用于裂解环境或临床样品中存在的微生物并从该微生物提取核酸以分析的装置

摘要

本发明涉及一种可以置于空气收集工具内部并容纳核酸回收工具的套筒，所述的套筒基本上是圆柱形的并且包含微生物滞留区，所述的滞留区包含微生物裂解工具。本发明也涉及一种用于收集空气中所含微生物的装置和一种用于微生物裂解的装置。

说明书

本发明的技术领域是生物分析。更具体地，本发明涉及一种用于裂解环境样品如空气样品或临床样品中存在的微生物的装置。

几年来，已经观察到医院中再出现院内感染。这些感染通过入院并且因而定义为免疫抑制的个体受到医院环境中存在的致病微生物污染而解释，其中所述的致病微生物即便在总是极小心地进行器械及表面消毒和空气处理的情况下也未能破坏。相对于这些日益增加的环境微生物污染常见案例，对于医护人员而言需要开发用于改善和促进环境控制的装置和方法。

除了院内感染问题之外，环境条件控制在过去几年期间也已经在工业环境、尤其食品加工工业或制药工业或化妆品工业中变成再次关注点。在食品加工工业中，已知产品甚至原材料被致病微生物污染可对消费者健康造成的灾难性后果。实际上，因细菌如李斯特菌属(Listeria)或沙门氏菌属(Salmonella)的那些细菌所致的食物中毒今日是常见事件。空气质量控制也是制药工业或化妆品工业的质量措施中的关键过程。

另外，这些控制措施必须满足因管理日益严格所致的日益高水平的要求。

在医护人员或制造商可获得用于进行环境控制的工具中，空气生物收集器(aerobiocollector)是用于检测空气中微生物的选择方案。在需要测量空气生物污染的前提下，将这些装置置于适宜地点。它们一般由偶联于培养基的空气收集器构成。由空气收集器收集的空气与该培养基接触，可能含于所收集空气中的微生物沉积在该培养基上。随后回收培养基并置于培养箱中，以便促进所述微生物生长。因而有可能通过常规微生物学技术检测并鉴定所述微生物。

然而，这些装置具有与所用技术关联的重大缺点。这个缺点是获得分析结果所需要的时间。其原因是使用了这样的常规微生物学、尤其细菌学技术手段意味着不得不坚持细胞生长所需的保温时间、甚至在特殊培养基上的再保温阶段的时间以便能够进行鉴定。随之而来的是获得结果所需要的时间相对长，实际上当意图检测和鉴定导致院内感染或食物中毒的致病生物时甚至太长。

这种类型装置的另一个缺点是培养的使用尽管使得有可能区分细菌的属和物种，但一般不可能区分相同细菌物种的菌株。现在已知微生物的致病性可能根据所讨论的菌株显著变化。

另外，存在用于回收空气中存在的粒子、尤其微生物的装置。文件GB-2 254 024因此描述了一种用于收集空气中所含粒子的装置，其原理基于旋风作用。尽管发现这种装置适于收集收集空气中所含的粒子，包括微生物，然而无论如何不会研究它用于处理如此获得的样品，尤其提取意图用来分析的遗传物质。

更一般地，无论对于临床样品或环境样品，就鉴定微生物和/或就提供结果的迅捷性而言，最重要的技术无疑是分子诊断技术。以分析微生物的遗传物质并且尤其分析某些特异性序列为基础的这些技术有可能在极短时间(record time)内实现微生物的极精确鉴定，因为它们有可能去掉培养步骤。

然而，此类技术的用途提出了某些限制，这些限制当中最重要的是在空气中存在并且因而可回收用于进行分析的潜在限定的微生物数量。事实上，已知环境样品以及一些临床样品具有相对低的微生物数量。则从这种原材料获得的遗传物质的数量少。就产率而言，用来提取核酸的技术的有效性因而成为一个重要参数。

另外，大部分用于裂解微生物的现有技术冗长，要求合格人员来进行人工步骤。

文件WO-A-2005/038025描述一种从(尤其取自空气的)微生物提取核酸的方法。这种方法在于进行3种不同裂解方法也即化学裂解法、热休克裂解法和机械裂解法。尽管这种方法无疑有可能优化核酸提取产率并且因而提高可用于分析的遗传物质的数量，然而，这种产率仍取决于所回收微生物的数量。然而，该文件中没有描述优化所述微生物的回收。

文件US-5,707,861描述了一种用于分解微生物类型的活细胞的装置。该装置有可能通过使用玻璃珠和振动作用裂解细胞，其中振动作用因含有微生物的管子与携带所述管子的夹持器的孔洞之间存在的空隙所致。因而，这种装置有可能优化细胞裂解并且因而优化遗传物质的提取。这种装置和使用的方法提出了如上文所提到那样相同的限制，即它们仍取决于所回收微生物的数量。另外，它们具有不得不依次进行核酸浓缩步骤，以便从细胞碎片分离所述核酸的额外缺点。最后，它们要求在浓缩步骤结束时手工回收核酸。

这些问题也伴随文件US-5,567,050中所述的装置出现。

还已经描述了更为集成的系统。因而，文件WO-A-2004/018704描述用于收集空气中微生物并使用PCR(聚合酶链反应)扩增技术鉴定它们的装置和方法。该系统特别适于在邮件分拣中心对付蓄意生物污染攻击。该系统由沿着邮件运输回路安置的空气收集装置、通过旋风作用过滤/分离粒子的装置、用于浓缩/回收液体样品中粒子的装置和用于将样品级分转移到Cepheid公司CepheidGeneXpert^TM PCR分析套筒的装置构成。随后将该套筒手工地转移到一个独立的自动化生物分析装置以鉴定从空气收集的微生物。

尽管该系统有可能解决与上文所述装置和方法关联的众多技术问题，然而它具有重大缺点。这些缺点中第一个缺点是用于转移至分析套筒之前处理样品(收集、分离、浓缩/回收)的系统相对复杂且笨重。第二缺点是在仅分析其一部分的液体样品中回收所收集的微生物。这意味着存在没有回收全部微生物的风险并且因而所有核酸都很高，极大限制该分析的相关性。另外，即便复杂，该系统还需要将套筒手工转移至GeneXpert^TM自动化分析装置。

因而，本发明的第一目的是提供用于全部裂解的装置和方法，所述的装置和方法可有效地用于环境样品和临床样品，以及有效地用于极其多样的微生物，无论它们是细菌、病毒或可能处于营养状态或孢子形式的真菌。

本发明的另一个目的将是提供能够以集成方式有效裂解环境样品如空气中或临床样品中含有的所述微生物的装置，以便从中提取核酸并回收所述核酸用于分析。

本发明的另一个目的将是提供能够收集空气样品中含有的全部微生物的装置。

本发明的另一个目的将是提供具有简单设计的装置。

本发明的另一个目的将是提供一种极紧凑的装置。

本发明的另一个目的将是提供一种密闭装置，其中上文所述的多个步骤在没有任何外部污染风险的情况下进行。

本发明的另一个目的将是提供一种装置，其中所述步骤在不由操作员转移的情况下进行，因而防止其污染。

最后，本发明的另一个目的将是提供能够在缓冲液中产生靶核酸的装置，其中所述的靶核酸可以直接用在包含例如扩增和检测步骤在内的分子诊断步骤中，而无额外的预处理步骤，如离心或过滤。

这些连同其他目的由本发明实现，其中本发明首先涉及一种可以置于空气收集工具内部并容纳核酸回收工具的套筒，所述的套筒基本上是圆柱形的并且包含微生物滞留区，所述的滞留区包含微生物裂解工具。

有利地，微生物滞留区包含能够滞留微生物、维持裂解工具就位和在液体存在下溶解的材料。该材料优选地是胶化材料。

该胶化材料可以有利地是微生物培养基。

根据该装置的一个变化，此装置包含用于连接分析装置的工具。

优选地，该裂解工具由珠子构成。甚至更优选地，所述珠子的直径在200和600μm之间。

本发明还涉及一种用于收集空气中所含微生物的装置，所述装置包含：

-空气收集工具，包含含有空气输入导管的上部单元和含有空气输出导管的下部单元，所述上部单元和下部单元可互相联锁(interlock)，从而可以在所述的空气收集工具内部产生空气流；

-包含微生物滞留区的基本上圆柱形的套筒，该滞留区包含微生物裂解工具，该套筒置于所述空气收集工具内部。

该空气收集工具能够与空气再循环回路连接。

本发明还涉及一种用于微生物裂解的装置，以便从所述的微生物分离核酸，所述装置包含：

-根据本发明的套筒，该套筒包含置于微生物滞留区中的微生物；

-可以装配到套筒中的基本上圆柱形的核酸回收工具，所述的回收工具与微生物裂解工具协作，以便裂解所述的微生物并且能够释放核酸。

有利地，该核酸回收工具包含用于抽吸/送递液体的工具。

值得注意地，该核酸回收工具也包含液体贮存区。

根据一个优选的实施方案，该套筒的内径大于核酸回收工具的外径，从而当核酸回收工具安装到该套筒中时，该套筒内壁与核酸回收工具外壁分隔的距离是足够大的，以容许裂解工具存在于这个间隙空间中，并且是足够小的，以使该裂解工具与所述壁中的一个或另一个接触。

本发明还涉及一种用于浓缩空气中所含微生物的方法，所述的方法包括以下步骤：

a)将套筒安置在空气收集工具内部，使得在所述套筒内部的滞留区与空气收集工具的空气输入导管连通，

b)通过任意适宜的手段使空气进入所述的空气收集工具，

c)在套筒滞留区中浓缩空气中所含的微生物。

根据一个具体实施方案，该方法还包括使滞留区中的微生物生长的步骤d)。

有利地，微生物滞留于滞留区内存在的裂解工具上。

本发明还涉及一种用于裂解空气中所含微生物的方法，所述的方法包括以下步骤：

a)将套筒安置在空气收集工具内部，使得在所述套筒内部的滞留区与空气收集工具的空气输入导管连通，

b)通过任意适宜的手段使空气进入所述的空气收集工具，

c)在套筒滞留区中浓缩空气中所含的微生物，

d)从所述空气收集工具取出套筒，

e)将核酸回收工具安置在该套筒中，

f)将目的液体导入该套筒中，这导致位于此套筒的微生物滞留区内的裂解工具处于悬浮状态，和

g)通过转动套筒内部的核酸回收工具以机械方式裂解微生物，所述的核酸回收工具转动其上滞留有微生物的裂解工具。

本发明还涉及一种用于裂解空气中所含微生物的方法，所述的方法包括以下步骤：

a)将套筒安置在空气收集工具内部，使得在所述套筒内部的滞留区与空气收集工具的空气输入导管连通，

b)通过任意适宜的手段使空气进入所述的空气收集工具，

c)在套筒滞留区中浓缩空气中所含的微生物，

d)从所述空气收集工具取出套筒，

e)将核酸回收工具装配到套筒中，

f)引起事先位于核酸回收工具贮存区内的目的液体的送递，所述的送递通过核酸回收工具的抽吸/送递工具获得，如此送递的液体充满位于核酸回收工具与套筒之间的间隙空间，这导致位于套筒的微生物滞留区中的裂解工具处于悬浮状态，所述的裂解工具位于套筒的垂直内壁与核酸回收工具的垂直外壁之间，和

g)通过转动套筒内部的核酸回收工具以机械方式裂解微生物，所述的核酸回收工具转动其上滞留有微生物的裂解工具。

本发明的另一个主题涉及一种用于从空气中所含微生物中提取核酸的方法，所述的方法包括以下步骤：

a)将套筒安置在空气收集工具内部，使得在所述套筒内部的滞留区与空气收集工具的空气输入导管连通，

b)通过任意适宜的手段使空气进入所述的空气收集工具，

c)在套筒滞留区中浓缩空气中所含的微生物，

d)从所述空气收集工具取出套筒，

e)将核酸回收工具安置在该套筒中，

f)将目的液体导入该套筒中，这导致位于此套筒的微生物滞留区内的裂解工具处于悬浮状态，和

g)通过转动套筒内部的核酸回收工具以机械方式裂解所述微生物，所述的核酸回收工具转动其上滞留有微生物的裂解工具，和

h)抽吸含有在裂解期间所释放的所述微生物的核酸的目的液体。

本发明还涉及一种用于从空气中所含微生物提取核酸的方法，所述的方法包括以下步骤：

a)将套筒安置在空气收集工具内部，使得在所述套筒内部的滞留区与空气收集工具的空气输入导管连通，

b)通过任意适宜的手段使空气进入所述的空气收集工具，

c)在套筒滞留区中浓缩空气中所含的微生物，

d)从所述空气收集工具取出套筒，

e)将核酸回收工具装配到套筒中，

f)引起事先位于核酸回收工具贮存区内的目的液体的送递，所述的送递通过核酸回收工具的抽吸/送递工具获得，如此送递的液体充满位于核酸回收工具与套筒之间的间隙空间，这导致位于套筒的微生物滞留区中的裂解工具处于悬浮状态，所述的裂解工具位于套筒的垂直内壁与核酸回收工具的垂直外壁之间，

g)通过转动套筒内部的核酸回收工具以机械方式裂解所述微生物，所述的核酸回收工具转动其上滞留有微生物的裂解工具，由此释放来自所述微生物的核酸，和

h)引起核酸回收工具的贮存区内的目的液体抽吸，所述的抽吸通过核酸回收工具的抽吸/送递工具获得，如此抽吸的目的液体含有在裂解期间所释放的所述微生物的核酸。

这些提取方法优选地包括使套筒滞留区中的浓缩微生物生长的额外步骤d′)。

通过在培养箱中保温该套筒2至24小时的一段时间获得所述生长。

本发明的另一个主题涉及一种用于裂解空气中所含微生物的方法，所述的方法包括以下步骤：

a)获得其中微生物位于滞留区附近的套筒，

b)将核酸回收工具装配到套筒中，

c)引起事先位于核酸回收工具贮存区内的目的液体的送递，所述的送递通过核酸回收工具的抽吸/送递工具获得，如此送递的液体充满位于核酸回收工具与套筒之间的间隙空间，这导致位于套筒的微生物滞留区中的裂解工具处于悬浮状态，所述的裂解工具位于套筒的垂直内壁与核酸回收工具的垂直外壁之间，和

d)通过转动套筒内部的核酸回收工具以机械方式裂解所述微生物，所述的核酸回收工具转动其上滞留有微生物的裂解工具。

本发明的另一个主题涉及一种用于裂解微生物的方法，所述的方法包括以下步骤：

a)获得其中微生物在滞留区中浓缩的套筒，

b)将核酸回收工具安置在该套筒中，

c)将目的液体导入该套筒中，这导致位于此套筒的微生物滞留区内的裂解工具处于悬浮状态，和

d)通过转动套筒内部的核酸回收工具以机械方式裂解所述微生物，所述的核酸回收工具转动其上滞留有微生物的裂解工具。

本发明的另一个主题涉及一种用于从微生物提取核酸的方法，所述的方法包括以下步骤：

a)获得其中微生物在滞留区中浓缩的套筒，

b)将核酸回收工具装配到套筒中，

c)引起事先位于核酸回收工具贮存区内的目的液体的送递，所述的送递通过核酸回收工具的抽吸/送递工具获得，如此送递的液体充满位于核酸回收工具与套筒之间的间隙空间，这导致位于套筒的微生物滞留区中的裂解工具处于悬浮状态，所述的裂解工具位于套筒的垂直内壁与核酸回收工具的垂直外壁之间，

d)通过转动套筒内部的核酸回收工具以机械方式裂解所述微生物，所述的核酸回收工具转动其上滞留有微生物的裂解工具，由此释放来自所述微生物的核酸，和

e)引起核酸回收工具贮存区内的目的液体的抽吸，所述的抽吸通过核酸回收工具的抽吸/送递工具获得，如此抽吸的目的液体含有在裂解期间所释放的所述微生物的核酸。

本发明的另一个主题涉及一种用于从微生物提取核酸的方法，所述的方法包括以下步骤：

a)获得其中微生物在滞留区中浓缩的套筒，

b)将核酸回收工具安置在该套筒中，

c)将目的液体导入该套筒中，这导致位于此套筒的微生物滞留区内的裂解工具处于悬浮状态，和

d)通过转动套筒内部的核酸回收工具以机械方式裂解所述微生物，所述的核酸回收工具转动其上滞留有微生物的裂解工具，和

e)抽吸含有在裂解期间所释放的所述微生物的核酸的目的液体。

本发明也涉及一种用于裂解微生物的方法，所述的方法包括以下步骤：

a)将含有所述微生物的液体样品导入本发明的套筒中，靠近滞留区，从而所述的液体样品导致位于套筒的所述微生物滞留区内的裂解工具处于悬浮状态，

b)将核酸回收工具安置在该套筒中，

c)通过转动套筒内部的核酸回收工具以机械方式裂解所述微生物，所述的核酸回收工具转动其上滞留有微生物的裂解工具。

术语“液体样品”意指可能含有微生物的任意液体样品。它可以是人或动物来源的液体样品。这种样品可以例如是尿样、全血样品、血浆样品或任何其他体液的样品。该液体样品可以是食物来源的，如饮料。它也可以是环境来源的，如水。另外，液体样品也可以是“转移”液体，其中在拭子型表面采样装置(如公司Copan以名称群集(flocked)SWABS出售的那些)上所含有的可能微生物通过在所述转移液体中搅动所述拭子来重悬。

另外，本发明涉及一种用于从微生物提取核酸的方法，所述的方法包括以下步骤：

a)将含有所述微生物的液体样品导入本发明的套筒中，靠近滞留区，从而所述的液体样品导致位于套筒的所述微生物滞留区内的裂解工具处于悬浮状态，

b)将核酸回收工具安置在该套筒中，

c)通过转动套筒内部的核酸回收工具以机械方式裂解所述微生物，所述的核酸回收工具转动其上滞留有微生物的裂解工具，

d)抽吸含有在裂解期间所释放的所述微生物的核酸的目的液体。

另外，本发明的另一个主题涉及一种用于鉴定一种或多种微生物的方法，所述的方法包括以下步骤：

a)通过本发明的装置分离来自所述样品中所含微生物的核酸，

b)鉴定如此分离的微生物。

根据本发明鉴定方法的一个有利变化，所述方法也包含纯化核酸的中间步骤。这种纯化步骤有可能将核酸与裂解步骤中所释放的其他细胞成分分开。该步骤总体上有可能浓缩核酸，并且适合用于纯化DNA或RNA。例如，有可能使用通过吸附或共价作用而任选用寡核苷酸涂层的磁性粒子(在该方面，见专利US4,672,040和US5,750,338)并且因而有可能通过洗涤步骤纯化与这些磁性粒子结合的核酸。当意图依次地扩增所述的核酸时，这个核酸纯化步骤是特别有利的。这些磁性粒子的一个特别有利的实施方案在专利申请WO-A-97/45202和WO-A-99/35500中描述。用于纯化核酸的方法的另一个有利实例是使用柱子形式或惰性粒子形式的二氧化硅(Boom R等，J.Clin.Microbiol.，1990，n°28(3)，第495-503页)或磁性粒子(Merck：MagPrepSilica，Promega：MagneSil^TM顺磁粒子)。其他广泛使用的方法基于柱形式或顺磁颗粒形式的离子交换树脂(Whatman：DEAE-Magarose)(Levison PR等人，J.Chromatography，1998，第337-344页)。另一种极重要但非本发明独有的方法是吸附到金属氧化物支持物(公司Xtrana：Xtra-Bind^TM基质)。

尤其，鉴定步骤包含以下的分步骤：

a)特异性地扩增分离的核酸，

b)检测如此扩增的核酸。

根据鉴定方法的一个优选变化，鉴定步骤在与本发明装置的套筒处于流体连通的鉴定装置中进行。

因此，将分离的核酸从本发明装置的核酸回收工具转移到该鉴定装置。

通过送递含有该核酸的目的液体有利地获得核酸的转移，通过核酸回收工具的抽吸/送递工具在核酸回收工具的贮存区内包含所述的目的液体。

微生物选自包含细菌、病毒、酵母、霉菌和寄生虫的组。

从中分离微生物的样品是环境来源的。因此，它们可以是空气样品或液体样品，如水，或表面样品。样品也可以是临床来源的，即能够进行分析以搜索并且鉴定微生物、任选致病微生物的人或动物来源的任意样品。

靶核酸的存在通过使杂交反应可视化而证实。术语“杂交反应”意指在捕获核酸与靶核酸之间的任意反应，其中所述的靶核酸通过转录，逆转录或NASBA(基于核酸序列的扩增)或PCR(聚合酶链反应)型扩增的步骤分离或产生。

术语“核酸”″意指寡核苷酸、脱氧核糖核酸和核糖核酸，并且还意指其衍生物。术语“寡核苷酸”指能够在合适杂交条件下与至少部分互补的寡核苷酸杂交的一串至少2个天然或修饰的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或两者)。术语“修饰的核苷酸”意指例如包含修饰碱基和/或在核苷酸间键水平和/或在主链水平包含修饰的核苷酸。作为修饰碱基的实例，可以提到的是肌苷、甲基-5-脱氧胞苷酸、二甲基氨基-5-脱氧尿苷、二氨基-2，6-嘌呤和溴-5-脱氧尿苷。

核苷酸间键例如硫代磷酸酯、N-烷基氨基磷酸酯、烷基膦酸酯和烷基磷酸二酯键。

α-寡核苷酸如在FR-A-2 60 7507中描述的那些、LNA如Bioorganic &Medicinal Chemistry Letters，第8卷，第16期，1998年8月18日第2219-2222页中描述的硫代磷酸-LNA和2′-硫代-LNA和作为M.Egholm等人，J.Am.Chem.Soc.(1992)，114，1895-1897论文主题的PNA是由主链被修饰的核苷酸组成的寡核苷酸的实例。

杂交反应可以由任意检测手段如直接或间接手段可视化。

在直接检测即无需标记的情况下，杂交反应通过等离子共振或通过携带导电聚合物的电极上的循环伏安法观察。

在间接检测即借助标记的情况下，可直接标记靶核酸或可对所述核酸的特异性结合伴侣进行预标记。

表述“所述核酸的特异性结合伴侣”意指能够与靶核酸结合的任何伴侣，并且将给出的实例是核酸、寡核苷酸或多核苷酸及酶底物。

术语“标记”意指能够直接或间直接地产生可检测信号的标记物的结合。这些标记的非限制性实例包括：产生可以通过例如电化学、比色法、荧光、发光来检测的信号的酶，或酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)、α-半乳糖苷酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；酶抑制剂；酶辅因子；粒子如金粒子、磁性粒子(magnetic latices)、脂质体；生色团如发光或显色化合物、放射性分子如³²P、³⁵S或¹²⁵I、荧光分子如荧光素、罗丹明、伞形酮、鲁米诺或藻蓝蛋白。在荧光的情况下，它可以涉及酶底物反应的荧光产物、荧光团-猝灭剂组合、荧光猝灭作用或基于荧光属性的任何其他系统。

也可以使用间接系统，例如涉及另一个配对，即配体/反配体(antiligand)对。配体/反配体对是本领域技术人员熟知的，例如：生物素/链霉抗生物素、糖/外源凝集素、多核苷酸/与该多核苷酸互补的序列。在这种情况下，它是携带结合物质的配体。反配体可以是通过前述段落中所述的标记物直接检测的，或本身可以是可通过配体/反配体检测的。

这些间接检测系统可以在某些条件下导致信号放大。这种信号放大技术是本领域技术人员熟知的，并且可以参考申请人先前的专利申请FR-A-2781802或WO-A-95/08000或参考论文J.Histochem.Cytochem.45：481-491，1997。

靶核酸的预标记可以通过在末端借助聚合酶或借助激酶随机或特异性地直接或间接掺入标记物或通过在该分子“内部”掺入来进行。

标记对靶分析物为特异的结合伴侣是本领域技术人员广泛已知的并且例如由Greg T.Hermanson在Bioconjugate Techniques，1996，Academic PressInc，525B Street，San Diego，CA92101 USA中描述。

根据对所用缀合物标记的类型，例如使用酶，本领域技术人员将添加试剂以观察该标记过程。该步骤对应于显现。在此之前是使用洗涤缓冲液，该洗涤缓冲液有可能除去不参与反应或微弱或非特异性结合的分析物部分或成分，以便限制背景噪音。

参考附图，在以下非限制性实施例的影响下将更清楚地理解本发明装置的目的和优势，其中：

图1代表根据本发明第一实施方案的空气收集工具的纵截面分解图。

图2代表根据本发明第一实施方案的空气收集工具的纵截面图，在所述空气收集工具中已经在收集微生物的步骤期间安置了套筒。

图3代表根据本发明第一实施方案的套筒和核酸回收工具的纵截面图，其处在将所述工具装配在套筒内的过程的初始阶段。

图4代表根据本发明第一实施方案的套筒和核酸回收工具的纵截面图，其处在将所述工具装配在套筒内的过程的进展(advanced)阶段。

图5代表根据本发明第一实施方案的套筒和核酸回收工具的纵截面图，其处在将所述工具装配在套筒内的过程的最终阶段。

图6代表根据本发明第一实施方案的核酸回收工具的纵截面图，其中所述的核酸回收工具在以机械方式裂解微生物的步骤期间装配到套筒中。

图7代表根据本发明第一实施方案的核酸回收工具的纵截面图，其中所述的核酸回收工具在抽吸含有核酸的目的液体至核酸回收工具的贮存区中的期间装配到套筒中。

图8代表根据本发明第一实施方案的核酸回收工具的纵截面图，当全部含有核酸的目的液体已经被抽吸至核酸回收工具的贮存区中时，所述的核酸回收工具装配到套筒中。

图9代表根据本发明第一实施方案的核酸回收工具的纵截面图，其中所述的核酸回收工具在提供该工具以鉴定微生物的期间装配到套筒中。

图10代表根据本发明第一实施方案的核酸回收工具的纵截面图，其中一旦用于鉴定微生物的工具与套筒处于流体连通状态，就将所述的核酸回收工具装配到套筒中。

图11代表在转移含有核酸的目的液体到微生物鉴定工具中的初始阶段，根据本发明第一实施方案的核酸回收工具-套筒-微生物鉴定工具组件的纵截面图。

图12代表在转移含有核酸的目的液体到微生物鉴定工具中后，根据本发明第一实施方案的核酸回收工具-套筒-微生物鉴定工具组件的纵截面图。

图13代表根据本发明第二实施方案的空气收集工具的纵截面图，在所述空气收集工具中已经在收集微生物的步骤期间安置了套筒。

图14代表在手动分布目的液体的步骤期间，根据第二实施方案的套筒的纵截面图。

图15代表根据本发明第二实施方案的核酸回收工具的纵截面图，其中所述的核酸回收工具在以机械方式裂解微生物的步骤期间置于套筒中。

图16代表根据本发明第二实施方案的核酸回收工具的纵截面图，其中所述的核酸回收工具在抽吸含有核酸的目的液体的步骤期间置于套筒中。

图17代表试验台的功能性示意图，所述的试验台意图测试用本发明装置捕获气溶胶中所含细菌的能力。

图18是显示本发明装置的收集效率的示意图，其中所述的收集效率是所产生气溶胶粒子的尺寸的函数。

图19是比较采用本发明装置和现有技术备选方法的细菌裂解效率的示意图。

图20是显示在通过本发明装置裂解多种混悬液中所含细菌并回收核酸后，使用实时NASBA技术，实时检测这些细菌的示意图。

图21是显示在通过本发明装置裂解多种全血样品中所含细菌并回收核酸后，使用实时NASBA技术，实时检测这些细菌的示意图。

根据第一实施方案，构成本发明装置的第一要素是空气收集工具10。该工具由上部单元12和下部单元14组成。上部单元12一般具有圆柱形状。该圆柱体的下端是不受约束的，而上端借助水平壁13被部分阻塞。壁13在中心具有借助导管18在上部单元12内部延伸的孔眼，其基部基本上是圆锥形的。该部分实际上构成空气注入空气收集工具10中的导管。根据一个具体实施方案，该空气输入导管可以通过任何适宜的工具与空气再循环回路的管道连接。

空气收集工具10可以例如具有在10和40mm之间、优选20mm的外径。空气输入导管的内径是例如6mm。

这种空气收集工具10可以有利地由可消毒、尤其通过高压灭菌消毒的材料制成。它因而可以由金属如铝或钢制成。它也可以由聚合物(如聚(甲基丙烯酸甲基酯(PMM))制成。

上部单元12的垂直环形壁20的下端在其外侧面包含肩形突出物201。围绕壁20的完整周边产生该凹槽。该凹槽意图有利于上部单元12和下部单元14的联锁。

下部单元14一般也是圆柱形状的。这种圆柱体的上端是不受约束的，而下端借助水平壁21被部分阻塞，其中所述的水平壁21在其中心包含一个基本上圆柱形的空气输出导管22，其中所述导管的基部与该水平壁整合。导管22的下端是不受约束的。该导管与下部单元14的内部连通，从而当空气收集工具10的上部单元12和下部单元14联锁时，导管22起到空气输出导管的作用，其中使所述空气通过空气输入导管18进入空气收集工具10。

下部单元14的垂直环形壁24的上端在其内侧面包含肩形突出物241。围绕壁24的完整周边产生该肩形突出物。该肩形突出物也意图有利于上部单元12和下部单元14的联锁，这是由于壁20和24的末端具有形状互补的交叉部分，从而便于装配在一起。最重要的是这种联锁是可逆的。一旦装配在一起，单元12和14应当能够彼此脱离。

联锁单元12和14的一种备选方式可以通过将一个单元拧到另一个单元上的联锁。为此目的，单元12或14之一的壁的末端可以携带凸螺纹并且第二单元的壁的末端可以携带相应的凹螺纹。

重要的是该收集工具是以密封方式封闭的，以便防止空气的任何附加进入。

根据使用该空气收集工具的一个具体模式，空气输出导管22的下端可以与空气空气吸泵(未显示)或任何其他等同的泵送工具连接。当需要例如在给定环境(如医院房间或用于生产药品或食品加工产品的房间)中进行环境空气分析时，该泵有可能将环境空气吸入空气收集工具中。为此目的，可以优选的是具有自主运行的泵送工具。

图2代表在运行期间与套筒30组合的空气收集工具10。从该图中可以看到，套筒30安置在空气收集工具10内部。为做到这点，将构成空气收集工具10的单元12和14隔开。安置套筒30以承载空气收集工具10的下部单元14。随后将上部单元12再放置于下部单元14上并将这两个工具联锁。如上文所述，由空气收集工具10和套筒30构成的组件随后与再循环回路连接或与泵送装置连接，以便引起在空气收集工具10内部的空气循环。

图2中所述的套筒30在纵截面上具有大致圆柱体的形状，带有一个基本上环状的横断截面。该圆柱体的上端是不受约束的，而下端由在其中心具有一个孔洞的壁构成，其中随该孔洞延伸，存在一个在套筒30内部延伸的导管32。应当指出当抵达该导管的上端时，导管的内部横截面变得更小。还要指出导管的下端由膜34封闭，所述的膜34发挥隔膜的作用。构成膜34的材料适合因采用尖锐物体单纯压迫而破裂。该过程在下相对于图9和10进行描述。该材料例如是聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚乙烯聚碳酸酯。

如可以在图2中看到，套筒30的下部壁35的内表面呈倾斜状，该斜面的最低点与导管32接触/并且最高点与套筒30的垂直壁36接触。所述壁35充当裂解工具38的支持物并且构成微生物滞留区。在这种情况下，这些裂解工具由尺寸相同的珠子构成。根据一个优选的实施方案，这些珠子由玻璃制成。不过，它们可能由任何其他等效材料(如铁)构成。这些珠子有利地具有200和800微米(μm)之间的直径。

根据一个有利的变化，所述珠子可以是不同尺寸的。因而，使用直径在200和300μm之间的珠子与直径在400和600μm之间的珠子的混合物可以是特别合适的。

珠子以一个或多个叠加层形式通过以层形式沉积的胶化材料保持就位，在所述胶化材料中埋入珠子层。该胶化材料应当满足几项要求。第一是它应当是惰性的，从而部影响在套筒内部实施的过程。第二是它应当具有在液体中溶解的能力，以便释放它截获的粒子以实现微生物裂解。这种材料例如可以是琼脂糖。

或者，胶化材料可以有利地是微生物培养基。实际上，已经在体外诊断领域中常规地使用琼脂培养基很长时间。使用这种培养基具有几个优点。主要优点是它能够在进行裂解微生物之前赋予微生物一个生长期。即便本发明装置寻求满足与快速检测致病微生物相关的需求，几分钟至几小时的生长期仍将使得微生物繁殖，这直接影响获得更多数量的核酸。使用培养基的第二个优点是培养基可以对一种或多种给定物种具有选择性。随之而来的是，使用这种培养基可以选择性生长并且因而选择性地检测某些致病微生物，杀灭无关的且在分析中可能有干扰作用的其他微生物。因而，可以考虑的是具有几个专用套筒，每个套筒适于检测特定的微生物物种。

套筒30的尺度就内径而言可以例如是从8至16mm，优选地是12mm。珠子层的总厚度一般在1和2mm之间，这对应于0.4与1克之间的玻璃珠数量。

套筒30有利地使用压射成形术产生。所用材料例如是聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯或PMMA。

当启动空气中收集装中空气的循环时，所述空气遵循的路径由图2中箭头指示。因而，应当指出空气通过空气输入导管18进入空气收集工具10。由于套筒30的导管32部分地插入空气输入导管18中，导管18中的空气流在导管32的顶部被转换成至周缘流。这由导管32上端基本上是圆锥形的事实解释。另外，膜34在导管32基部存在以防止空气穿透进入导管32，因为在加压力状态下这是极为迅速的。由于输入导管18的壁与导管32的壁之间的间隙空间因导管32末端的圆锥形状而骤然缩窄，因而存在对周缘空气流的加速作用。随后，周缘空气流在珠子38的上层停顿，在该位置上导致空气流中所输送的微生物因冲击作用在胶化材料或培养基的表面滞留。该过程因而相对地类似于空气生物收集器中发生的过程。

空气就其本身而言继续前进，由泵送工具抽吸。空气沿着套筒30的垂直壁36的内面反转上升至其因循环路径变宽而失去速度的水平。空气沿着同一个壁的外侧面再次下沉并且在空气输出导管22的入口出被转换成中心流，所述的中心流通过所述空气输出导管离开空气收集工具10。

空气中收集装置10中收集的空气的流速可以例如在20和100升/分钟(l/min)之间。它有利地是50l/min。

一旦已经进行套筒内部的微生物滞留/浓缩步骤，则通过松开(脱位或拧下)所述工具的上部单元12和下部单元14从所述空气收集工具取出套筒。

在该阶段，若需要培养所述套筒中浓缩的微生物，则有机会将套筒在37℃的培养箱中保温。如上文所述，这种保温一般持续几分钟至几小时，从而不过多延长分析时间。然而，若不急于获得分析结果，可以考虑将套筒保温适合约束细菌生长的较长时间段，即大约24小时。

类似地，若需要推迟分析，也可以构思的是将套筒贮藏在适合这种贮藏的环境中，如冷室。

根据本发明的一个变化，可以提供直接安置在空气中收集装置10中的套筒30。该类型的提供具有避免用户不得不在空气收集装置中安装套筒并且因而降低该步骤期间污染风险的优点。在这种情况下特别有利的是空气收集工具10由与套筒30相同的材料(即聚丙烯、聚碳酸酯或PMMA)制成。随后通过压射成形法制造是特别合适的。

当进行分析时，套筒30与核酸回收工具40联锁，如图3中所示。根据箭头A所示的垂直平移运动，将所述工具经套筒的自由末端插入该套筒。

在图3的纵截面中所示的核酸回收工具40包含具有圆形横截面的总体上为圆柱形的实体42。实体42在其外壁的上半部分具有肩形突出物43，其功能是当在套筒30中完全插入所述核酸回收工具时，通过抵住套筒30的垂直壁36的上末端，确保套筒30-核酸回收工具40组件无泄漏。另外，实体42的外壁在其顶端部分具有几个连续凹槽。位于肩形突出物43下方的凹槽44本身起到肩形突出物的作用，因为当在套筒30中完全插入工具40时，凹槽44抵住在垂直壁36的上末端产生的肩形突出物45，如图5中所示。位于凹槽44下方的第二凹槽46本身具有能够减小实体42的直径的功能，从而在实体42的垂直壁的外表面与套筒30的垂直壁36的内表面之间存在间隙空间。这种空间的作用下文待述。另外，全部这些肩形突出物和凹槽使得加强由套筒30和核酸回收工具40构成的组件的无泄漏性成为可能。

在其基部，实体42在中心位置具有基本上呈圆柱形状的具有圆形横截面的腔体47，该腔体上端基本上呈圆锥形状。类似地，它还在其上部分在中心位置包含腔体48。腔体48构成其中安置目的液体50的贮存区，其中所述的腔体48基本上是带圆形横截面的圆柱形状，其下端基本上呈圆锥形状。这种液体不但可以重悬玻璃珠38，还可以回收核酸，一旦微生物已经裂解。因而重要的是，这种液体一方面对微生物是惰性的，并且另一方面就生物学方法而言对核酸是惰性的。因而，这种目的液体一般是适于执行生物方法的缓冲液。腔体47中所含的目的液体的体积可以例如在0.1和0.4毫升(ml)之间。

为了使目的液体能够发挥其作用，腔体48与由其形状互补于腔体48下部分的柱塞52和处于垂直位置的臂54构成的抽吸/送递工具协作，其中所述的臂54与柱塞52成为整体并伸出腔体48之外。该臂与连接柱塞52的末端相对的末端可以具有一个特定形状的头部，所述头部能够啮合用于以平移方式根据基本上垂直的运动驱动(未显示)抽吸/送递工具的工具。这种驱动工具优选地是自动化工具。

腔体48通过通道56与腔体47处于流体连通状态，其中所述的通道56将腔体48的下端连接到腔体47的上端。在图3中，通道56由位于腔体47上端的膜58阻塞，从而防止清空腔体47。该膜也由可以穿透的材料制成。尤其，可以借助套筒30的导管32上端穿透该膜。

如图4中所示，核酸回收工具40外部形状完美地互补于套筒30的内部形状。随后，工具40完美地安放在套筒30内部，导管32通过自身插入腔体47内部而发挥引导作用。安放工具40直至工具40的下部壁60抵住珠子38。

在此阶段，根据图5中所示的箭头B，在核酸回收工具上并且同时在抽吸/送递工具上存在压力运动。抽吸/送递工具的这种平移运动导致目的液体50经通道56送递到腔体47中并且更具体地送递到腔体47的内壁与导管32的外壁之间的间隙空间中。这种送递是可能的，因为所述液体对膜58所产生的压力导致该膜的穿透或脱离。目的液体50随后移动到其中存在玻璃珠38的套筒滞留区内，并灌满该滞留区，导致截获珠子的胶化材料悬浮，从而在由抽吸/送递工具产生的目的液体流中的珠子被夹带到核酸回收工具40与套筒30之间的间隙空间62。应当指出这种间隙空间优选地具有600和800μm之间的宽度。此宽度与所用珠子38的直径直接相关。具体而言，所述珠子应当能够在这种空间中轻易地循环，还应当能够被核酸回收工具40转动。为此目的，实体42的外部垂直壁64优选地具有促进珠子转动的粗糙表面。

一旦全部珠子沿实体42的外部垂直壁64分布，则可以将核酸回收工具完全插入套筒，因而产生组件的无泄漏性，尤其借助肩形突出物43和44，其中所述的肩形突出物43和44分别抵住套筒30的壁的末端和抵住肩形突出物45，如图5中所示。

当然，通过目的液体流，将滞留于胶化材料和珠子上的微生物以如同珠子那样的相同方式转移到间隙空间62。

就转移目的液体而言，当将目的液体推入通道56时，膜34在导管32基部的存在似乎防止导管32中含有的空气被逐出。随后，导管32中由所截获空气产生的压力防止目的液体进入该导管，所述的目的液体因而浸润腔体47的内壁与所述导管32的外壁之间的间隙空间。一旦珠子38沿着实体42的外部垂直壁64分布并且核酸回收工具40-套筒30组件联锁，则启动裂解步骤本身。该步骤在图6中描述。如可以在该图中看到，将核酸回收工具40以箭头C所示的方向转动。为此，将核酸回收工具40的实体42通过任何适宜的机械偶联工具与自动装置联锁。这种系统尤其有可能精确调节转动的速度。

然而，可以构思手工转动核酸回收工具。为此，可以在实体42的上部分专门地提供持握工具(未显示)。随后可以用一只手抓紧这些持握工具，而用另一只握住套筒30。

例如，转动速度值可以在300和2000转/分钟之间，优选地是1000转/分钟。

就转动时间而言，一般在1和2分钟之间。

显而易见，这两个参数的选择取决于意图裂解的微生物类型。因此，为了裂解酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)型酵母，最佳裂解条件由同于1000转/分钟的转动速度持续2分钟组成。

在该步骤期间，通过针对核酸回收工具中实体42的摩擦作用围绕对称轴转动珠子38。这种双重转动导致机械地裂解在珠子38与实体42之间截获的微生物。

一旦裂解步骤已经结束并且释放核酸，则将目的液体通过抽吸/送递工具抽吸到腔体48中，如图7中所示。详细言之，通过在臂54上牵引的任何适宜的自动或手动工具，以垂直平移方式根据箭头D移动抽吸/送递工具。这种平移运动导致抽吸目的液体50至腔体48。在这种抽吸期间，目的液体沿着裂解步骤之前该液体在送递期间所遵循途径的逆向途径行进。具体而言，该液体行进到核酸回收工具40与套筒30之间的间隙空间中，返回至通道56并停留在腔体48中。如可以在7和8图中看到，充满腔体48的目的液体载有微生物的靶核酸70。

由于核酸回收工具40完全地插入套筒30中，该工具40的下部壁60与释放了珠子的该套筒底部之间的间隙空间不足以允许珠子38通过，其中所述的底部起到微生物滞留区的作用。随后，珠子38仍沿着实体42的垂直壁64分布。

类似地，在腔体47的内壁与导管32的外壁之间的间隙空间特别适合发挥滤器的作用，尤其用于滞留裂解步骤期间产生的细胞碎片。这是因为在制造套筒和核酸回收工具期间，可以以如此方式调整所述套筒和所述核酸回收工具尺寸，从而极好地控制这种间隙空间的尺寸并优化过滤作用。

一旦已经将全部目的液体抽吸到腔体48中，可以构思将所述液体转移到一个生物分析装置中。这种转移可以直接在该分析装置或在其最终部件为该分析装置的流体回路中进行。

当将目的液体直接转移到该装置时，构思在该装置本身中进行用于鉴定微生物的全部核酸处理步骤。因而，可以构思例如在该装置中进行靶核酸的扩增、切割和标记这些靶核酸并且通过与互补性序列杂交而检测靶核酸。

在图9中，在纵截面上部分地描述流体分析装置80。这种装置80在其上半部分包含用于射流连接到核酸回收工具40-套筒30组件的优先区82。优先连接区82总体上是圆锥形的，更具体地互补于导管32的形状。在其顶部，它具有接触装置80的内部射流回路86的孔隙84。如图9中所示，根据箭头E，将射流分析装置80通过如此方式与核酸回收工具40-套筒30组件连接，即把优先连接区82提升到所述组件的基部、具体是提升到阻塞导管32的膜34的水平。由于优先连接区82的末端是尖锐的，当该末端与膜34接触时，它穿透该膜，从而打开指向导管32的通道。随后将分析装置80插入导管32，直到它有触感，即直至该优先连接区的外壁与导管32的内壁接触，如图10中所示。当分析装置80因而与核酸回收工具40-套筒30组件连接时，应当指出优先连接区82的末端与通道56的下端接触。随后，在优先连接区82的上半部分中的射流装置80的壁切断了通道56和位于腔体47内壁与导管32外壁之间的间隙空间之间的流体连通。

随后，当操作员希望将含有靶核酸70的目的液体50转移到分析装置80时，足以对抽吸/送递工具的臂54再次施加压力，从而该工具以垂直平移方式根据箭头B移动到腔体48中。这在图11中描述。

抽吸/送递工具的移动导致将目的液体50和核酸70转移到将腔体48与腔体47连接的通道56中。由于通道56借助优先连接区82的孔隙84与内射流分析装置80的内部射流回路86处于直接流体连通状态，目的液体随后被直接地转移到分析装置80中，而没有所述液体与外部环境接触的任何风险。也不存在目的液体逃逸进入核酸回收工具40与套筒30之间的间隙空间，因为通道56和位于腔体47内壁与导管32外壁之间的间隙空间之间的任何流体连通被阻断。这在图12中描述。

一旦全部目的液体50和全部核酸70已经转移到射流分析装置80中，则可以从核酸回收工具40-套筒30组件脱离该装置。由于所述组件是用过的，因而抛弃这些组件。射流分析装置80本身随后用来进行微生物的鉴定。

根据一个有利的实施方案，上文联系图1至12所述的全部步骤并且尤其与微生物裂解、核酸提取和转移所述核酸至射流分析装置有关的那些步骤可以通过用于此目的的系统加以自动化。

图13至16描述本发明装置的第二实施方案。所考虑的装置具有比第一实施方案的装置更简单的设计。

根据这个第二实施方案的装置也包含空气收集工具90。该工具由上部单元92和下部单元94组成。上部单元92一般是圆柱形状的。该圆柱体的下端是不受约束的，而上端借助水平壁93被部分阻塞。壁93在中心具有经由导管98延伸到上部单元92中的一个孔眼，其基部是圆锥形的。该部分实际上构成空气注入空气收集工具90中的导管。根据一个具体实施方案，该空气输入导管可以通过任何适宜的工具与空气再循环回路的管道连接。

在其下部分，导管98包含一个筛板99。该筛板的功能导致空气流均匀地分布在空气收集工具90内部。

上部单元92的垂直环形壁100的下端在其外侧面包含肩形突出物1001。围绕壁100的完整周边产生该凹槽。该凹槽意图便利上部单元92和下部单元94装配在一起。

下部单元94一般也是圆柱形状的。这种圆柱体的上端是不受约束的，而下端借助水平壁101被部分阻塞，其中所述的水平壁101在其中心包含一个基本上圆柱形的空气输出导管102，其中所述导管的基部与该水平壁整合。导管102的下端是不受约束的。该导管与下部单元94的内部连通，从而当空气收集工具90的上部单元92和下部单元94联锁时，导管102起到空气输出导管的作用，其中使所述空气通过空气输入导管98进入空气收集工具90。

下部单元14的垂直环形壁104的上端在其内侧面包含肩形突出物1041。围绕壁104的完整周边产生该肩形突出物。该肩形突出物也意图便利上部单元92和下部单元94装配在一起，其原因在于如此事实：壁100和104的末端具有形状互补的交叉部分，从而便于装配在一起。最重要的是这种装配在一起是可逆的。一旦装配在一起，单元92和94应当能够彼此脱离。

将单元92和94装配起来的一种备选方式可以通过将一个单元拧到另一个单元上而装配起来。为此目的，单元92或94之一的壁的末端可以携带凸螺纹并且第二单元的壁的末端可以携带相应的凹螺纹。

重要的是该收集工具是以密封方式封闭的，以便防止空气的任何附加进入。

根据使用该空气收集工具的一个具体模式，空气输出导管102的下端可以与空气空气吸泵(未显示)或任何等同的泵送工具连接。

套筒110安置在空气收集工具90内部。为做到这点，将构成空气收集工具90的单元92和94隔开。安置套筒110以承载空气收集工具90的下部单元94。随后将上部单元92再放置于下部单元94上并将这两个工具联锁。如上文所述，由空气收集工具90和套筒110构成的组件随后与再循环回路连接或与泵送装置连接，以便引起在空气收集工具10内部的空气循环。

套筒110在纵截面上具有大致圆柱体的形状，具有低高度和一个基本上环状的横断截面。这种圆柱体的上端是不受约束的，而下端由壁112构成。所述壁112充当裂解工具118的支持物并且构成微生物滞留区。如上所述，这些裂解工具由珠子构成。珠子以一个或多个叠加层形式通过如上所述的以层形式沉积的胶化材料保持就位，在所述胶化材料中埋入珠子层。

当启动空气中收集装中空气的循环时，所述空气遵循的路径由图13中箭头指示。因而，应当指出空气通过空气输入导管98进入空气收集工具90。借助筛板99，空气均匀地分布并且在珠子118的上层停顿，在该位置上导致空气流中所输送的微生物因冲击作用在胶化材料或培养基的表面滞留。

空气就其本身而言继续前进，由泵送工具抽吸。它沿着套筒110的壁的内面上升返回。空气沿着同一个壁的外侧面再次下沉并且在空气输出导管102的入口出被转换成中心流，所述的中心流通过所述空气输出导管离开空气收集工具90。

一旦已经进行空气收集，则松开空气收集工具90的单元92和94并回收套筒110。

随后进行分布目的液体的步骤，如14图中所示。在该步骤期间，使用图14中局部所示的移液器122，操作员将给定体积的目的液体120置于套筒110中。如上所述，目的液体可以例如是裂解缓冲液。目的液体与截获珠子的胶化材料之间的借助导致悬浮该材料并且因而悬浮珠子本身。置于套筒110中的目的液体的体积可以例如是0.5ml。

一旦已经进行该步骤，操作员将核酸回收工具124置于套筒110内。不同于第一实施方案中所述的工具40，工具124既不包含抽吸/送递工具，也不包含能够接受目的液体的腔体。工具124具有基本上圆柱形的横断截面并且在其上半部分具有优先夹扣区126。工具124的下部壁128基本上是扁平的并且抵住珠子。随后由操作员将工具124按照箭头F的方向围绕对称轴转动来进行裂解。壁128的转动导致珠子118围绕对称轴转动。这种双重转动导致机械地裂解在珠子118与壁128之间截获的微生物。这引起核酸释放到目的液体中。

一旦裂解步骤已经结束并且释放核酸，则由操作员借助移液器122抽吸含有所述核酸70的目的液体，如图16中所示。

一旦全部目的液体位于移液器中，则可以将所述液体转移到分析装置中，以便其中进行如上文所述的多个核酸处理步骤。也可以将它置于以便贮存的容器中或置于意图用于核酸处理步骤之前的步骤的任意装置中。这种步骤可以例如是意图通过将核酸与仍存在的细胞成分分开而浓缩所述核酸的纯化步骤。当本发明装置在其第二实施方案中使用时，此步骤是特别重要的，因为通过第二实施方案的简单设计，含有核酸的目的液体不再进行任何过滤，如同它在第一实施方案的装置中和如上文所述那样。

实施例

实施例1：使用本发明装置捕获气溶胶中所含枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)孢子的效率的测量

设计无泄漏试验台以便进行这种测量。该试验台在图17中描述。它由气溶胶发生器202供应气溶胶的密闭空气回路200构成。这种发生器有可能将恒定数量的枯草芽孢杆菌(CIP 52.62)孢子从浓度已知的孢子混悬液导入空气流。合适的气溶胶发生器例如由公司TSI出售。空气在该回路中借助吸泵204循环。3个THE滤器206均沿着该回路安置，从而有可能取出空气中所含的粒子、尤其是尘粒子。气压计208可以验证回路中的压力并且两个流量计210可以验证该回路中空气的流速。本发明装置称作212。它由内部安置套筒30的空气收集工具10构成。该收集工具与如上所述的空气回路连接。最后，该空气回路中的两个采样源紧邻装置212的上游和下游安置。在这些水平上以恒定级分形式采样的空气进入光谱仪214以进行粒子(即所述部分中所含枯草芽孢杆菌孢子)的空气动力学测量。这种光谱仪是TSI公司出售的Aerodynamic Particle Sizer3321型。借助阀门216将空气转移到抵达光谱仪的辅助回路，其中所述阀门216可以允许或防止在装置212上游和下游的采样。对上游和下游级分的差异性分析有可能计算本发明装置捕获枯草芽孢杆菌孢子的效率。

在受控湿度和温度条件(25℃，35％相对湿度)下，通过本发明装置的空气的流速是50l/min。该流速借助泵204获得。

在以下两个条件下研究本发明装置的捕获效率：

-确定采用其中珠子36置于不含胶化材料的套筒内的套筒捕获枯草芽孢杆菌孢子的效率，

-确定采用其中珠子36置于套筒内并用甘油精细膜涂层覆盖的套筒捕获枯草芽孢杆菌孢子的效率。这种产物具有足够粘性以提供气溶胶对收集平板的良好黏附并且总体上不干扰后续的分子分析。

图18中显示伴以和不伴以甘油时所获得的结果。在该图中，可以将收集枯草芽孢杆菌孢子的效率关联为由发生器202所产生气溶胶粒子的直径的函数。

在覆盖套筒中珠子36的胶化材料不存在的情况下，本发明装置收集孢子的效率可达大于70％。

在覆盖套筒中珠子36的胶化材料存在的情况下，收集效率攀升至大于90％。

收集效率在甘油型胶化材料存在的情况下提高由孢子与这种材料黏连的事实解释。在胶化材料不存在下，出现孢子在珠子上回弹的微弱现象，从而阻止孢子与珠子黏连。

实施例2：通过本发明裂解方法与备选方法之间的比较确定裂解效率

在这种情况下，将3种方法与本发明的裂解方法比较：

-使用FastPrep^TM仪(FP120型，BIO101，Thermo ElectronCorporation公司出售)的机械裂解方法；

-使用溶菌酶的酶裂解方法；

-使用离液剂(异硫氰酸胍，GuSCN)的方法，该方法与加热细胞混悬液至90℃的步骤、随后冻融细胞的3个步骤组合。

在本实施例中，所用的细胞是混悬液中的蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)。

在裂解步骤后，使用本申请人出售NucliSENSeasyMAG^TM提取系统纯化所回收的核酸。使用SYBRGreen检测方法(Molecular Probes)最终定量纯化的核酸。下文描述比较性研究的步骤：

步骤1制备蜡状芽孢杆菌混悬液

蜡状芽孢杆菌培养在TSA(胰蛋白酶大豆肉汤)平板中的琼脂培养基上进行。细菌菌落在该琼脂上回收并在本申请人出售的NucliSENSeasyMAG^TM提取缓冲液3(参考号280132)中洗涤。一旦已经洗涤了细胞，则将它们稀释于5ml的相同提取缓冲液中，以获得在波长600nm上具有0.5光密度的细菌混悬液。

步骤2a：用FastPrep仪裂解

将0.5ml细菌混悬液转移到充以1g玻璃珠混合物(相等部分的多种尺寸的珠子：150-212μm、420-600μm和700-1180μm)的2ml试管。以最大速度使用FastPrep仪(设置在6.0)持续60秒。一旦裂解已经完成，将100μl裂解物转移到NucliSENSeasyMAG^TM仪中，从而进行纯化步骤。

-步骤2b：用本发明装置裂解

将0.3ml细菌混悬液转移到与上文所述套筒110等同的套筒中。该套筒随后充以0.4g玻璃珠混合物(相等部分的多种尺寸的珠子：150-212μm、212-300μm和420-600μm)。使该套筒与核酸回收工具接触。该核酸回收工具以2000转/分钟转动2min。一旦已经进行该裂解步骤，将100μl裂解物转移到NucliSENSeasyMAG^TM仪中，从而进行纯化步骤。

-步骤2c：酶裂解

在用溶菌酶裂解的这种方法中，将100μl细菌混悬液与100μl溶菌酶溶液(50mg/ml)混合。该混合物在37℃保温30分钟。在这种保温后，将全部裂解物(200μl)转移到NucliSENSeasyMAG^TM仪中，从而进行纯化步骤。

-步骤2d：离液裂解

将100μl细菌混悬液与100μlGuSCN浓溶液(5mol/l)混合并且将全部混合物保温30分钟。在这种保温后，将全部裂解物(200μl)转移到NucliSENSeasyMAG^TM仪中，从而进行纯化步骤。

-步骤3：使用NucliSENSeasyMAG^TM仪纯化裂解物

使用NucliSENSeasyMAG^TM仪通用提取方案进行该纯化步骤。将本申请人出售的2ml NucliSENSeasyMAG^TM裂解缓冲液(参考号280134)和本申请人出售的50μl NucliSENSeasyMAG^TM磁性二氧化硅粒子混悬液(参考号280133)添加到每份裂解物。在25μl NucliSENSeasyMAG^TM提取缓冲液3中稀释每份裂解物的核酸。

-步骤4：核酸检测

为了确定每份洗脱物中核酸的量，将10μl所述洗脱物置于0.2mlPCR管中。随后添加180μlSyberGreen溶液至样品并且使用本申请人出售的NucliSENS EasyQ仪测量荧光信号。

图19中给出荧光测量的结果。响应结果如下：

B＝用本发明装置裂解

C＝酶裂解

D＝离液裂解

通过分析图19，应当指出本发明装置的裂解效率与FastPrep机械裂解方法的裂解效率相似。另外，这两种机械方法比酶裂解方法或使用离液剂的化学裂解方法显著更高效。

实施例3：使用本发明装置裂解芽孢杆菌混悬液联合用NASBA方法检测

将0.3ml稀释于NucliSENSeasyMAG^TM提取缓冲液3中的蜡状芽孢杆菌混悬液导入本发明的套筒中。重复如先前实施例中描述的本发明裂解方法2分钟。在裂解步骤后，使用5μl裂解物，利用蜡状芽孢杆菌特异性引物和探针，以实时NASBA方法，通过使用NucliSENS EasyQ仪的荧光进行检测。用于检测的靶基因是EF-tu基因。扩增产物的大小是115个核苷酸。

使用范围从6至6×10⁵的多个量的芽孢杆菌。

图20显示作为导入本发明装置的蜡状芽孢杆菌多个量的函数的实时荧光产生。在本图中，对应如下：

a＝含6×10⁵个芽孢杆菌的样品

b＝含6×10⁴个芽孢杆菌的样品

c＝含6×10³个芽孢杆菌的样品

d＝含600个芽孢杆菌的样品

e＝含60个芽孢杆菌的样品

f＝含6个芽孢杆菌的样品

g＝无芽孢杆菌的样品

从图20的观点看，观察到在检测的荧光水平与样品中所含细菌的数目之间的极好相关性。另外，注意到不含细菌的样品与仅含6个细菌的样品之间的显著差异。最后，可以从该分析的结果中推断，本发明的装置提供了适于使用NASBA型核酸扩增方法的性能水平。

应当指出在借助NASBA方法进行扩增之前，通过浓缩核酸可能这种分析的灵敏度。这种浓缩步骤可以使用例如NucliSENSeasyMAG^TM仪进行。

实施例4：使用本发明装置分析全血样品

在本实施例中，本发明装置用来分析其中已经添加蜡状芽孢杆菌群的全血样品。该血样源自健康个体。

蜡状芽孢杆菌培养在TSA(胰蛋白酶大豆肉汤)平板中的琼脂培养基上进行。细菌菌落在该琼脂上回收并用NucliSENSeasyMAG^TM提取缓冲液3洗涤。一旦已经洗涤了细胞，则将它们稀释于5ml的相同提取缓冲液中，以获得在波长600nm上具有0.5光密度的细菌混悬液。这种贮存液大约含有2.2×10⁷个细菌/ml。该贮存混悬液于NucliSENSeasyMAG^TM提取缓冲液3中稀释，以获得具有不同浓度的混悬液，一个浓度是10³个细菌/ml并且一个浓度是10⁵个细菌/ml。

后续使用的方案对于每个稀释混悬液如下：

1.将24μl稀释的混悬液添加到150μl血液并混合；

2.将125μl的NucliSENSeasyMAG^TM提取缓冲液1(参考号280130)导入本发明的套筒中；

3.将载有细菌的血样导入该套筒中；

4.通过使套筒与核酸回收工具接触来进行裂解步骤；该核酸回收工具以2000转/分钟转动2min；

5.将100μl裂解物抽吸到套筒中；

6.使用NucliSENSeasyMAG^TM仪如实施例2的步骤3中所述，进行这种裂解物的纯化，这使得能够回收25μl洗脱液。

7.使用5μl这种洗脱液来利用实时NASBA技术进行扩增和检测。

结果在图21中给出。在本图中，对应如下：

a＝含有53个芽孢杆菌(10⁵个细菌/ml的稀释混悬液)的全血样品

b＝含有5个芽孢杆菌(10³个细菌/ml的稀释混悬液)的全血样品

c＝含有5个芽孢杆菌(10³个细菌/ml的稀释混悬液)的全血样品

d＝不含细菌的全血样品。

给出的结果对应于10³和10⁵个细菌/ml的稀释混悬液。另外，分析10⁵个细菌/ml的混悬液一式两份。

从导入本发明套筒的稀释混悬液的体积看，细菌的实际数量对于10³和10⁵个细菌/ml的混悬液分别是5个和530个细菌。

因而，应当指出，用本发明装置对仅含有5个细菌的样品的分析产生了阳性检测信号(曲线b和c)，它们可以与用不含细菌的样品所获得的结果(曲线d)清晰地区分。

还要指出即便用微小量的细菌，该结果仍是可重复的；这由曲线b和c显示。

应当指出仅使用纯化步骤结束时所获得的25μl中的5μl，就获得了这种极好的灵敏度。这种灵敏度因而可以通过纯化后进行浓缩样品的步骤进一步改进。

因而从这些实施例中引出结论：本发明装置是用于收集空气样品中所含细菌、裂解它们并导致从所述细菌回收核酸用以分析的有效工具。为此，所用的装置将首先由导入空气收集工具的套筒构成并且其次由含有所收集细菌的套筒连同核酸回收工具构成。

本发明装置也完全适用于分析临床样品，如全血样品。在这种情况下，使用无空气收集工具的套筒。将液体样品置于套筒中并且随后套筒与核酸回收工具组合，以裂解细菌并且回收核酸。