用于破坏与泛素化相关的酶的相互作用的抑制剂和其应用

摘要

本发明公开了一种泛素蛋白连接酶E3的疏水结合袋，并使用该结合袋来设计抑制剂从而破坏泛素结合酶E2和E3的相互作用。通过使用该结合袋设计了四种抑制剂，它们可以被用于治疗癌症。

说明书

技术领域

本发明涉及针对泛素化途径的基于结构的药物设计，以及使用这些化合物用于癌症治疗。特别地，本发明涉及一类E2-E3抑制剂的鉴定，精确调控蛋白-蛋白表面相互作用。本发明描述的这类化合物及其类似物受到专利保护。

本专利可应用于哺乳动物中的癌症和其它疾病的治疗。文中所引用的人类的生化指标只是为了便于理解，并不仅限于此。文中引用的术语“病人、人体或人类”也均是为了便于描述，实际上包括所有的哺乳动物病体或身体。

背景技术

泛素介导的降解，是一种在翻译后水平上控制蛋白质丰度的蛋白质调控机制。它是一种与磷酸化作用相当的调控机制。此途径在DNA损伤修复、细胞周期控制、I类抗原加工、染色体组成、信号转导、受体介导的内吞作用及细胞凋亡过程中发挥重要作用(Hochstrasser，M，1996)。如果以上过程的调控出现问题就会导致细胞生长失控或者癌症，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、白血球过多症、淋巴瘤和骨髓瘤(Konstantinopoulos PA.等；2006starita LM等；Montagut C.等.；Pulczynski，S；Keating，MJ.；Hall，EJ.；Magrath，L；Voutsadakis，I.A.)。

泛素的级联放大过程涉及E1酶、E2酶和E3酶活性依次发挥作用(Scheffner，M.等，1998)。E1酶(泛素激活酶)，在存在ATP的反应中，其活性位点的胱氨酸与泛素的C末端形成硫酯键，从而激活泛素。被激活的泛素接着被转移到E2酶(泛素结合酶)的胱氨酸活性位点，同样形成硫酯键。E3酶是泛素-蛋白连接酶，至少定义为额外的蛋白质或蛋白质复合物，其对特异性底物的识别和泛素化是必要的。E3酶首先介导泛素从E2酶转移到底物的赖氨酸侧链上，然后在泛素的赖氨酸侧链上继续转移泛素，最终形成的多聚泛素底物被蛋白酶体识别后降解。E3酶可分为两类：一类是不表现出与泛素形成硫酯键的RING指E3酶家族(Scheffner，M.等)；另一类是Hect结构域E3连接酶家族(Schwarz，S.E.等)。Hect结构域是指与E6结合蛋白[E6AP]的C末端结构域相似(homologous to E6-associated protein[E6AP]carboxyl-terminal domain)。E3蛋白的Hect类可形成泛素的硫酯键中间体，并促进底物的多聚泛素化。

所有E2酶有相同的结构，RING指E3酶与Hect E3酶具有相似的与E2酶发生相互作用的结构方式(Huang，L等，Zheng，N.等.)。它们结合袋的细微差别见图1。因而，此表面的抑制剂可选择性地影响两类E3结合酶对底物的泛素化作用。这类抑制剂可以应用于多种疾病的治疗。蛋白质与蛋白质之间的相互作用通常很难被破坏，然而E2-E3的相互作用是很独特的。发明人的生化研究发现，E2酶(UbcH7)和E3酶(E6AP’Hect结构域)的结合作用相当微弱，其相互作用力无法抵抗凝胶过滤，这种结合只能用非变性胶电泳或共结晶法检测。发明人还详细分析了E2-E3复合物的相互作用界面，发现了界限清晰的、对E2-E3相互作用起重要作用的疏水袋。根据疏水袋的大小、形状及其它性质，此袋最适合与小分子靶标结合。因而，E2酶与E3酶的相互作用位点可以轻易被小分子物质瓦解，这也正本发明的理论基础。

泛素化途径的一个著名的底物，是被称为“基因组守护者(genomeguardian)”的肿瘤抑制因子p53。肿瘤抑制因子p53的失活在癌症细胞中发生的几率最高。用基因毒剂处理后，激活的转录因子p53使细胞周期停留在G1/S检查点或目标使受损细胞凋亡，从而阻止受损DNA的复制(Oren，M.)。超过50％以上的人类癌症细胞中发生了p53的失活。例如，在35％的Burkitt淋巴瘤和60％的L3型B细胞急性成淋巴细胞的白血球过多症中发生了p53的错误调控(Soussi，T.& Jonveaux，P.)。除了p53突变原因外，泛素介导的p53降解也是一个失活p53的途径，此途径常发生于淋巴瘤和白血球过多症中(Masdehors，P.等；Bueso-Ramos，CE.等.；Teoh，G.等.；Pan，Y.& Haines，D.S.；Gustafsson，B.& Stal，O.)。在不同的细胞环境中，两类E3连接酶均可以介导p53的降解。在正常细胞中，RING指E3连接酶MDM2通过降解p53来调节p53的水平(Fuchs，S.Y.等；Honda，R.)。在人类乳头瘤病毒(HPV)感染的细胞中，E6AP被病毒蛋白E6劫持，进而泛素化p53。因而，通过阻断E2-E3的结合来防止肿瘤抑制因子p53的泛素化，有可能会抑制肿瘤的生长。

其它的疾病，如糖尿病和神经退行性疾病，也可能与泛素化途径出错有关。在试验性糖尿病中，胰岛素信号分子(如胰岛素受体的底物IRS-1和IRS-2)的错误降解已得到证实(Balasubramanyam M.等.)。近来的一些报道在鼠实验中评估了蛋白酶体抑制剂MLN519在治疗局部缺血/再灌注脑损伤中的疗效(Williams AJ，等.)。

本发明利用基于结构的药物设计技术，在E2-E3复合物的晶体结构基础上，发现了一些新的化合物。E2酶和E3酶是蛋白质降解中重要且必需的两个酶。蛋白质的错误降解会导致很多严重的疾病。蛋白质的泛素化与蛋白质的磷酸化同样重要，因而E2酶和E3酶与激酶一样重要。激酶的各种抑制剂作为新药已经上市。我们发现的这些新化合物及其类似物可用于癌症治疗，例如乳腺癌、结肠癌、子宫颈癌、肺癌、肝癌和脑瘤。

发明内容

本发明的目的之一是定义E2-E3结合界面的特定袋结构，该结构适合与小分子治疗剂结合，有效破坏E2-E3复合物的形成，从而通过E2-E3的信号途径控制达到治疗效果(参见图1和图2)。

本发明的另一目的是提供与E3酶的E2酶结合袋相适应的化合物种类的鉴定方法。

本发明的另一目的是提供这些化合物的组合物。

本发明的另一目的是证明这些化合物能够抑制肿瘤细胞的生长，从而单独用这些化合物或类似物，或将这些化合物同其它化学治疗药物或药物载体联合起来使用，来治疗对象的肿瘤。

因而，第一方面，本发明提供了用于设计E2酶抑制剂的蛋白质结合袋，该结合袋包括：基于SEQ ID NO.1的Val657、Leu658、Ser661、Leu662、Leu665、Met 676、Ile678、Ile682、Ile705、Phe713、Tyr717。

第二方面，本发明提供了设计E2酶抑制剂的方法，该方法包含使用上述蛋白质结合袋。

第三方面，本发明提供了一种E2酶抑制剂，此抑制剂包括选自以下化合物组中的化合物：

结构式I

X₁＝N，C；

R1＝卤素(F，Cl，Br)、甲基、氧甲基、羟基，使用上述官能团的组合在自由价原子上进行单取代或多取代；

X₂＝其中之一或其中多个是C或N；

Ring＝五元或六元环，并与图中明确示出的芳香环结合，包括苯、吡啶、嘧啶、吡嗪(pyrizine)、吡咯、咪唑、呋喃、噁唑；

结构式II

R1＝在邻位、间位或对位取代的卤素(F，Cl，Br)、甲基、氧甲基、羟基，用前述官能团的组合进行单取代或多取代；

Ring＝五元或六元芳香环，有无取代基均可，包括杂环，例如苯、吡啶、嘧啶、吡嗪(pyrizine)、吡咯、吡唑、咪唑、呋喃、噁唑、噁二唑；

结构式III

R1＝在邻位、间位或对位取代的卤素(F，Cl，Br)、甲基、氧甲基、羟基，用前述官能团的组合进行单取代或多取代；

R2＝在邻位、间位或对位取代的卤素(F，Cl，Br)、甲基、氧甲基、羟基、苯基，小芳香杂环包括吡咯、吡唑、咪唑、呋喃、噁唑、噁二唑；和/或

结构式IV

R1＝在邻位、间位或对位取代的卤素(F，Cl，Br)、甲基、氧甲基、羟基，用前述官能团的组合进行单取代或多取代；

X＝C或N的可能组合；

Ring＝非取代的和取代的五元或六元环，包括苯、吡啶、嘧啶、吡嗪(pyrizine)、吡咯、吡唑、咪唑、呋喃、噁唑、噁二唑。

第四方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物中含有至少一种上述化合物和药物载体。

第五方面，本发明提供上述抑制剂在癌症治疗中的应用。优选地，该癌症是脑瘤、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌。

第六方面，本发明提供了一种治疗患者癌症的方法，该方法包括：对需要的患者给药治疗有效量的至少一种所述化合物。

第七方面，本发明提供了一种应用上述任一化合物作为显像剂用于肿瘤诊断的方法。

附图说明

图1示出RING指E3酶和Hect E3酶的E2结合区结构的比较，包括相似点和差异。

图2示出放大后的E2酶(与E3酶接触的特异性残基)，及E3酶的E2酶结合袋。

图3示出合成的化合物Mol 11的氢核磁共振(1H NMR)数据。

图4示出合成的化合物Mol 21的氢核磁共振(1H NMR)数据。

图5示出合成的化合物Mol 44的氢核磁共振(1H NMR)数据。

图6示出合成的化合物Mol 640的氢核磁共振(1H NMR)数据。

图7说明可能的Mol 11衍生物。

图8说明可能的Mol 21衍生物。

图9说明可能的Mol 44衍生物。

图10说明可能的Mol 640衍生物。

图11说明来自NCBI数据库的E6AP全长序列，下划线标注的是E2-E3的结合袋区。

具体实施方式

定义

文中的“E2酶抑制剂”指的是破坏E2酶与E3酶相互作用的抑制剂。

1)关键的小分子抑制剂结合位点的鉴定。

蛋白质与蛋白质之间的相互作用很难被小分子物质破坏，这已是公认的常识。然而，通过E2-E3相互作用的定位分析和对E2-E3界面进行分子表面分析，我们在E3酶上鉴定到一个结合位点对E2-E3复合物形成很关键，该结合位点适合与小分子相互作用。E3酶上的这个结合袋被E2酶的Phe63占据。E3酶上组成该结合位点上的氨基酸是：Val657、Leu658、Ser661、Leu662、Leu665、Met 676、Ile678、Ile682、Ile705、Phe713和Tyr717。

亲脂性分析表明E3酶的结合袋高度疏水，主要是因为E3酶疏水侧链：Leu658、Leu662、Leu665、Met 676、Ile678、Ile682、Ile705、Phe713和Tyr717。

针对这个小的疏水结合袋，我们证明了一类小分子有足够的能力破坏E2-E3信号级联反应，继而破坏泛素化途径。此类小分子的分子量约为500道尔顿，拥有作为药物的良好特点，包括药效、稳定性(体内和体外)、有效性和安全性。

虽然只要能结合该小疏水袋就会有一定的药效，但我们还发现将E2-E3界面处的相互作用扩展至如图6所述的第二个结合袋后，就可以选择性地抑制不希望的靶向。第二个结合袋位置上靠近第一个疏水区，但前者的疏水性相对较弱，最适合与极性化学部分和/或杂环组分相结合。与第二个袋的特异性残基氢键作用会进一步增强药效和选择性。现已证实，通过在两个结合袋间设计合适的接头，单个化学个体就可以同时互补结合两个结合袋。经过对E2-E3界面进行广泛的优化，设计的化学个体(化合物)有望高选择性抑制在作用起效期间可能暴露的其他生物学靶向，因而减少了潜在的副作用。

2)以结构为基础的药物设计

一些计算机技术可以用来判断E2和E3的相互作用，包括蛋白表面的产生和比较，氢键分析，图像性质，包括疏水性分析、静电势分析及双复合物界面的总形状互补性分析。本研究在E2-E3界面发现了一个明确的小疏水袋，该区域对E2-E3复合物的相互作用很重要。因而针对这个疏水袋有望破坏E2-E3复合物的形成，进而干涉泛素化途径，达到前面提到的疗效。

设计合适的能与疏水袋结合的抑制剂需要进行文库设计、相似性检索、虚拟筛选和重新设计。使用商品化试剂，在可靠的合成方案基础上，设计了几个虚拟的化合物文库。这些虚拟的化合物与已有的商品购买的数据集一起组成了一个更大的化合物数据库。根据一些药物的特点对这些化合物进行筛选，通过筛选步骤的化合物即为候选药物，进而分析候选药物与E3酶疏水袋的结合力。在自由能截止值(cutoff)为-20kJ/mol时，筛选到数十个有希望的结合分子，并在蛋白质环境下视觉检查了这些分子与蛋白质结合时的构象以保证二者的正确结合。利用一套突变操作技术对结合位点内的这些化合物进行优化，同时结合能量估算法进一步优化它们与E3酶的相互作用，并将新结构引入模板。

3)抗肿瘤应用的权利要求。

本发明提供了一种对癌症患者的癌症治疗方法，该方法包括对患者给药治疗有效量的本发明公开的此类化合物或类似物，任选地，结合使用药物载体。该方法可适用于实体瘤或白血球过多症。特别地，该方法可应用于治疗如下癌症：脑瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或结肠直肠癌。

本发明也提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，该组合物包括活性成分的物质，任选地但通常与合适的药物载体组合使用。本药物组合物也可以加入其它的活性组合物，如已有的化疗药物，用于联合治疗。

本发明化合物的治疗剂量根据患者的特点和病情严重程度、化合物种类和给药途径的变化而变化。对本文公开有效剂量的药物来说，任何合适的给药途径均可以使用，用于给药给哺乳动物，特别是人。例如可以使用的给药途径有口服给药、直肠给药、局部给药、肠胃外给药、眼部给药、肺部给药、鼻部给药等。剂型包括片剂、含片、散剂、悬浮剂、溶液、胶囊、乳膏、软膏、气雾剂等。

本发明的组合物适用于各种给药途径，包括口服、直肠给药或局部给药(包括经皮肤、气溶胶、乳液、软膏，洗液和扑粉)，肠胃外给药(包括皮下、肌肉内、动脉内和静脉内)，眼部给药(经眼)，肺部给药(鼻部或口腔吸入)或鼻部给药。虽然在任何情况下最恰合的给药途径很大程度上与要治疗的疾病类型、病情的严重程度、药物活性成分相关，但为了便于使用，可以将药物组合物设计成单位剂量的形式，并采用药学领域中各种常用方法进行制备。

在制备口服药物时，一些非药物的介质可能会用到，例如水、乙二醇、油、酒精、调味剂、保护剂、着色剂以及在口服液体(例如悬浮液、酏剂和溶液)制备中可能会用到的材料；或载体例如淀粉、糖、维晶纤维素、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、分解剂等。口服的固体制剂优于口服液体制剂，例如粉末、胶囊和片剂。如果需要，胶囊可以用标准的含水或不含水的方法来包衣。除了上述的给药形式，本发明的化合物还可以根据本领域的常识通过受控制释放手段或策略进行给药。

适合口服给药的本发明的药物组合物，可以做成散剂例如胶囊、扁胶囊或片剂(每一粒都是有固定量活性成分的粉末或颗粒形式)，也可以做成溶液或悬浮液(在含水的、不含水的液体中的或者在水包油或油包水乳液中)。以上组合物可以用药学领域中已知的任何一种方法来制备。通常组合物可以通过以下方式制备：将活性成分和液体载体进行均一、充分混合，或者与细分的固体载体混合，或者二者均有。如有需要，可把药做成需要的形状。例如，可以通过压缩或造型制造片剂。任选地加入一种或多种辅助成分。压缩片剂可以用自由流动形式的活性成分(如粉末或颗粒)在适当的机器中通过压缩而制得的，任选地，该活性成分可以与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂或表面活性或分散剂相混合。模塑片剂可以使惰性稀释剂润湿的粉末化合物的混合物在适当的机器通过模塑而制得

通过下面具体的实验细节可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应该了解下面的例子只是为了更好地说明问题，本专利的保护范围不只限于这些例子。

实施例

实施例1

通过前面描述的方法得到的新化合物(NCE)Mol11。其化学结构如下：

合成的途径如下所示。质谱测得分子量为294。氢核磁共振的结果见图3。

实施例2

通过前面描述的方法得到新化合物(NCE)Mol 21。其化学结构如下：

合成的途径如下所示。质谱测得分子量为403。氢核磁共振的结果见图4。

实施例3

通过前面描述的方法得到新化合物(NCE)Mol 44。其化学结构如下：

合成的途径如下所示。质谱测得分子量为402。氢核磁共振的结果见图5。

实施例4

通过前面描述的方法得到新化合物(NCE)Mol 640。其化学结构如下：

合成的途径如下所示。质谱测得分子量为448。氢核磁共振的结果见图6。

实施例5

以上鉴定的化合物的抗肿瘤活性效果在人癌细胞中用MTT生存实验进行了分析。MTT实验是一种常用的评估细胞存活的方法，其原理是：有活力的细胞可以将MTT(MTT，∑，Cat No.044K5307)即：可溶性四唑鎓盐：溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四唑鎓转化为不可溶的甲沉淀，该沉淀物用二甲基亚砜(DMSO)溶解后可以用分光光度法定量分析。

简要概括就是，在96孔组织培养板中，不同的肿瘤细胞用阴性对照、不同浓度的各种测试项和阳性对照(DDP)进行处理，每个测试项在不同的浓度均重复3次。

不同肿瘤细胞用10％ FBS和RMPI 640或MEM培养基稀释至3-5×10⁴个细胞/ml悬浮液。在96孔组织培养板中，每孔加入100微升细胞悬液，在37℃培养第一天。第二天，弃培养上清液，每孔加入100微升含不同浓度测试项的培养基，同时设立3个阴性对照孔和3个阳性对照孔(DDP)，在37℃继续孵育68小时。68小时后弃培养上清液，每孔加入100微升用PBS稀释的1mg/ml MTT。在37℃孵育4小时后弃培养上清液。每孔加入150微升DMSO，混匀后放置10min，用Bio-Rad公司的Model 550读板机(Microplate)测定波长570nm时的吸光光度值。细胞生长抑制率IR％＝(阴性对照OD570-测试项OD570)/阴性对照OD570。用Bliss方法计算细胞50％抑制浓度(IC50)的95％置信水平。

宫颈癌细胞株(Hela细胞)的IC50结果

乳腺癌细胞株(MCF-7)IC50结果

结肠癌细胞株(HCT116)IC50结果

肺癌细胞株(A459)IC50结果

肺癌A459细胞株实验#2

肝癌细胞株(SMMC-7721)IC50结果

肝癌SMMC-7721细胞株实验#2

卵巢癌细胞株(SKOV3)IC50结果

卵巢癌细胞株(SKOV3)IC50结果

神经胶质瘤(脑瘤U251)IC50结果

神经胶质瘤(脑瘤U251)IC50结果

本发明中参考的所有专利、专利申请书和文献作为参考完整地引入本文。在本发明详细说明的启发下，对于本领域技术人员来讲，暗示了本发明的许多变化，这种明显的变化落入后附的权利要求的完整范围内。。

备注：围绕在E3酶结合袋周围的氨基酸残基有Val634，Leu635，Ser638，Leu639，Leu642，Met 653，Ile655，Ile659，Ile682，Phe690，Tyr694，参考E6AP三维结构(Huang等.)。在全长E6AP(或者UBE3A_人)中，这些氨基酸残基是Val657，Leu658，Ser661，Leu662，Leu665，Met 676，Ile678，Ile682，Ile705，Phe713，Tyr717。

参考文献

Balasubramanyam M.et al.Mol.Cell Biochem.275(1-2)，117-25(2005)

Bucso-Ramos，C.E.et al.Blood 82，2617-2623(1993).

Fuchs，S.Y.，Adlcr，V.，Buschmann，T.，Wu，X.& Ronai，Z.Oncogene 17，2543-2547(1998).

Gustafsson，B.& Stal，O.Pediatr Hematol Oncol 15，519-526(1998).

Hall，E.J.Int J Radiat Oncol Biol Phys 30，1019-1028(1994).

Hochstrasscr，M.Annu Rev Genet 30.405-439(1996).

Honds，R.，Tanaka，H.& Yasuda，H.FEBS Lett 420，25-27(1997).

Huang，L.et al.Science 286，1321-1326(1999).

Keating，M.J.Clin Cancer Res 3，2598-2604(1997).

Konstantinopoulos PA et al.Expert Opin Investig Drugs 15(9)，1067-75(2006)

Magrath，I.Cancer Res 52，5529s-5540s(1992).

Masdehors，P.et al.Blood 96，269-274(2000).

Montagut C.et al.Clin Transl Oncol.8(5)：313-7(2006)

Oren，M.Semin Cancer Biol 5，221-227(1994).

Pan，Y.& Haines，D.S.Cancer Res 59，2064-2067(1999).

Pulczynski，S.Leul，Lyrupliuma 15，243-252(1994).

Scheffner.M.，Smith，S.& Jentsch，S.in Ubiquitin and the Biology of the Cell，Plenum，NY，

Peters.J.-M.，Harris，J.R.，and Finley，D.，65-98(1998).

Schwarz.S.E.，Rosa.I.L.& Scheffner，M.J Biol Chem 273，12148-12154(1998).

Soussi.T.& Jonveaux，P.Noav Rev Fr Hematol 33，477-480(1991).

Starita I.M.et al.Cancer Biol Ther 5(2)，137-141(2006)

Teoh，G.et al.Blood 90，1982-1992(1997).

Vouaisdakis，I.A.Acta Oncol 39，151-156(2000).

Williams AJ et al.Neurochem Int.49(2)，106-12(2006)

Zheng，N.et al.Cell 102，533-539(2000)

<110>黄岚

李兴

<120>用于泛素连接酶E3酶的新的结合袋，其用于设计E2酶抑制剂，通过应用该结合袋设计E2酶抑制剂的方法，通过所述方法设计的抑制剂以及所述抑制剂用于癌症治疗的应用

<130>

<150>us60/856,125

<151>2006-11-02

<160>1

<170>PatentIn Version 3.4

<210>1

<211>875

<212>PRT

<213>UBE3A_人

<400>1

Met Glu Lys Leu His Gln Cys Tyr Trp Lys Ser Gly Glu Pro Gln Ser

1                5                  10                  15

Asp Asp Ile Glu Ala Ser Arg Met Lys Arg Ala Ala Ala Lys His Leu

            20                  25                  30

Ile Glu Arg Tyr Tyr His Gln Leu Thr Glu Gly Cys Gly Asn Glu Ala

        35                  40                  45

Cys Thr Asn Glu Phe Cys Ala Ser Cys Pro Thr Phe Leu Arg Met Asp

    50                  55                  60

Asn Asn Ala Ala Ala Ile Lys Ala Leu Glu Leu Tyr Lys Ile Asn Ala

65                  70                  75                  80

Lys Leu Cys Asp Pro His Pro Ser Lys Lys Gly Ala Ser Ser Ala Tyr

                85                  90                  95

Leu Glu Asn Ser Lys Gly Ala Pro Asn Asn Ser Cys Ser Glu Ile Lys

            100                 105                 110

Met Asn Lys Lys Gly Ala Arg Ile Asp Phe Lys Asp Val Thr Tyr Leu

        115                 120                 125

Thr Glu Glu Lys Val Tyr Glu Ile Leu Glu Leu Cys Arg Glu Arg Glu

    130                 135                 140

Asp Tyr Ser Pro Leu Ile Arg Val Ile Gly Arg Val Phe Ser Ser Ala

145                 150                 155                 160

Glu Ala Leu Val Gln ser Phe Arg Lys Val Lys Gln His Thr Lys Glu

                165                 170                 175

Glu Leu Lys Ser Leu Gln Ala Lys Asp Glu Asp Lys Asp Glu Asp Glu

            180                 185                 190

Lys Glu Lys Ala Ala Cys Ser Ala Ala Ala Met Glu GIu Asp Ser Glu

        195                 200                 205

Ala Ser ser ser Arg Ile Gly Asp Ser Ser Gln Gly Asp Asn Asn Leu

    210                 215                 220

Gln Lys Leu Gly Pro Asp Asp Val Ser Val Asp Ile Asp Ala Ile Arg

225                 230                 235                 240

Arg Val Tyr Thr Arg Leu Leu Ser Asn Glu Lys Ile Glu Thr Ala Phe

                245                 250                 255

Leu Asn Ala Leu Val Tyr Leu Ser Pro Asn Val Glu Cys Asp Leu Thr

            260                 265                 270

Tyr His Asn Val Tyr Ser Arg Asp Pro Asn Tyr Leu Asn Leu Phe Ile

        275                 280                 285

Ile Gly Met Glu Asn Arg Asn Leu His Ser Pro Glu Tyr Leu Glu Met

    290                 295                 300

Ala Leu Pro Leu Phe Cys Lys Ala Met Ser Lys Leu Pro Leu Ala Ala

305                 310                 315                 320

Gln Gly Lys Leu Ile Arg Leu Trp Ser Lys Tyr Asn Ala Asp Gln Ile

                325                 330                 335

Arg Arg Met Met Glu Thr Phe Gln Gln Leu Ile Thr Tyr Lys Val Ile

            340                 345                 350

Ser Asn Glu Phe Asn Ser Arg Asn Leu Val Asn Asp Asp Asp Ala Ile

        355                 360                 365

Val Ala Ala Ser Lys Cys Leu Lys Met Val Tyr Tyr Ala Asn Val Val

    370                 375                 380

Gly Gly Glu Val Asp Thr Asn His Asn Glu Glu Asp Asp Glu Glu Pro

385                 390                 395                 400

Ile Pro Glu Ser Ser Glu Leu Thr Leu Gln Glu Leu Leu Gly Glu Glu

                405                 410                 415

Arg Arg Asn Lys Lys Gly Pro Arg Val Asp Pro Leu Glu Thr Glu Leu

            420                 425                 430

Gly Val Lys Thr Leu Asp Cys Arg Lys Pro Leu Ile Pro Phe Glu Glu

        435                 440                 445

Phe Ile Asn Glu Pro Leu Asn Glu Val Leu Glu Met Asp Lys Asp Tyr

    450                 455                 460

Thr Phe Phe Lys Val Glu Thr Glu Asn Lys Phe Ser Phe Met Thr Cys

465                 470                 475                 480

Pro Phe Ile Leu Asn Ala Val Thr Lys Asn Leu Gly Leu Tyr Tyr Asp

                485                 490                 495

Asn Arg Ile Arg Met Tyr Ser Glu Arg Arg Ile Thr Val Leu Tyr Ser

            500                 505                 510

Leu Val Gln Gly Gln Gln Leu Asn Pro Tyr Leu Arg Leu Lys Val Arg

        515                 520                 525

Arg Asp His Ile Ile Asp Asp Ala Leu Val Arg Leu Glu Met Ile Ala

    530                 535                 540

Met Glu Asn Pro Ala Asp Leu Lys Lys Gln Leu Tyr Val Glu Phe Glu

545                 550                 555                 560

Gly Glu Gln Gly Val Asp Glu Gly Gly Val Ser Lys Glu Phe Phe Gln

                565                 570                 575

Leu Val Val Glu Glu Ile phe Asn Pro Asp Ile Gly Met Phe Thr Tyr

            580                 585                 590

Asp Glu Ser Thr Lys Leu Phe Trp Phe Asn Pro Ser Ser Phe Glu Thr

        595                 600                 605

Glu Gly Gln Phe Thr Leu Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ala Ile Tyr

    610                 615                 620

Asn Asn Cys Ile Leu Asp Val His Phe Pro Met Val Val Tyr Arg Lys

625                 630                 635                 640

Leu Met Gly Lys Lys Gly Thr Phe Arg Asp Leu Gly Asp Ser His Pro

                645                 650                 655

Val Leu Tyr Gln Ser Leu Lys Asp Leu Leu Glu Tyr Glu Gly Asn Val

            660                 665                 670

Glu Asp Asp Met Met Ile Thr Phe Gln Ile Ser Gln Thr Asp Leu Phe

        675                 680                 685

Gly Asn Pro Met Met Tyr Asp Leu Lys Glu Asn Gly Asp Lys Ile Pro

    690                 695                 700

Ile Thr Asn Glu Asn Arg Lys Glu Phe Val Asn Leu Tyr Ser Asp Tyr

705                 710                 715                 720

Ile Leu Asn Lys Ser Val Glu Lys Gln Phe Lys Ala Phe Arg Arg Gly

                725                 730                 735

Phe His Met Val Thr Asn Glu Ser Pro Leu Lys Tyr Leu Phe Arg Pro

            740                 745                 750

Glu Glu Ile Glu Leu Leu Ile Cys Gly Ser Arg Asn Leu Asp Phe Gln

        755                 760                 765

Ala Leu Glu Glu Thr Thr Glu Tyr Asp Gly Gly Tyr Thr Arg Asp Ser

    770                 775                 780

Val Leu Ile Arg Glu Phe Trp Glu Ile Val His Ser Phe Thr Asp Glu

785                 790                 795                 800

Gln Lys Arg Leu Phe Leu Gln Phe Thr Thr Gly Thr Asp Arg Ala Pro

                805                 810                 815

Val Gly Gly Leu Gly Lys Leu Lys Met Ile Ile Ala Lys Asn Gly Pro

            820                 825                 830

Asp Thr Glu Arg Leu Pro Thr Ser His Thr Cys Phe Asn Val Leu Leu

        835                 840                 845

Leu Pro Glu Tyr Ser Ser Lys Glu Lys Leu lys Glu Arg Leu Leu Lys

    850                 855                 860

Ala Ile Thr Tyr Ala Lys Gly Phe Gly Met Leu

865                 870                 875