O－乙酰化形式GD2神经节苷酯特异性的单克隆抗体用于治疗一些癌症的用途

摘要

本发明涉及使用仅识别O－乙酰化形式GD2神经节苷酯的单克隆抗体或所述抗体的片段用于癌症的诊断和治疗的用途，在所述癌症中细胞表达O－乙酰化GD2，所述抗体或所述片段识别由所述肿瘤细胞表达的O－乙酰化GD2分子并且不识别外周神经表面表达的GD2分子，从而增加诊断的特异性并且降低治疗的毒性。本发明还涉及人工修饰的抗体，该抗体可有利地用于治疗和诊断其中的细胞表达O－乙酰化GD2的癌症。

说明书

发明领域

本发明提供使用表达O-乙酰化形式的GD2神经节苷酯的细胞用于癌症 的诊断和治疗的新方法。这些方法基本上包括使用识别O-乙酰化GD2且不 识别健康细胞(sound cells)和外周神经系统(peripheral nervous system)的神经 纤维的重组单克隆抗体或其片段。这些新方法将对癌细胞更具特异性，并且 与先前使用的治疗这些癌症的抗体和衍生物相比会降低治疗的毒性。

现有技术

肿瘤细胞在它们的表面上具有许多抗原决定簇。在这些抗原决定簇中， 一些是肿瘤特异性的抗原。这些肿瘤抗原主要在癌细胞表面表达，或者甚至 只在癌细胞表面表达。

这些人肿瘤抗原通过不同物种如小鼠等的免疫系统诱导被称为抗体的 分子的产生，抗体的特征在于特异性识别它们所源自的抗原分子。

这种单克隆抗体和它的人肿瘤抗原之间的特异性识别对于癌症免疫寻 靶尤其有利。事实上，这使得用于诊断的检测剂或用于治疗肿瘤的毒剂在患 病组织或器官上浓缩成为可能。这些检测剂或毒剂可以任选地包括在抗体施 用之前或之后与抗体人工连接的放射性化合物、化学化合物或生物学化合 物。这些试剂(agent)也可以是通过抗体募集至肿瘤细胞的天然存在于患者体 内的生物学化合物(补体、趋化因子、细胞因子、细胞毒性细胞的组分，例 如T或NK淋巴细胞)。

神经节苷酯是细胞膜的成分，其中一些神经节苷酯已经被表征为肿瘤抗 原。能够证明GD2神经节苷酯在神经外胚层来源的人患癌症中高表达，所 述癌症诸如特别是黑素瘤(melanoma)、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、小细胞 肺癌(small cell lung carcinoma)和成神经细胞瘤(neuroblastoma)。上述肿瘤病 理学的列举并非穷举。成视网膜细胞瘤(retinoblastoma)和骨肉瘤 (osteosarcoma)也表达GD2神经节苷酯。一些卵巢癌也表达GD2神经节苷酯。 GD2神经节苷酯是一种由神经酰胺与寡糖组合形成糖脂酸(glycolipid acid)， 所述寡糖具有葡萄糖半乳糖N-乙酰-半乳糖胺序列。与半乳糖分子连接的是 两个唾液酸分子。可以通过添加O-乙酰部分来修饰末端的唾液酸以产生O- 乙酰化GD2。依靠GD2特异性抗体(该抗体也识别GD2的O-乙酰化形式) 可以显示特定类型的癌症(特别是神经外胚层来源的癌症)以不同的比例表达 GD2及其O-乙酰化形式O-乙酰化GD2。

已经描述了在小鼠中产生的几种单克隆抗-GD2抗体。分别属于IgG2a 和IgG3小鼠免疫球蛋白的抗-GD2单克隆抗体14.G2a和3F8的治疗用途已 经在临床研究中进行了试验。

这些研究已经强调了小鼠单克隆抗体本身固有的几种不良副作用。

这些不良反应之一是变应性或过敏性反应，这可能归因于人对小鼠抗体 产生的免疫应答。

为了解决在小鼠中产生的单克隆抗体的这种免疫原性问题，可以使用遗 传工程技术来制备嵌合抗体。“嵌合”抗体指经遗传修饰的抗体，其中由人 抗体的相应部分来取代编码小鼠抗体的遗传信息中重要性不等(more or less important)的部分。通常，鼠抗体(murine antibody)的重链和轻链的可变区(V_H和V_L)是保守的，而抗体分子的剩余部分源自人抗体。这些嵌合抗体保留了 小鼠单克隆抗体固有的对肿瘤抗原的特异性识别，同时具有人抗体固有的物 理性质和效应物性质。因此，临床研究已经证明了嵌合抗体ch.14G2a和 ch.14.18与它们所源自的小鼠单克隆抗体相比展现降低的免疫原性和增加的 血清半衰期。另外，还证明了在将小鼠抗-GD2单克隆抗体嵌合化时，它们 展现增加的募集人效应细胞的能力，而小鼠抗体仅具有有限的募集这些人效 应细胞的能力。

使鼠抗体对人抗体具有同一性(L′identification des anticorps murins aux anticorps humains)可以进一步通过仅保留所谓的CDR区或“互补决定区”中 的鼠抗体氨基酸来进行，CDR区或“互补决定区”包含抗原附着位点并且 因此确定抗体特异性。“人源化”抗体意指经遗传修饰的抗体，其中仅保留 起始小鼠抗体的CDR氨基酸以及任选地接近这些CDR区的少数氨基酸，并 且其中所述分子的剩余部分源自人抗体。

现有技术的缺陷

对于单克隆抗体的体内治疗或诊断用途，单克隆抗体必须满足特定特异 性、亲和力和非毒性的要求。然而，对抗-GD2单克隆抗体和抗GD2嵌合抗 体进行的临床研究证明了一种主要的不良副作用，该副作用不能通过嵌合化 或人源化来解决，且为抗-GD2抗体神经毒性。事实上，施用以抗-GD2抗体 的患有神经外胚层来源癌症的患者在抗体的施用过程中遭受了疼痛，并且这 些患者中的一些患上了(developed)外周神经系统神经病。对这些结果的解释 是外周系统的神经纤维细胞表面上GD2神经节苷酯的存在。

因此显然的是，抗-GD2抗体的使用中所固有的这种神经毒性限制了以 这些抗体进行的免疫治疗的临床开发。而GD2抗原靶的巨大数量仍是用于 免疫靶向神经外胚层来源癌症的一个有重要价值的因素。

一种方法应该有助于解决神经毒性问题，这种方法将使用这样一种抗 体，该抗体识别不同于GD2神经节苷酯的与神经外胚层来源癌症相关的肿 瘤抗原，并且不识别外周神经纤维。

几年前，发明人进行了一系列小鼠免疫，以产生抗-GD2抗体。由此得以分 离了几种抗-GD2抗体，并且对它们的表征具体导致鉴定出一种属于小鼠IgG3 类、命名为8B6的抗体，所述抗体特异性识别因O-乙酰部分的存在而轻度修饰 的GD2神经节苷酯分子。这项工作，尤其是这种8B6抗体在文章《Variable Region Gene Segments of Nine Monoclonal Antibodies Specific to Disialoganglisosides (GD2，GD3)and their O-Acetylated Derivatives》，Cerato等，Hybridoma Volume 16， Number 4，1997，307-316中描述，将其通过提述并入本文。

检查了这种抗体的结构，但是没有进一步对其进行开发。事实上，与已 知的抗-GD2抗体相比，后来对这种新抗体似乎没有特别的兴趣。与GD2的 非乙酰化形式相反，O-乙酰化GD2在人体内的组织分布问题尚未得到充分 的证明，原因是缺乏灵敏的检测方法，诸如依赖于使用乙酰化形式GD2特 异性的单克隆抗体的方法。因而预期这种新抗体的临床应用很可能引起与使 用抗GD2单克隆抗体相同的神经毒性问题。另外，尚未证明8B6抗体的细 胞毒活性(cytotoxic activity)，并且IgG3抗体由于它们团聚的趋势(tendency to agglomerate)而不易操作。

发明目的

不识别GD2神经节苷酯的O-乙酰化GD2神经节苷酯特异性单克隆抗体 可具有不识别外周神经纤维的优势，并且因此不引起神经毒性。因此这样的 抗体与抗GD2单克隆抗体相比，在免疫靶向表达O-乙酰化形式的GD2神经 节苷酯的特定癌症类型(诸如神经外胚层来源的人患癌症)中可具有显著优势。

这样的抗体可以通过本领域技术人员已知的多种技术获得。这些技术中 的一些包括第一免疫动物，特别是啮齿类动物包括小鼠、大鼠或仓鼠，兔形 目动物(lagomorph)包括家兔，camelidae，包括美洲驼(lama)。免疫原性物质， 即含有抗原(针对该抗原产生抗体)的制备物，可以是糖脂本身，无论是纯化 的或是包含在粗制或部分纯化的混合物中；或者是所述糖脂或它的一个部 分，特别是糖基化的亲水部分，任选地与作为“载体(carrier)”的蛋白质或脂 质共价偶联以刺激免疫应答。在另一免疫方法中，免疫原性物质可以从表达 抗原的细胞制备，所述细胞通过对肿瘤细胞系或从肿瘤样品获得的原代细胞 进行细胞培养获得。有用的细胞系具体包括动物细胞系，如鼠类(murine)或 人EL-4胸腺瘤(thymoma)，例如人IMR32成神经细胞瘤、人U87MG成胶质 细胞瘤、HCI-H82小细胞肺癌和人M21黑素瘤。然后可以将这些细胞作为 完整的、活的或固定的细胞施用，或者可以进行分级(fractionate)从而仅注射 例如含有细胞膜或胞质组分的部分纯化的级分。

这些免疫原性物质可以通过多种途径向动物施用，特别是皮下、腹膜内 或肌内，单独施用或者在佐剂的存在下施用，所述佐剂特别是明矾或弗氏佐 剂。可以按照几天至几个月的频率重复免疫。

三种常规方法可以提供能够在工业应用中使用的抗体。第一种包括从免 疫动物取得血样和使用本领域技术人员已知的方法从血样提取含有或多或 少纯化的抗体的级分(血清或血浆，总免疫球蛋白(total immunoglobulins))。 抗体可以通过层析技术或免疫吸附进一步纯化。第二种方法包括采样能够合 成抗体的细胞，包括脾细胞或淋巴结细胞；和使它们无限增殖化，特别是根 据本领域技术人员已知的方法通过病毒转化或通过体细胞杂交进行。在所述 无限增殖的细胞中，进行克隆可提供对产生感兴趣抗体的细胞的筛选，并且 细胞培养使得大量地从培养物上清分离这些抗体并纯化它们成为可能。最后 的第三种方法包括从能够合成抗体的细胞分离RNA，特别是采样自动物的 脾细胞、淋巴结细胞或外周淋巴细胞，无论是否为无限增殖的细胞，或者甚 至是来自人的细胞；和汇编cDNA文库，从所述文库中将根据本领域技术人 员已知的方法通过筛选选择感兴趣的抗体序列，并且特别是通过将这种文库 在噬菌体表面表达来进行，其也称为噬菌体展示表达系统。将在丝状噬菌体 表面表达(“噬菌体展示”)的人VH和VL区的组合文库构建成“单链”片 段的形式(“单链Fv”，scFv)，其中将VH区与VL区连接；或构建成F(ab) 片段的形式，所述F(ab)片段由与VH-CH1肽区段相连(associée)的轻链组成， 所述VH-CH1肽区段对应于恒定区的第一结构域。

本发明的抗体可以从通过上述任一方法获得的抗体中选择，因为(in that) 它们识别O-乙酰化GD2抗原并且不识别非-O-乙酰化GD2抗原，这种性质 将被指定为所需特异性。这种选择可以在抗体分离过程中进行，例如通过仅 使具有所需特异性的产抗体细胞增殖来进行。或者，也可以在已经分离的抗 体中进行搜索，以选择具有这种特异性的那些抗体。为了这个目的，可以使 用多种方法，特别是对细胞进行间接免疫荧光法，其用于将识别已知表达 O-乙酰化GD2的细胞(特别是IMR32)的抗体与同样识别表达GD2但是不表 达O-乙酰化GD2的细胞(特别是Neuro 2A)的抗体区分开。也可以对干燥的 细胞使用ELISA酶联免疫测定来选择仅与表达O-乙酰化GD2的细胞结合并 且不与仅表达GD2的那些细胞结合的抗体。也可以使用硅薄层层析(silica thin layer chromatography)分离同时表达O-乙酰化GD2和GD2的细胞(特别 是IMR32)的糖脂组分，通过仅保留只标记对应于O-乙酰化GD2的条带的抗 体，来选择具有所需特异性的抗体。也可以通过藉由碱处理破坏脂质提取物 中的O-乙酰化GD2并且通过检查所述标记的有效消除确认这种结果。这些 用于确认本发明抗体的特异性的技术的实施实例在下文本发明的详述中给 出。用于相同目的的其它方法可以由本领域技术人员开发。

本发明的抗体可以通过本领域技术人员已知的多种技术修饰以适合于 各种应用。因此可以使用现有技术已知的方法产生单链scFv抗体以及保留 结合抗原能力的多种融合蛋白。特别已知的是完整修饰所谓的抗体恒定区， 例如将鼠恒定区与来自人抗体的恒定区交换，并且不损失对抗原的识别。嵌 合抗体的构建包括分离编码小鼠单克隆抗体VH区和VL区的DNA并且将 它与编码人免疫球蛋白恒定区H和L的DNA结合。这样的遗传构建提供一 种人杂合抗体，该抗体的恒定部分在人体内完全没有免疫原性或者免疫原性 非常低(概括而言，人IgG1的恒定区和人Cκ区)。还已知仅保留抗原识别所 必需的区，即所谓的超变区、互补决定区或CDR，并且替换全部其它部分 从而进行称作抗体的“人源化”的过程。所得的这些蛋白质的混合物将定名 为术语“人工修饰的抗体”以便于描述。

对于本发明的抗体来说，这些蛋白质中的一些是特别感兴趣的(certaines de ces protéines ont unparticulier pour les anticorps de la présente invention)。例如，保留对O-乙酰化GD2神经节苷酯的识别而不识别GD2神 经节苷酯的人工修饰的O-乙酰化抗-GD2抗体与小鼠O-乙酰化抗GD2单克隆 抗体相比可具有显著优势，因为前者将具有卓越的物理特征和效应器特征。

O-乙酰化GD2特异性的人工修饰抗体应该对相应抗原具有充分的亲和 力，从而尽可能地防止这种抗体的扩散，防止任意地携带毒性或治疗性物质 进入健康组织或细胞。在本发明的范围内，对GD2神经节苷酯的亲和力应 该高于10^-7摩尔/升(mol/liter)。这些抗体的亲和力可以通过本领域技术人员 已知的技术增加。因此，在噬菌体表面进行抗体片段的表达构成了从提供的 scFv搜索高亲和力突变体的有价值的工具。因此可以模仿在产生免疫应答的 过程中观察到的亲和力成熟。已经由此成功地使用了随机突变或靶向突变继 之以通过免疫吸附/洗脱的重复循环来进行选择的技术，并且已经提供了亲和 力几乎10倍于初始片段的亲和力的抗体片段。

本发明的一个具体目的涉及从已知展现所需特异性的8B6抗体制备的 人工修饰抗体，以及使用指定为SEQ ID NO：3-8的互补决定区序列的重组蛋 白，但不应限于这个实例。

本发明的一个目的还提供对具有所需特异性的抗体的修饰从而为所述 抗体提供用于特定癌症诊断或治疗的有用性质。这些应用中的一些需要向患 有某些癌症的患者注射抗体或它们的衍生物。在这种情况下，具有与人抗体 序列更紧密相关的序列的衍生物将是优选的，因为它们很可能限制受治疗的 患者产生对抗所注射分子的抗体，并且具有增加的耐受性和重复施用的可能 性。这样的衍生物还很有可能有利于(favor)针对所注射抗体特有的特定决定 簇(determinant)的抗体应答，即，据称具有治疗价值的所谓的抗独特型抗体。

对于治疗性应用，在本发明O-乙酰化GD2的情况下，优选的修饰将是 针对表达靶抗原的肿瘤细胞提供细胞毒活性的那些修饰。

已知仅某些类型的免疫球蛋白具有激活补体或诱导细胞介导的细胞毒 性的性质。例如，8B6抗体识别O-乙酰化GD2但是不能足够有效地诱导这 种细胞毒性。因此本发明的另一目的是提供识别O-乙酰化GD2并且具有细 胞毒活性的抗体。具体而言，这可以通过用能够引发这种细胞毒性的抗体的 恒定区(包括1类人免疫球蛋白的恒定区)替换抗体恒定区来完成。然后将进 一步提高细胞毒性能力，具体而言通过生成特异性糖基化的(包括低岩藻糖 基化的)抗体来进行，例如通过使它们由特殊选择或转化的细胞产生。也可 以将文献中描述的特定突变引入抗体序列用于同样的目的。

制备根据本发明的治疗性抗体的另一种方式是将细胞毒性剂与具有所 需特异性的抗体衍生物组合。所述细胞毒性剂可以是毒性化学品，反义RNA， 包括毒性抗肿瘤药(包括紫杉烷类(taxanes)、长春花生物碱类(periwinkle alkaloids)和它们的衍生物)，蒽环类(anthracyclin)，烷化剂，毒性生物制剂， 包括植物或细菌毒素(包括蓖麻毒蛋白或假单胞菌属毒素(pseudomonas toxin))，或者甚至发射β粒子的放射性同位素，诸如131碘、90-钇、177-镥、 186-铼或67-铜，或俄歇电子，诸如111-铟，或者甚至α粒子，诸如213-铋、 212-铋或211-砹，这些实例决不限制本发明的范围。抗体也可以通过本领域 技术人员已知的分子工程方法以与细胞因子组合的融合蛋白形式产生。使用 的细胞因子是白介素家族的关键成员，诸如白介素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16和IL-18，造血生长因子诸 如GM-CSF (粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)或G-CSF(粒细胞集落刺激因 子)，肿瘤坏死因子(TNF)，和趋化因子。所得抗体-细胞因子融合蛋白具有细 胞因子的生物学特性和它所源自的抗体的特异性。

本发明的抗体也可以有利地应用于诊断，无论所述诊断是依照本领域技 术人员已知的任何技术在体外进行的用于检测细胞或生物学流体样品中O-乙 酰化GD2抗原的存在，或是通过施用经修饰的抗体衍生物在体内进行，其中 所述修饰使得抗体能够通过已知的医学成像技术之一即闪烁照相术 (scintigraphy)或正电子发射断层成像术(positon emission tomography)来检测。 在这种情况下，抗体衍生物将与发射γ光子的放射性同位素诸如131-碘、123- 碘、111-铟或99m-锝组合用于闪烁成像或单光子断层成像(single photon tomography)，或者与发射正电子的同位素诸如18-氟、124-碘、86-钇、64-铜、 44-钪组合用于正电子发射断层成像，同样这些实例并不限制本发明的范围。

本发明的抗体可以与毒性化合物或放射性化合物组合。所述毒性产物通 过多种化学键包括酯键、酰胺键、二硫键或硫醚键与抗体化学偶联或共价偶 联。通过亲电取代(在碘同位素的情况下)或亲核取代(在18-氟的情况下)直接 偶联放射性原子，或通过放射标记的反应性合成子，包括用于碘同位素的 Bolton-Hunter试剂、或用于碘同位素或211-砹的甲锡烷基化活化酯偶联放射 性原子，或者当所述原子是放射性金属时甚至可通过螯合剂偶联放射性原 子。在后一种情况下，本领域技术人员已知在螯合剂中选择哪种可与金属一 起提供在生物流体中具有良好稳定性的复合物。因此DTPA可以有利地与 111-铟一起使用，而DOTA将优选用于使用90-钇的标记。

本领域技术人员可以将本发明的抗体用于已知方法中，其中毒性剂或可 检测剂不直接与抗体结合，而是正相反与第二阶段施用的低分子量分子结 合，在这之前向患者体内施用能够识别这种小分子的抗体衍生物。在这种情 况下，抗体衍生物具体而言是双特异性抗体或免疫缀合物，或抗体衍生物和 抗生物素蛋白之间的融合蛋白。这种方法能够有利地与本发明的抗体一起用 于癌症的体内诊断和治疗。

因此，本发明的抗体和“衍生物”、“抗体衍生物”或“衍生物质”能够 有利地用于这些肿瘤的诊断和治疗。这些包括神经外胚层来源的肿瘤，包括 黑素瘤、小细胞肺癌、神经胶质瘤和成神经细胞瘤。本发明的产品可以有利 地应用于这些肿瘤的检测和治疗，特别是当它们是播散性的(disseminated)或 对现有治疗无反应时。

发明内容

本发明公开了使用抗体用于免疫靶向神经外胚层来源的人患癌症诸如 黑素瘤、成胶质细胞瘤、小细胞肺癌和成神经细胞瘤的用途。

在全部上述本发明多个方面中，已经非常令人惊讶地发现了对O-乙酰 化GD2特异性的单克隆抗体不附着于表达GD2的神经纤维，而是识别表达 GD2神经节苷酯及其O-乙酰化形式的肿瘤细胞。因此这些抗体具有限于神 经外胚层来源肿瘤细胞的特异性，并且不识别外周神经纤维。特异性增加致 使在治疗应用中的毒性降低，具体而言是因为在正常外周神经组织上无附 着，这是使用识别GD2神经节苷酯的抗体观察到的。本发明因此包括使用 这样的抗体用于癌症的诊断和治疗，所述抗体与识别GD2的抗体相比具有 增加的特异性和降低的毒性。

本发明的抗体对它们识别的肿瘤细胞具有细胞毒活性，这种活性或者是 固有的(这是将该抗体嵌合化或人源化的原因之一)，或者是因为所述抗体作 为毒剂尤其是放射剂的载体发挥作用。

因此本发明包括任何仅识别GD2神经节苷酯的O-乙酰化形式的单克隆嵌 合抗体或人源化抗体，或这种抗体的片段，所述抗体或所述片段识别由肿瘤细 胞表达的O-乙酰化GD2分子并且不识别外周神经表面上表达的GD2分子。

本发明还提供这样的抗体，其中使用本领域技术人员已知的分子遗传技 术将一些氨基酸用其它氨基酸替换，特别是用于修饰原始抗体的性质，特别 是用于降低它的免疫原性，或用于增加它的毒性或者甚至用于加快或减缓它 在注射之后的清除率(clearance)。

有利的是，本发明的人工修饰的单克隆抗体或其片段的特征在于它是一 种对O-乙酰化GD2的亲和力高于10^-7摩尔/升并且对GD2本身的亲和力比 对O-乙酰化GD2的亲和力低至少十倍(d’affinitéau moins dix fois plus faible pour le GD2lui-même)的κ-IgG，其中所述抗体或所述抗体片段是单特异性或 双特异性的。

具体而言，但不限于，本发明提供任何人工修饰的单克隆抗体或其片段， 其中H链可变区的互补决定区具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列，并且L链可变区的互补决定区具有SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列。

具体而言，但不限于，本发明提供任何人工修饰的单克隆抗体或其片段， 所述抗体或其片段具有通过将编码非人抗体重链可变区的cDNA与编码人免 疫球蛋白恒定区的cDNA相连获得的重链，还具有通过将编码相同的非人抗 体轻链可变区的cDNA与编码人免疫球蛋白轻链恒定区的cDNA相连获得的 轻链，其特征在于所述非人抗体是小鼠8B6单克隆抗体，并且所述人工修饰 的抗体是针对O-乙酰化GD2神经节苷酯产生的并且不识别外周神经纤维。

具体而言，但不限于，本发明提供任何人工修饰的单克隆抗体或其片段， 所述抗体或其片段的重链可变区具有SEQ ID NO：1所示的推导的(deduced) 氨基酸序列，并且轻链可变区具有SEQ ID NO：2所示的推导的氨基酸序列。

优选地，本发明的人工修饰的单克隆抗体或其片段是能够通过CHO细 胞系获得的KM8B6抗体或其片段。

本发明还提供源自本发明的人工修饰的抗体或其片段的任何药物分子， 其中所述抗体或其片段与分子X偶联(couple)，其中X是毒性分子、药物、 前药或与所述抗体的特异性无关的第二抗体。

根据一个实施方案，所述毒性分子是毒性化学、生物学或放射性分子， 所述分子经设计用于杀伤表达O-乙酰化GD2神经节苷酯的肿瘤细胞。

优选地，本发明的药物分子靶向的所述肿瘤细胞是成神经细胞瘤、黑素 瘤、成胶质细胞瘤或小细胞肺癌细胞。

优选地，将本发明的药物分子在它们的Fc区通过附加糖而突变，由此 调节免疫细胞和补体系统分子的活化。

本发明还提供用于癌症诊断的任何分子，所述癌症在肿瘤细胞表面呈现 O-乙酰化GD2神经节苷酯的表达，所述分子源自本发明的人工修饰的抗体 或其片段，其中所述抗体或所述片段与通过荧光或放射性来检测抗体或所述 片段所用的试剂结合。

因此，本发明涉及本发明的人工修饰的抗体或其片段和/或本发明的分子 用于制备治疗性处理癌症的药物的用途或用于制备诊断这种癌症所用产品 的用途，所述癌症具有表达O-乙酰化形式的GD2神经节苷酯的细胞。

本发明还提供8B6单克隆抗体(在文章‘Variable Region Gene Segments of Nine Monoclonal Antibodies Specific to Disialoganglisosides(GD2，GD3)and their O-Actylated Derivatives’，Cerato等，Hybridoma Volume 16，n°4，1997， 307-316中描述)用于制备药物分子的用途，其中所述抗体与毒性化学、生物 学或放射性剂结合，所述分子经设计用于杀伤表达O-乙酰化GD2神经节苷 酯的肿瘤细胞。

具体而言，但不限于，本发明提供这样的用途，其中所述细胞是成神经 细胞瘤、黑素瘤、成胶质细胞瘤或小细胞肺癌细胞。

具体而言，但不限于，本发明提供这样的用途，其中将所述治疗性分子 在其Fc区通过附加糖而突变，由此调节免疫细胞和补体系统分子的活化。

本发明还提供8B6单克隆抗体用于制备癌症诊断用分子的任何用途，所 述癌症在肿瘤细胞表面表达O-乙酰化GD2神经节苷酯，所述分子源自所述抗 体，其中所述抗体与通过荧光或放射性来检测该抗体所用的试剂结合。

本发明还提供编码本发明人工修饰的抗体的任何DNA序列以及包含与 启动子功能性连接的这样的DNA序列的任何表达载体。

本发明还提供任何细胞，特别是动物细胞，所述细胞包含这样的表达载 体，以及产生本发明人工修饰的抗体的任何非人转化体。

最后，本发明提供用于产生O-乙酰化GD2神经节苷酯的人工修饰的抗 体的任何方法，所述方法包括在合适条件下在细胞或非人转化体中表达所述 DNA序列，和抗体回收。

优选地，在抗体积累(build up)的条件下培养所述细胞或转化体。

附图简述

图1描述质粒60C3L-VL的构建。

图2描述质粒60C3L的构建。

图3描述质粒KM8B6L的构建。

图4描述人工修饰的抗体KM8B6轻链的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。

图5描述质粒II SK(+)60C3L-VH的构建。

图6描述质粒II SK(+)KM60C3-H的构建。

图7描述质粒II SK(+)KM8B6-H的构建。

图8描述质粒pcDNA3.1/(+)KM8B6-H的构建。

图9描述人工修饰的抗体KM8B6重链的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。

图10描述对纯化的抗O-乙酰化GD2人工修饰的抗体KM8B6的 SDS-PAGE分析。所述分析在还原条件下(左侧)和非还原条件下(右侧)进行。 从左至右，分子量标记、KM8B6、IgG3 8B6(还原条件)、高分子量标记、 KM8B6和IgG3 8B6(非还原条件)。

图11的图示描述通过免疫荧光测定的8B6抗体和KM8B6抗体对具有 或不具有O-乙酰化GD2抗原的IMR 32和NeuroA细胞的反应性，纵坐标显 示检测到的细胞数，横坐标显示荧光强度。蓝色曲线(plot)对应于参比的反应 性，红色曲线对应于产品的反应性。

图12的图示显示通过ELISA测定法检测的8B6和KM8B6抗体对IMR32 和NeuroA细胞的反应性。

图13显示用KM8B6抗体从大鼠脑神经节苷酯获得的免疫染色谱，所述 大鼠脑神经节苷酯是通过硅薄层层析术分离的。条带A是对多种大鼠脑神经 节苷酯迁移的间苯二酚染色。

图14显示对成神经细胞瘤细胞和人神经纤维的免疫组织化学测定法的 结果。

图15显示毒性研究(ADCC)的结果。人工修饰的KM8B6抗体和该抗体 所来源的小鼠8B6mAb的百分比ADCC活性。^*用作阴性对照的抗CD20抗体。

图16显示在小鼠中8B6mAb针对表达O-乙酰化GD2抗原的鼠类EL4 胸腺瘤的抗肿瘤效果的体内研究结果。

发明详述

人工修饰的KM8B6抗体的产生

1.制备编码小鼠单克隆抗体60C3的可变L-VL区的cDNA

(a).从产生单克隆60C3抗体的60C3杂交瘤提取总RNA。

依靠RNAble试剂(EUROBIO，Courtaboeuf，France)根据供应商的指导从 指数生长期的10660C3杂交瘤细胞提取总RNA。总RNA浓度通过测量260 nm的光密度来测定。

(b).获得60C3L-VL cDNA的核苷酸序列

从信使RNA通过RACE-PCR获得对编码60C3L-VL可变区的cDNA的 基因扩增，以提供编码与其可变区(VL)组合的信号肽(L)的核苷酸序列。此扩 增使用得自BD Biosciences公司(San Jose，CA，USA)的SMART^TM RACE cDNA Amplification试剂盒根据供应商的指导进行。用于反转录(back-transcription)的 总RNA量是1μg。将反应产物稀释于可由供应商得到的100μL tricine(两性离 子缓冲剂)EDTA缓冲溶液中。将2.5μL体积的稀释产物用于基因扩增。使用 的60C3VL cDNA特异性的反义引物如下：5′-60C3VL 5′-TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC AGC-3′(SEQ ID NO：9)。通过将反应混合物在PERKIN-ELMER (PE)DNA Thermal Cycler 480(PERKIN ELMER WELLESLEY，MA，USA)中在 下述条件下温育来进行扩增：5个循环(94℃ 5秒，72℃ 3分钟)，继之以5个 循环(94℃ 5秒，然后70℃ 10秒，继之以72℃ 3分钟)，和25个循环(94℃ 5 秒，继之以69℃ 10秒和72℃ 3分钟)。通过1％琼脂糖凝胶电泳(Q.BIOGENE， Morgan Irvine，CA，USA)在Tris EDTA pH 8(40mM Tris碱(SIGMA CHEMICALS Co)、25mM EDTA(INERCHIM，Montlucon，France)、20mM乙 酸(CARLO ERBA REAGENTI SPA，Rodano，MI，Italy))迁移缓冲溶液中分析 RACE-PCR的反应产物。然后依靠Gel Extraction试剂盒(QIAGEN) 根据供应商的指导纯化具有期望分子量的产物。对所得纯化产物核酸序列的测 定由GENOME EXPRESS公司(Meylan，France)进行，以检查编码60C3L-VL 区的cDNA序列。由此测定了对应于与60C3抗体轻链可变区组合的信号肽的 序列，并且设计了用于将60C3L-VL cDNA克隆至表达载体中的引物(amorces)。

(c).扩增60C3L-VL cDNA

60C3L-VL cDNA的扩增是通过RT-PCR从提取自60C3杂交瘤细胞的总 RNA来实现的。反应混合物如下：Oligo d(T)18 0.5μg(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.Beverly，MA，USA)、RNA 1μg、dNTP 0.5mM(PROMEGA， Madison，WI，USA)、无菌水qsp 12μL。将这种混合物在65℃(无水控温浴(dry regulated bath))温育5分钟，接着是4℃(融化中的冰)2分钟以使RNA变性。 其后向反应混合物添加4μL的5X第一链缓冲溶液(INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES)、10mM DTT(INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES)、160U的Rnasine(PROMEGA)和800U的反转录酶 (INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES)。其后将所得混合物在37℃温 育1小时，然后在70℃温育15分钟以终止反应。通过PCR基因扩增使用 以下合成寡核苷酸获得了60C3L-VL cDNA的拷贝：5′-BamHI 60C3L-VL： 5′-AG GGA TCC AAA GAC AAA ATG GAT-3′(有义引物，SEQ ID NO：10)和 3′-XhoI 60C3L-VL：5′-TT CAG CTC GAG CTT GGT CCC AGC ACC-3′(反 义引物，SEQ ID NO：11)。

使用的合成引物将沉默突变引入DNA序列，其不导致氨基酸序列的改 变，同时产生克隆至载体中所需的BamHI和XhoI限制位点。

反应介质具有以下组成：dNTP(PROMEGa)500μM、Taq聚合酶 (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1μL、PCR缓冲溶液(INVITROGEN IIFE TECHNOLOGIES)10μL、cDNA(matrix(基质))1μL、MgCl₂(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1.5mM、引物3′-XhoI 60C3L-VL和 引物5′-BamHI 60C3 500μM。

扩增在MJ-research PTC 200热循环仪(PELTIER THERMAL CYCLER) 中在以下条件下进行：94℃ 5分钟，然后接着35个循环的94℃ 30秒、55℃ 45秒和72℃ 1分钟。

在通过1％琼脂糖凝胶电泳分析检查PCR产物之后，使用Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导纯化60C3L-VL cDNA。

2.构建具有60C3L-VL cDNA的重组质粒：60C3L-VL

(a).载体和60C3L-VL cDNA的消化和消化载体的去磷酸化

限制酶消化提供线性载体，其具有插入感兴趣的cDNA所必需的粘性末 端。消化在以下条件下进行：缓冲液NEB2 10X(5μL)、BSA 100X(0.5μL)、 载体或60C3L-VL cDNA(1μg)、限制酶BamHI(10U)、限制酶 XhoI(10U)。限制酶、反应缓冲溶液和BSA溶液由New England Biolabs Inc 提供。将反应在37℃水浴中继续3小时。使用Gel Extraction试 剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导纯化消化的载体和插入物。其后将载体用 CIP (NEW ENGLAND BIOLABS INC.)在37℃去磷酸化1小时。反应混合物 的组成如下：缓冲液NEB3 10X(5μL)、载体(1μg)、CIP(1μL)。这种反应 通过减少载体自连接的百分比来增加连接产率。事实上，通过消化来抑制释 放出的边缘的5′和3′端的磷酸部分来阻止载体的自发性闭合。

(b).连接反应

使用T4连接酶(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)进行的连接将经消化的 60C3L-VL cDNA插入经消化并且去磷酸化的载体将所述反应 在16℃的水浴中在以下反应介质中进一步进行16小时：连接缓冲溶液5X(4 μL)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)、消化的去磷酸化的载体200ng、T4 连接酶(400U)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)、纯化的cDNA 170ng(对于 1kb的插入物)。插入物∶载体摩尔比为3∶1。

(c).转化感受态大肠杆菌XL 1blue(STRATAGENE)

将20μL的连接反应产物添加至100μL的感受态细菌悬液。将所得混合 物在4℃温育30分钟。其后使细菌暴露于42℃的热激2分钟，继之以4℃ 2分钟。其后添加1mL体积的LB培养基，并且将细菌在37℃在搅拌(250rpm) 条件下温育1小时。通过在4℃以4000xg离心5分钟来回收细菌。将细菌 沉淀物取入10μL的LB培养基中，之后涂布在含有2XTY琼脂培养基的Petri 平板中，所述培养基含有100μg/mL氨苄青霉素(SIGMA CHEMICALS CO) 和12.5μg/mL四环素(SIGMA CHEMICALS CO)。在37℃过夜温育之后产 生抗性菌落。

(d).通过PCR检查载体中插入物60C3L-VL的存在

将分离的菌落在通风橱(extractor hood)中的无菌条件下分别置于含有以 下PCR反应混合物的管中：dNTP(PROMEGA)500μM、Taq聚合酶 (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1μL、PCR缓冲溶液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)10μL、cDNA(基质)1μL、MgCl₂(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1.5mM、引物3′-XhoI 60C3L-VL和引物5′-BamHI 60C3 500μM。

扩增在MJ-research PTC 200热循环仪中在以下条件下进行：94℃ 5分 钟，其后的35个循环为94℃ 30秒、55℃ 45秒和72℃ 1分钟。用1％琼脂 糖凝胶电泳分析检查扩增的PCR产物的大小。只有正确(properly)转化的那 些克隆可提供具有期望大小的PCR产物。

(e).产生感兴趣的质粒60C3L-VL

使用无菌牙签，并且在采样菌落之后，添加至5mL含有100μg/mL氨 苄青霉素(SIGMA CHEMICALS CO)和12.5μg/mL四环素(SIGMA CHEMICALS CO)的LB选择性液体培养基，并且在37℃温育16小时。其 后用细菌稀释液使用QIAprep离心小量制备试剂盒(spin miniprep kit) (QIAGEN)根据供应商的指导进行质粒DNA的小量制备。

3.制备编码人P3Non2单克隆抗体恒定区hu-Cκ的cDNA

(a).从产生P3Non2单克隆抗体的P3Non2杂交瘤提取总RNA。

使用RNAble试剂(EUROBIO，Courtaboeuf，France)根据供应商的指导从 指数生长期的106P3Non2杂交瘤细胞提取总RNA。总RNA浓度通过测量 260nm的光密度来测定。

(b).扩增hu-CκcDNA

通过RT-PCR从来自P3Non2杂交瘤细胞的总RNA提取物实现hu-Cκ cDNA扩增。反应混合物如下：Oligo d(T)18 0.5μg(New England Biolabs Inc. Beverly，MA，USA)、RNA 1μg、dNTP 0.5mM(Promega，Madison，WI，USA)、 无菌水qsp 12μL。将这种混合物在65℃(无水控温浴)温育5分钟，接着是4℃ (融化中的冰)2分钟以使RNA变性。其后向反应混合物添加4μL的5X第一 链缓冲溶液(Invitrogen Life Biotechnologies)、10mM DTT(Invitrogen Life Biotechnologies)、160U的Rnasine(PROMEGA)和800U的反转录酶(Invitrogen Life Biotechnologies)。其后将所得混合物在37℃温育1小时，然后在70℃ 温育15分钟以终止反应。通过PCR基因扩增使用以下合成寡核苷酸获得了 60C3L-VL cDNA的拷贝：5′-XhoI hu-Cκ：5′-AG CTC GAG CTG AAA CGA ACT GTG GCT GCA C-3′(有义引物，SEQ ID NO：12)和3′-XbaI hu-Cκ：5′-CTT CTA GAT TTA ACA CTC TCC CCT GTT GA-3′(反义引物，SEQ ID NO：13)。

使用的合成引物将沉默突变引入DNA序列，其不导致氨基酸序列的改 变，同时产生克隆至载体中所需的XbaI和XhoI限制位点。

反应介质具有以下组成：dNTP(PROMEGA)500μM、Taq聚合酶 (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1μL、PCR缓冲溶液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)10μL、cDNA(基质)1μL、MgCl₂(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1.5mM、引物3′-XbaI hu-Cκ和引物5′-XhoI hu-Cκ500μM。

扩增在MJ-research PTC 200热循环仪(PELTIER THERMAL CYCLER) 中在以下条件下进行：94℃ 5分钟，然后接着35个循环的94℃ 30秒、55℃ 45秒和72℃ 1分钟。

在通过1％琼脂糖凝胶电泳分析检查PCR产物之后，使用Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导纯化hu-CκcDNA。

4.构建人工修饰抗体KM 60C3轻链的表达载体：KM60C3-L

(a).载体60C3L-VL和hu-CκcDNA的消化，和消化载体的 去磷酸化

消化在以下条件下进行：缓冲液NEB2 10X(5μL)、BSA 100X(0.5uL)、 载体60C3L-VL或hu-CκcDNA(1μg)、限制酶XhoI(10U)、限制 酶XbaI(10U)。限制酶、反应缓冲溶液和BSA溶液由New England Biolabs Inc 提供。将反应在37℃水浴中继续3小时。使用Gel Extraction试 剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导纯化消化的载体和插入物。其后将载体用 CIP(NEW ENGLAND BIOLABS INC.)在37℃去磷酸化1小时。反应介质的 组成如下：缓冲液NEB3 10X(5μL)、载体(1μg)、CIP(1μL)。

(b).连接反应

使用T4连接酶(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)进行的连接将经消化的 cDNA hu-CκcDNA插入经消化并且去磷酸化的载体60C3L-VL。 将所述反应在16℃的水浴中在以下反应介质中进一步进行16小时：连接缓 冲溶液5X(4μL)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)、消化的去磷酸化的载体 200ng、T4连接酶(400U)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)、纯化的cDNA 170ng(对于1kb的插入物)。插入物∶载体摩尔比为3∶1。将连接反应产物用 于转化感受态细菌大肠杆菌XL1 blue(STRATAGENE)。

(c).通过PCR检查载体60C3L-VL中插入物hu-Cκ的存在

将分离的抗性菌落在通风橱中的无菌条件下置于含有以下PCR反应混 合物的管中：dNTP(PROMEGA)500μM、Taq聚合酶(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1μL、PCR  缓冲溶液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)10μL、cDNA(基质)1μL、MgCl₂(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1.5mM、引物3′-XbaI hu-Cκ和引物5′-XhoI hu-Cκ500μM。 扩增在MJ-research PTC 200热循环仪中在以下条件下进行：94℃ 5分钟， 其后的35个循环为94℃ 30秒、55℃ 45秒和72℃ 1分钟。用1％琼脂糖凝 胶电泳分析检查扩增的PCR产物的大小。只有正确转化的那些克隆可提供 具有期望大小的PCR产物。

(d).产生感兴趣的质粒KM60C3-L

使用无菌牙签，并且在采样菌落之后，添加至5mL含有100μg/mL氨 苄青霉素(SIGMA CHEMICALS CO)和12.5μg/mL四环素(SIGMA CHEMICALS CO)的LB选择性液体培养基，并且在37℃温育16小时。其 后用细菌稀释液使用QIAprep离心小量制备试剂盒(QIAGEN)根据供应商的 指导进行质粒DNA的小量制备。

5.构建人工修饰抗体KM 8B6轻链的表达载体：8B6-L

(a).获得载体hu-Cκ

通过使用限制酶BamHI和XhoI的消化从载体KM60C3-L制 备载体hu-Cκ。反应介质的组成如下：缓冲液NEB2 10X(5μL)、 BSA100X(0.5μL)、载体(1μg)、限制酶BamHI(10U)、限制酶XhoI(10U)。 限制酶、反应缓冲溶液和BSA溶液由NEW ENGLAND BIOLABS Inc提供。 将反应在37℃水浴中继续3小时。使用Gel Extraction试剂盒 (QIAGEN)根据供应商的指导纯化消化的载体。其后将载体用CIP(NEW ENGLAND BIOLABS INC.)在37℃去磷酸化1小时。反应介质的组成如下： 缓冲液NEB3 10X(5μL)、载体(1μg)、CIP(1μL)。

(b).从产生8B6单克隆抗体的8B6杂交瘤提取总RNA

使用RNAble试剂(EUROBIO，Courtaboeuf，France)根据供应商的指导从 指数生长期的106 8B6杂交瘤细胞提取总RNA。总RNA浓度通过测量260 nm的光密度来测定。

(c).获得核苷酸cDNA序列8B6L-VL

从信使RNA通过RACE-PCR获得对编码可变区8B6L-VL的cDNA的 基因扩增，以提供编码与其可变区(VL)结合的信号肽(L)的核苷酸序列。此扩 增使用得自BD BIOSCIENCES公司(San Jose，CA，USA)的SMART^TM RACE cDNAAmplification试剂盒根据供应商的指导进行。用于反转录的总RNA量 是1μg。将反应产物稀释于可由供应商得到的100μL两性离子缓冲剂(tricine) EDTA缓冲溶液中。将2.5μL体积的稀释产物用于基因扩增。使用的8B6VL cDNA特异性的反义引物如下：3′-mu Cκ5′-gtt cat act cgt cct tgg tca acg tga ggg-3′，该引物可与编码κ型小鼠抗体轻链的恒定域mu C-κ的cDNA杂交。 通过将反应混合物在PERKIN-ELMER(PE)DNA Thermal Cycler 480 (PERKIN ELMER WELLESLEY，MA，USA)中在下述条件下温育来进行扩 增：5个循环(94℃ 5秒，72℃ 3分钟)，继之以5个循环(94℃ 5秒，然后70℃ 10秒，继之以72℃ 3分钟)，和25个循环(94℃ 5秒，继之以69℃ 10秒和 72℃ 3分钟)。通过1％琼脂糖凝胶电泳(Q.BIOGENE，Morgan Irvine，CA， USA)在Tris EDTA pH 8(40mM Tris碱(SIGMA CHEMICALS Co)、25mM EDTA(INERCHIM，Montlucon，France)、20mM  乙酸(CARLO ERBA REAGENTI SPA，Rodano，MI，Italy))迁移缓冲溶液中分析RACE-PCR的反应 产物。然后依靠QIAquick Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导 纯化具有期望分子量的产物。对所得纯化产物核酸序列的测定由GENOME EXPRESS公司(Meylan，France)进行，以检查编码8B6L-VL区的cDNA序列。 由此测定了对应于与8B6抗体轻链可变区组合的信号肽的序列，并且设计了 用于将8B6L-VL cDNA克隆至表达载体中的引物。

(d).扩增8B6L-VL cDNA

8B6L-VL cDNA的扩增是通过RT-PCR从来自8B6杂交瘤细胞的总 RNA提取物来实现的。反应混合物如下：Oligo d(T)18 0.5μg(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.Beverly，MA，USA)、RNA 1μg、dNTP 0.5mM (PROMEGA，Madison，WI，USA)、无菌水qsp 12μL。将这种混合物在65℃(无 水控温浴)温育5分钟，接着是4℃(融化中的冰)2分钟以使RNA变性。其 后向反应混合物添加4μL的5X第一链缓冲溶液(INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES)、10mM DTT (INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES)、160U的Rnasine(PROMEGA)和800U的反转录酶 (INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES)。其后将所得混合物在37℃温 育1小时，然后在70℃温育15分钟以终止反应。通过PCR基因扩增使用 以下合成寡核苷酸获得了8B6L-VL cDNA的拷贝：5′-BamHI 8B6L-VL：5′- AAG GGA TCC GCC ACC ATG AAG TTG CCT GTT-3′(有义引物，SEQ ID NO：14)和3′-XhoI 8B6L-VL：5′-CCG TTT TAT CTC GAG CTT GGT CCC-3′ (反义引物，SEQ ID NO：15)。

使用的合成引物将沉默突变引入DNA序列，其不导致氨基酸序列的改 变，同时产生克隆至载体中所需的BamHI和XhoI限制位点。

反应介质具有以下组成：dNTP(PROMEGA)500μM、Taq聚合酶 (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1μL、PCR缓冲溶液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)10μL、cDNA(基质)1μL、MgCl₂(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1.5mM、引物3′-XhoI 8B6L-VL和引物：5′-BamHI 8B6L-VL 500μM。

扩增在MJ-research PTC 200热循环仪(PELTIER THERMAL CYCLER) 中在以下条件下进行：94℃ 5分钟，然后接着35个循环的94℃ 30秒、55℃ 45秒和72℃ 1分钟。

在通过1％琼脂糖凝胶电泳分析检查PCR产物之后，使用Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导纯化8B6L-VL cDNA。

(e).8B6L-VL cDNA的消化

使用限制酶BamHI和XhoI消化8B6L-VL cDNA。反应介质的组成如下： 缓冲液NEB2 10X(5μL)、BSA 100X(0.5μL)、8B6L-VL cDNA(1μg)、限制 酶BamHI(10U)、限制酶XhoI(10U)。限制酶、反应缓冲溶液和BSA溶液由 NEW ENGLAND BIOLABS Inc提供。将反应在37℃水浴中继续3小时。使 用Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导纯化消化的 插入物。

(f).连接反应

使用T4连接酶(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)进行的连接将经消化的 8B6L-VL cDNA插入经消化并且去磷酸化的载体hu-Cκ。将所述反 应在16℃的水浴中在以下反应介质中进一步进行16小时：连接缓冲溶液5X (4μL)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)、消化并且去磷酸化的载体hu-Cκ200ng、T4连接酶(400U)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)、纯化的8B6 L-VL cDNA 170ng(对于1kb的插入物)。插入物∶载体摩尔比为3∶1。将连接 反应产物用于转化感受态细菌大肠杆菌XL1 blue(STRATAGENE)。

(g).通过PCR检查载体hu-Cκ中插入物8B6L-VL的存在

将分离的抗性菌落在通风橱中的无菌条件下置于含有以下PCR反应混 合物的管中：dNTP(PROMEGA)500μM、Taq聚合酶(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1μL、PCR缓冲溶液(Invitrogen Life Technologies)10μL、 cDNA(基质)1μL、MgCl₂(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1.5mM、 引物3′-XhoI 8B6L-VL和引物5′-BamHI 8B6L-VL 500μM。扩增在 MJ-research PTC 200热循环仪中在以下条件下进行：94℃ 5分钟，其后的 35个循环为94℃ 30秒、55℃ 45秒和72℃ 1分钟。用1％琼脂糖凝胶电泳 分析检查扩增的PCR产物的大小。只有正确转化的那些克隆可提供具有期 望大小的PCR产物。

(h).产生感兴趣的质粒KM8B6L

使用无菌牙签，并且在采样菌落之后，添加至5mL含有100μg/mL氨 苄青霉素(SIGMA CHEMICALS CO)和12.5μg/mL四环素(SIGMA CHEMICALS CO)的LB选择性液体培养基，并且在37℃温育16小时。其 后用细菌稀释液使用QIAprep离心小量制备试剂盒(QIAGEN)根据供应商的 指导进行质粒DNA的小量制备。

6.制备编码小鼠60C3单克隆抗体的L-VH可变区的cDNA

(a).获得60C3L-VH cDNA的核苷酸序列

从信使RNA通过RACE-PCR获得对编码60C3L-VH可变区的cDNA 的基因扩增，以提供编码与其可变区(VH)组合的信号肽(L)的核苷酸序列。 此扩增使用得自BD BIOSCIENCES公司(San Jose，CA，USA)的SMART^TMRACE cDNA Amplification试剂盒根据供应商的指导进行。用于反转录的总 RNA量是1μg。将反应产物稀释于可从供应商获得的100μL两性离子缓冲 剂(tricine)EDTA缓冲溶液中。将2.5μL体积的稀释产物用于基因扩增。使 用的60C3VH cDNA特异性的反义引物如下：3′-60C3L-VH 5′-TGC AGA GAC AGT GAC CAG CAG AGT AGT CCC-3′(反义引物，SEQ ID NO：16)， 该引物与编码κ型小鼠抗体重链的mu C-κ恒定域的cDNA杂交。通过将反 应混合物在Perkin-Elmer(PE)DNA Thermal Cycler 480(PERKIN ELMER WELLESLEY，MA，USA)中在下述条件下温育来进行扩增：5个循环(94℃ 5 秒，72℃ 3分钟)，继之以5个循环(94℃ 5秒，然后70℃ 10秒，继之以72℃ 3分钟)，和25个循环(94℃ 5秒，继之以69℃ 10秒和72℃ 3分钟)。通过 1％琼脂糖凝胶电泳(Q.BIOGENE，Morgan Irvine，CA，USA)在Tris EDTA pH 8(40mM Tris碱(SIGMA CHEMICALS Co)、25mM EDTA(INERCHIM， France)、20mM乙酸(CARLO ERBA REAGENTI SPA，Rodano，MI， Italy))迁移缓冲溶液中分析RACE-PCR的反应产物。然后依靠QIAquick Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导纯化具有期望分子量的产物。 对所得纯化产物核酸序列的测定由GENOME EXPRESS公司(Meylan，France) 进行，以检查编码60C3L-VH区的cDNA序列。由此测定了对应于与60C3 抗体重链可变区组合的信号肽的序列，并且设计了用于将60C3L-VH cDNA 克隆至表达载体中的引物。

(b).扩增60C3L-VH cDNA

60C3L-VH cDNA的扩增是从来自60C3杂交瘤细胞的总RNA提取物通 过RT-PCR来实现的。反应混合物如下：Oligo d(T)18 0.5μg(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.Beverly，MA，USA)、RNA 1μg、dNTP 0.5mM(PROMEGA， Madison，WI，USA)、无菌水qsp 12μL。将这种混合物在65℃(无水控温浴) 温育5分钟，接着是4℃(融化中的冰)2分钟以使RNA变性。其后向反应 混合物添加4μL的5X第一链缓冲溶液(INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES)、10mM DTT(INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES)、160U的Rnasine(PROMEGA)和800U的反转录酶 (INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES)。其后将所得混合物在37℃温 育1小时，然后在70℃温育15分钟以终止反应。通过PCR基因扩增使用 以下合成寡核苷酸获得了60C3L-VH cDNA的拷贝：5′-BamHI 60C3L-VH： 5′-CAG GAT CCG AAC ACA CTG ACT CTA ACC ATG G-3′(有义引物，SEQ ID NO：17)和3′-NheI 60C3L-VH：5′-T GCT AGC TGC AGA GAC AGT GAC CAG AGT-3′(反义引物，SEQ ID NO：18)。

使用的合成引物将沉默突变引入DNA序列，其不导致氨基酸序列的改 变，同时产生克隆至载体中所需的BamHI和NheI限制位点。

反应介质具有以下组成：dNTP(PROMEGA)500μM、Taq聚合酶 (Invitrogen Life Technologies)1μL、PCR缓冲溶液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)10μL、cDNA(基质)1μL、MgCl₂(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1.5mM、引物3′-NheI 60C3L-VH和引物：5′-BamHI 60C3 L-VH 500μM。

扩增在MJ-research PTC 200热循环仪(PELTIER THERMAL CYCLER) 中在以下条件下进行：94℃ 5分钟，然后接着35个循环的94℃ 30秒、55℃ 45秒和72℃ 1分钟。

在通过1％琼脂糖凝胶电泳分析检查PCR产物之后，使用Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导纯化60C3L-VH cDNA。

7.构建具有60C3L-VH cDNA的重组质粒

(a).构建克隆载体pBluescript II SK(+)60C3L-VH

将编码60C3L-VH区的序列插入载体pBluescript II SK(+)的过程包括通 过产生平端切割的限制酶EcoRV(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)来消化所 述载体。用Taq聚合酶在dTTP存在下处理所得的线性质粒，从而进一步将 胸苷添加至所述载体的3’端并且阻止自连接。用于获得60C3L-VH cDNA的 Taq DNA聚合酶具有5’-3’外切核酸酶活性，向PCR产物的每个3’端添加一 个末端腺嘌呤，使所述PCR产物能够直接克隆入这种载体。由于A/T的互 补性，连接反应的产率与平端连接反应相比大大提高。使用所述连接反应产 物来转化感受态细菌大肠杆菌XL1 blue(STRATAGENE)。

(b).通过PCR检查载体pBluescript II SK(+)中60C3L-VH插入物的存在

将分离的抗性菌落在通风橱中的无菌条件下置于含有以下PCR反应混 合物的管中：dNTP(PROMEGA)500μM、Taq聚合酶(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1μL、PCR  缓冲溶液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)10μL、MgCl₂(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1.5 mM、引物3′-NheI 60C3L-VH和引物5′-BamHI 60C3L-VH 500μM。扩增 在MJ-research PTC 200热循环仪中在以下条件下进行：94℃ 5分钟，其后 的35个循环为94℃ 30秒、55℃ 45秒和72℃ 1分钟。用1％琼脂糖凝胶电 泳分析检查扩增的PCR产物的大小。只有正确转化的那些克隆可提供具有 期望大小的PCR产物。

(c).产生感兴趣的质粒pBluescript II SK(+)60C3L-VH

为了这个目的，使用无菌牙签，并且在采样菌落之后，添加至5mL含 有100μg/mL氨苄青霉素(SIGMA CHEMICALS Co)和12.5μg/mL四环素 (SIGMA CHEMICALS Co)的LB选择性液体培养基，并且在37℃温育16小 时。其后用细菌稀释液使用QIAprep离心小量制备试剂盒(QIAGEN)根据供 应商的指导进行质粒DNA的小量制备。

(d).通过酶消化检查载体pBluescript II SK(+)60C3L-VH中插入物 60C3L-VH的方向

通过用酶BamHI(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)根据供应商的指导对 载体pBluescript II SK(+)60C3L-VH进行酶消化来确认60C3L-VH插入物 是以有义方向存在的。事实上，T克隆技术不控制插入物的统一方向，因此 插入物能够以有义或反义方向插入。仅当60C3L-VH插入物以有义方向插 入时才由两个BamHI限制位点从侧翼包围。因此在通过酶BamHI消化之后， 电泳分析能够分辨并且选择具有有义方向的60C3L-VH cDNA的克隆。

8.制备编码hu-Cγ1人抗体恒定区的cDNA

a.从产生γ1同种型重链的LP1人骨髓瘤的细胞系提取总RNA

使用RNAble试剂(EUROBIO，Courtaboeuf，France)根据供应商的指导从 指数生长期的106LP1杂交瘤细胞提取总RNA。总RNA浓度通过测量260 nm的光密度来测定。

b.hu-Cγ1cDNA区段的基因扩增

从来自LP1杂交瘤的总RNA提取物来进行对hu-Cγ1cDNA的扩增。 反应混合物如下：Oligo d(T)18 0.5μg(NEW ENGLAND BIOLABS Inc. Beverly，MA，USA)、RNA 1μg、dNTP 0.5mM(PROMEGA，Madison，WI， USA)、无菌水qsp 12μL。将这种混合物在65℃(无水控温浴)温育5分钟， 接着是4℃(融化中的冰)2分钟以使RNA变性。其后向反应混合物添加4μL 的5X第一链缓冲溶液(Invitrogen Life Biotechnologies)、10mM DTT (Invitrogen Life Biotechnologies)、160U的Rnasine(PROMEGA)和800U的 反转录酶(Invitrogen Life Biotechnologies)。其后将所得混合物在37℃温育1 小时，然后在70℃温育15分钟以终止反应。通过PCR基因扩增使用以下 合成寡核苷酸获得了hu-Cγ1cDNA的拷贝：5′-NheI hu-Cγ1：5′-CA GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC C-3′(有义引物，SEQ ID NO：19) 和3′-XbaI hu-Cγ1：5′-AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TAA TCT AGA CG-3′(反义引物，SEQ ID NO：20)。

使用的合成引物将沉默突变引入DNA序列，其不导致氨基酸序列的改 变，同时产生克隆至载体中所需的NheI和XbaI限制位点。

反应介质具有以下组成：dNTP(PROMEGA)500μM、Taq聚合酶 (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1μL、PCR缓冲溶液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)10μL、cDNA(基质)1μL、MgCl₂(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1.5mM、引物3′-XbaI hu-Cγ1和引物：5′-NheI hu-Cγ 1500μM。

扩增在MJ-research PTC 200热循环仪(PELTIER THERMAL CYCLER) 中在以下条件下进行：94℃ 5分钟，然后接着35个循环的94℃ 30秒、55℃ 45秒和72℃ 1分钟。

在通过1％琼脂糖凝胶电泳分析检查PCR产物之后，使用Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导纯化hu-Cγ1cDNA。

9.构建具有偶联的60C3L-VH cDNA与hu-Cγ1cDNA的重组质粒： pBluescript II SK(+)KM60C3H

(a).消化载体pBluescript II SK(+)60C3L-VH和hu-Cγ1cDNA，和消化 载体的去磷酸化

消化在以下条件下进行：NEB2 10X缓冲液(5μL)、BSA 100X(0.5μL)、 载体pBluescript II SK(+)60C3L-VH或hu-Cγ1cDNA(1μg)、限制酶NheI (10U)、限制酶XbaI(10U)。限制酶、反应缓冲溶液和BSA溶液由NEW ENGLAND BIOLABS Inc提供。将反应在37℃水浴中继续3小时。使用 Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导纯化消化的载 体和插入物。其后将载体用CIP(NEW ENGLAND BIOLABS INC.)在37℃ 去磷酸化1小时。

反应介质的组成如下：NEB3 10X缓冲液(5μL)、载体(1μg)、CIP(1μL)。

(b).连接反应

使用T4连接酶(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)进行的连接将经消化的 hu-Cγ1cDNA插入经消化并且去磷酸化的载体pBluescript II SK(+)60C3 L-VH。将所述连接反应在16℃的水浴中在以下反应介质中进一步进行16 小时：连接缓冲溶液5X(4μL)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)、消化的去 磷酸化的载体pBluescript II SK(+)60C3L-VH 200ng、T4连接酶(400U) (NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)、纯化的hu-Cγ1cDNA 170ng(对于1kb 的插入物)。插入物∶载体摩尔比为3∶1。将所述连接反应产物用于转化感受态 细菌大肠杆菌XL1 blue(STRATAGENE)。

(c).通过PCR检查载体pBluescript II SK(+)60C3L-VH中插入物hu-Cγ 1的存在和方向

由于选择的是NheI和XbaI限制位点，hu-Cγ1插入物可以是有义或反 义方向。这是因为限制位点的序列不控制插入物的统一方向。通过PCR来 确认有义方向的插入物。将分离的菌落在通风橱中的无菌条件下分别置于含 有以下PCR反应混合物的管中：dNTP 500μM(PROMEGA)、Taq聚合酶 (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1μL、PCR缓冲溶液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)10μL、MgCl₂(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1.5mM、有义引物和反义引物500μM。扩增在MJ-research PTC 200热循环仪中在以下条件下进行：94℃ 5分钟，其后的35个循环为 94℃ 30秒、55℃ 45秒和72℃ 1分钟。使用的引物是：5′-BamHI 60C3L-VH： 5′-CAG GAT CCG AAC ACA CTG ACT CTA ACC ATG G-3′(有义引物，SEQ ID NO：21)和3′-XbaI hu-Cγ1：5′-AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TAA TCT AGA CG-3′(反义引物，SEQ ID NO：21)。

如果插入物的方向不正确，那么两个引物将存在于待扩增序列的同一链 上，导致无扩增。用1％琼脂糖凝胶电泳分析检查扩增的PCR产物的大小。 只有正确转化的那些克隆可提供具有期望大小的PCR产物。

(d).产生感兴趣的质粒pBluescript II SK(+)KM60C3H

使用无菌牙签，并且在采样菌落之后，添加至5mL含有100μg/mL氨 苄青霉素(SIGMA CHEMICALS Co)和12.5μg/mL四环素(SIGMA CHEMICALS Co)的LB选择性液体培养基，并且在37℃温育16小时。其 后用细菌稀释液使用QIAprep离心小量制备试剂盒(QIAGEN)根据供应商的 指导进行质粒DNA的小量制备。

10.构建人工修饰抗体重链KM 8B6的表达载体：pcDNA3/Hygro 8B6-H

(a).获得载体pBluescript II SK(+)hu-Cγ1

通过使用限制酶BamHI和XbaI的消化从载体pBluescript II SK(+) KM60C3H制备载体pBluescript II SK(+)hu-Cγ1。反应介质的组成如下： NEB2 10X缓冲液(5μL)、BSA 100X(0.5μL)、载体(1μg)、限制酶BamHI (10U)、限制酶XbaI(10U)。限制酶、反应缓冲溶液和BSA溶液由NEW ENGLAND BIOLABS Inc提供。将反应在37℃水浴中继续3小时。使用 QIAquick Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导纯化载体。其后 将载体用CIP(NEW ENGLAND BIOLABS INC.)在37℃去磷酸化1小时。 反应介质的组成如下：NEB310X缓冲液(5μL)、载体(1μg)、CIP(1μL)。

(b).从产生8B6单克隆抗体的8B6杂交瘤提取总RNA

使用RNAble试剂(EUROBIO，Courtaboeuf，France)根据供应商的指导从 指数生长期的106 8B6杂交瘤细胞提取总RNA。总RNA浓度通过测量260 nm的光密度来测定。

(c).获得核苷酸cDNA序列8B6L-VH

从信使RNA通过RACE-PCR获得对编码8B6L-VH可变区的cDNA的 基因扩增，以提供编码与其可变区(VH)组合的信号肽(L)的核苷酸序列。这 种扩增使用得自BD BIOSCIENCES公司(San Jose，CA，USA)的SMART RACE cDNA Amplification试剂盒根据供应商的指导进行。用于反转录的总 RNA量是1μg。将反应产物稀释于可从供应商获得的100μL两性离子缓冲 剂EDTA缓冲溶液中。将2.5μL体积的稀释产物用于基因扩增。使用的8B6 L-VH cDNA特异性的反义引物如下：3′-mu Cγ35′-tGA TCA ACT CAG TCT TGC TGG CTG GGT GGG-3′(SEQ ID NO：23)，该引物与编码γ3型小鼠抗体 重链mu C-γ3恒定域的cDNA杂交。通过将反应混合物在PERKIN-ELMER (PE)DNA Thermal Cycler 480(PERKIN ELMER WELLESLEY，MA，USA)中 在下述条件下温育来进行扩增：5个循环(94℃ 5秒，72℃ 3分钟)，继之以5 个循环(94℃ 5秒，然后70℃ 10秒，继之以72℃ 3分钟)，和25个循环(94℃ 5秒，继之以69℃ 10秒和72℃ 3分钟)。通过1％琼脂糖凝胶电泳(Q.Biogene， Morgan Irvine，CA，USA)在Tris EDTA pH 8(40mM Tris碱(SIGMA CHEMICALS Co)、25mM EDTA(INERCHIM，France)、20mM乙 酸(CARLO ERBA REAGENTI SPA，Rodano，MI，Italy))迁移缓冲溶液中分析 RACE-PCR的反应产物。然后依靠QIAquick Gel Extraction试剂盒(QIAGEN) 根据供应商的指导纯化具有期望分子量的产物。对所得纯化产物核酸序列的 测定由GENOME EXPRESS公司(Meylan，France)进行，以检查编码8B6 L-VH区的cDNA序列。由此测定了对应于与8B6抗体重链可变区组合的信 号肽的序列，并且设计了用于将8B6L-VH cDNA克隆至表达载体pBluescript II SK(+)hu-Cγ1中的引物。

(d).8B6L-VH区段的基因扩增

从来自8B6杂交瘤细胞的总RNA提取物通过RT-PCR来实现对8B6 L-VH cDNA的扩增。反应混合物如下：Oligo d(T)18 1μL(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.Beverly，MA，USA)、RNA 1μg、dNTP 0.5mM(PROMEGA， Madison，WI，USA)、无菌水qsp 12μL。将这种混合物在65℃(无水控温浴) 温育5分钟，接着是4℃(融化中的冰)2分钟以使RNA变性。其后向反应 混合物添加4μL的5X第一链缓冲溶液(INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES)、10mM DTT(INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES)、160U的Rnasine(PROMEGA)和800U的反转录酶 (INVITROGEN LIFE BIOTECHNOLOGIES)。其后将所得混合物在37℃温 育1小时，然后在70℃温育15分钟以终止反应。通过PCR基因扩增使用 以下合成寡核苷酸获得了8B6L-VH cDNA的拷贝：5′-BamHI 8B6L-VH： 5′-CCG TCG GAT CCG GCC ACC ATG AAG TTG TGG-3′(有义引物，SEQ ID NO：24)和3′-NheI 8B6L-VH：5′-CGG GGT GCT AGC TGA GGA GAC TGT-3′(反义引物，SEQ ID NO：25)。

使用的合成引物将沉默突变引入DNA序列，其不导致氨基酸序列的改 变，同时产生克隆至载体中所需的BamHI和NheI限制位点。

反应介质具有以下组成：dNTP(PROMEGA)500μM、Taq聚合酶 (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1μL、PCR缓冲溶液(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)10μL、cDNA(基质)1μL、MgCl₂(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1.5mM、引物3′-NheI 8B6L-VH和引物5′-BamHI 8B6L-VH 500μM。

扩增在MJ-research PTC 200热循环仪(PELTIER THERMAL CYCLER) 中在以下条件下进行：94℃ 5分钟，然后接着35个循环的94℃ 30秒、55℃ 45秒和72℃ 1分钟。

在通过1％琼脂糖凝胶电泳分析检查PCR产物之后，使用Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导纯化8B6L-VH cDNA。

(e).8B6L-VH cDNA的消化

使用限制酶BamHI和NheI消化8B6L-VH cDNA。反应介质的组成如 下：缓冲液NEB2 10X(5μL)、BSA 100X(0.5μL)、8B6L-VH cDNA(1μg)、 限制酶BamHI(10U)、限制酶NheI(10U)。限制酶、反应缓冲溶液和BSA溶 液由NEW ENGLAND BIOLABS Inc提供。将反应在37℃水浴中继续3小 时。使用Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导纯化 消化的插入物。

(f).连接反应

连接将经消化的8B6L-VH cDNA插入经消化并且去磷酸化的载体 pBluescript II SK(+)hu-Cγ1。将所述反应在16℃的水浴中在以下反应介质 中进一步进行16小时：连接缓冲溶液5X(4μL)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)、消化并且去磷酸化的载体pBluescript II SK(+)hu-Cγ1 200ng、T4连 接酶(400U)(NEW ENGLAND BIOLAB S Inc.)、纯化的8B6L-VH cDNA 170 ng(对于1kb的插入物)。插入物∶载体摩尔比为3∶1。将连接反应产物用于转 化感受态细菌大肠杆菌XL1 blue(STRATAGENE)。

(g).获得编码人工修饰抗体的重链的cDNA

通过限制酶BamHI和XbaI消化载体pBluescript II SK(+)KM8B6H来 产生编码人工修饰抗体的重链的cDNA。反应介质的组成如下：NEB2 10X 缓冲液(5μL)、BSA 100X(0.5μL)、载体(1μg)、限制酶BamHI(10U)、限制 酶XbaI(10U)。限制酶、反应缓冲溶液和BSA溶液由NEW ENGLAND BIOLABS Inc提供。将反应在37℃水浴中继续3小时。使用Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)根据供应商的指导纯化释放的插入物。

(h).载体pcDNA3/Hygro的消化和消化载体的去磷酸化

消化在以下条件下进行：NEB2 10X缓冲液(5μL)、BSA 100X(0.5μL)、 载体(1μg)、限制酶BamHI(10U)、限制酶XbaI(10U)。限制酶、反应缓冲溶 液和BSA溶液由NEW ENGLAND BIOLABS Inc提供。将反应在37℃水浴 中继续3小时。使用Gel Extraction试剂盒(QIAGEN)根据供应商 的指导纯化经消化的载体和插入物。其后将载体用CIP(NEW ENGLAND BIOLABS INC.)在37℃去磷酸化1小时。反应介质的组成如下：NEB3 10X 缓冲液(5μL)、载体(1μg)、CIP(1μL)。

(i).连接反应

连接反应将编码人工修饰抗体的重链的cDNA插入经消化并且去磷酸 化的载体pcDNA3/Hygro。将所述反应在16℃的水浴中在以下反应介质中进 一步进行16小时：连接缓冲溶液5X(4μL)(NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)、消化并且去磷酸化的载体pcDNA3/Hygro 200ng、T4连接酶(400U) (NEW ENGLAND BIOLABS Inc.)、纯化的编码人工修饰抗体的重链的cDNA 170ng(对于1kb的插入物)。插入物∶载体摩尔比为3∶1。将连接反应产物用 于转化感受态细菌大肠杆菌XL1 blue(STRATAGENE)。

(j).通过PCR检查载体pcDNA3/Hygro中编码人工修饰抗体重链的 cDNA的存在

将分离的抗性菌落在通风橱中的无菌条件下置于含有以下PCR反应混合 物的管中：dNTP(PROMEGA)500μM、Taq聚合酶(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1μL、PCR缓冲溶液(Invitrogen Life Technologies)10μL、 MgCl₂(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES)1.5mM、3′引物和5′引物500 μM。扩增在MJ-research PTC 200热循环仪中在以下条件下进行：94℃ 5分 钟，其后的35个循环为94℃ 30秒、55℃ 45秒和72℃ 1分钟。使用的引物 是：5′-BamHI 60C3L-VH：5′-CCG TCG GAT CCG GCC ACC ATG AAG TTG TGG-3′(有义引物，SEQ ID NO：26)和3′-NheI 8B6L-VH：5′-CGG GGT GCT AGC TGA GGA GAC TGT-3′(反义引物，SEQ ID NO：27)。

用1％琼脂糖凝胶电泳分析检查扩增的PCR产物的大小。只有正确转化 的那些克隆可提供具有期望大小的PCR产物。

(k).产生感兴趣的质粒pcDNA3KM8B6L

使用无菌牙签，并且在采样菌落之后，添加至5mL含有100μg/mL氨 苄青霉素(SIGMA CHEMICALS Co)和12.5μg/mL四环素(SIGMA CHEMICALS Co)的LB选择性液体培养基，并且在37℃温育16小时。其 后用细菌稀释液使用QIAprep离心小量制备试剂盒(QIAGEN)根据供应商的 指导进行质粒DNA的小量制备。

11.转染表达人工修饰的KM8B6抗体的CHO细胞

使用CHO细胞作为宿主细胞用于表达和分泌人工修饰的KM8B6抗体。 将这些细胞使用试剂盒(QIAGEN GMBH，Hildn，Germany)根据供 应商的指导用质粒KM8B6-L和pDNA3.1/KM8B6-H共转 染，上述质粒分别编码人工修饰的KM8B6抗体的轻链(图4)和重链(图9)。 选择经转化细胞对遗传霉和潮霉素(INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES，Carlsbad，CA，USA)的抗性。通过常规克隆技术经由有限 稀释(limited dilution)获得抗性克隆。其后使用ELISA酶联免疫测定法选择它 们的KM8B6表达和分泌。选择了以3.8ng/mL分泌KM8B6抗体的稳定的转 染子克隆。

12.纯化8B6和KM8B6抗体

从相应的杂交瘤培养物上清(Cerato等，1997)产生了神经节苷酯特异性 的小鼠单克隆抗体。通过蛋白A层析(GE HEALTHCARE AMERSHAM BIOSCIENCE AB，Uppsala，Sweden)根据发明人开发的规程纯化了所述抗体， 所述规程可限制小鼠IgG3不可逆的嗜同性聚集现象(the irreversible phenomena of homophilic aggregations)(Chapman等，1990)。首先用0.1M Tris-HCl pH 7.6缓冲液平衡柱。使2L含有10％平衡缓冲液的培养物上清样 品以1mL/min的流速通过柱。其后用10体积的平衡缓冲液清洗柱。用酸性 缓冲液0.1M柠檬酸盐、0.3M NaCl，pH 3洗脱固定于蛋白A的物质，其后 按级分收集，立即通过之前引入收集管中的缓冲液1M Tris-HCl，pH 7.6来中 和。纯化的进程通过测量收集级分的光密度变化来监测。其后将有价值的级 分在PBS溶液pH 7.4NaCl 0.3M中透析并且通过在0.22μm滤器上过滤来灭 菌。通过测量280nm的光密度来测定蛋白量，其后将mAb浓度调节至低于 或等于0.9mg AcN/mL的浓度以防止小鼠IgG3的嗜同性聚集现象。将纯化 的mAb照此贮藏在如4℃直至使用。

通过蛋白A亲和层析从CHO细胞培养物上清纯化人工修饰的KM8B6 抗体，所述CHO细胞培养物上清源自用质粒pcDNA3 KM8B6-L和 pcDNA3/Hygro KM8B6-H稳定共转染的克隆。

通过SDS-PAGE分析在还原变性条件下分析纯化的抗体。将样品取至缓 冲溶液Tris-HCl 0.5M pH 6.8中，该缓冲溶液含有10％甘油(VWR，Fontenay sous Bois，France)和5％β-巯基乙醇(PROMEGA)。将它们煮沸5分钟，其后通 过SDS-PAGE电泳根据Laemmli方法分析。将所述蛋白质以3μg的量置于用 1.5mm厚聚丙烯酰胺凝胶制备的孔中，所述凝胶的上部凝胶和下部凝胶的聚 丙烯酰胺浓度分别为4.5％和12％(VWR)。在室温以200V电泳45分钟之后， 将凝胶固定并且用考马斯蓝R250(SIGMA CHEMICALS Co)染色。通过分子 量标记Precision PlusStandards(BIO-RAD)的迁移率计算分子量。

在还原变性条件下的12％SDS-PAGE凝胶分析显示L和H嵌合链的分 子量分别为25kDa和50kDa。在非还原变性条件下的6％SDS-PAGE凝胶分 析显示所述L和H链正确装配以产生抗体分子，并且该人工修饰抗体的分 子量是大约150kDa。

13.KM8B6抗体特异性的研究

(a).通过活细胞的间接免疫荧光

在表达O-乙酰化GD2的IMR32细胞和不表达O-乙酰GD2的Neuro 2A 细胞上检验抗体特异性。将10⁶细胞与8B6或KM8B6抗体一起在4℃温育 30分钟。然后将细胞在1％PBS-BSA缓冲液pH 7.4中清洗两次，并且在山 羊F(ab)2抗小鼠免疫球蛋白或抗人免疫球蛋白抗体存在下再温育30分钟， 所述抗体用异硫氰酸荧光素(JACKSON IMMUNORESEARCH EUROPE LTD，Cambrideshire，UK)标记，以1/100稀释于1％PBS-BSA中。在PBS中 再次清洗3次之后，在去除死细胞和细胞碎片之后，使用流式细胞仪FACScan (Beton-Dockinson，Mountain View，CA)在SSC/FL1-H窗中分析10000个细胞。 在使用仅用第二抗体非特异性标记的对照调整基线(base)之后，将荧光高于1 Log的细胞判定为阳性。

获得的结果显示KM8B6抗体像8B6抗体一样仅识别IMR32细胞。

(b).通过在96孔微量滴定板中对干燥细胞进行ELISA酶联免疫测定法

在表达O-乙酰化GD2的IMR32细胞和不表达O-乙酰化GD2的Neuro 2A细胞上检查抗体特异性。通过用胰蛋白酶处理使肿瘤细胞的体外培养物 从它们的培养基底(substrate)上分离。用PBS清洗3次之后，将细胞分配在 Maxisorp平底微量滴定板(NUNC A/S，Roskilde，Denmark)中，每孔10⁵个细 胞，于50μL体积的PBS中。其后将所述平板置于37℃烘箱中过夜以使PBS 蒸发。可以直接使用该平板或在使用前于室温保存数月。对于分析，首先将 平板在室温于搅拌条件下(under stirring)与200μL含有1％BSA的PBS缓冲 溶液pH 7.4一起温育1小时以使非特异性位点饱和。其后将平板在室温于搅 拌条件下与100μL稀释在含0.1％BSA的PBS缓冲液中的抗体溶液一起温 育2小时。清洗3次(每次用200μL PBS缓冲液)之后，在每个孔中加入100 μL以1/2500稀释在0.1％PBS-BSA中的F(ab′)2溶液，所述F(ab′)2来自对全 体小鼠免疫球蛋白或对全体人免疫球蛋白特异性的生物素化的抗体 (JACKSON IMMUNORESEARCH EUROPE LTD，Cambrideshire，UK)。在室 温于搅拌条件下温育1小时并且在PBS中清洗3次之后，将0.1％PBS-BSA 中的生物素化的抗生蛋白链菌素过氧化物酶(biotinylated streptavidine peroxydase)(JACKSON IMMUNORESEARCH EUROPE LTD，Cambrideshire， UK)的溶液反应1小时，之后通过清洗去除。通过添加100μL ABTS底物 (ROCHE DIAGNOSTICS GMBH MANNHEIM，Germany)使固定的复合物显 影。通过以不同时间间隔在分光光度计(Multisan EX，Thermo Electron Corporation，Waltham，MA)上于405nm处对平板进行读数来测定光密度。

获得的结果显示KM8B6抗体像8B6抗体一样以剂量依赖性方式专有地 (exclusively)固定在IMR32细胞上。

(c)在硅薄层上

对IMR32细胞的总神经节苷酯提取物进行分析。根据Ariga等(1991)描 述的技术提取组织神经节苷酯。将待提取的样品在10体积的氯仿/甲醇(C∶M) 混合物(1∶1，v/v)中研磨，并且在机械搅拌下放置于室温过夜。过滤之后，将 残余物取至2.5体积的(C∶M)(1∶1，v/v)中，并且重新开始再搅拌6小时。其后 过滤混合物，并且使两份滤液在减压条件下在旋转蒸发器上蒸发。其后将干 燥的残余物置于含有2mL乙酸盐形式的DEAE-Sephadex A-25(SIGMA CHEMICALS Co)的柱上。通过15mL溶剂A去除中性脂质。其后用15mL 含0.4M乙酸钠(SIGMA CHEMICALS Co)的甲醇洗脱神经节苷酯。向所得级 分加入30mL PBS pH 7.4用于在C18疏水凝胶的Sep-Pak柱(Waters Co.， Milford，MA，USA)上根据McLuer的方法(1990)脱盐。首先用两倍柱体积的 甲醇，其后用1∶2(v/v)甲醇/PBS混合物来调节(condition)所述C18凝胶。其 后使待脱盐的提取物以1mL/min的速率通过柱。神经节苷酯的烃链通过疏 水键与凝胶相互作用，而盐和其它非疏水分子通过两倍柱体积的蒸馏水去 除。其后用一份体积的甲醇，再用一份体积的2∶1(v/v)氯仿/甲醇混合物来洗 脱鞘糖脂。将从此柱洗脱的神经节苷酯浓缩至另一合适体积的2∶1(v/v)C/M 混合物中并且贮藏在-20℃。

其后通过薄层层析分离神经节苷酯。这种方法能够测定总神经节苷酯谱 (profile)。HPTLC平板包含涂于铝箔上的硅胶60(MERCK)。使点样的神经 节苷酯于室温在用迁移溶剂饱和的槽中迁移20分钟。这种溶剂(移动相)由 C/M/CaCl₂混合物的0.22％水溶液(50∶45∶10，v/v/v)组成。神经节苷酯的唾液酸 化越多，其极性越大，则移动将最少。用间苯二酚/HCl试剂(Svennerholm，1963) 以化学方法进行神经节苷酯平板检测。这种试剂仅与神经节苷酯特有的唾液 酸反应。用间苯二酚显影之后，观察到几条对应于来自总提取物的神经节苷 酯的迁移率的染色条带。对分离的神经节苷酯的鉴定或者依靠特异性单克隆 抗体进行，或者通过与用作标记物的标准神经节苷酯比较进行，其中所述标 记物与待检测的神经节苷酯提取物同时迁移。

神经节苷酯在硅薄层上迁移之后，将平板浸没在0.01％聚甲基丙烯酸异 丁酯(poly-(isobutyl)-methacrylate)的己烷溶液中1分钟，然后风干。这使得平 板塑化(plasticize)以防止凝胶在后续阶段与其基底分离。其后除了对抗体与 神经节苷酯结合(bonding)的显影之外，对包括干燥细胞的ELISA测定法的规 程进行监测，所述显影用即用即制的4-氯-1-萘酚(4-chloro-1-naphtol)溶液 (SIGMA ALDRICH CHEMIE GMBH，STENHEIM，Germany)(将1mg产品溶 解在1mL甲醇中)进行，将其取至20mL PBS中并且添加30μL 30体积的氧 合水(30μL of 30volume oxygenated water)。

结果显示，在不对神经节苷酯提取物进行碱处理的情况下，KM8B6抗 体像8B6抗体一样仅识别O-乙酰化GD2。

14.研究神经系统中和肿瘤组织上的GD2神经节苷酯分布及其O-乙酰 化形式

肿瘤样品(成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、肺癌)获得自外科切 除术。人外周神经样品收集自肌皮神经的端感分支(distal sensory branch)，腓 神经的侧分支(side branch)。这些是用于诊断外周神经病或前角病症的样品 (正常感觉神经)，所述状况给诊断带来问题。取样体积不大于0.5cm³的组织 并且冷冻在冷却至液氮温度的异戊烷中。60秒后，将样品取出并转移至预冷 至-70℃的冷冻试管中。依靠恒冷切片机切出冷冻组织的10μM切片。将切 片回收至Suoerfrost Gold+载玻片上(VWR)。使切片风干3分钟，然后在丙 酮中固定10分钟并且再次风干。其后将切片贮藏在-20℃，直到通过免疫组 织化学法对它们进行分析。使用以下小鼠初级mAb(primary mouse mAb)进 行组织样品的免疫染色：

GD2特异性的初级抗体：

GD2特异性的mAb 10B8(IgG3，κ)

GD2-O-Ac特异性的8B6mAb(IgG3，κ)

用作阴性对照试剂的初级抗体：DNP特异性的MCA2063mAb(IgG3，κ) (Serotec France，Cergy Saint Christophe，Rance)。

对这些抗体在测试组织样品上的结合的显影使用用于小鼠初级抗体的 DakoCytomation Envision+System，Peroxydase HRP试剂盒(DAKO，Glostrup， Denmark)根据供应商的指导进行。其后将样品用含水封固介质Aquadex (VWR)封固在载玻片和盖玻片之间。然后使用100和400倍放大率的光学显 微镜通过光学显微术分析进行标记测定。对每个分析的样品随机选择三个显 微视野的数字显微照片。

来自多位患者的所有肿瘤样品显示了用10B8和8B6抗体标记的阳性膜 和胞质，而健康细胞没有受到任何这些抗体的标记。未检测到MCA2063抗 DNP抗体的标记。

测试的全部神经样品显示在有髓鞘的神经纤维节间有10B8抗体标记， 而轴突和成纤维细胞显示无标记。对于8B6抗体未发现或者几乎检测不到这 种标记。用MCA2063抗体未观察到标记。

15.O-乙酰化8B6和KM8B6抗-GD2抗体的细胞毒性研究

(a).制备靶细胞悬液

将培养在RPMI培养基中的IMR32人成神经细胞瘤的1×10⁶个细胞在 1.85MBq的Na₂⁵¹CrO₄存在下在37℃温育1小时。其后用RPMI将细胞清 洗3次并且离心，之后重悬在RPMI中，再于4℃温育30分钟以测量放射 性物质的自发盐析。

在最后的离心之后，将细胞取至5mL RPMI中调整浓度至2×10⁵细胞/mL。

(b).制备效应细胞

从志愿捐献者采得人血装入含有肝素的血液试管中。以通过梯 度离心(1,800xg 30分钟)从全血分离外周血白细胞。将所得细胞在RPMI中 以1500xg离心3次以进行清洗，再重悬在RPMI中产生5×10⁶细胞/mL的 细胞浓度。

(c).测量ADCC活性

在从Falcon公司获得的U型底96孔微量滴定板的每个孔中，添加a) 中获得的50μL靶细胞悬液。其后添加b)中获得的100μL效应细胞悬液， 即每孔50000个细胞。靶细胞与效应细胞数的比例是1∶50。然后向各个孔以 1μg/mL或10μg/mL的浓度添加8B6抗体和人工修饰的KM8B6抗体，以及 用作阴性对照的κIgG1、抗CD20人-小鼠抗体。将混合物在37℃ 温育4小时。在离心之后，将平板离心并且使用γ计数器测量上清中⁵¹Cr的 量。根据相同方法通过添加不含抗体的基质和5N氢氧化钠溶液代替效应细 胞悬液来测量释放的⁵¹Cr总量。其后使用以下公式计算ADCC：

％ADCC活性＝(上清中的⁵¹Cr-自发释放的⁵¹Cr)/(总⁵¹Cr-自发释放的⁵¹Cr)

16.8B6抗体在小鼠淋巴瘤同系基因模型(syngenic model)中的肿瘤活性

在C57BL/6品系小鼠中，在小鼠EL-4T淋巴瘤的同系基因皮下移植物模 型中测定8B6抗体的抗肿瘤活性，所述淋巴瘤表达GD2抗原(Zhang H，Zhang S，Cheung NK，Ragupathi G，Livingston PO.Antibodies against GD2 ganglioside can eradicate syngenic cancer micrometastases.Cancer Res.1998，58：2844-9)。这 些EL4细胞还表达O-乙酰化GD2抗原。向在动物房中培育的证实为A1级的 二十四只小鼠在12周龄时皮下注射施用悬浮在PBS中的20×10⁴EL-4细胞。 组成两批各12只小鼠。从注射EL4细胞之后第一天起每3天(tous les 3 jours à partir du premier j our après l′injection des cellules EL4et jusqu′au 21^èmejour)向批 次A的小鼠静脉内注射施用70μg mAb 8B6(作为200μL PBS缓冲溶液中的 溶液)，直至第21天。根据相同的规程，向批次B的小鼠仅施用200μL PBS 溶液。其后每两天测量肿瘤的体积。肿瘤体积使用以下公式评估：体积(mm³) ＝长(mm)×宽²(mm²)×0.5(Zeng G，Li DD，Gao L，Birkle S，Bieberich E， Tokuda A，Yu RK；Alteration of ganglioside composition by stable transfection with antisense vectors against GD3-synthase gene expression.Biochemistry 1999 38：8762-9)。处死(肿瘤)体积＞3,000mm³的小鼠。

获得的结果示于图16。静脉内施用PBS的批次B，对应于无处理的对 照批次(图16，B图)。从接种后第10日起可以检测到肿瘤，并且随后显示 指数生长。接种后20天，除了2只之外的全部小鼠具有大于1000mm³的肿 瘤。在第30天之前根据动物实验规程处死了全部小鼠，因为它们的肿瘤大 于3000mm³。在用8B6抗体处理的批次A小鼠中(图16，图A)，观察到肿 瘤发育的延迟。另外，在施用这种抗体的小鼠中肿瘤生长放缓。在接种后20 天，经处理的小鼠均无大于1000mm³的肿瘤。30天之后，58％用8B6mAb 处理的小鼠存活，而未处理的小鼠全部死亡。40天之后，25％的经处理小 鼠仍然存活，并且在第50天之后，8％的经处理小鼠仍然存活并且未呈现明 显的肿瘤(palpable tumor)而被认为得到治愈。

序列表

<110>南特大学(Universite de Nantes)

<120>O-乙酰化形式GD2神经节苷酯特异性的单克隆抗体用于治疗一些癌症的用途

<130>67985

<140>PCT/EP2007/060750

<141>2007-10-10

<150>FR 06/08881

<151>2006-10-10

<160>27

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>137

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>1

Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly

1               5                   10                  15

Phe Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu

            20                  25                  30

Pro Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Glu Phe Thr Phe

        35                  40                  45

Thr Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Arg Lys Ala Leu

    50                  55                  60

Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu

65                  70                  75                  80

Tyr Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

                85                  90                  95

Gln Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Thr Glu Asp Ser Ala

            100                 105                 110

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

        115                 120                 125

Gln Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala

    130                 135

<210>2

<211>8

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>2

Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

1               5

<210>3

<211>10

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>3

Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr

1               5                   10

<210>4

<211>10

<211>10

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>4

Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr

1               5                   10

<210>5

<211>133

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>5

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Gly

1               5                   10                  15

Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

            20                  25                  30

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

        35                  40                  45

Leu Lys Asn Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ser

    50                  55                  60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser

65                  70                  75                  80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr

                85                  90                  95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys

            100                 105                 110

Ser Gln Ser Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

        115                 120                 125

Glu Leu Lys Arg Thr

    130

<210>6

<211>12

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>6

Gln Ser Leu Leu Lys Asn Asn Gly Asn Thr Phe Leu

1               5                   10

<210>7

<211>3

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>7

Lys Val Ser

1

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>8

Ser Gln Ser Thr His Ile Pro Tyr Thr

1               5

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>60C3VL特异性的反义引物

<400>9

tttcagctcc agcttggtcc cagc        24

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>60C3L-VL特异性的有义引物

<400>10

agggatccaa agacaaaatg gat         23

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>60C3L-VL特异性的反义引物

<400>11

ttcagctcga gcttggtccc agcacc      26

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>60C3L-VL特异性的有义引物

<400>12

agctcgagct gaaacgaact gtggctgcac   30

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>60C3L-VL特异性的反义引物

<400>13

cttctagatt taacactctc ccctgttga    29

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>8B6L-VL的有义引物

<400>14

aagggatccg ccaccatgaa gttgcctgtt   30

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>8B6L-VL的反义引物

<400>15

ccgttttatc tcgagcttgg tccc               24

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>60C3L-VH特异性的反义引物

<400>16

tgcagagaca gtgaccagca gagtagtccc         30

<210>17

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>60C3L-VH特异性的有义引物

<400>17

caggatccga acacactgac tctaaccatg g       31

<210>18

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>60C3L-VH特异性的反义引物

<400>18

tgctagctgc agagacagtg accagagt           28

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hu-C gamma 1特异性的有义引物

<400>19

cagctagcac caagggccca tcggtct tcc         30

<210>20

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hu-C gamma 1特异性的反义引物

<400>20

agcctctccc tgtctccggg taaataatct agacg    35

<210>21

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>有义引物BAmHI 60C3L-VH

<400>21

caggatccga acacactgac tctaaccatg g        31

<210>22

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反义引物BAmHI 60C3L-VH

<400>22

agcctctccc tgtctccggg taaataatct agacg    35

<210>23

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>8B6L-VH cDNA特异性的反义引物

<400>23

gatcaactca gtcttgctgg ctgggtggg           29

<210>24

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>有义引物BamHI 8B6L-VH

<400>24

ccgtcggatc cggccaccat gaagttgtgg         30

<210>25

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反义引物NheI 8B6L-VH

<400>25

cggggtgcta gctgaggaga ctgt               24

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>有义引物BamHI 60C3L-VH

<400>26

ccgtcggatc cggccaccat gaagttgtgg         30

<210>27

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反义引物NheI 8B6L-VH

<400>27

cggggtgcta gctgaggaga ctgt               24