具有优化的5’端前导功能(5’－UTR)的人工DNA序列用以改进异源蛋白质在植物内的表达

摘要

5’－UTR核苷酸前导序列，其包含有利于基因表达的元件，如重复的CAA三核苷酸元件，其与重复的CT二核苷酸元件组合。

说明书

发明领域

本发明涉及用以改善异源蛋白质在植物中表达的人工DNA序列。

发明背景

在生物技术领域内，对于提高引入相关生物的基因的表达水平有着强烈的需求。这一表达水平往往并不能令人满意，并成为植物和动物生物技术中的创新付诸工业应用的障碍。有大量数据显示了前导区在调控基因表达水平中的重要性，同时有多种结构元件来表征其调控能力。

在此情况中，如同对于广泛普及的载体(例如pBI121及其衍生物、pCAMBIA及其衍生物)所提出的，5’端的非翻译前导序列(5’-UTR)存在着大量的缺陷，使其不适合指导基因修饰的生物体内足够水平的基因表达。特别是，想要最大化产量时(例如利用植物作为细胞工厂生产对人有用的化合物)，必须消除5’-UTR序列产生的产量限制。为此，已提议将前导序列Ω(自然存在于烟草花叶病毒TMV中的序列)用于植物中。然而，这也有缺陷和冗余之处，使其有待改善。

人们已知存在于TMV前导序列Ω中的翻译增强子中的多聚(CAA)区域(Gallie和Walbot 1992Nucleic Acids Res.，20，4631-4638)显著提高表达水平，也就是说，它对异源蛋白质在体外和体内的翻译水平有积极的影响(Gallie等人，1988a Nucleic Acids Res.，16，883-893，Gallie等人，1988bNucleic Acids Res.，16，8675-8694，Gallie 2002Nucleic Acids Res.，30，3401-3411)。在前导序列Ω中，多聚(CAA)序列与三个ACAATTAC重复序列相连(Gallie等人，1988a)，但缺失研究表明，负责提高表达水平的调控元件可能包含与基序(CAA)n组合的单拷贝ACAATTAC序列(Gallie和Walbot 1992)。

人们还知道，CaMV 35S启动子的转录起始位点(Inr)有助于mRNA的有效加帽(Guilley等人，1982Cell，30，763-773)。

此外，人们已知许多植物前导序列(Bolle等人，1996 Plant Mol.Biol.32，861-868)具有富含CT元件的序列，并且该富含CT元件的序列可以改变转录水平(Chen等人，1996 J.Virol.，70，8411-8421)。

人们还知道，长度超过40个核苷酸的序列易于识别第一个AUG作为真正的起始翻译密码子(Kozak 1989 J.Cell.Biol.，108，229-241)。例如，已观察到，将前导区从29个核苷酸延长至74个核苷酸导致mRNA在体外(Kozak 1991，J.Biol.Chem.，266，19867-19870)和体内(Gallie和Walbot1992)翻译水平的增加。前导序列的A/T含量越高导致表达水平越高，原因是阻碍了由于分子自身折叠而导致的双链mRNA片段的形成。事实上，可以肯定这种二级结构对翻译效率具有不利影响(Pelletier和Sonenberg1985 Cell，40，515-526；Kozak 1986 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，2850-2854)。此外，已注意到，源自病毒的5’-UTR的部分向植物前导区中的引入可以由报道蛋白表达水平的增加反映出来(Dowson Day等人，1993 Plant Mol.Biol.，23，97-109)。

因此本发明的目的在于弥补本领域现状的缺陷，并获得增加植物中重组蛋白表达水平的前导序列。

本申请的申请人设计、测试并具体实施了本发明以克服本领域现状中的缺点并达到这些以及其他目的和优势。

发明概述

独立权利要求阐述并表征了本发明，而从属权利要求描述本发明的其他特征或主要发明的想法的变型。

按照上述目的，根据本发明的具有5’端前导功能(5’-UTR)的人工DNA序列(以下用LL-TCK表示)同时包含有利基因表达的元件，如重复的CAA三核苷酸元件，其与重复的CT二核苷酸元件组合。

根据本发明的LL-TCK序列是通过人工合成的方法获得的，是智慧的结晶，因为它不是天然存在的。

根据有利方案，根据本发明的LL-TCK序列提供三核苷酸元件CAA与二核苷酸元件CT的组合，以及存在于前导序列Ω中的激活翻译的序列的修饰。

根据变型，根据本发明的序列含有多聚(CAA)区域，即含有两个或更多的CAA元件拷贝的寡核苷酸，优选所述CAA元件彼此邻接，但非必需。

根据另一变型，根据本发明的序列含有多聚(CT)区域，即含有两个或多个CT元件拷贝的寡核苷酸，优选所述CAA元件彼此邻接，但非必需。

本发明的变型提供的序列含有一个或多个拷贝的ACAATTAC八聚体。

由组合具有多聚(CAA)区域的序列和具有多聚(CT)区域的序列所获得的序列也涵盖在本发明的范围内。

由组合具有多聚(CAA)区域的序列和具有一个或多个ACAATTAC八聚体拷贝的序列所获得的序列也涵盖在本发明的范围内。

此外，由组合具有多聚(CT)区域的序列和具有一个或多个ACAATTAC八聚体拷贝的序列所获得的序列也涵盖在本发明的范围内。

根据本发明，可以提供由组合具有多聚(CAA)区域的序列、具有多聚(CT)区域的序列和具有一个或多个ACAATTAC八聚体拷贝的序列所获得的序列。

此外，根据本发明，还可以提供这样的序列，其由一个或多个上述序列与CaMV 35S Inr位点组合获得，CaMV 35S Inr位点也就是花椰菜花叶病毒35S启动子的转录起始位点。

因此根据本发明的LL-TCK序列能够提高异源蛋白质在转基因植物中的表达水平。根据本发明的有利方案，合成了新的LL-TCK序列，从而根据独有的创新模式生成下列元件的组合：

(1)用于有效的mRNA加帽的CaMV 35S启动子的转录起始位点(Inr)；

(2)与存在于TMV前导序列Ω中的翻译增强子相似的多聚(CAA)区；

(3)像许多植物的前导序列那样，富含CT元件的序列。

此外，LL-TCK序列的长度超过40个核苷酸，以促进识别第一个AUG作为真正的翻译起始密码子(Kozak 1989)，且其G+C的总体含量少于40％。

根据本发明的具体方案，LL-TCK序列如SEQ ID NO：1(5’-3’)所示。

可以预见，小的突变并不会改变LL-TCK序列的效力，因此，本发明还涉及源自此序列的前导序列，例如经过CAA三联体的缺失或重复、单个碱基的取代或缺失等的序列。

LL-TCK序列的创新在于它在单个前导区中汇聚了修饰的多聚(CAA)元件、TMV前导序列Ω中的八聚体和植物来源的富含CT的序列。

因此，根据本发明有利方案的人工序列LL-TCK提供了单个的ACAATTAC八聚体，其与位于该八聚体5’端位置的9个CAA重复序列相连。

由于ACAATTAC元件中的ATT三联体可以表示非典型的翻译起始位点(Tyc等人，1984 Eur.J.Biochem.，140，503-511，Schmitz等人，1996Nucleic Acids Res.，24，257-263)，在LL-TCK前导序列中，这个三联体已被置于具有终止密码子的读码框内。

此外，在人工LL-TCK前导序列中，已将(CT)₄元件添加到由ACAATTAC八聚体和多聚(CAA)序列结合得到的调控元件的3’端。已知这两个元件各自都对基因表达有积极的影响，这两个元件的组合从未在自然界中发现过，之前也从未人工制造。

组合了这两个元件的LL-TCK前导序列使得相关基因的翻译水平和转录水平均得到增强。

用35S-LL-TCK::uidA(pSTART)和35S::uidA(具有原始前导序列的pBI121)构建体转化烟草植株(Nicotiana tabaccum)，通过对比从中获得的uidA基因的表达水平证实了这一效果。通过用LL-TCK替代pBI121(Clontech)中的前导序列获得pSTART载体。具体而言，替代和操作的对象是在Inr区域(ACACG)和限制位点Xba I(TCTAGA)之间所包含的pBI121序列。这两个构建体中uidA的起始翻译密码子侧翼的核苷酸序列保持不变，以防止AUG密码子识别的变异。

决定选择使用uidA基因编码的β-葡糖苷酸酶(GUS)作为报道蛋白，是由于烟草中没有可以观察的天然GUS样活性这一事实，且转基因uidA的表达水平可以通过荧光试验的方法(Jefferson等人，1987 EMBO J.，6，3901-3907)测量，其特点是具有相当高的敏感度、精度、速度和易于操作。

按Jefferson(1987)的描述，测量转化后的再生植株(T₁代植株)中关于GUS酶活性的荧光读数，该荧光读数显示与原始构建体相比，LL-TCK前导序列的存在导致uidA基因的表达水平有可观的提高(达15倍)。

方差分析确定了涉及的两种烟草群体(用pSTART和pBI121转化)之间所见的差异是统计上显著的，两个群体的最佳表达子之间也差异显著。

为了排除来自后生变异的影响，用由最佳的原代转化植株自交获得的T2子代植株重复该分析。在这种情况下，pSTART转化的植株显示的uidA基因表达水平也比pBI121转化的植株高得多。具体来说，以所有植株的整体考虑，所见的活性增加等于8.6倍，仅考虑高于平均的表达子的话，活性增加等于12.5倍。

为了测定LL-TCK对uidA基因转录的影响，挑选特点为GUS水平居中间的T₂代植株(pBI121的10株，pSTART的13株)，用实时RT-PCR的方法分析转录物水平。从各植株中提取的总RNA开始，合成在实时RT-PCR中作为模板使用的cDNA。使用两对引物(一对为uidA基因特异性的，一对用于18S RNA的内源基因)和SYBR-Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)。通过连续稀释对照质粒的方法绘制两条校准线(一条用于转基因，一条用于内源基因)，使正确定量成为可能。然后用检测到的转基因的mRNA量与相应的核糖体18S RNA的量之间的百分比率，计算各样品中uidA基因相对的转录水平。

这种分析可以证实，pSTART植株中uidA基因的平均转录物水平比pBI121植株中所见的高1.7倍。

对于7对特征在于转录物数值相似的pSTART和pBI121植株，计算TEI(翻译效率指数)。TEI等于GUS蛋白质的值(用荧光测定法测量)与相对标准化的mRNA值(通过实时RT-PCR测定)之间的比率。通过比较TEI，清楚地看到新的LL-TCK前导序列不仅影响mRNA水平，而且还导致mRNA翻译效率的增加。

LL-TCK序列通过作用于有关基因涉及的mRNA的含量水平、同时还作用于存在的蛋白质的最终数量水平这两者，使异源蛋白质的表达水平得以提高。

利用组成型CaMV 35S启动子和编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的uidA基因，在烟草中研究LL-TCK的影响，但结合其他启动子和其他基因，(LL-TCK)也可有其他应用。

尽管在本文报道的实施例中，LL-TCK前导序列与CaMV 35S启动子组合使用来增强烟草植株中uidA的表达，但所述前导序列也在烟草和马铃薯中于光诱导的rbcS1启动子(GenBank登录号AY163904)下游和在水稻中于胚乳特异性、相位依赖性的glub4启动子(GenBank登录号AY427571)下游成功使用。在这些实验中使用的基因为编码鼠BCL1抗体、人β-葡糖苷酶和合成的弹性蛋白样聚合物的基因。利用具有不同的长度、碱基组成和结构特点的不相关的基因进行实验，这些基因受具有不同转录活性的启动子控制，在双子叶植物和单子叶植物物种中均表达，由于在这些实验中没有功能性丧失的记录，可以说LL-TCK前导序列或类似组成的5’-UTR是通用的，也就是不局限于与某些启动子和/或编码序列的组合，且不限于某些宿主物种。因此，本发明的优选实施方案包含在一系列的生物技术应用中，其包含对生物/非生物胁迫和除草剂的抗性，生产生物燃料、生物塑料、合成的生物聚合物和工业酶，生物药剂(如抗体及其片段、疫苗、人类的酶、细胞因子和生长因子)的分子农业，改善粮食、饲料和纤维的质量，开发报道和标记基因系统。

此外，本发明的范围涵盖在植物表达载体中构建5’-UTR，其中同时存在有以下元件：CaMV 35S Inr位点、多聚(CAA)n、ACAATTAC八聚体、多聚(CT)n，其中n是大于或等于2的任何数。

如上所述的构成5’-UTR前导序列元件的所有可能的组合、或其相关的变体，无论它们5’-3’的相对位置如何，均涵盖在本发明的范围内。

此外，本发明还涉及如上所述序列的互补序列或相关变体。

依据变型，本发明的序列长度包括在20至200个核苷酸之间，优选为40至150个核苷酸之间。

依据变型，本发明的序列的G+C含量少于60％，优选少于50％。

本发明的范围还包括一个或多个扩增引物，其包括的核苷酸序列选自SEQ ID NO：2-7或者其互补序列。

根据本发明的另一实施方案，本发明的序列可以获得自：

a)人工合成；

b)天然或人工序列中天然或诱导的重组或突变方法。

本发明的一个特点还涉及使用一种或多种所述扩增引物人工合成上述序列的方法。

本领域内的技术人员可能发现、并视为不显著变体的天然5’-UTR前导序列，如果它们在功能上与本发明的序列相似，则也属于本发明的范围。

由本发明序列进行突变得到的序列，其产生了对技术人员来说不显著的变体，如果它们在功能上与本发明的序列相似，则也属于本发明的一部分；突变涉及本发明序列或其互补序列中一个或多个核苷酸的无论是缺失、插入、转换、颠换均可。

本发明还涉及携带含有本发明序列的质粒的菌株，特别是涉及物种大肠杆菌(Escherichia coli)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。

本发明还涉及含有本发明序列的工程菌株，不论宿主生物体的类型。

此外，用含有本发明序列、受组成型启动子控制的表达载体所转化的植物细胞，也在本发明的范围内。

本发明还涉及以下内容：

-用含有本发明序列、在组织特异性启动子尤其是种子特异性启动子的控制下的表达载体所转化的植物细胞；

-用含有本发明序列、在诱导型启动子的控制下的表达载体所转化的植物细胞；

-用含有本发明序列、在具有相位依赖性转录活性的启动子的控制下的表达载体所转化的植物细胞；

-用含有本发明序列、在叶绿体内具有活性的启动子的控制下的表达载体所转化的植物细胞；

-用含有本发明序列、在线粒体内具有活性的启动子的控制下的表达载体所转化的植物细胞。

本发明还包括这样的植物，其特征在于瞬时表达信使RNA含有本发明序列的任何蛋白，瞬时表达意味着通过病毒载体、农杆菌浸润(agroinfiltration)、电穿孔、基因枪(particle delivery)的方法生产所述蛋白。

本发明还涉及双子叶植物，特别涉及但并不限于属于茄科(Solanaceae)、蝶形花科(Papilonaceae)和十字花科(Cruciferae)的物种，其用含有本发明序列的表达载体稳定转化，并且还涉及所述双子叶植物的子代。

本发明还涉及单子叶植物，特别涉及但并不限于属于禾本科(Graminaceae)(禾本科(Poaceae))的物种，其用含有本发明序列的表达载体转化，并且还涉及所述单子叶植物的子代。

本发明有着有利的工业用途，因为它也涉及将发明的序列用于下列行为中的任意一个：

-以生物技术生产分子；

-合成重组蛋白；

-合成重组蛋白，以诱导对病毒、细菌或真菌病原体的抗性；

-合成重组蛋白，以诱导对除草剂的抗性；

-合成重组蛋白，以使原料和由其得到的产品中脂肪酸的组成得到改变；

-合成重组蛋白，以使原料和由其得到的产品的营养价值得到改变；

-合成重组蛋白，以生产燃料、橡胶和生物塑料；

-合成工业酶和商业蛋白质；

-合成药物蛋白质；

-合成用于人和动物的口服疫苗；

-合成用于人和动物的注射疫苗；

-合成患者特异性注射疫苗，优选为个体基因型特异性，用于治疗淋巴系统的肿瘤；

-合成参与次生代谢物生产的蛋白质；

-合成直接或间接作为因子鉴定和/或选择转化细胞的蛋白质。

附图简述

下面对一些优选实施方案的描述，将使本发明的这些以及其他特点变得显见，所述优选实施方案作为非限制性实例给出，并参考附图，其中：

图1、比较pBI121和pSTART中的前导序列，其中转录起始位点用下划线标出。由于在pSTART和pBI121中，Eco RV位点和转录起始位点之间、Xba I位点和uidA的ATG三联体之间的序列是相同的，已将其部分省略(圆点)；

图2、显示了转基因植株T₁代中β-葡糖苷酸酶(GUS)的表达水平；

图3、显示了转基因植株T₂代中β-葡糖苷酸酶(GUS)的表达水平；植株被分为四组，各代表从最佳T₁代转化体继代的姊妹株。最小显著差异(P＝0.01)＝4.7U/mg总蛋白质；

图4a、显示在用pSTART和pBI121(转化)得到、以β-葡糖苷酸酶的表达水平居中间为特征的T₂代植株中，uidA(gusA)的相对转录物水平，该水平由实时RT-PCR测定。鉴定了七对具有相似的转录物水平的植株；

图4b、显示了具有相似的转录物水平的T₂代植株的翻译效率指数(TEI)的值。TEI计算方式如下：对于各转化体，用β-葡糖苷酸酶(GUS)的浓度[U/mg总蛋白质]除以相对标准化的mRNA水平；最高的TEI视为等于1.00，相应地表达记录的各转化植株的值；

图5、为通过递归式PCR方法合成LL-TCK所用反向和正向引物的重叠的图解。

发明详述

A)SEQ ID NO：1所示的人工前导序列LL-TCK的合成：

A.1)利用市售可得的专门服务，LL-TCK序列或具有相似组成的5’-UTR的合成能够最方便地通过人工合成而完成。由于序列的长度有限，在前导序列的每一侧添加侧翼区是尤其有用的，该侧翼区以启动子序列中已存在的限制性位点(5’侧翼区)和编码序列(3’侧翼区)结束。对本行业内的技术人员显见，除非同时计划修饰启动子和/或编码序列，这些侧翼区将分别精确复制起始位点(Inr)的上游序列和编码序列。

A.2)获得所述前导序列的另一方法是递归式PCR(Podromou和Pearl1992 Protein Eng.，5，827-829，Wheeler等人，1996 Gene，169，251-255，Prytulla等人，1996 FEBS Letters，399，283-289)。

一旦用任一方法获得了LL-TCK序列或具有相似组成的5’-UTR，则通过PCR或任何其他用于随机或者原位诱变的方法均可以很容易地生产前导序列的变体。

在此实施例中报道了对用递归式PCR的方法合成LL-TCK将其插入pBI121(GenBank登录号AF485783)的描述，特别是将其插入CaMV 35S启动子和uidA编码序列之间。

用5种合成的寡核苷酸作为引物，其长度在42和54个核苷酸之间，部分重叠度等于24个核苷酸，以及19个核苷酸的末端反向引物，分别显示在SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的序列中。

所有的引物是以5’-3’的方向书写的。序列SEQ ID NO：2、4、6是正向引物，而序列SEQ ID NO：3、5和7是反向引物。正向和反向引物如图5所示彼此重叠。

为了便于操作以及将LL-TCK序列插入相关的载体序列中，将以EcoRV位点起始的末端部分添加到5’端，同时将单个Xba I位点添加到3’边缘。

因此，引物的设计使35S启动子(从Eco RV位点到Inr区)3’末端部分重组，以便随后插入载体pBI121(Clontech)中。

外部反向引物在3’末端引入Xba I位点，而在5’端使用Eco RV位点。

在pBI121中，这些位点分别位于CaMV 35S启动子内部和接近uidA翻译起始信号。因此，为合成提供期望的序列和克隆以代替[Eco RV-Xba I]片段。

设计并制造了包含SEQ ID NO：2-7所示的核苷酸序列的引物，以确定处于Eco RV位点和CaMV 35S起始位点之间的区域的启动子序列，从而合成LL-TCK前导序列，并为3’末端提供分子挂钩(molecular hook)以供克隆。

LL-TCK的合成用单个PCR完成，所使用的PCR反应混合物中外部引物SEQ ID NO：2和7(对应合成片段的两端)的浓度比内部引物SEQ IDNO：3、4、5和6高100倍。

为了使DNA合成实现更高的保真度，将校正DNA聚合酶与浓度减少了50％的dNTP结合使用。

PCR反应混合物如下：

含有15mM Mg²⁺的10X Pfu缓冲液：10μL

引物SEQ ID NO：2[10μM]：2μL

引物SEQ ID NO：3[0.1μM]：2μL

引物SEQ ID NO：4[0.1μM]：2μL

引物SEQ ID NO：5[0.1μM]：2μL

引物SEQ ID NO：6[0.1μM]：2μL

引物SEQ ID NO：7[10μM]：2μL

Pfu DNA聚合酶[3U/μL]：0.8μL

dNTP[各2.5mM]：4μL

加水至终体积100μL。

特别地，对于DNA合成和扩增，使用Taq聚合酶Pfu(Promega)和如下循环：1×(95℃进行5分钟)；40×(95℃进行15秒；48℃进行30秒；72℃进行20秒)；1×(72℃进行7分钟)。

PCR产物用乙醇沉淀法进行纯化，用处于TAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶进行电泳，使用商业试剂盒从凝胶中回收，用AmpliTaq Gold^TM加A尾巴，并连入-T(Promega)进行双链测序。

用连接混合物转化大肠杆菌感受态细胞JM101菌株。通过双链测序验证了克隆序列和设计序列之间没有任何错配。

B)含有LL-TCK序列的植物表达载体的构建。

给LL-TCK序列或具有相似组成的5’-UTR添加侧翼区或分子挂钩，可为不同类型的表达载体提供广泛的克隆方案。在此实施例中，描述了克隆实施例1中的[Eco RV-Xba I]片段以取代pBI121(GenBank登录号AF485783)的[Eco RV-Xba I]片段所使用的方法。由于pBI121除了在CaMV 35S启动子内部之外还有多个Eco RV位点，利用限制性内切酶Hind III和Xba I将该启动子从pBI121(Clontech)中切除(Jefferson等人，1987)。

将片段从处于TAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶中回收，并亚克隆到经相同的酶消化的pUC18中(Pharmacia，GenBank登录号L08752)。

如我们所说，此过渡是必要的，因为pBI121有多个Eco RV位点。用得到的pUC18/35S载体制备35S启动子-LL-TCK前导序列的新组合。

通过用Eco RV和Xba I(NEB)消化的方法从pGEM-T载体切除LL-TCK序列，通过琼脂糖凝胶电泳与载体序列分离，然后使用商业试剂盒从凝胶中回收。接下来用同样的酶消化pUC18/35S载体，经过碱性磷酸酶(Pharmacia)处理，进行如上的电泳并从凝胶中回收。然后在T4 DNA连接酶(Promega)存在下在4℃进行16个小时的连接反应。具体是，在10μL体积中含有适当的反应缓冲液，在1U的T4DNA连接酶存在下，用3.5ng[Eco RV-Xba I]片段与25ng载体结合。

用Xba I和Hind III(NEB)消化pBI121载体(Clontech)，以移除CaMV 35S启动子。接下来用同样的酶消化pUC18克隆载体，从中切除35S-LL-TCK复合体；对pBI121载体框和35S-LL-TCK插入片段进行电泳并如上从凝胶中回收。最后，将35S-LL-TCK连接入pBI121构架中，获得载体pBI121/35S-LL-TCK::uidA::NOS，其被命名为pSTART(图1)。

C)用含有LL-TCK序列的表达载体转化植物。

含有LL-TCK序列或具有相似组成的5’-UTR的转基因植物可以通过一系列方法产生，其包含与农杆菌属(Agrobacterium spp.)工程菌株共感染、用植物病毒(phytovirus)工程株感染或转染、电穿孔、基因枪、DNA显微注射。

pSTART表达载体通过电穿孔进入根癌农杆菌EHA 105菌株中，将转化的农杆菌细胞用于珊西烟(Nicotiana tabacum L.，cv.Xanthi)转化。简言之，用转化的农杆菌细胞接种补加了卡那霉素(50mg/L)的2ml LB培养基。细菌培养物在29℃孵育16个小时。用木栓穿孔器从无菌生长、30天大的幼苗上或者从采集自处于莲座后期(late-rosette stage)植株的成熟叶片上取得叶盘(直径7毫米)。在后一种情况下，将烟草叶片用蒸馏水清洗，用1％的次氯酸钠表面消毒5分钟，再用95％乙醇消毒30秒，在层流罩超静台中用无菌滤纸吸干。

将叶盘置于培养皿中，培养皿中含有15mL的MS(Murashige和Skoog)培养基，其中补加0.1mg/L萘乙酸(NAA)、1mg/L 6-苄基腺嘌呤(BA)、30g/L蔗糖，并用8g/L琼脂固化。此转移之后，立即将2ml上述农杆菌培养物倒入培养皿，使叶盘均匀浸湿。移除多余的LB培养基后，密封培养皿，在25℃见光(30.5μE/m²/sec)孵育24小时。

然后将叶盘转移到新的培养皿中，培养皿中含有15mL的MS培养基，其中补加0.1mg/L的萘乙酸(NAA)、1mg/L的6-苄基腺嘌呤(BA)、500mg/L的头孢噻肟、30g/L蔗糖，并用8g/L琼脂固化。将其在28℃孵育一周，光照16小时/天；最后将其转移到同前面一样、但具有200mg/L的卡那霉素的底物中。外植体每3周进行继代培养；将再生苗从愈伤组织中分离出来，在半固体MS培养基上生根培养，培养基中补加2mg/L的吲哚-3-丁酸、500mg/L的头孢噻肟、200mg/L的卡那霉素，30g/L蔗糖。

将假定的转基因植物用泥炭盆栽，在温室中生长，在Powerstar HQI-T灯(Osram)(于株冠水平，200mM光子/m²/sec)下光照16小时/天，光照/黑暗温度分别是25℃和19℃。

在此实施例中，用PCR和β-葡糖苷酸酶测定法证实转化。对于PCR测定，根据Doyle和Doyle(1990)提取总DNA，使用下列引物：

正向5’-ACAATTACGTATTTCTCTCTCTAGA-3’

反向5’-CGATCGGGGAAATTCGAGCTC-3’

正向和反向引物分别退火至LL-TCK序列末端和部分NOS终止子，且在非转化的珊西烟(Xanthi)植株中不产生任何扩增产物(转基因植物中的扩增子长度如预期一样，为1936bp)。

当形成标准的反应混合物并使用如下循环温度时，发现约93％的再生植株为转基因植株：

1×(94℃进行5分钟)；40×(94℃进行1分15秒；60℃进行45秒；72℃进行2分钟)，1×(72℃进行5分钟)。

GUS组织化学测定(Jefferson等人，1987)和GUS活性的荧光测定进一步证明了植物转化。对照包括由未感染的叶盘体外培养的珊西烟植株。用于荧光检测的方法和获得的结果在D部分详细报道。

遵循同样的程序生产和表征含有原始前导序列的转基因植物。其它条件相同时，未发现再生和转化率受到LL-TCK影响。

D)LL-TCK序列对转基因表达水平的影响。

如前所述，分别将质粒pBI121和pSTART用于农杆菌介导的烟草叶盘转化。因为在这两种情况下，受控基因都是uidA(也称为gusA)，用LL-TCK和广泛分布的pBI121前导序列可达到的转基因表达水平可以通过测定uidA编码的酶(β-葡糖苷酸酶(EC 3.2.1.31))的活性而直接进行对比。各群体中取约20个原代转化体(即属于第一代T₁的转基因植物)，用PCR测定转基因的存在，随后分析β-葡糖苷酸酶的活性(图2)。当到达莲座后期(炼苗(hardening)30天)，从每株植物上采集3片最嫩的叶片，通过压榨(Erich)获得原液；将100μL的原液与含有12mg的高分子量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的二倍体积的提取缓冲液(Jefferson 1989)混合。11,500×g下离心15分钟后，收集上清，用4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷酸(MUG；Sigma-Aldrich)作为底物，一式两份进行荧光分析(Dyna Quant 200荧光计；GE Healthcare)。通过试验确定了由于样品的固有荧光、猝灭、以及重组酶以外的因子引发的底物降解所产生的背景噪音。转基因表达水平是通过每毫升原液的β-葡糖苷酸酶单位数衡量的，定义一个单位为使用与前述相同的测定条件(Jefferson1989)，每分钟释放1nM 4-甲基伞形酮(4-MU)的酶的量。为了避免方差与均值间的任何相关，对数据进行对数转换；用Kolmogorov-Smirnov检验检查对数数据分布的正态性、并用Bartlett公式进行方差同质性检验后，进行方差分析。用Duncan多重范围检验于概率水准P＝0.05对比平均值。

对荧光数据进行的方差分析显示，同一植株的嫩叶之间不存在任何显著变化，而植株之间存在着显著差异。明确地，合成的前导序列决定了uidA表达的高度显著的增长(达15倍)(表1)。

表1：随机选择的T₁代植物中β-葡糖苷酸酶的活性(U/ml原液)

  pSTART  pBI121  96.10  6.24  89.81  5.37  67.06  5.34  57.89  4.52

  33.16  4.20  27.62  3.55  15.97  2.95  4.24  2.89  3.51  2.79  1.85  2.34  1.64  2.30  1.46  1.62  1.21  1.17  0.77  1.12  0.64  0.75  0.46  0.47  0.38  0.23  0.15

为了证明这些结果不因为后生变异而产生偏差，用T₂子代重复了分析。特别地，每个群体中最好的4个T₁代植株自交，产生的种子接种在富含卡那霉素的培养基上进行筛选；在各子代中随机挑选5-7株T₂代抗性植株，并培养至莲座后期，用PCR和通过荧光测定法测量β-葡糖苷酸酶的活性来证实转基因的存在；酶水平再次用“单位/mL原液”表示，还用“单位/mg总蛋白质”(由Bradford法确定)表示，以报偿新陈代谢中植株与植株之间的差异。

与在T₁代观察到的一样，含有新的前导序列的转基因T₂代植物显示显著更高的uidA表达水平(图3)；与pBI121前导序列相比，以整个植物群体或高于平均水平的表达子计，估计活性分别增加8.6倍和12.5倍(表2)。

表2：从最好的4个T₁代植株获得的T₂代植株中β-葡糖苷酸酶的活性(U/mg蛋白质)

  pSTART  pBI121  139.07  789  71.27  5.17

  45.43  4.44  44.81  3.96  41.67  3.94  32.92  3.78  29.81  3.77  19.79  3.58  18.04  3.55  16.40  3.23  15.10  3.15  13.55  3.09  12.84  2.94  12.32  2.62  10.78  2.45  10.02  1.71  9.00  1.28  8.50  1.22  6.98  1.14  6.57  0.64  5.39  0.52  5.16  0.46  5.01  0.44  3.17  0.31

E)LL-TCK序列对基因转录和翻译的影响

LL-TCK或具有相似组成的5’-UTR中不同元件的组合，反映了给定的转基因的转录和翻译效率的可测量的改进。在此实施例中，如前面所描述，在用pBI121和pSTART获得的转基因T₂代烟草植株中显示了这样的改进。为了采集这样的证据，分析属于pBI121或pSTART组(分别为10和13株T₂代)、并以特点为uidA表达水平居中间的植株以测定：

i.uidA的平均转录物水平；

ii.18S RNA的平均转录物水平；

iii.实际生产的β-葡糖苷酸酶的量。

为了最小化实验误差，从各植株上取一嫩叶并将其切为两半，一半用于RNA分离，另一半用于β-葡糖苷酸酶测定。

用RNAgents总RNA分离系统(RNAgents Total RNA IsolationSystem)(Promega)提取总RNA。在随机引物存在下，用AMV反转录酶(Promega)由1μg RNA合成cDNA第一链。以1∶5稀释cDNA的合成反应物，取1μl用于实时PCR(qRT-PCR)。

qR-PCR用SYBR-Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)进行，各特异性引物终浓度为0.3μM。所有反应均用iCycler iQ多色实时PCR检测系统(Bio-Rad)进行，运行以下程序：1×(95℃进行10分钟)；50×(95℃进行15秒；62℃进行30秒；72℃进行30秒)。为了扩增uidA转录物，使用以下引物：

正向5’-TTACGCTGAAGAGATGCTCGAC-3’

反向5’-CCTAAAGAGAGGTTAAAGCCGACAG-3’

对于18S RNA靶序列，引物设计以GenBank登录号AJ236016为基础：

正向5’-ACATCCAAGGAAGGCAGCAG-3’

反向5’-GACTCATAGAGCCCGGTATTGTTATT-3’

在两种情况下，扩增子长度均为90bp。各个PCR反应中，其包含对照质粒的系列稀释，同时包括已知数量的进料拷贝数，以画出标准校准曲线。特别地，使用含有uidA的pBI221质粒的10倍系列稀释(从10⁵到10²拷贝)作为模板。为同样的目的，将18S RNA基因(AJ236016)的550bp的片段克隆进pGEM-T Easy(Promega)，并以10⁸-10⁵拷贝的范围使用。

uidA转录物和对照RNA的起始数量用ICycler IQ实时检测系统软件3.0版本测定。对于各个样品，至少进行3次独立的评价；在所有情况下，变异系数(VC＝SD/平均值)的最大值固定于20％。计算各样品uidA和18S RNA的平均转录物水平之间的的百分比率(％ratio)。为使数据标准化，最高的uidA转录物水平视为等于1.00，并据此表达记录的各转基因植株的值。

qRT-PCR得到的结果表明，LL-TCK取代pBI121前导序列使uidA平均转录物水平明显增加。特别地，发现含有LL-TCK前导序列的植株的转录效率高1.7倍(表3)。

表3：若干T₂代植株中uidA和18S转录物之间的百分比率(％ratio)

  pSTART  pBI121  0.01371％  0.00881％  0.01189％  0.00832％  0.01132％  0.00761％  0.00968％  0.00437％  0.00960％  0.00315％  0.00896％  0.00308％  0.00578％  0.00282％  0.00556％  0.00234％  0.00425％  0.00225％  0.00315％  0.00158％  0.00272％  0.00072％  0.00201％  0.00189％

此外，鉴定了7对具有近乎重叠的uidA转录物水平的植株(图4a)之后，确定各植株的翻译效率指数(TEI)(图4b)，计算β-葡糖苷酸酶的浓度和uidA转录物相对标准化水平之间的比率。通过比较TEI值，发现两个前导序列所决定的uidA转录物的翻译效率明显不同，使用本发明的前导序列则效率更高(表4)。

表4：在一些T₂代植株中测量的GUS酶活性和uidA基因相对转录水平的比率

序列表

<110>乌迪内大学

<120>具有优化的5’端前导功能(5’-UTR)的人工DNA序列用以改进异源蛋白质在植物内的表达

<130>T3-2288

<150>IT UD2006A0000280

<151>2006-12-29

<160>7

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>73

<212>DNA

<213>人工

<220>5’UTR

<223>异源蛋白质在植物内改进的表达

<400>1

acacgtattt ttacaacaat accaacaaca acaacaacaa acaacattac aattacgtat     60

ttctctctct aga                                                        73

<210>2

<211>54

<212>DNA

<213>人工

<220>引物_结合

<223>通过递归式PCR进行人工合成的正向引物元件

<400>2

gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca agac           54

<210>3

<211>54

<212>DNA

<213>人工

<220>引物_结合

<223>通过递归式PCR进行人工合成的反向引物元件

<400>3

atgaaatgaa cttccttata tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attg           54

<210>4

<211>53

<212>DNA

<213>人工

<220>引物_结合

<223>通过递归式PCR进行人工合成的正向引物元件

<400>4

tctatataag gaagttcatt tcatttggag agaacacgta tttttacaac aat             53

<210>5

<211>52

<212>DNA

<213>人工

<220>引物_结合

<223>通过递归式PCR进行人工合成的反向引物元件

<400>5

taatgttgtt tgttgttgtt gttgttggta ttgttgtaaa aatacgtgtt ct              52

<210>6

<211>53

<212>DNA

<213>人工

<220>引物_结合

<223>通过递归式PCR进行人工合成的正向引物元件

<400>6

aacaacaaca acaaacaaca ttacaattac gtatttctct ctctagagga tcc             53

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>引物_结合

<223>通过递归式PCR进行人工合成的反向引物元件

<400>7

cacccgggga tcctctaga                                                   19