口腔内用杀菌剂和含有该杀菌剂的食品添加剂

摘要

目的在于提供安全且副作用少，通过在饮食品中添加可以与饮食品一起食用，同时在口腔内发挥杀菌效果，而且即使长期日常摄取也不会不安全的杀菌剂，以及含有该杀菌剂的食品添加剂。提供含有乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖和pH调节成分的用于杀灭口腔内细菌的口腔内用杀菌剂。

说明书

技术领域

本发明涉及含有乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖和pH调节成分的用于杀灭口腔内细菌的口腔内用杀菌剂、以及含有该杀菌剂的食品添加剂。本发明的口腔内用杀菌剂和含有该杀菌剂的食品添加剂对由于口腔内细菌而引起的疾病的预防和/或治疗有效。

背景技术

牙周病作为口腔内的烦恼，是仅次于龋齿的第二多的疾病。牙周病是破坏牙龈、牙周组织、牙骨质、牙槽骨等牙周组织并影响其功能的疾病。仅次于牙周病的较多的口腔内烦恼是口臭。口臭症被分为由牙周病等原发疾病引起的病理性口臭和由于其他原因造成的生理性口臭，已知作为这种口臭的成因物质的挥发性含硫化合物的产生与以牙周病菌为代表的各种口腔内细菌相关(例如，非专利文献1)。

近年来，一直担心高龄者和需要护理的人士中，由于唾液和食物等的吸入(咽下液体或固体时误入气管)而导致的吸入性肺炎，而且现已指出口腔内细菌可能与这种吸入性肺炎的发病相关。也就是说，确保口腔内的卫生状态对高龄者和需要护理的人士来说，是关乎生命的重要事情，因此人们逐步认识到口腔护理的重要性(例如，非专利文献2)。

影响口腔内卫生状态的重要的口腔内细菌中，作为牙周病成因的牙周病菌，已知有属于革兰氏阴性菌的伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)和核粒梭形杆菌(Fusobacterium nucleatum)等。尤其是，伴放线放线杆菌是快速发展成重度牙周炎的急进性牙周炎的病因菌。口腔内，除了这些代表性的牙周病菌等病原菌外，还存在多种口腔内细菌，形成了口腔内菌群。

乳过氧化物酶作为乳蛋白质中的一种，是以哺乳类的乳汁为主、且唾液、泪液、呼吸道粘液等分泌液中也含有的氧化还原酶，工业上可以从牛乳中大规模纯化(例如，专利文献1、专利文献2)。已知该乳过氧化物酶在过氧化氢和硫氰酸的存在下催化次硫氰酸(Hypothiocyanic acid)的生成，呈现出强抗菌活性。一般来说，该抗菌系统(乳过氧化物酶在过氧化氢和硫氰酸的存在下，催化次硫氰酸的生成，呈现出强抗菌活性的系统)被称为乳过氧化物酶系统。

该乳过氧化物酶系统的抗菌活性方面，已知一般对龋齿菌等革兰氏阳性菌不呈现抗菌活性或杀菌活性，而且对牙周病菌中的许多革兰氏阴性菌的一部分菌种呈现抗菌活性(例如，专利文献3)。另一方面，据报道，即使是革兰氏阴性菌中，如上所述已知也存在与牙周病相关的伴放线放线杆菌和核粒梭形杆菌等对乳过氧化物酶系统的感受性低，也就是说乳过氧化物酶系统对伴放线放线杆菌等的杀菌活性不充分(例如，非专利文献3)。对此，为了维持对伴放线放线杆菌和核粒梭形杆菌的充分的杀菌活性，提出了在乳过氧化物酶系统中组合碘离子以代替硫氰酸的乳过氧化物酶系统(例如，非专利文献4)。

上述乳过氧化物酶系统中使用的硫氰酸及其盐一般不允许作为食品添加剂，将来也不可能被允许。而且，作为硫氰酸的替代品而提出的碘离子和碘化合物也不允许作为食品添加剂，而且将来也没有这种可能性。

专利文献1：日本特开平5-41981号公报

专利文献2：国际公开WO2005/078078号小册子

专利文献3：日本特公平4-25924号公报

非专利文献1：“Clinical Guideline For Halitosis”，K.Yaegaki ed.，Quintessence Pub.，Tokyo，2000，pp.13-26

非专利文献2：Gerodontology、英国、第23卷、2006年、p.55～59

非专利文献3：Journal of Periodontal Research、丹麦、第33卷、1998年、p.421～427

非专利文献4：International Journal of Antimicrobial Agents、荷兰、第21卷、2003年、p.434～440

发明内容

发明要解决的问题

如上述所述，口腔内卫生状态的确保对于预防牙周病和口臭症很重要。尤其是，在高龄者和需要护理的人士中，为了避免吸入性肺炎，口腔护理也极为重要。

然而，在高龄者和需要护理的人士中，为了口腔护理而进行刷牙、刷牙后再漱口吐出牙膏的操作，许多情形下对于本人和护理者来说都是极为困难且伴随痛苦的工作。尤其是，如果吐出失败而因此引起吸入事故，则由此很有可能发生吸入性肺炎。也就是说，刷牙等口腔护理，根据高龄者和需要护理的人士的状态而言，作为口腔内卫生状态的确保手段，是风险极大的手段。

因此，作为口腔内卫生状态的确保手段，寻求不需要刷牙、漱口、吐出等的口腔护理方法。

另一方面，给予只允许作为药品的强力合成杀菌剂等的手段虽对于暂时提高口腔内卫生状态是有用的，但作为数年以上长期日常性使用的卫生状态确保手段，从安全性方面来说还存在不安全性。

鉴于这些方面，本发明人等获得了如下构想，即，如果使用安全且副作用少，能添加在饮食品中与饮食品一起食用，同时在口腔内发挥杀菌效果，而且即使长期日常摄取也不会不安全的杀菌剂，则成为完全解决上述问题的口腔护理手段。

因此，本发明的目的在于提供安全且副作用少，通过在饮食品中添加能够与饮食品一起食用，同时在口腔内发挥杀菌效果，而且即使长期日常摄取也不会不安全的杀菌剂、和含有该杀菌剂的食品添加剂。

用于解决问题的方案

为了实现上述目的，本发明人等对能够在饮食品中添加的杀菌剂进行了积极的探索研究。而且，着眼于含有乳蛋白质中的乳过氧化物酶的乳过氧化物酶系统。但是，该乳过氧化物酶系统以不允许作为食品添加剂的硫氰酸等作为必需的成分。

可是，在探索研究的过程中，不在乳过氧化物酶系统中添加硫氰酸而只测定其它成分在人唾液中的杀菌活性，结果发现通过不添加硫氰酸和其替代物质而添加pH调整成分，可发挥强杀菌活性。

也就是说，本发明人等发现，通过使用组合了乳蛋白质中的乳过氧化物酶和葡萄糖氧化酶、葡萄糖和pH调节成分的系统(体系)来作为口腔内用杀菌剂，可以实现上述目的，从而完成了本发明。

而且令人惊奇的是，本发明的口腔内用杀菌剂对于以往认为对乳过氧化物酶系统感受性低的口腔内细菌伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)有抗菌活性。

因此，本发明在于如下的(1)～(8)。

(1)一种用于杀灭口腔内细菌的口腔内用杀菌剂，其含有乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖和pH调节成分作为有效成分。

(2)根据(1)所述的口腔内用杀菌剂，其中，pH调节成分为有机酸和/或有机酸的盐类。

(3)根据(2)所述的口腔内用杀菌剂，其中，有机酸为选自于柠檬酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸和谷氨酸所组成的组中的至少1种以上的酸。

(4)根据(1)～(3)任一项所述的口腔内用杀菌剂，其通过pH调节成分调节pH条件至pH5.9～pH4.4的范围。

(5)根据(1)～(4)任一项所述的口腔内用杀菌剂，其中口腔内细菌是伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)。

(6)一种食品添加剂，其含有(1)～(5)任一项所述的口腔内用杀菌剂的。

(7)一种牙周病、口臭症或吸入性肺炎的预防和/或治疗用的食品添加剂，其含有(1)～(5)任一项所述的口腔内用杀菌剂。

(8)一种牙周病、口臭症或吸入性肺炎的预防和/或治疗用的药物组合物，其含有(1)～(5)任一项所述的口腔内用杀菌剂。

进而，本发明还在于如下的(9)～(14)。

(9)一种饮食品，其含有(1)～(5)任一项所述的口腔内用杀菌剂或(6)～(7)任一项所述的食品添加剂。

(10)一种牙周病、口臭症或吸入性肺炎的预防和/或治疗用的饮食品，其含有(1)～(5)任一项所述的口腔内用杀菌剂或(6)～(7)任一项所述的食品添加剂。

(11)乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖和pH调节成分在制造用于杀灭口腔内细菌的口腔内用杀菌剂中的用途(用途)。

(12)乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖和pH调节成分在制造食品添加剂中的用途(用途)。

(13)乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖和pH调节成分在制造饮食品中的用途(用途)。

(14)通过在口腔内给予有效量的(1)～(5)任一项所述的口腔内用杀菌剂、(6)～(7)任一项所述的食品添加剂、(8)所述的药物组合物、或(9)～(10)所述的饮食品来预防和/或治疗牙周病、口臭症、或吸入性肺炎的方法(方法)。

发明的效果

本发明的口腔内杀菌剂和食品添加剂不仅作为口腔内卫生状态的确保手段是有效的，而且安全、副作用少，通过在饮食品中添加可以与饮食品一起食用，同时在口腔内发挥杀菌效果，而且即使长期日常摄取也不会不安全。

而且，通过本发明的口腔内用杀菌剂和食品添加剂进行的口腔护理，不再迫使高龄者和需要护理的人士进行刷牙、刷牙后再漱口、然后吐出牙粉这种对本人和护理者而言极为困难且伴随痛苦的、对于高龄者和需要护理的人士的状态而言风险大的操作。

而且，本发明的口腔内用杀菌剂和食品添加剂起到以下所示的效果。

(1)可以有效杀灭口腔内细菌。

(2)对由口腔内细菌引起的疾病的预防和/或治疗有效。

(3)对人的安全性高，可以日常摄取。

(4)通过添加在饮食品中，可以提供对预防牙周病等有效的饮食品。

附图说明

图1是表示本发明的口腔内杀菌剂的给予带来的人呼出气体中的硫化氢量的变化的图。

图2是表示本发明的口腔内杀菌剂的给予带来的人呼出气体中的挥发性含硫化合物的变化的图。

具体实施方式

接下来，对本发明的优选实施方式进行详细的说明。但是，本发明并不限于以下优选的实施方式，可以在本发明的范围内自由地进行变化。而且，本说明书中的百分率如没有特别说明，都表示质量百分率。

本发明中使用的乳过氧化物酶可以从哺乳类的乳汁等中获得，例如，可以从人、牛、马、绵羊、山羊等的乳汁等中获得。例如，优选像日本特开平5-41981公报(发明名称：含有活菌的液状组合物)中公开的方法那样，从乳汁等未加热的乳清或脱脂乳中按照常规方法(例如，离子交换层析等)进行工业化制造，而且，还可以使用市售的天然物来源的乳过氧化物酶(例如Biopole公司制等)、或重组型乳过氧化物酶〔例如，通过シン等人的方法(Biochemical and Biophysical ResearchCommunications、第271卷、2000年、p.831-836)表达和纯化的重组型乳过氧化物酶或市售的重组型乳过氧化物酶〕。

本发明中使用的乳过氧化物酶可优选使用来源于哺乳类的乳汁的乳过氧化物酶。在口腔内用杀菌剂、食品添加剂、药物组合物中使用时，优选传统上可用于饮食的牛、羊、山羊等的乳汁来源的乳过氧化物酶，尤为优选牛奶来源的乳过氧化物酶。这是因为，由于它们长期在人的饮食中使用，因此能够以极高水准确保对人的安全性。

而且，由于牛乳来源的未加热的乳清可以作为乳制品制造的副产物稳定且大量地获得，因此作为本发明中使用的乳过氧化物酶的原料是特别优选的。

本发明中使用的葡萄糖氧化酶可以使用例如黑曲霉(Aspergillus niger)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)等微生物生产的酶中的、市售的葡萄糖氧化酶(例如，新日本化学工业公司制等)。

本发明中使用的葡萄糖可以使用例如市售品的食品添加剂用的葡萄糖(例如，日本食品化工公司制等)。

作为本发明中使用的pH调节成分，只要具有将口腔内用杀菌剂悬浮于唾液等溶剂时的pH稳定在4.4～5.9的弱酸性的缓冲能力，则可以是任意一种，例如可以使用有机酸和/或有机酸的盐类，例如可以使用选自于市售的食品添加剂中的柠檬酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸、谷氨酸等所组成的组中的至少1种以上的酸和选自于柠檬酸盐(例如，柠檬酸三钠、柠檬酸三钾等)、乳酸盐(例如，乳酸钠等)、苹果酸盐(例如，苹果酸钠等)、琥珀酸盐(例如，琥珀酸一钠、琥珀酸二钠等)、酒石酸盐(例如，酒石酸钠、酒石酸氢钾等)、谷氨酸盐(例如，谷氨酸钠、谷氨酸钾等)等所组成的组中的至少1种以上盐类的组合。

这些葡萄糖氧化酶、葡萄糖、有机酸和盐类均作为食品添加剂被广泛利用，而且也有售卖，可以容易获得。

乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖、有机酸和盐类通过与唾液混合而具有杀灭口腔内细菌的作用，因此可以作为口腔内用杀菌剂(以下，有时也称为“本发明的杀菌剂”、“本发明的杀菌剂组合物”或“本发明的组合物”。)的有效成分来使用。这里，“有效成分”是指对杀灭口腔内细菌的作用有贡献的成分。而且，本发明的杀菌剂中，除了与乳过氧化物酶系统相关的成分以外，还可以含有具有杀灭口腔内细菌作用的成分。例如，本发明的杀菌剂中还可含有属于乳汁中其它有用的蛋白质的乳铁蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、酪蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白等、起益生菌作用的乳酸菌等。

本发明的口腔内用杀菌剂具有杀灭口腔内细菌的作用。因此，本发明的杀菌剂可以用作例如：对由口腔内细菌引起的牙周病、口臭症或吸入性肺炎等各种疾病具有预防和治疗效果的杀菌剂。但是，本发明的口腔内用杀菌剂不限定于预防和/或治疗由口腔内细菌引起的疾病这一用途。

本发明的口腔内用杀菌剂，由于作为其有效成分的乳蛋白质、酶、糖类、酸、和盐类等作为食品原料和食品添加剂使用，因此对人的安全性高，而且具有如下特征，即，通过日常经口摄取而对由口腔内细菌引起的疾病发挥预防和/或治疗的效果。作为前述由口腔内细菌引起的疾病，可以列举牙周病、口臭症、吸入性肺炎等。

本发明的口腔内用杀菌剂可以是乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖、酸和盐类的混合物本身，还可以含有这些之外的成分。乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖、酸和盐类以外的成分可以根据摄取的形态进行适当选择。例如，可以通过经口等给予方法而适当使用，还可以通过公知的方法加工成片剂、胶囊剂、含片剂(troche)、糖浆剂、颗粒剂、散剂等。

本发明的口腔内用杀菌剂可如下制造，例如可以通过使用药学上容许的赋形剂等任意的添加剂将作为有效成分的乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖和pH调节成分制剂化来制造。可以以同样方式将本发明的食品添加剂制剂化。制剂化时，制剂中的有效成分的含量通常为0.005～20质量％，优选为0.05～12.5质量％。制剂化时，可以使用赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、矫味矫臭剂、稀释剂、注射剂用溶剂等添加剂。

作为赋形剂，可以列举例如乳糖、白糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇等糖衍生物，玉米淀粉、马铃薯淀粉、α-淀粉、糊精、羟甲基淀粉等淀粉衍生物，结晶纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙等纤维素衍生物，阿拉伯树胶，葡聚糖(dextran)，普鲁兰多糖(pullulan)，轻质无水硅酸、合成硅酸铝、偏硅酸铝酸镁(magnesiumaluminometasilicate)等硅酸盐衍生物，磷酸钙等磷酸盐衍生物，碳酸钙等碳酸盐衍生物，硫酸钙等硫酸盐衍生物等；作为结合剂，例如，除上述赋形剂之外，还可以列举明胶，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇(macrogol)等；作为崩解剂，例如，除上述赋形剂之外，还可以列举交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮等经化学修饰的淀粉或纤维素衍生物等；作为润滑剂，可以列举例如滑石，硬脂酸，硬脂酸钙、硬脂酸镁等硬脂酸金属盐，硅溶胶；蜂胶、鲸蜡等蜡类，硼酸，二元醇，富马酸、己二酸等羧酸类，苯甲酸钠等羧酸钠盐，硫酸钠等硫酸类盐，亮氨酸，月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁等月桂基硫酸盐，无水硅酸、硅酸水合物等硅酸类，淀粉衍生物等；作为稳定剂，可以列举例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸酯类，氯丁醇、苄醇、苯乙醇等醇类，苯扎氯铵，醋酸酐，山梨酸等；作为矫味矫臭剂，可以列举例如甜味剂、酸味剂、香料等，作为注射剂用溶剂，可以列举例如水、乙醇、甘油等。

而且，本发明的口腔内用杀菌剂和食品添加剂还可以配合在饮食品中进行给予。给予量和给予次数根据目标作用效果、给予方法、治疗时间、年龄、体重等而不同，但给予量通常可以在成人每1天10mg～10g的范围内进行适当选择，给予次数可以在1天1次至1天数次的范围内适当选择。而且，作为给予时间，优选在7天以上。

作为本发明的配合了含有乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖、酸和盐类的口腔内用杀菌剂或食品添加剂的饮食品的形态，可以列举例如清凉饮料、乳饮料等或这些饮料的浓缩原液和调整用粉末；加工乳、发酵乳等乳制品；经肠营养食品及其调整用粉末、粘稠调整食品；功能性食品等，而且还可以列举碳酸饮料、营养饮料、果实饮料等饮料(包括这些饮料的浓缩原液和调整用粉末)；冰淇淋、冰冻果子露、刨冰等冷饮；荞麦面、乌冬面、粉丝、饺子皮、烧麦皮、中国面、方便面等面类；饴糖、口香糖(chewing gum)、糖块、口香糖(gum)、巧克力、片状点心、小吃、饼干、果冻、果酱、奶油、烤制点心等点心类；鱼糕、火腿、香肠等水产和畜产加工食品；色拉油、天麸罗油、人造黄油、蛋黄酱、起酥油、生奶油、调味汁等油脂和油脂加工食品；沙司、佐料等调味料；汤、炖菜、色拉、家常菜、腌制菜、面包等。这种饮食品例如可以通过在本发明的口腔内用杀菌剂或食品添加剂(包括粉末或其水溶液(糖浆等)等形态)中配合糊精、淀粉等糖类，明胶、大豆蛋白、玉米蛋白等蛋白质，丙氨酸、谷氨酸、异亮氨酸等氨基酸类，纤维素、阿拉伯胶等多糖类，大豆油、中链脂肪酸甘油三酯等油脂类等来制造。

作为饮食品的合适的形状，可以例示药片状的补充剂。由此，可以准确把握有效成分的摄取量和与有效成分同时被摄取的热量。

此外，作为饮食品的优选的形状，可以列举液体，尤其是粘稠的液体。这是因为液体遍布到口腔内各处，尤其是容易渗透到牙周病中出现问题的牙的硬组织和牙龈组织之间，粘稠的液体滞留在口腔内的时间变长，由此可以更有效地发挥杀菌效果。因此，上述制剂和饮食品中，液体、尤其是粘稠液体的形态是本发明的优选形态。

而且，本发明的口腔内用杀菌剂或食品添加剂可配合到标识出以下所示疾病的预防用或治疗用的功效的饮食品中。也就是说，这种饮食品和本发明的饮食品可标识出由口腔内细菌引起的疾病、例如牙周病、口臭症、吸入性肺炎等的预防用或治疗用。

这里，所谓的“标识”是指告知需要前述功效的人的行为，例如，在配合了本发明的口腔内用杀菌剂或食品添加剂的饮食品或本发明的饮食品的商品或者商品的包装/广告等中附加前述功效的行为，转让、提供、展示附加了上述功效的产品的行为等，特别优选标识为特定保健用食品〔参照健康增进法施行规则(平成15年4月30日、日本厚生劳动省令第86号)的第12条第1项第5号〕的方式。

[实施例]

下面，通过列举实施例对本发明进行详细的说明。本发明并不限于以下实施例。

如上所述，本发明在探索研究的过程中，并非在乳过氧化物酶系统中添加硫氰酸，而只测定其它成分在人唾液中的杀菌活性，结果发现不添加硫氰酸及其代替物质，而通过添加pH调整成分，可发挥强杀菌活性，从而完成本发明。

关于本发明的口腔内用杀菌剂发挥杀菌活性的机制，本发明人等设想是由于唾液中存在微量的硫氰酸，因为这种作用而导致抗菌活性发挥，于是进行了以下实验，并确认了本发明的口腔内杀菌剂的效果可靠地再现。

本发明中，为了评价口腔内用杀菌剂产生的对口腔内细菌的杀菌作用，对迄今为止有报道的对乳过氧化物酶、过氧化氢、硫氰酸的组合所形成的乳过氧化物酶系统的感受性低(International Journal of Antimicrobial Agents、荷兰、第21卷、2003年、p.434～440)的人口腔内细菌中的伴放线放线杆菌，研究了口腔内用杀菌剂的杀菌活性。予以说明，作为溶剂，使用人唾液试样或者添加了与唾液同水平的0.5mM硫氰酸的磷酸缓冲生理盐水来代替唾液。详细内容按照后述的试验例的方法。

以下通过示出试验例，详细说明本发明的口腔内用杀菌剂的作用。

[试验例1]

本试验是为了研究口腔内用杀菌剂对口腔内细菌的效果而进行的。

(1)试样的制备

添加赤藓醇(日研化学公司制)15g、还原麦芽糖糖稀(东和化成公司制)52.5g、山梨糖醇(东和化成公司制)30g、玉米淀粉(Oji Cornstarch Co.，Ltd.)15g、金虎尾香料(高砂香料工业公司制)0.75g、蔗糖脂肪酸酯(Mitsubishi-Kagaku FoodsCorporation制)6g、柠檬酸一水合物(国产化学公司制)2.58g、柠檬酸三钠二水合物(国产化学公司制)5.21g、木糖醇(和光纯药公司制)18g、葡萄糖(和光纯药公司制)4.5g、乳过氧化物酶(Biopole公司制)0.05g、葡萄糖氧化酶(新日本化学工业公司制)0.4g的各粉末，然后在研钵中混合均匀，制成混合物，作为试验试样。而且，制作只是不添加乳过氧化物酶的混合物作为对照试样。

(2)菌液的制备

使用脑心浸液液体培养基(BD公司制)过夜培养伴放线放线杆菌JCM8578(由理化学研究所分售)，制备菌液。

(3)试验方法

在容量50ml的灭菌一次性管中添加0.5g试验试样或对照试样。然后，添加3.3ml含有与人的唾液相同水平的0.5mM硫氰酸钠的磷酸缓冲生理盐水，悬浮后，添加33.3μl的上述菌液，搅拌后，于37℃下在填充了10％二氧化碳的培养箱中保持15分钟。用磷酸缓冲生理盐水将该混合液以每次10倍阶梯稀释，涂布在通过添加10％马血清、0.1％酵母提取物、75μg/ml杆菌肽、5μg/ml万古霉素而使伴放线放线杆菌选择性生长的胰酪胨大豆(Tryputicase Soy)琼脂培养基(Journal of ClinicalMicrobiology，美国、第15卷、1982年、p.606～609)上，于37℃，在填充了10％二氧化碳气体的培养箱中培养3天后，测定在琼脂培养基上形成的菌落数。根据检测出的伴放线放线杆菌的菌落数，求出每1ml上述悬浮液中的活菌数的对数值(log₁₀cfu/ml)。

(3)试验结果

本试验的结果示于表1。

[表1]

  试样  伴放线放线杆菌的菌数(log₁₀cfu/ml)  试验试样  N.D.  对照试样  6.82

N.D.：检测限以下(＜1.70)

初始菌数：7.0log₁₀cfu/ml

该结果表明，含有乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖、酸和盐类的试验试样使伴放线放线杆菌的活菌数减少到检测限以下，显示出非常强的杀菌效果。另一方面，在只是不含乳过氧化物酶的对照试样中活菌数基本没有变化。而且，在相同条件下，使用经过滤灭菌的采自健康成人的唾液来代替添加了硫氰酸钠的磷酸缓冲生理盐水，确认了试验试样的强杀菌活性。

[试验例2]

本试验是为了研究口腔内用杀菌剂对口腔内细菌的效果中pH调整剂和葡萄糖的影响而进行的。

(1)试样的制备

添加赤藓醇(日研化学公司制)15g、还原麦芽糖糖稀(东和化成公司制)52.5g、山梨糖醇(东和化成公司制)30g、玉米淀粉(Oji Cornstarch Co.，Ltd.)15g、金虎尾香料(高砂香料工业公司制)0.75g、蔗糖脂肪酸酯(Mitsubishi-Kagaku FoodsCorporation制)6g、木糖醇(和光纯药公司制)18g、乳过氧化物酶(Biopole公司制)0.05g、葡萄糖氧化酶(新日本化学工业公司制)0.4g的各粉末，在研钵中混合均匀，制成不含葡萄糖、酸和盐类的混合物。

(2)菌液的制备

用与试验例1同样的方法制备伴放线放线杆菌的菌液。

(3)试验方法

在容量50ml的灭菌一次性管中添加0.459g不含上述pH调整剂和葡萄糖的混合物。然后，添加3倍浓度的磷酸缓冲水溶液1.11ml、100mM柠檬酸缓冲液(pH4.6、5.0、5.4、5.8、或6.2)或100mM磷酸缓冲液(pH6.6、7.0、或7.4)1.0ml、50mM硫氰酸钠33.3μl，再添加15mg/ml葡萄糖水溶液和纯化水，使得葡萄糖终浓度为0、0.045、0.15、0.45、1.5或4.5mg/ml并且总计添加液量达到3.3ml，悬浮后，再添加33.3μl的上述菌液，进行搅拌，然后于37℃下在填充了10％二氧化碳气体的培养箱中保持15分钟。用与试验例1同样的方法测定该混合液中的伴放线放线杆菌的活菌数。本试验的杀菌活性的评价基准是：在活菌数降低到接种菌数的十分之一以下时，判断为有效。

(3)试验结果

本试验的结果示于表2。

[表2]

N.D.：检测限以下(＜1.70)

初始菌数：6.06log₁₀cfu/ml

表2中，各行表示添加了各pH的缓冲液时的悬浮液的pH实测值，各列表示不同葡萄糖浓度下的结果。其结果为，pH实测值在5.9以下的弱酸性条件下，在添加葡萄糖时，所有的葡萄糖浓度下均具有有效的杀菌活性。也就是说，可知本发明的口腔内用杀菌剂通过添加具有缓冲能力的酸和盐类，使悬浮在溶剂时的pH达到5.9以下，从而获得了强杀菌活性。该杀菌活性优选在pH5.9以下有效发挥，当葡萄糖浓度在0.15mg/ml以上时，通过使pH值达到5.5以下，可有效发挥使菌数达到检测限以下的程度的效果，当葡萄糖浓度在0.45mg/ml以上时，只要通过使pH值达到5.9以下，可有效发挥使菌数达到检测限以下的程度的效果，当葡萄糖浓度在1.5mg/ml以上时，只要使pH值达到6.8以下，可有效发挥使菌数达到检测限以下的程度的效果，当葡萄糖浓度在4.5mg/ml以上时，通过使pH值达到7.1以下，可有效发挥使菌数达到检测限以下的程度的效果。而且，在葡萄糖浓度为0.15mg/ml以上的条件下，在pH4.4～pH7.1的范围内的任一pH时，均具有有效的杀菌活性。根据该结果进行计算，可知口腔内用杀菌剂中的葡萄糖配合量方面，当使用上述任意一种缓冲液作为酸和盐类时只要组合物中的葡萄糖含量(葡萄糖重量在混合物、葡萄糖、酸、和盐类的总计重量中所占的百分率)在0.1％以上，则可以获得强杀菌效果。

根据以上结果可知，本发明的口腔内用杀菌剂利用存在于唾液中的微量的硫氰酸而发挥其杀菌活性。而且，还可知对以往被认为乳过氧化物酶系统的杀菌效果无法杀灭的伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)也可发挥杀菌活性。

本发明的口腔内用杀菌剂其自身不含硫氰酸成分，不需要添加外部的硫氰酸，通过存在于唾液中的微量浓度的硫氰酸可充分发挥杀菌活性，因此本发明的口腔内用杀菌剂在作为药品时，对于常常弄错服药量的高龄者和需要护理的人士来说是一种可以极为放心使用的杀菌剂，作为食品添加剂也是极为放心的。

而且，由于本发明的口腔内用杀菌剂对伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)可发挥杀菌活性，因此本发明提供了一种新的伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)用口腔内用杀菌剂。

下面，通过列出制造例(实施例1)对本发明进行更为详细的说明，但本发明并不限于以下制造例。

实施例1

添加赤藓醇(日研化学公司制)150g、还原麦芽糖糖稀(东和化成公司制)525g、山梨糖醇(东和化成公司制)300g、玉米淀粉(Oji Cornstarch Co.，Ltd.)150g、金虎尾香料(高砂香料工业公司制)7.5g、蔗糖脂肪酸酯(Mitsubishi-Kagaku FoodsCorporation制)60g、柠檬酸(San-Ei Gen F.F.I.公司制)25.8g、柠檬酸三钠(San-Ei Gen F.F.I.公司制)52.1g、木糖醇(东和化成公司制)180.1g、葡萄糖(日本食品化工公司制)45g、乳过氧化物酶(Biopole公司制)0.5g、葡萄糖氧化酶(新日本化学工业公司制)4g的各粉末，并均匀混合，使用压片机(HataIron Works Co.，Ltd制)，制成每片0.5g的片剂，以12片/分钟的压片速度、9.8KPa的压力将前述混合粉末连续压片，制成1800片(约900g)口腔内用杀菌剂的药片。

[试验例3]

本试验是为了研究本发明的口腔内用杀菌剂产生的对人口臭的效果而进行的。

(1)试样的制备

(试验试样)

实施例1的方法中，除了片剂以每片0.6g的质量压片之外，其余用与实施例1同样方法制造药片(本发明的口腔内用杀菌剂)，将其作为试验试样。

(对照试样)

而且，在前述试验试样中，除了用还原麦芽糖糖稀代替乳过氧化物酶和葡萄糖氧化酶以外，其它成分按同样的组成，用与实施例1同样的方法制造药片，将其作为对照试样。

(2)试验方法

(试验组)

对在试验日起床后禁止进行刷牙和漱口等牙齿的清洁、饮水以及饮食的3名正常人受试者，在试验日的上午，每次将一片试验试样(药片)在口腔内溶解，连续服用3片(试验组)。

在药片摄取前以及摄取1小时后和2小时后的各个时间点采集口腔内的呼出气体，用口臭测定器(Abilit公司制、Oral Chroma)测定已知是口臭成因物质的硫化氢的变化量和挥发性含硫化合物的变化量(硫化氢、甲硫醇、二甲基硫的总变化量)，用每10ml呼出气体的ng数表示3名受试者的平均值。

(对照组)

而且，作为对照试验，在与前述试验日的其它日子，对在试验日起床后禁止进行刷牙和漱口等牙齿的清洁、饮水以及饮食的3名正常人受试者，用与前述试验组同样的方法使受试者服用3片对照试样(药片：不含乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶)，用口臭测定器测定口腔内的呼出气体(对照组)。

(无摄取组)

进而，在与试验组、对照组不同的试验日的其它日子，与试验组和对照组一样，对在试验日起床后禁止进行刷牙和漱口等牙齿的清洁、饮水以及饮食的3名正常人受试者，不摄取任何药片，用口臭测定器测定口腔内的呼出气体中的硫化氢的变化量和挥发性含硫化合物的变化量(无摄取组)。

(3)试验结果

本试验的结果示于表3和表4。表3示出了各组中呼出气体中的硫化氢的变化量。而且，表4示出了各组中呼出气体中的挥发性含硫化合物的变化量。此外，图1和图2是将表3和表4图像化的图。

[表3]

[表4]

a)硫化氢的变化量

由表3和图1可知，受试者在什么都不摄取的状态(无摄取组：图1中用□表示)下，1小时后呼出气体中的硫化氢量稍微上升0.50ng/10ml，而且，2小时后呼出气体中硫化氢的变化量达到3.14ng/10ml，但通过摄取本发明的药片(试验组：图1中用●表示)，1小时后比摄取前减少2.54ng/10ml，2小时后虽比1小时后增加0.17ng/10ml，但是依然维持在比摄取前低2.37ng/10ml的状态。而且，在摄取了不含乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶的药片的组(对照组：图1中用▲表示)中，摄取1小时后比摄取前暂时减少了1.02ng/10ml，而在2小时后，呼出气体中的硫化氢量又恢复到摄取前的状态，看不到使呼出气体中的硫化氢量保持在较低状态的效果。也就是说，在摄取1小时后，试验组与对照组相比，显示出约2.5倍的硫化氢的减少量。此外还可知，即使在对照组的硫化氢的变化转变成增大的2小时后，试验组中这种硫化氢的减少状态也维持在与摄取1小时后相同的程度。

b)挥发性含硫化合物的变化量(硫化氢、甲硫醇、二甲基硫的总变化量)

由表4和图2可知，受试者在什么都不摄取的状态(无摄取组：图2中用□表示)下，1小时后呼出气体中的挥发性含硫化合物的变化量稍微上升0.37ng/10ml，而且，2小时后呼出气体中的挥发性含硫化合物的变化量达到5.30ng/10ml，但通过摄取本发明的药片(试验组：图2中用●表示)，1小时后比摄取前减少3.93ng/10ml，即使2小时后与1小时后相比增加1.99ng/10ml，但是依然维持在比摄取前低1.94ng/10ml的状态。而且，在摄取不含乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶的药片的组(对照组：图2中用▲表示)中，摄取1小时后比摄取前暂时减少1.48ng/10ml，但在2小时后，呼出气体中的挥发性含硫化合物的总量又恢复到摄取前的状态，看不到使呼出气体中的挥发性含硫化合物的总量保持在较低状态的效果。也就是说，试验组在摄取1小时后与对照组相比，显示出约2.6倍的挥发性含硫化合物的减少量。此外还可知，即使在对照组的挥发性含硫化合物的变化转变成增大的2小时后，试验组中这种挥发性含硫化合物的减少状态也维持在摄取1小时后的约一半左右。

以上内容表明，口腔内的呼出气体中的硫化氢或挥发性含硫化合物的总量由于摄取含有乳过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的本发明的口腔内用杀菌剂(试验组)而减少，而且本发明的口腔内用杀菌剂具有使这种减少的状态维持一段时间的效果。也就是说，可以得知本发明的口腔内用杀菌剂不仅在体外的实验系统可发挥这种杀菌活性，而且在实际的人口腔内都可发挥这种杀菌活性，使人呼出气体中的口臭成分减少，即实际上发挥人口臭的抑制效果，而且这些效果不伴随任何副作用，只是给予在人的口腔内就可以发挥作用。

工业上的可利用性

本发明的口腔内用杀菌剂和食品添加剂作为口腔内的卫生状态的确保手段是有效的，而且其安全且副作用少，通过在饮食品中添加而能与饮食品一起食用，同时在口腔内发挥杀菌效果，且长期日常摄取也不会不安全。