实施例5：Ru1MVP的制备

采用实施例3中类似的方法制备聚合物Ru1MVP。

Ru1MVP聚合物的制备：实施例2的Ru1mono(156mg，0.16mmol)和4-乙烯吡啶(151mg，1.44mmol)(Ru1mono与4-乙烯吡啶的摩尔比为1∶9)溶解在30毫升四氢呋喃中。加入4.4毫克引发剂AIBN。反应回流过夜。冷却和蒸干，经二氯甲烷洗涤、干燥得260毫克固体。聚合物的核磁证明双键完全消失(见图24)。Ru1MVP聚合物的重均分子量用溶胶渗透色谱法测定(以聚4-乙烯吡啶为标准)约为90,000。

实施例6：材料的光学和电化学性质的测定

表1单体和聚合物的紫外吸收和发光的图谱，

发光效率和发光的寿命τ以及氧化还原的电位的值

钌的配合物单体和其聚合物的紫外吸收和发光图谱如图4所示，发光效率和发光寿命τ以及氧化还原电位的值在表1中列出。由此可见聚合前后，这些基本的参数没有变化。这说明钌的配合物单体的稳定性没有受到自由基聚合反应的影响。

表1的说明如下：取20μl电化学测试用的溶液用2毫升乙腈稀释得[C]₁，UV吸收峰值代表溶液中钌的配合物的浓度。结合紫外吸收系数和紫外吸收峰值，溶液的有效的钌的配合物的浓度可以通过紫外吸收来推断。用来测试发光效率的浓度[C]₂是从[C]₁以如表1所示比例而稀释出来。为了能和ECL测试的溶剂的条件一致，我们使用同样的溶液，即0.05M Bu₄NClO₄的乙腈溶液。基于发光的图谱的形状基本相同，其面积可以以峰值代替，溶液的浓度可以用紫外吸收峰值代替，的数值可以通过一些近似而获得。

图5列出Ru2COOH，Ru2mono和Ru2MVP的拉曼图谱。在钌的配合物单体中，七个联吡啶的共振峰出现在1000cm^-1-1700cm^-1分别被观察到。三个特征性的峰在1310，1480，1610cm^-1之间也被发现。这进一步证明制备聚合物的过程没有破坏钌的配合物的属性。

Ru2COOH的KBr压片的红外图谱显示了羧基的振动分别在1740cm^-1，1730cm^-1。在Ru2mono中，因酰胺基形成这种振动减弱到1660cm^-1，1670cm^-1。这可归功于氨基吸电的作用。在红外图谱中N-H的弯曲振动1540cm^-1也被发现。

Ru2mono和Ru1mono的发光效率是参照母体Ru(bpy)₃²⁺获得，聚合物的发光效率是以RuPVP作为参照的。紫外吸收溶液都是从用来检测的ECL高浓度的溶液稀释而来。发光收率的溶液是从紫外吸收的溶液再一次稀释而来，用来测试荧光收率的溶液浓度约是10^-5-10^-6M。基于这一类的化合物的紫外吸收系数是相近的，Ru2COOH吸收的系数是1.36＊10^-4M^-1cm^-1(见文献Calvert J.M.et al.，J.Amer.Chem.Soc.1982，104(24)，6620-6627)，RuPVP是1.30＊10^-4M^-1cm^-1(见文献Beer P.D.et al.，J.Amer.Chem.Soc.1997，119(49)，11864-11875)。基于发光图谱的形状基本相同，其面积可以以峰值代替，溶液的浓度可以用紫外吸收峰值代替。的数值可以通过一些近似而获得。

如表1所示在聚合物中单体中钌的配合物的发光效率比较接近。这意味着聚合物中邻近的钌的配合物的激发和发光是相对独立的。与单体相比，聚合物减弱20％左右，这现象可能归因于聚合物中邻近的钌的配合物的轻微的激发态的淬灭。Ru1MVP的发光效率相对偏低，这可能归因于分子间的能量的传递。这与最初的设计思路是相吻合的，通过一个容易转动的支链连接钌的配合物到高分子链上可以增加钌的配合物中心的转动。较小的可能因为分子间的激发态的能量的快速传递而引起的淬灭。和使用两个连接的支链的连接钌的配合物单体到高分子链上的Ru2MVP相比，Ru1MVP应该更有利于薄膜中电化学发光的效率提高。

和RuPVP相比，这一类新的钌的配合物激发态的寿命增加6倍。这极大程度上归功于新型的配合物的配位结构非常稳定。和RuPVP，Ru(bpy)₃²⁺样品相比，在缓冲溶液Pbs中新型的金属的聚合物Ru2MVP，Ru1MVP和Ru2MP的氧化还原电位的峰不明显。在乙腈的溶液中，氧化还原电位有所增加(见表1)，这归功于两个吸电的酰胺基团的引入。

实施例7：材料在膜和溶液中的电化学发光性质的测定

首先制备溶液样品，即以10毫克左右Ru2MVP、Ru1MVP、Ru2MP或RuPVP溶于1毫升CH₃NO₂或DMF溶剂中。然后取15μl溶液滴加到电极表面，干燥过夜后进行电化学发光的测试。有效的钌的配合物单体的中心的浓度通过紫外吸收进行表征。

在膜的表面的电化学发光是由发生在电极表面的氧化还原反应所引发的。一旦电极的表面的钌被氧化后通过电子的传递聚合物膜的表面的钌的配合物单体被氧化，它将会和溶液里的还原剂三乙胺或草酸钠反应产生自由基(见图6)，这样自由基会和连续被氧化的钌的配合物反应产生激发态的钌的二价配合物。从这一步开始，它的发光是和通过紫外光激发发光是一样的。因为电极上氧化还原是连续的，如果钌的配合物的材料比较稳定，电化学的发光将是稳定的。它的机理被文献详细的阐明(见文献W.Miao，Handbookof electrochemistry，2007Elsevier B.V.All rights reserved，Edited by C.G.Zoski)。

图7和图8是样品Ru1MVP，Ru2MP，Ru2MVP电化学发光的图谱，RuPVP是参照。我们尝试着不同的扫描速度100mV/s，200mV/s，50mV/s，100mV/s以确定膜的稳定性，其中100mV/s的扫描速度是用来确定材料的电化学反应时间的典型速度。在测定ECL电信号时光增幅仪电位为650V，Ru2MVP的电化学发光特别强而没法测量，Ru1MVP，Ru2MP和RuPVP可被测试。在光增幅仪电位为550V时，再次以RuPVP为参照测定Ru2MVP的电化学发光效率。基于两次的测定是使用同样的参照物，样品Ru1MVP，Ru2MP，Ru2MVP相对的电化学发光的效率可以被校正。结果列于表2。

表2中，X mg/Y ml：样品的重量和溶剂的体积，其中Ru2MVP和Ru2MP是用溶剂CH₃NO₂来溶解，Ru1MVP和RuPVP是用DMF来溶解。Mw是一个重复单元的分子量，M₁是计算出的浓度，M₂是测定用2ml溶剂稀释的20μl电化学测定用的溶液的紫外吸收推算出的浓度，a：测定条件是光增幅仪的电压是650V，b：测定条件是光增幅仪的电压是550V。

表2参照物RuPVP，样品Ru1MVP，Ru2MVP和Ru2MP膜的ECL的相对效率

  X mg/Y ml>  10/1>  6/0.5>  7.8/0.5>  13.6/1>  重复单元的Mw>  2387>  1089>  2243>  1645>  M₁(＊10^-4M)  42>  110>  61>  61>  UV吸收峰值  20μl/2mlACN>  0.87>  1.71>  0.87>  0.53>  M₂(＊10^-4M)  6.40>  12.5>  6.30>  4.10>  ECl^a  溢出>  0.28>  5.3>  0.2>  ECl^b  2.4>    0.014>  ECl比值>  171>  1.4>  27>  1>  ECl/M>  110>  0.48>  17>  1>

电化学发光的效率将以M₂来校正，M₂分别是M₁的7-10倍左右。同时从图谱中，我们不难看出新的钌的配合物的电化学发光的效率的持续性。这表明基于钌的配合物的核是稳定的，因此这一类材料的电化学发光也是稳定的。RuPVP的电化学发光只有一次，接着在不同的扫描速度下，它的发光变得非常弱，这可能取决于配合物结构的不稳定而没有重复使用的能力。

考虑到电极上的配合物的浓度的差异，在100mV/s扫描速率下电化学发光的相对效率被计算出来。结果发现在还原剂三乙胺中Ru2MVP电化学发光是RuPVP的110倍，Ru1MVP电化学发光是RuPVP的17倍，Ru2MP电化学发光和RuPVP的一样大小。

如图7所示，在0.01M Pbs的缓冲溶液中，这一类的配合物薄膜没表现明显的氧化和还原的峰，只有在0.05M H₂SO₄溶液中，可以获得氧化和还原峰。

图9是在0.9-1.3V测定的氧化还原循环电位(CV)，其结果列于表3。

表面覆盖的效率Γ可以根据CV的氧化的峰面积来计算，Ru1MVP有效的表面吸附性是Ru2MVP的35倍，Ru2MP的Γ数值几乎是零。和Ru2MVP对照时，Ru1MVP具有较大的表面吸附。这可能归功于羧基的存在从而增加对电极表面的吸附。对照Ru2MVP和Ru2MP，我们可以知道吡啶环也对材料表面的吸附性有较大的影响。ECL/Γ的数值可以用来估计薄膜中电子传递的效率。ECL/Γ的数值表明合成的所有新型材料的电子传递的速度比RuPVP大。这可能归功于酰胺基的连接方法是柔韧的从而增加电子的传递速度。对于样品Ru2MP，其减弱的电化学发光性可能归功于邻近的钌的配合物之间的快速的电子传递从而淬灭绝大部分的激发态。

表3在0.9-1.3V之间测定的氧化还原循环电位和根据氧化的峰面积来估算膜的表面覆盖的效率Γ

  样品> Q (＊10^-4C)  Γ＊10^-7  (mol/cm^-2)>  Γ的比值>  ECl比值>  能量传递  ECL/Γ>  Ru2MVP> 0.05>  0.18>  1>  117>  10773>  Ru2MP> 0>   0>  1.4>  ∞>  Ru1MVP> 2.04>  6.40>  35>  27>  48>  RuPVP> 3.67>  11.5>  63>  1>  1>

溶液中的电化学的发光现象与此相反。有趣的是Ru1MVP在溶液中表现较强的电化学发光效率，几乎接近单体的电化学发光。Ru2MVP和Ru2MP的数值却非常小。相对的的电化学发光率是参照Ru(bpy)₃²⁺而计算出来(见表4)。

表4相对的的电化学发光率

[C]₃是用于溶液中ECL测定的紫外吸收峰的高度，向2毫升0.05MBu₄NClO₄乙腈的样品溶液加入0.3ml 0.1M TPA的0.05M Bu₄NClO₄的乙腈溶液，因此，钌的配合物的浓度能从紫外吸收峰推算出来。

相对的是基于溶液电化学发光峰值(如图10)和紫外吸收峰值。RuPVP在溶液中没有电化学发光。在溶液和在膜中Ru1MVP的ECL会有如此大的差别，原因可能是在膜中羧基可能和吡啶形成氢键从而阻止钌的核的转动。在有机相溶剂中如乙腈，这种氢键会被打断，钌的核可以转动自由，这可能是电化学发光增强的主要原因。还有一个原因如模型2(见图11)所示，通过羧基和TPA形成氢键作用，电化学发光可能发生在高分子链上的任何有激发态钌的配合物上。考虑到这种情况下钌的核容易转动，Ru1MVP电化学发光的效率远远高于Ru2MVP和Ru2MP。非常低的电化学发光可能表明仅仅是靠近电极表面的钌的核发生电化学反应而发光。如模型3(见图12)，水溶液中的电化学发光依赖于高分子链中电子的传递，也就是说它是依赖于连接钌的核到高分子链上的基团的柔韧性。荧光是一种独立的过程，所以荧光效率不受溶液的影响。

经过ECL测试后，所有的样品表现出胶体的形状。特别是样品Ru1MVP，通过对照膜的电化学发光的测定前后的照片(见图13)，我们不难发现形成了透明的胶体。同时膜表现出与电极的表面有很强的吸附。

考虑到溶液中Ru1mono和Ru1MVP的高效的电化学发光的性质，以及蛋白质中的氨基和钌的配合物单体中的羧基反应而结合，和表面活性剂的存在下，它们可能被用来开发新型的水溶性的生物label试剂去进行用于开发免疫检测领域，或是通过与DNA有选择性结合的氨类化合物4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的作用从而实现检测DNA片段(见文献Lee J.G.et al.，Bioelectrochemistry，2007，70，228-234)。总之，采用这一类的高效电化学发光的钌的配合物的聚合物材料可以大大的提高检测的灵敏度。

Ru2MVP的ECL在还原剂草酸钠的存在下，其数值是RuPVP的40倍。这种条件下ECL可用来检测和推断溶液葡萄糖的含量。结果被列在图14和表5中。

表5在还原剂草酸钠的存在下光增幅仪的测定电位为650V时ECL的数值

   Ru2MVP>  Ru2MP>  Ru1MVP>  RuPVP>  样品>  M₂(＊10^-4M)  ECl>  ECl比值>  ECl/M>  Ru2MVP>  6.4>  7.6>  63>  40>  RuPVP>  4.1>  0.12>  1>  1>