用于调控牛羊围产期能量代谢障碍的微生物饲料添加剂

摘要

本发明涉及一种用于调控牛羊围产期能量代谢障碍的微生物饲料添加剂，属于饲料添加剂生产领域。将无机硒源加入到菌剂生产培养基中，使培养基中硒浓度为2～10mg/kg，将克鲁斯假丝酵母、产朊假丝酵母和嗜热链球菌种子液按13∶1∶2接种于培养基中，培养液与适量的玉米粉混合，35～40℃烘干即得。本发明利用益生菌可将糖转化为甘油，无机态硒转化为有机硒的原理，生产出富含甘油和有机硒的复合益生菌产品，能同时发挥甘油、有机硒和益生菌三重功效，能为反刍动物补充能量，调控能量代谢障碍，调节肠道菌群，拮抗病原微生物，增进食欲，提高机体免疫力和抗病力，提高生产性能，是一种安全、无残留、效价高的新型饲料添加剂。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于调控牛羊围产期能量代谢障碍的微生物饲料添加剂，属于饲料添加剂生产领域。

背景技术

牛、羊的围产期是指妊娠后期(产前2～3周)至泌乳初期(产后2～3周)。由于反刍动物日粮中大部分糖在瘤胃发酵过程中形成挥发性脂肪酸，只有少量葡萄糖在消化道中被吸收，并且围产期母畜经历妊娠、分娩等一系列剧烈的生理变化，极易导致能量摄入不足与消耗增多，血糖浓度下降，从而导致能量代谢障碍。如奶牛发生产乳热、酮病和脂肪肝，奶羊发生妊娠毒血症、酮病等。以奶牛酮病为例，有资料报道，我国奶牛酮病的发病率占泌乳牛的15.0％～30.0％，美国为5.0％，英国为12.0％，印度为14.69％，而日本高达43.1％。因此，围产期能量代谢障碍严重影响了牛、羊养殖业。

糖异生作用是指甘油、乳酸和某些氨基酸等非糖物质转变为糖元或葡萄糖的过程。围产期的糖异生作用对牛羊有重要的意义，是调节能量代谢障碍的重要途径。早在20世纪70年代就有人提出甘油可以作为生糖物质添加到反刍动物的日粮中，当前寻找新能源的迫切需要也使甘油成为一种实用性的能源。研究发现，给围产期奶牛饲喂甘油可以提高血糖，调节血液代谢，提高泌乳性能，降低酮体含量，调节能量平衡。甘油的生产方法主要有三种：一是从天然油脂皂化或水解的副产品中获得，即油脂皂化水解法；二是以石油化工产品为原料通过环氧氯丙烷法、丙烯醛法、环氧丙烷过醛酸法合成甘油，即化学合成法；三是以淀粉、糖类或农副产品为原料经微生物作用发酵生产甘油，即发酵法。近年来，前两种方法由于油脂价格上涨，肥皂生产的减少，化学合成的成本高，甘油提取工艺复杂等原因导致甘油需求供应不足，价格上升。另外工业甘油的毒性较大，含砷及重金属物质，导致甘油未普遍应用于反刍动物饲料添加剂领域。而发酵法生产甘油恰恰克服了工业生产甘油的缺点。近年来，随着生物技术、微生物菌种、发酵工艺和提取分离等各方面技术的进展，发酵甘油生产具有很好的发展前景。选取特定的益生菌做为菌种，以淀粉、糖类或农副产品为原料进行发酵生产甘油，然后用于反刍动物饲料添加剂领域，其优点在于：原料来源丰富，设备要求简单，安全无污染，发酵后不需提取甘油，大大降低了生产成本。目前，尚未有发酵法生产甘油直接用于饲料添加剂领域的报道。

硒是一种动物所必须的微量元素，是一种多功能的生命营养元素。研究表明，硒对动物具有抗氧化，提高机体免疫力，提高抗病能力，调节机体代谢，提高繁殖机能，抗肿瘤，拮抗有毒元素等多种功能。硒一般通过日常饮食进入动物机体内，饲料中微量元素硒缺乏或结构不合理都会引起机体缺乏硒，而我国饲料中的硒多从土壤中获得，因此机体硒状况与土壤中硒含量密切相关。据统计，全世界有40多个国家和地区缺硒，我国是个缺硒大国，有72％的国土面积存在着硒缺乏。围产期的奶牛处于应激状态，机体出现免疫抑制，疾病的易感性增加。研究认为，奶牛围产期容易发生的乳房炎、子宫炎、胎衣滞留、酮病、脂肪肝等均与机体妊娠后期和分娩刺激等所致的氧化应激有关。Sordillo报道，奶牛妊娠末期、分娩及泌乳早期的代谢需要均可使体内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)的产生增加，大大超过了正常水平，而使动物处于氧化应激状态。正常情况下，体内ROS不断产生，也不断被抗氧化系统清除，从而始终保持一种动态平衡状态。ROS对许多生物分子具有强氧化性，除可造成蛋白质、DNA和核苷酸损伤外，主要引起生物膜的脂质过氧化作用。硒的最主要的功能是抗氧化性，它参与机体的抗氧化防御系统，围产期缺乏硒可降低机体的免疫功能。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是哺乳动物体内第一个被公认的含硒酶，具有极强的抗氧化作用，催化还原型谷胱甘肽(GSH)还原体内有害的过氧化物(POOH)，包括过氧化氢(HOOH)，使之转变为无害的羟基化合物，从而保护生物膜免受过氧化物的氧化损伤。

为了在饲料中强化硒，防治缺硒症状发生，人们开发了多种硒营养补充剂。目前补硒的方法主要是在饲料中添加无机硒，但大量研究表明亚硒酸钠等无机硒的利用率较低，动物排泄的硒造成土壤和环境污染的危险较大，这些已经引起人们对使用无机硒的疑虑；而有机硒毒性小，吸收率高，生物利用率高，在满足动物生长发育所需的添加量的范围内对环境基本没有污染。生物有机化是获得有机营养元素的简便而经济的途径，有利于实际生产中大量应用。硒的生物有机化主要是在植物中和微生物体内进行的。研究表明，在人和动物体内，大部分的硒是以含硒蛋白及硒酶的生物活性形式发挥作用的，硒在这些蛋白质及硒酶的氨基酸中取代硫的位置，形成硒蛋氨酸、硒胱氨酸、硒半胱氨酸等。通过生物转化获得的有机硒因与其在人和动物体内存在的形式相同或相近，所以吸收利用率更高。

益生菌(probtotlcs)又名促生素、生菌剂、原生菌、微生物制剂、活菌制剂，是指“当摄入一定量时能对宿主的健康有作用的微生物活体”。益生菌主要包括乳酸菌类、双歧杆菌类、芽孢杆菌类、光合细菌类和酵母类。围产期母畜经历妊娠、分娩等一系列剧烈的生理变化，饮食改变，往往会造成动物机体肠道内有益菌数量下降，导致肠道微生物生态失调，引起菌群易位，诱发内源感染，造成机体病变，通过外源补充益生菌，可维持肠道菌群平衡，提高机体免疫力，降低疾病的易感性。

综上所述，以特定的益生菌为菌种，以淀粉、糖类或农副产品为原料，通过发酵法将原料转化为甘油，并将无机态的硒转变成有机态的硒，用适当的吸附剂吸附，得到一种富含甘油和有机硒的用于调控牛羊围产期能量代谢障碍的微生物饲料添加剂，可以同时发挥甘油、有机硒和益生菌的三重功效，这显然能有效地改善机体的内生环境，补充能量，调节能量代谢障碍，增强机体的免疫力，抵抗肿瘤，拮抗病原微生物，从而达到预防疾病的作用。因此富含甘油和有机硒的复合益生菌制剂作为安全、多功能的饲料添加剂必将在医药、饲料添加剂领域发挥巨大作用。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种简单、低成本生产的用于调控牛、羊围产期能量代谢障碍的微生物饲料添加剂，该产品同时发挥甘油、有机硒和益生菌三重功效。

技术方案

用于调控牛、羊围产期能量代谢障碍的微生物饲料添加剂，具体生产方法包括以下步骤：

1)菌种克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、嗜热链球菌(Streptococcus Thermophilus)；均为卫生部允许使用的益生菌菌种。

2)菌剂生产培养基质量体积比

15％～25％葡萄糖、0.5％～2％酵母浸膏、0.1％～0.3％尿素、0.1％～0.3％玉米浆干粉、0.3％～0.4％磷酸二氢钾、4％～6％氯化钠，其余为水。

3)斜面活化培养基

克鲁斯假丝酵母活化培养基(CM0357)：40g葡萄糖、2g尿素、4g酵母浸膏、20g琼脂，1000ml水，pH4.5，115℃高压蒸汽灭菌15min，备用。

产朊假丝酵母、嗜热链球菌活化培养基(YPD)：20g葡萄糖、5g酵母浸膏、10g蛋白胨、20g琼脂、1000ml水，初始pH 6.7，115℃高压蒸汽灭菌15min，备用。

4)液体活化培养基斜面活化培养基中不加琼脂。

5)无机硒源配置含硒量0.2～2mg/ml的亚硒酸钠溶液，100～125℃高压蒸汽灭菌20～30min，备用。

6)吸附剂玉米粉。

7)菌种的活化与种子液的获得

将保存在4℃的克鲁斯假丝酵母接种于CM0357固体培养基上，于20～30℃培养30～40h；如此连续转接3～5次，再接种于CM0357液体培养基中，于20～30℃，150r/min，摇床培养24～36h，得克鲁斯假丝酵母种子液，其cfu达到10⁹/ml以上；将保存在4℃的产朊假丝酵母接种于YPD固体培养基上，于20～30℃培养30～40h，如此连续转接3～5次，再接种于YPD液体培养基中，于20～30℃，150r/min，摇床培养24～36h，得产朊假丝酵母种子液，其cfu达到10⁹/ml以上；将保存在4℃的嗜热链球菌接种于YPD固体培养基上，于36～45℃培养36～48h；如此连续转接3～5次，再接种于YPD液体培养基中，于36～45℃，培养24～36h，得嗜热链球菌种子液，其cfu达到10¹⁰/ml以上。

8)生产

取生产培养基配料葡萄糖15～25kg、酵母浸膏0.1～1.0g、尿素100～300g、玉米浆干粉100～300g、磷酸二氢钾300～400g和氯化钠4～6kg，将其溶解在水中，使总体积达到100L，然后加入到150L发酵罐中，115～120℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至40～50℃，将无机硒源加入到菌剂生产培养基中，使培养基中硒浓度为2～10mg/kg；再将克鲁斯假丝酵母、产朊假丝酵母和嗜热链球菌种子液按体积比13∶1∶2接种于菌剂生产培养基中，总接种量体积比为6％～11％，培养温度为20～40℃，通气量为0.05m³/h，摇床转速70r/min，罐压为0.04Mpa，培养时间为96～132h；

9)产品获得

培养结束后，培养液与适量的玉米粉混合，35～40℃烘干，即得到一种富含甘油和有机硒的复合益生菌产品。

有益效果：

试验表明，围产期饲喂本发明不同剂量富含甘油和有机硒的复合益生菌产品，产品处理组血浆葡萄糖浓度高于对照组，血浆游离脂肪酸和β-羟丁酸浓度及尿酮浓度低于对照组。随着日粮添加产品的增加，中剂量组血浆葡萄糖浓度和H组显著高于对照组(P＜0.05)；中剂量组和高剂量组血浆游离脂肪酸浓度显著低于对照组(P＜0.05)，高剂量组血浆β-羟丁酸浓度显著低于对照组(P＜0.05)；中剂量和高剂量组尿酮浓度显著低于对照组(P＜0.05)。

本发明利用益生菌可将糖转化为甘油，无机态硒转化为有机硒的原理，生产出富含甘油和有机硒的复合益生菌产品，能同时发挥甘油、有机硒和益生菌三重功效，能为反刍动物补充能量，调控能量代谢障碍，调节肠道菌群，拮抗病原微生物，增进食欲，提高机体免疫力和抗病力，提高生产性能，是一种安全、无残留、效价高的新型饲料添加剂。

具体实施方式

实施例1

(1)菌种

克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株代号为CICC1722。

产朊假丝酵母(Candida utilis)：购自中国科学院微生物研究所微生物菌种保藏中心，菌株代号为AS2.1180。

嗜热链球菌(Streptococcus Thermophilus)：购自中国科学院微生物研究所微生物菌种保藏中心，菌株代号为AS1.2471。

(2)菌种活化与种子液的获得

斜面活化培养基质量比：克鲁斯假丝酵母活化培养基(CM0357)：40g葡萄糖、2g尿素、4g酵母浸膏、20g琼脂，1000ml水，pH4.5，115℃高压蒸汽灭菌15min，备用；产朊假丝酵母、嗜热链球菌活化培养基(YPD)：20g葡萄糖、5g酵母浸膏、10g蛋白胨、20g琼脂、1000ml水，pH6.7，115℃高压蒸汽灭菌15min，备用。

将保存在4℃的克鲁斯假丝酵母接种于CM0357固体培养基上，于30℃，培养30h；如此连续转接3～5次，再接种于CM0357液体培养基中，于30℃，150r/min，摇床培养24h，得克鲁斯假丝酵母种子液，其cfu达到3.24×10⁹/ml(菌种液A)。

将保存在4℃的产朊假丝酵母接种于YPD固体培养基上，于28℃，培养32h；如此连续转接3～5次，再接种于YPD液体培养基中，于28℃，150r/min，摇床培养24h，得产朊假丝酵母种子液，其cfu达到4.46×10⁹/ml(菌种液B)。

将保存在4℃的嗜热链球菌接种于斜面活化培养基上，于42℃，培养48h；如此连续转接3～5次，再接种于液体活化培养基中，于42℃，培养24h，得嗜热链球菌种子液，其cfu达到8.25×10¹⁰/ml(菌种液C)。

(3)生产培养基配料

培养基配料：葡萄糖20kg、酵母浸膏200g、尿素200g、玉米浆干粉200g、磷酸二氢钾350g、氯化钠4kg。

制备无机硒源：制备Se浓度为1.0mg/ml的亚硒酸钠溶液0.5L，121℃高压蒸汽灭菌30min，备用。

吸附剂：50kg玉米粉

(4)生产

将上述菌剂生产培养基配料溶解在水中，使其总体积达到100L，然后加入到BIOTECH-BS/JS(150L)发酵罐中，115℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至40～50℃，加入含硒量为1.0mg/ml的亚硒酸钠溶液0.5L，接入菌种液A6.5L、菌种液B0.5L、菌种液C1L，温度为33℃，通气量为0.05m³/h，转数为70r/min，罐压为0.04Mpa，培养时间为120h，得到发酵液。

将上述发酵液与50kg玉米粉混匀，38℃左右烘干，得到富含甘油和有机硒的复合益生菌制剂。

上述获得的富含甘油和有机硒的复合益生菌制剂的量为61.95kg，克鲁斯假丝酵母、产朊假丝酵母、嗜热链球菌的数量分别达7.75×10⁸cfu/g、2.69×10⁸cfu/g、6.45×10⁹cfu/g，甘油含量为108.55g/kg，有机硒的含量为6.79mg/kg，硒的总含量为8.06mg/kg，有机硒转化率约为84.2％。

实施例2

(1)菌种

克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株代号为CICC1722。

产朊假丝酵母(Candida utilis)：购自中国科学院微生物研究所微生物菌种保藏中心，菌株代号为AS2.1180。

嗜热链球菌(Streptococcus Thermophilus)：购自中国科学院微生物研究所微生物菌种保藏中心，菌株代号为AS1.2471。

(2)菌种活化与种子液的获得

斜面活化培养基质量比：克鲁斯假丝酵母活化培养基(CM0357)：40g葡萄糖、2g尿素、4g酵母浸膏、20g琼脂，1000ml水，pH4.5，115℃高压蒸汽灭菌15min，备用；产朊假丝酵母、嗜热链球菌活化培养基(YPD)：20g葡萄糖、5g酵母浸膏、10g蛋白胨、20g琼脂、1000ml水，pH6.7，115℃高压蒸汽灭菌15min，备用。

将保存在4℃的克鲁斯假丝酵母接种于CM0357固体培养基上，于30℃，培养30h；如此连续转接3～5次，再接种于CM0357液体培养基中，于30℃，150r/min，摇床培养24h，得克鲁斯假丝酵母种子液，其cfu达到3.24×10⁹/ml(菌种液A)。

将保存在4℃的产朊假丝酵母接种于YPD固体培养基上，于28℃，培养32h；如此连续转接3～5次，再接种于YPD液体培养基中，于28℃，150r/min，摇床培养24h，得产朊假丝酵母种子液，其cfu达到4.46×10⁹/ml(菌种液B)。

将保存在4℃的嗜热链球菌接种于斜面活化培养基上，于42℃，培养48h；如此连续转接3～5次，再接种于液体活化培养基中，于42℃，培养24h，得嗜热链球菌种子液，其cfu达到8.25×10¹⁰/ml(菌种液C)。

(3)发酵所需配料

培养基配料：葡萄糖20kg、酵母浸膏200g、尿素200g、玉米浆干粉200g、磷酸二氢钾350g、氯化钠4kg，其余为水。

制备无机硒源：制备Se浓度为0.8mg/ml的亚硒酸钠溶液0.5L，121℃高压蒸汽灭菌30min，备用。

吸附剂：50kg玉米粉

(4)生产

将菌剂生产培养基配料溶解在水中，使其体积达到100L，然后加入到BIOTECH-BS/JS(150L)发酵罐中，115℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至40～50℃，加入含硒量为0.8mg/ml的亚硒酸钠溶液0.5L，接入菌种液A6.5L、菌种液B0.5L、菌种液C1L，温度为33℃，通气量为0.05m³/h，转数为70r/min，罐压为0.04Mpa，培养时间为120h，得到发酵液。

将上述发酵液与50kg玉米粉混匀，38℃左右烘干，得到富含甘油和有机硒的复合益生菌制剂。

上述获得的富含甘油和有机硒的复合益生菌制剂的量为61.98kg，克鲁斯假丝酵母、产朊假丝酵母、嗜热链球菌的数量分别达7.77×10⁸cfu/g、2.72×10⁸cfu/g、6.53×10⁹cfu/g，甘油含量为115.77g/kg，有机硒的含量为5.70mg/kg，硒的总含量为6.45mg/kg，有机硒转化率约为88.4％。

添加了上述富含甘油和有机硒的复合益生菌制剂的饲料产品进行试验时的试验动物选取、处理及试验结果，包括：

1.试验动物及分组

12头经产荷斯坦奶牛，体况、年龄、胎次、预产期、产奶量相近，随机分成4组，每组3头奶牛，即对照组(不添加产品组)、L组(低剂量组，添加约含甘油30g的产品276.4g/头·天)、M(中剂量组，添加约含甘油60g的产品552.7g/头·天)、H组(高剂量组，添加约含甘油90g的产品829.1g/头·天)，预试验7天，正式试验从产前14天至产后21天。

对照组喂给基础日粮；L组喂给基础日粮+产品276.4g/头·天(约含有甘油30g，Se 2.6mg和益生菌2.07×10⁹cfu)-276.4g玉米粉；M组喂给基础日粮+产品552.7g/头·天(约含有甘油60g，Se5.1mg和益生菌4.14×10⁹cfu)-552.7g玉米粉)；H组喂给基础日粮+产品829.1g/头·天(约含有甘油90g，Se7.6mg和6.21×10⁹cfu)-829.1g玉米粉。在每天下午喂牛时，把产品拌入混合精料，单独投喂。

2.试验方法

血浆葡萄糖(Glucose)浓度采用Sigma葡萄糖氧化酶试剂盒的方法进行测定；游离脂肪酸(Non-esterified fatty acids，NEFA)浓度采用南京建成生物工程研究所的游离脂肪酸试剂盒的方法测定；β-羟丁酸(β-hydroxybutyrate，BHBA)浓度采用Sigma试剂盒310-A的方法测定；尿样采用Bayer CLIN ITEK 500型尿液分析仪及配套试纸、半定量法测定尿酮(Urine ketones)浓度。

所有奶牛分别于试验第0、21(产后第7d)、28(产后第14d)、35(产后第21d)d采集血液样品。所有奶牛分别于产后第7、14、21d采集尿样。

3.试验结果

由表1可知围产期饲喂不同剂量富含甘油和有机硒的复合益生菌产品，产品处理组血浆葡萄糖浓度高于对照组，血浆游离脂肪酸和β-羟丁酸浓度及尿酮浓度低于对照组。随着日粮添加产品的增加，M组血浆葡萄糖浓度和H组显著高于对照组(P＜0.05)；M组和H组血浆游离脂肪酸浓度显著低于对照组(P＜0.05)，H组血浆β-羟丁酸浓度显著低于对照组(P＜0.05)；M和H组尿酮浓度显著低于对照组(P＜0.05)。

试验表明，在围产期饲喂富含甘油和有机硒的复合益生菌产品可以有效地调控奶牛围产期能量代谢障碍。该产品的优点在于：原料来源丰富，设备要求简单，较工业化生产安全无污染，发酵后不需提取甘油，大大降低了生产成本。该产品具有甘油、有机硒和益生菌三重功效，能给反刍动物改善机体的内生环境，调节能量代谢，调节肠道菌群，拮抗病原微生物，增进食欲，提高机体免疫力和抗病力，是一种安全、无残留、效价高的新型饲料添加剂。

表1富含甘油和有机硒的复合益生菌产品对围产期奶牛血浆代谢产物和尿酮含量的影响

同行肩注不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，同列肩注不同大写字母表示差异显著(P＜0.05)。