法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-08-18
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):G01N33/68 授权公告日:20130529 终止日期:20160701 申请日:20080701
专利权的终止
2013-05-29
授权
授权
2010-03-03
实质审查的生效
实质审查的生效
2010-01-06
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种肝炎病毒检测蛋白芯片,具体涉及一种丙型肝炎病毒检测的蛋白芯片,还涉及该芯片的医疗用途。
背景技术
生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一,是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术,具有重大的基础研究价值,又具有明显的产业化前景。现在,根据基片上教练固定的识别分子种类的不同,生物芯片已经发展了基因芯片、蛋白芯片、组织芯片等多种类型,其中蛋白芯片是应“后基因组时代”而诞生的一项新技术,并广泛的应用于疾病诊断、药物筛选、给药个性化等多个方面,为整个人类社会带来深刻广泛的变革。
蛋白芯片是用于蛋白质功能研究及其相互作用分析的生物芯片,采用原位合成、机械点样或共价结合等方法将多肽、蛋白、酶、抗原、抗体固定于基片形成分子点阵。利用生物分子与蛋白芯片的探针分子发生杂交或相互作用,检测和分析蛋白质的一项技术。目前对蛋白芯片反应信号的检测主要有荧光法、酶显色法和胶体金-银显色法。荧光法是蛋白芯片通常采用的信号检测系统,主要利用激光共聚焦扫描仪对杂交信号进行高通量检测和分析,具有自动化程度高、灵敏度高的特点,但需要购买昂贵的芯片扫描仪和专业人员,无法在基层医疗单位推广。酶显色法主要利用标记的辣根酶或者其他生化酶与特定的显色液相互作用,根据芯片矩阵的颜色变化对反应结果进行分析的过程,但灵敏度和特异性低。胶体金-银显色法主要利用胶体金进行蛋白质标记并通过银进行直接显色,该方法既具有高的灵敏度和特异性,同时又无需增添设备,是可视化芯片的重要模式,具有广泛的应用潜力和前景。
丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的丙型肝炎是一种十分严重的传染性肝脏疾病。目前,我国共有患者3800-4000万,并且随着卖淫、吸毒、不规范输血等社会问题的出现呈增加趋势。丙型肝炎治疗主要是采用干扰素合并利巴韦林为主,并根据病毒的基因型和病毒载量的不同采用不同的剂量及治疗时间,但该治疗方案有效率低且复发率高(Fried MW and Hoofnagle JH.Therapy of hepatitis C,Semin Liver Dis,1995;15:82-91)。主要原因在于上述治疗方案中没有考虑到HCV变异对治疗效果的影响。研究显示:HCV变异的大小与干扰素的治疗效果密切关系,当HCV变异大的患者对干扰素的治疗效果差,而HCV变异小的患者对干扰素治疗的应答比率高,因此对HCV变异的研究,除了可以对IFN的治疗效果进行预测,还可以帮助临床制定更有针对性地个体化治疗方案。
在HCV变异的研究中,位于病毒第二包膜蛋白N端的第一高变区(HVR1)处于十分重要的地位。研究显示:尽管HVR1仅有27个氨基酸,但其变异占到整个病毒基因组变异的80%以上,常以HVR1序列的变化作为衡量病毒变异的标准;HVR1含有HCV唯一的中和性抗原表位,其抗体能阻止病毒吸附敏感细胞,早期HVR1抗体的出现,有助于疾病的自愈;HVR1的变异的复杂程度与IFN的治疗效果有密切关系等(修冰水,凌世淦。丙型肝炎病毒第一高变区的研究进展,国外医学病毒学分册,2000,7(5):158-160)。国内外十分重视对HCV病毒变异的检测,目前对HCV变异的检测是建立在逆转录-PCR检测HVR1基因异质性的基础之上,该方法对人员素质、设备要求高,因此,至今国内外对HCV变异的检测仅限于大的科研机构水平,无法进行大规模推广,而发明人此前提出了建立在HVR1抗体异质性检测基础之上的HCV变异检测技术,利用酶联免疫的方法检测HCV患者体内多靶点HVR1抗体的异质性,从而对HCV的变异情况作出判断(申请号200710002626.6)。但建立在酶联免疫技术上的HCV变异检测技术涉及血清用量大、检测不平行、效率低等缺点。
蛋白芯片在疾病检测中具有很好的应用前景,我国的第一个蛋白芯片新药证书就是丙型肝炎病毒(HCV)抗体检测芯片,可以在一个反应矩阵中同时检测HCV患者血清中总抗体及核心区、非结构区NS3、NS4、NS5共5种抗体的存在性,具有高效、平行、高灵敏度检测的效果。但该产品在我国并没有得到广泛的应用,其中需要购置昂贵的激光共聚焦扫描仪和缺少明确的临床意义是限制其推广的主要原因。目前尚未有检测丙型肝炎病毒的可视化蛋白芯片的报道。
发明内容
为了解决目前丙型肝炎病毒检测蛋白芯片的缺点,本发明提供了一种丙型肝炎病毒变异检测蛋白芯片。该蛋白芯片固定用抗原为丙型肝炎病毒第一高变区抗原,其氨基酸序列选自如下两种或两种以上的氨基酸序列:
本发明的蛋白芯片采用胶体金-银染检测系统显色芯片。
为了实现HCV变异的高效平行检测的目的,本发明通过对蛋白芯片领域的深入研究,提出了一种用于检测HCV变异的新方法。本发明以HVR1作为研究靶点,采用可视化蛋白芯片技术,检测HCV患者血清中HVR1抗体的异质程度,从而建立可视化HCV变异检测蛋白芯片。
本发明的丙型肝炎病毒变异蛋白检测芯片,不同于以往的HCV抗体检测芯片,是建立在HCV-HVR1抗体异质性检测基础上的HCV变异蛋白芯片,并利用“胶体金-银染”显色系统达到芯片检测结果可视化目的。本发明提供的蛋白芯片,仅用1滴样本就可以检测到血清与16个多靶点HVR1抗原的反应情况,实现了检测的高通量、平行性和高效性。
为实现上述目的,发明人设计了由16个多靶点HVR1抗原组成的6×6反应矩阵,每个抗原作了2次重复并设立了阳性IgG对照和抗原表达空载体IL1阴性对照,图1所示。
按图1所示,采用点接触法将16种HVR1抗原固定于芯片基片上,与HCV患者血清相互作用,采用“胶体金-银染”使芯片显色,通过结果判断。研究HCV患者血清与各个靶点抗原的反应情况,统计患者血清中HVR1抗体的异质程度,并分析其临床意义。
本发明是通过以下技术方案得以实现的:首先制备HVR1抗原,可采用化学合成或分子生物学方法进行制备,将制备的HVR1抗原纯化后进行预处理,采用点接触法制备HCV变异检测芯片,封闭并干燥,获得本发明的蛋白芯片。在使用该芯片进行丙型肝炎病毒抗体检测时,将HCV患者血清与芯片进行反应,漂洗后采用胶体金标记二抗反应,并用硝酸银溶液显色,可以目视或用普通图象扫描仪记录分析结果,并检测其临床意义。
本发明还公开了上述丙型肝炎病毒第一高变区抗原在制备丙型肝炎病毒检测试剂中的用途。
实验结果证明,本发明可视化HCV变异检测蛋白芯片可以对患者血清中HVR1抗体的异质程度进行检测,结果显示,丙型肝炎慢性肝病变组和肝硬化组HVR1抗体的异质程度要显著高于无症状组,干扰素治疗无效及复发组也要显著高于治疗有效组。提示本发明的蛋白芯片可用于HCV疾病转归和预后、干扰素治疗效果预测的研究,为该产品的推广和临床应用打下基础。
与现有技术相比,本发明具有以下特点:
1.发明是建立在免疫学检测的原理上
目前,HCV的诊断行业多以血清免疫学检测为主,通过对血清中的各种抗HCV抗体的检测,确定HCV感染。本发明通过检测HCV变异抗体的存在,反映患者体内病毒的变异情况,可有效的避开RT-PCR的基因检测,使本发明具有简单易操作、重复性好等特点而得到推广和应用。
2.发明是建立可视化芯片检测技术的基础上
本发明所涉及的HVR1抗原共有16种,采用蛋白芯片法可通过一次加样就能达到检测患者血清中HVR1抗体的异质程度,检测效率远高于原有的酶联检测技术,采用“胶体金-银染”可实现蛋白芯片检测结果的可视化,无需购买昂贵的芯片扫描仪,适合临床推广。
3.本发明具有一定的临床意义。
本发明所采用的靶点抗原是具有HCV变异标记作用的第一高变区(HVR1),它集中了HCV 80%以上的变异,还含有HCV唯一的中和性抗原表位。HVR1抗体具有多种临床意义,HVR1与临床研究关系密切,目前,国内外在这方面积累了大量资料。如早期HVR1抗体的出现有助于患者的自愈,而HVR1的异质程度随着慢性肝炎、肝硬化、肝癌的发展而不断增加。而HVR1的变异的复杂程度与IFN的疗效密切相关。
附图说明
附图1.HCV变异检测蛋白芯片反应矩阵设计图,其中A:芯片反应区B:6×6芯片反应矩阵C:芯片固定HVR1抗原编号。
附图2.HCV变异检测蛋白芯片反应信号检测的可视化
附图3.可视化HCV变异检测蛋白芯片检测与疾病慢性化进程之间的关系图,其中A:无症状HCV患者 B:慢性HCV患者 C:HCV肝硬化患者。
附图4.可视化HCV变异检测蛋白芯片检测与干扰素治疗之间的关系图,其中A:治疗无效组,B:治疗有效组
具体实施方式
实施例1 HCV变异检测蛋白芯片反应矩阵设计和蛋白芯片制备
一、材料:阴离子交换柱Q-Sepharose FF,凝胶过滤柱Sephardex G-50购自于Pharmacia Biotech公司;脲、蔗糖购自于北京化学试剂公司;溶菌酶、BSA 购自于Promega公司;氨基硅烷化玻璃片购自于北京博奥生物芯片有限公司;超声波碎仪购自于宁波新芝科技有限公司。
二、方法结果:
1.我们设计了由16个多靶点HVR1抗原组成的6×6反应矩阵,每个抗原垂直作了2次重复,并设立了阳性IgG对照和IL1阴性对照(附图1)。
2.表达菌株的培养:取-70℃保存的表达菌株(本室保存。丙型肝炎病毒第一高变区抗原及其在制备丙型肝炎病毒检测试剂中的用途,申请号:200710002626.6)20μl接种于LB培养基中(100ml LB/500ml三角瓶),30℃空气摇床培养过夜,次日按5%的比例转种于LB培养基(同上),30℃空气摇床培养约3小时,当OD600值达到0.7时,立即将培养瓶转到42℃水浴摇床中,诱导培养4小时。将菌液合并,6000rpm离心20分钟,弃上清,收集沉淀部分。
3.提取包涵体:将沉淀称湿重,用10倍体积的20mmol/L pH8.0TE缓冲液将沉淀悬起,加入溶菌酶(1mg/ml悬液),在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声波破碎菌,每次超30秒钟,间隔30秒钟,共超10次。8℃,1,2000rpm,离心20分钟,弃上清,沉淀用1mol/L NaCl(用TE配制)洗一次,再用TE洗2次,收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8.0TE配制)溶解,加1%β-巯基乙醇。再于20℃1,2000rpm离心10分钟,去沉淀取上清。
4.纯化:将上述溶解的包涵体溶液过Q-Sepharose FF阴离子交换柱,用平衡液(pH8.0,20mmol/L TE含6mol/L脲,0.1%β-巯基乙醇)清洗后,用不同浓度的NaCl(用平衡液配制)洗脱,收集各洗脱峰,经SDS-PAGE鉴定,收集0.05mol/L NaCl洗脱峰。再过Sephardex G-50凝胶过滤柱,收集第一洗脱峰。各种纯化重组表位抗原均用SDS-PAGE鉴定。
5.HVR1抗原的预处理
将纯化的候选抗原用pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释到1.0mg/ml,在384孔板上,每孔加入8μl预处理液(pH7.2的磷酸盐缓冲液含40%甘氨酸)和2μl抗原,注意赶出气泡。
6.芯片反应矩阵的制备
将氨基硅烷化的玻片用CCS-100围栏覆盖分区,采用点接触法(ArrayitTM micro spotting pins加样针)将抗原按设计以1nl/点的点样量依次固定,晾干后用封闭液(pH7.2的磷酸盐缓冲液含1%酪蛋白、10%山羊血清、2%蔗糖)封闭2小时,用洗涤液(pH7.2的磷酸盐缓冲液含20%Tween-20)洗3次,干燥后4℃保存备用。
实施例2 HCV变异检测蛋白芯片反应及结果的可视化
一、材料:胶体金标记蛋白 A:购自北京中杉生物技术公司;对苯二酚柠檬酸钠、柠檬酸、硝酸银购自北京化学试剂公司;
二、方法结果:
将芯片从冰箱取出后复温20分钟,用纯净水洗片,吸出多余水分。将血清用芯片稀释液稀释10倍,滴入芯片反应区上,室温1小时。用洗涤液洗片5次,用纯净水洗片后吸出多余水分。加入胶体金标记的蛋白A(用PBS1:100稀释),室温反应10分钟,用洗涤液洗片5次,用纯净水洗片后吸出多余水分,加入银显色液(A液:对苯二酚0.425g、柠檬酸钠1.175g、柠檬酸1.275g用纯净水定容至25ml;B液:硝酸银46.5mg用纯净水定容25ml;A液与B液等量混合,注意A、B液需要现用现配),避光反应10分钟,纯净水冲洗3次终止显色,晾干后肉眼观测或用普通扫描仪扫描记录结果(见附图2)。
实施例3 可视化HCV变异检测蛋白芯片临床意义
一、材料:28份无症状HCV感染血清由北京红十字血液中心提供;41份慢性丙肝患者血清和37份肝硬化患者血清由北京大学附属人民医院提供;干扰素治疗丙型肝炎前后血清样品由重庆医科大学第二附属医院提供;
二、方法结果:
1.可视化HCV变异检测蛋白芯片与疾病慢性化进程之间的关系
采用可视化HCV变异检测蛋白芯片对28份无症状HCV患者血清、41份慢性患者血清及37份肝硬化患者血清的中的HVR1抗体的异质程度进行检测。结果如图3所示:无症状、慢性肝病变、肝硬化HCV感染者血清中多靶点HVR1抗体阳性数目分别为5.39±3.75、11.74±3.29、10.61±4.09,统计结果显示:慢性肝病变组和肝硬化组中抗HVR1抗体的异质程度要显著高于无症状组(P<0.01),提示可视化HCV变异检测蛋白芯片可用于HCV疾病转归和预后的研究。
2.可视化HCV变异检测蛋白芯片与干扰素治疗之间的关系
采用可视化HCV变异检测蛋白芯片对具有不同干扰素治疗效果的HCV患者的做出检测,结果如图4所示:有效应答的患者抗体异质数目平均值为5.4±3.2,而无效及复发患者抗体异质数目为10.3±3.1;统计结果显示:无效及复发组中抗HVR1抗体的异质程度要显著高于有效应答组(P<0.01)。提示可以根据可视化HCV变异检测蛋白芯片的结果对患者的治疗效果做出预测,以便开展更有针对性的个体化治疗。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
<120>一种丙型肝炎病毒变异检测蛋白芯片、其制备方法及用途
<130>
<160>16
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>27
<212>PRT
<213>
<400>1
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20 25
机译: 一种检测血清中des-羧基-凝血酶原异常的蛋白芯片及试剂盒及其制备方法
机译: 丙型肝炎病毒细胞培养系统,丙型肝炎病毒RNA构建体,细胞培养系统或构建体的用途,获得与丙型肝炎病毒RNA构建体相容的突变体的方法,丙型肝炎全长病毒的制备方法基因组,丙型肝炎病毒部分基因组或任何丙型肝炎病毒构建体突变体,适用于细胞培养的丙型肝炎病毒构建体,其突变体,丙型肝炎病毒全长基因组突变体,丙型肝炎病毒颗粒或类病毒颗粒,以及被其感染的细胞
机译: 疫苗诱导的乙型肝炎病毒株,核酸编码的分子编码丙型肝炎病毒的突变株主要表面抗原,用于制备多肽的矢量和矢量系统,一种用于制备多肽(多肽)(多变体)的方法寡核苷酸,一种抗体(变体)的制备方法,抗体(多种),一种测定治疗乙型肝炎病毒感染的化学成分的方法,一种成分,一种制备方法,一种方法乙型肝炎病毒的有机液体筛查,一种抗体使用方法,疫苗接种疫苗