用于增加种子的大小或植物对水分胁迫的抗性的细胞色素P450基因

摘要

本发明涉及一种细胞色素P450蛋白质，该细胞色素P450蛋白质来源于拟南芥并且可以用于增加种子的大小或种子中储存蛋白质的含量，或用于增强植物对水分胁迫的抗性。本发明还涉及编码所述蛋白质的基因、包含所述基因的重组植物表达载体，以及用所述载体来增加种子的大小或种子中储存蛋白质的含量的方法、和增强植物对水分胁迫的抗性的方法。本发明还涉及用所述方法产生的植物和所述植物的转基因种子。根据本发明，通过使用本发明的细胞色素P450基因，可以增加种子的大小或种子中储存蛋白质的含量、或增强植物对水分胁迫的抗性。

说明书

技术领域

本发明涉及来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的细胞色素P450蛋白质，该细胞色素P450蛋白质可以用于增加种子的大小或种子中储存蛋白质的含量，或用于增强植物对水分胁迫的抗性。本发明还涉及编码所述细胞色素P450蛋白质的基因、包含所述基因的重组植物表达载体，以及用所述载体来增加种子的大小或种子中储存蛋白质的含量的方法，以及增强植物对水分胁迫的抗性的方法。本发明还涉及用所述方法产生的植物和所述植物的转基因种子。

背景技术

细胞色素P450催化许多涉及多种底物的酶催化反应，即内源底物或异生素底物(xenobiotic substrate)的氧化、过氧化和还原代谢。尤其是植物P450参与了多种植物产品合成的生物化学途径，包括苯丙酯类(phenylpropanoids)、生物碱、萜类、脂类、生氰糖苷和芥子油苷(glucosinolates)(Chapple，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.1989，49：311-343)。

细胞色素P450也通称为P450半硫醇蛋白质，并且在多组分电子传递链中作为最终氧化酶起作用，该电子传递链也称作含P450的单加氧酶系统。作为特异性催化反应，该系统包括去甲基化、羟基化、环氧化、N-氧化、硫代氧化、N-、S-和O-脱烷基化、脱氨基化、脱硫，以及含氮基团、硝基基团和N-氧化基团的还原。

烟草植物的P450酶的多种作用涉及多种植物代谢产物的传递，例如苯丙酯类(phenylpropanoids)、生物碱、萜类、脂类、生氰糖苷、和芥子油苷(glucosinolates)和许多其它化学体。在过去的两三年中，已经证实了某些P450酶对植物中植物代谢产物的组成起作用。

基于上述现有技术，本发明在研究细胞色素P450的功能时发现，来源于拟南芥的细胞色素P450可以改进植物种子的大小或植物中储存蛋白质的含量，或增强植物对水分胁迫的抗性，因此完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是研究来源于拟南芥的细胞色素P450蛋白质在植物中的功能。

为了实现上述目的，本发明提供了一种细胞色素P450蛋白质，该细胞色素P450蛋白质来源于拟南芥且可以用于增加植物种子的大小或种子中储存蛋白质的含量，或用于增强植物对水分胁迫的抗性。

本发明进一步提供了编码所述细胞色素P450蛋白质的基因。

本发明进一步提供了包括所述基因的重组植物表达载体。

本发明进一步提供了用所述载体增加种子的大小或种子中储存蛋白质的含量的方法，以及用所述载体增强植物对水分胁迫的抗性的方法。

本发明还进一步提供了用所述方法产生的植物和所述植物的转基因种子。

根据本发明，使用本发明的细胞色素P450基因可以增加种子的大小或种子中储存蛋白质的含量，或增强植物对水分胁迫的抗性。

附图说明

图1显示了AtCYP78A7在不同的拟南芥组织中的表达的RT-PCR分析。

图2显示了AtCYP78A7表达的GUS组织化学分析。

图3显示了在拟南芥中过表达AtCYP78A7增加了种子的大小(A)、种子的重量(B)和种子储存蛋白质(例如12S球蛋白和2S白蛋白)的含量(C)。

图4显示ABA-响应基因、干旱/寒冷胁迫相关基因的半定量RT-PCR。

图5显示了野生型和转基因拟南芥的干旱胁迫响应的比较。数字表示了过表达AtCYP78A7的各转基因株系。Daws表示水分胁迫后的天数；Darw表示再浇水后的天数。

图6显示了为了证实过表达AtCYP78A7的转基因稻类植物中AtCYP78A7基因的表达而进行的PCR的结果(A)和基因组杂交反应的结果(B)。图中显示的数字表示了过表达AtCYP78A7的各转基因稻类植物的数目。HW(Hwayoung)为对照稻类组。

图7显示了本发明中产生的一些转基因稻类植物对水分胁迫的抗性的测试结果。

图8显示了本发明中产生的转基因稻类植物的种子的称重结果(对于100个种子)。图中显示的数字表示过表达AtCYP78A7的各转基因稻类植物的数目。HW(Hwayoung)为对照稻类组。

具体实施方式

为了实现上述本发明的目的，本发明提供了一种细胞色素P450蛋白质，该细胞色素P450蛋白质来源于拟南芥并且具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，该蛋白质可以用于增加植物种子的大小或种子中储存蛋白质的含量，或用于增强植物对水分胁迫的抗性。

本发明涉及来源于拟南芥的细胞色素P450蛋白质的用途。具体地，所述蛋白质可以用于增加植物种子的大小或种子中储存蛋白质的含量，或用于增强植物对水分胁迫的抗性。所述种子中储存蛋白质可以是种子中的12S酸性储存蛋白、种子中的12S碱性储存蛋白、或种子中的2S储存蛋白，但是不限于此。

对于根据本发明一个实施方式的细胞色素P450蛋白质，可以含有SEQID NO：1所示的氨基酸序列。另外，所述氨基酸序列的变体也包括在本发明的范围内。所述变体包括序列发生改变但具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相似的功能和免疫性的氨基酸序列。具体地，本发明的细胞色素P450蛋白质可以包括与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％同源性的氨基酸序列。

本发明还提供了编码来源于拟南芥的细胞色素P450蛋白质的基因(AtCYP78A7)，该细胞色素P450蛋白质具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，该蛋白质可以用于增加植物种子的大小或种子中储存蛋白质的含量，或用于增强植物对水分胁迫的抗性。优选地，所述基因包括SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。另外，所述核苷酸序列的变体也包括在本发明的范围内。所述变体包括序列发生改变但具有与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列相似的功能和免疫性的核苷酸序列。具体地，编码细胞色素P450蛋白质的基因可以包括与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％同源性的核苷酸序列。

对于特定多核苷酸和多肽的“序列同源性”是通过比较最佳比对的两个序列的相对应区域来定义的。此种情况下，对于两个序列的最优比对，在相对应区域中的多核苷酸或多肽部分与参考序列(没有任何添加或缺失)相比较，可以含有添加或缺失(即空位)。

所述百分比通过下述方法获得：确定相比较的两个序列都存在的核苷酸碱基或氨基酸残基的位点数，由此得到匹配位点数，用获得的匹配位点数除以相比较区域的总位点数，再将得到的值乘以100，即获得序列同源性的百分比值。用于此类比较的最优比对可以通过计算机设备以已知的处理模式(例如Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.，Madison，WI，Wisconsin遗传软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFAST、或获自国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的BlastN和BlastX)来执行、或通过测定进行。

本说明书中使用的术语“基本一致”或“基本相似”指含有能够在严格性条件下与靶多肽杂交的序列的多肽。所述严格性条件为2×SSC溶液和温度为65℃。

“基本相似的”多肽共有所述序列，除了可以由氨基酸残基的保守改变而变化的不同残基的位置。保守氨基酸取代指具有相似侧链的氨基酸残基可以互相取代。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，具有脂肪族羟基侧链的氨基酸组包括丝氨酸和苏氨酸，和具有含酰胺侧链的氨基酸组包括天冬酰胺和谷氨酰胺，具有芳香族侧链的氨基酸组包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，具有碱性侧链的氨基酸组包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸，及具有含硫侧链的氨基酸组包括半胱氨酸和甲硫氨酸。

基本一致的多核苷酸序列指包括具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％的序列一致性的序列的多核苷酸。根据另一种定义，当两个核苷酸分子在严格性条件下可以彼此特异性杂交时，它们的核苷酸序列相对于彼此是基本一致的。严格性条件依赖于序列的特性，可能在其它不同条件下发生变化。通常，在限定离子强度和pH值时，严格性条件选择的温度比特异性序列的熔解温度(Tm值)低约10℃。Tm值为50％的靶序列与完全匹配的探针结合的温度(在限定的离子强度和pH值条件下)。杂交复合物的Tm值由探针的长度和碱基组成来确定，且可以根据文献(Sambrook，T.等人，(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual(secondedition)，分子克隆-实验室手册(第二版)，1-3卷，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring)中描述的信息来计算。典型的Southern印迹分析的严格性条件包括以0.2×SSC溶液在65℃下进行洗涤。对于优选的寡核苷酸探针，典型的洗涤条件为以6×SSC溶液在42℃下进行洗涤。

根据本发明的一个实施方式，编码细胞色素P450的基因还可以包括细胞色素P450的编码基因的启动子序列，该启动子序列由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列组成。将GUS基因与所述启动子序列融合，并且随后在植物中表达获得的基因以后，发现所述基因在暗萌发幼苗/光萌发幼苗的子叶和顶端分生组织，花蕾，花，腋芽，或发育中的胚胎中的表达较强。

为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了包括本发明的基因的重组植物表达载体。

术语“重组体”指能够复制异源核苷酸或表达所述核苷酸、肽、异源肽、或异源核苷酸编码的蛋白质的细胞。重组体的细胞可以以正义或反义的形式来表达在天然状态细胞中不存在的基因或基因片段。另外，重组体的细胞也可以表达在天然状态细胞中存在的基因，但是该基因被修饰并通过人工方法引入到细胞中。

本说明书中所用的术语“载体”指传递到细胞中的一个或多个DNA片段和核苷酸分子。所述载体可以复制DNA并能在宿主细胞中独立复制。术语“传递系统”和“载体”通常可互换使用。术语“表达载体”指包括以下序列的重组DNA：所需的编码序列；以及在特定宿主生物体中对于可操作连接的所述编码序列的表达很重要的其它合适的核苷酸序列。众所周知，对于真核细胞可以使用启动子、增强子、终止信号和多腺苷酸化信号。

植物表达载体的优选实例是Ti质粒载体，当Ti质粒载体存在于合适的宿主(例如Agrobacterium tumefaciens)中时，它可以向植物细胞传递自身的一部分，即所谓的T区域。其它类型的Ti质粒载体(见EP 0116718B1)通常用于向原生质体内传递杂合基因(hybrid gene)，通过适当地插入植物细胞或者向植物基因组插入杂合DNA而产生新的植物。尤其优选的Ti质粒载体的形式是在EP 0120516B1和USP No.4,940,838中公开的所谓的二元载体。用于向宿主植物中引入本发明的DNA的其它载体，可以选自双链的植物病毒(例如CaMV)、单链的植物病毒和来源于Gemini病毒的病毒载体等等，例如不完全植物病毒载体。当植物宿主不能进行合适的转化时，使用所述载体尤其有利。

所述表达载体可以包括至少一种筛选标记。所述筛选标记包括用于真核细胞培养的脱氢叶酸还原酶(dehydrofolate reductase)基因或新霉素抗性基因。广泛用于植物转化的所述筛选标记为新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，该基因分离自Tn5和对抗潮霉素(一种抗生素)具有抗性的的潮霉素磷酸转移酶基因。

对于根据本发明的一个实施方式的植物表达载体，启动子可以是任意的CaMV 35S、肌动蛋白、泛素、pEMU、MAS或组氨酸启动子，但是不限于此。术语“启动子”指RNA聚合酶为了起始转录而结合的DNA分子，相应于结构基因上游的DNA区域。术语“植物启动子”指可以在植物细胞中起始转录的启动子。术语“构成型启动子”指在多数环境条件下和发育状态或细胞分化状态下都有活性的启动子。由于转化体可以通过多种机制在不同阶段进行筛选，因此本发明优选构成型启动子。因此，此处不限于选择构成型启动子。

终止子可以是胭脂碱合成酶(NOS)或稻α淀粉酶RAmyl A终止子，但是不限于此。关于终止子的必要性，通常认为此区域可以增强植物细胞转录的可靠性和有效性。因此，在本发明的范围内高度优选使用终止子。

为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了增加种子的大小或种子中储存蛋白质的含量的方法，以及增强植物对水分胁迫的抗性的方法，该方法包括以本发明的重组植物表达载体转化植物细胞以过表达细胞色素P450基因。优选地，所述植物选自由拟南芥、稻、油菜籽、小麦、大麦、玉米、大豆、马铃薯、红豆、燕麦和稷所组成的组中，但是不限于此。

术语“植物组织”可以是分化的组织或未分化的组织，包括根、茎、叶、花粉、种子、癌性组织和具有多种形状的用于培养的细胞(即单个细胞)、原生质体、芽和愈伤组织，但是不限于此。植物组织可以是植物中的，或处于器官培养、组织培养或细胞培养的状态。

术语“植物细胞”包括植物中(planta)的植物细胞，还包括培养状态的植物细胞和原生质。

植物转化指能将DNA传递到植物中的任意方法。此种转化方法不一定具有再生期和/或组织培养期。植物种的转化目前很常见，不仅用于双子叶植物，也用于单子叶植物。原则上，可以使用任意的转化方法将本发明的杂合DNA引入到合适的祖细胞(progenitor cell)中。所述方法适当地选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等人，1982，Nature 296，72-74；NegrutiuI.等人，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)、用于原生质体的电穿孔方法(Shillito R.D.等人，1985Bio/Technol.3，1099-1102)，用于植物组分的显微注射方法(Crossway A.等人，1986，Mol.Gen.Genet.202，179-185)、用于多种植物组分的粒子轰击方法(DNA或RNA被包埋的)(Klein T.M.et al.，1987，Nature 327，70)、或在根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中通过完全成熟的花粉或小孢子植物的侵入或转化来介导基因转移的(不完全)病毒感染方法(EP 0301316)等等。本发明的优选方法包括土壤杆菌介导的DNA转移。特别是在本发明中优选使用EP A 120516和USP No.4,940,838中公开的所谓的二元载体技术。

为了实现本发明的另一个目的，本发明提供种子的大小或储存蛋白质的含量增加或对水分胁迫的抗性增强的植物。通过用本发明的方法转化植物细胞，可以过表达细胞色素P450基因，结果使种子的大小或种子中储存蛋白质的含量增加，或使植物对水分胁迫的抗性增强。优选地，所述植物可以选自由拟南芥、稻、油菜籽、小麦、大麦、玉米、大豆、马铃薯、红豆、燕麦和稷所组成的组中，但是不限于此。

为了实现本发明的另一个目的，本发明提供以本发明的重组载体转化的植物的转基因种子。优选地，所述植物可以选自由拟南芥、稻、油菜籽、小麦、大麦、玉米、大豆、马铃薯、红豆、燕麦和稷所组成的组中，但是不限于此。

下面参考下述实施例来详细说明本发明。然而，这仅为了特定举例说明本发明，而不是通过这些实施例来限制本发明的范围。

材料和方法

植物材料和生长条件

使用拟南芥生态型Ws-2作为用于转化的野生型。将种子进行表面除菌，在4℃冷冻2天，然后使其在含1x Murashige和Skoog盐(Murashige T，S koogF(1962)Physiol Plant 15：473-497)并添加有1％蔗糖(用KOH调pH5.8)的0.8％琼脂固体培养基上，并且在16小时光照(22-24℃)/8小时黑暗(18-20℃)的光周期条件下发芽和生长。在土壤中培养的植物也在相同的光周期条件下生长。

在拟南芥中AtCYP78A7的构成型表达

含有AtCYP78A7编码区的基因组片段，用拟南芥基因组DNA作为模板通过Pwo聚合酶(Roche，Mannheim，德国)以一对引物进行扩增。为了容易地克隆PCR产物，以下述方式向引物中引入KpnI和XbaI酶切位点：78A7KpF，5’-GGGGTACCCATCAACCCAAAATAATGGAGTTGATG-3’(SEQ ID NO：4)，78A7XbR，5’-GCTCTAGACATTCTGCAATTCATACCTCTCGACAA-3’(SEQ ID NO：5)。将PCR产物克隆到pUC19载体的SmaI位点。测定PCR产物的完全核苷酸序列，以检查PCR的错误。将PCR产物的KpnI/XbaI酶切片段亚克隆到pART7的CaMV 35S启动子和ocs3’之间(Gleave AP(1992)Plant Mol Biol 20：1203-1207)。将含有来自pART7的过表达盒的NotI酶切片段亚克隆到二元载体pART27中(Gleave AP(1992)PlantMol Biol 20：1203-1207)。将pART27中的过表达盒通过电穿孔转化到土壤杆菌GV3101中，并用植物侵染法引入到生态型Ws-2植物中(Clough SJ，BentAF(1998)Plant J 16：735-743)。在含有卡那霉素(40μg/mL)的MS平板上筛选转基因植物。

启动子构建体的传代和GUS染色步骤

含有AtCYP78A7启动子区域的基因组片段(长度约为2.5kb)获得自以SalI/BamHI消化的BAC克隆(MYH9)。启动子片段包括该基因的部分开放读码框(ORF)，以使其与GUS基因翻译融合。将SalI/BamHI片段亚克隆到pB I101二元载体中。将所述启动子构建体通过电穿孔转化到土壤杆菌GV3101中，并使用植物侵染法引入到生态型Ws-2植物中(Clough SJ，BentAF(1998)Plant J 16：735-743)。在含有卡那霉素(40μg/mL)的MS平板上筛选转基因植物。从T3代筛选含有启动子构建体的纯合转基因株系(homozygous transgenic lines)。根据Stomp方法(Stomp A-M(1992)In S.R.Gallagher ed，GUS protocols：Using the GUS gene as a reporter of geneexpression，Academic Press，San Diego，CA，pp.103-113)进行植物和植物组织的GUS染色。GUS染色的组织通过系列的乙醇脱水。

反转录-聚合酶链式反应

用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)纯化植物组织的总RNA。通过MMLV反转录酶(Invitrogen)使用所述总RNA(5μg)进行第一链cDNA合成。PCR扩增的条件如下：96℃初始变性5分钟，然后94℃变性15秒、55℃退火30秒和72℃延伸1分钟(共27个循环)，最后72℃延伸5分钟。扩增编码微管蛋白-2的转录本作为阳性对照。用于RT-PCR的引物序列在表1中列出。

表1用于RT-PCR的引物序列

蛋白质的提取和SDS-PAGE

将500个成熟干燥的种子用400μl提取缓冲液[125mM Tris-HCl(pH8.8)、1％SDS、10％甘油、50mM亚硫酸钠]用研杵和研钵进行匀浆。离心后，取各提取物5μl用于SDS-PAGE(Laemmli UK(1970)Nature 227：680-685)。用Bio-Rad蛋白质测试试剂盒以BSA为标准测定蛋白质含量。

脱水处理

将5周大的野生型和转基因拟南芥植物用于干旱胁迫处理。使土壤培养的植物吸水12小时，除去过剩的水，然后通过停止灌溉18天进行脱水胁迫。为了检查植物是否能从脱水胁迫中恢复，在脱水胁迫进行18天后重新浇水。

RNA提取和微阵列杂交

用TRIzol试剂(Invitrogen)提取12天幼苗的总RNA。分离的总RNA用RNeasy植物小型试剂盒(Qiagen，德国)进一步纯化。取每样品的15μg总RNA用SuperscriptII反转录酶(Invitrogen)制备cDNAs，用Genisphere3DNA Array 900DNA标记试剂盒根据制造商的说明书(Genisphere，Montvale，NJ)由所述cDNA制备出以Cy3和Cy5标记的微阵列探针。将该cDNA探针与29000个元素的拟南芥寡核苷酸微阵列进行杂交，该微阵列是在Arizona大学用Qiagen-Operon Arabidopsis Genome Array Ready Oligo Set(AROS)Version 3.0(http://www.ag.arizona.edu/microarray/)制得的。简言之，杂交按以下两个步骤进行：1)将cDNA与载玻片上点样的寡聚体杂交，2)通过在第一链的合成过程中掺入cDNA的捕获序列，使cDNAs与3-DNA荧光枝状聚合体(dendrimers)杂交。将全部的cDNA和荧光染料在体积为35μL的制造商提供的SDS-碱杂交缓冲液中进行杂交。所述cDNA的杂交在MAUI杂交系统和MAUI Mixer AO Hybridization Chamber Lids(BioMicro Systems，Salt Lake City)上进行，在60℃杂交18小时。然后根据实验方法清洗载玻片，并离心10分钟进行空气干燥。如上所述，3-DNA杂交在55℃进行4小时，除了在开始两次清洗中加入0.5mM二硫苏糖醇(DTT)来防止荧光素氧化，其它都与上述方法相同。包括染料交换载玻片的步骤在内，各实验进行4个重复，以消除染料的荧光偏差。对于转基因拟南芥株系#19和#38，我们分别使用3个和2个载玻片。

扫描和数据分析

杂交以后，用General 4000B(Axon Instruments，Union City，CA)扫描载玻片，然后用General Pro4.0(Axon Instruments，Union City，CA)对斑点进行定量。扫描的微阵列结果输入到敏感分析软件3.0版(Acuity analysissoftware 3.0(Axon Instruments，Union City，CA))中，并用Global LOWESSNormalization(Yang等人，(2002)Nucleic Acids Res 30：e15)进行均一化。然后生成各实验的数据文件，所述实验满足如下筛选条件：[(中值总数＞＝100)和(Flags＞＝0)和(F635％Sat＜3)和(F532％Sat＜3)和(RgnR2(635/532)＞0.6)和(SNR635＞3)和(SNR532＞3)]。所述筛选排除了由GenePix错误标记的数据点、或中值总数少于100(非常弱)的数据点、或像素低于背景的数据点(可能不是真正的斑点)。分析了至少75％的所用载玻片上符合这些标准的斑点。为了比较野生型和转基因株系，计算了各数据组中符合这些标准的斑点的比例中值的平均值。得到的2个数据组用Acuity软件中的K-均值聚类算法(K-means clustering algorithm)进行聚类。从拟南芥信息资源网(TAIR，ftp://ftp.arabidopsis.org/home/tair/home/tair/)上收集微阵列上的克隆的注释和基因的本体(ontology)功能，并根据Gene Ontology Consortium(www.geneontology.org)提供的类别进行分类。

转基因稻类植物的制备

从pART27二元载体上获得含有35S：AtCYP78A7：3′ocs的NotI酶切片段。然后，用Pfu DNA聚合酶形成平末端。用SmaI消化后，将片段克隆到pCAMBIA1201二元载体中。将这样制备的用于产生转基因稻类植物的载体用电击方法引入到根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL24菌株中。所述产生转基因稻类植物的过程，通过使用盾状组织(scutellum tissue)的早期转染方法来实现。在含有潮霉素(50μg/ml)的MS固体培养基上筛选转基因稻类植物。

基因组杂交方法

基于CTAB方法从稻类植物中分离基因组DNA。将纯化的基因组DNA(10μg)用SacI消化，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。用毛细管方法将消化的DNA转移到尼龙膜上，与[32P-dCTP]-标记的AtCYP78A7DNA探针进行杂交反应。杂交反应和洗涤的条件与现有技术(Kim HB等人(2003)Journalof Plant Biology.46：263-270)中所述的条件相同。

转基因稻类植物对水分胁迫的抗性的分析

将在MS固体培养基中发芽和生长约7天的稻类植物幼苗转移到土壤中，在温室中生长1个月左右。在水分胁迫处理12小时之前，将栽有植物的盆完全浸在水中。移去水后，10天不再灌溉所述植物，以对所述植物进行水分胁迫。为了确定所述植物是否可以克服所述水分胁迫，在10天后再对所述植物浇水。

实施例1：不同类型组织的表达谱的RT-PCR分析

用RT-PCR来测定本发明的转基因植物中不同类型组织的表达谱。结果发现AtCYP78A7基因几乎在所有组织中表达，尤其在花蕾、花、角果(silique)和植物幼苗中表达很强(见图1)。

实施例2：对使用启动子：：GUS的表达的分析

用GUS报告基因来测定所述转基因植物中不同类型组织的表达谱。结果发现AtCYP78A7基因在暗萌发幼苗/光萌发幼苗的子叶和顶端分生组织、以及花蕾、花、腋芽或发育中的胚胎中的表达较强(见图2)。

实施例3：过表达AtCYP78A7基因的转基因拟南芥

1)转基因植物的种子大小、种子重量和储存蛋白质的含量

在过表达的转基因植物中，如图3-A可见，种子的大小比野生型(Ws-2)大。如图3-B可见，种子的重量比野生型(Ws-2)约重50％。另外，如图3-C可见，种子中储存蛋白质(例如12S球蛋白和2S白蛋白等)的含量也相对于野生型(Ws-2)增加了。用相等数量的野生型(Ws-2)和转基因种子(#9和#19)来测量种子重量。从相等数量的野生型(Ws-2)和转基因种子(#9和#19)中分别提取总的储存蛋白质。

2)转基因植物的微阵列分析

用包含所有拟南芥基因组序列的寡核苷酸芯片进行微阵列分析。从生长12天的植物幼苗中分离总RNA，然后进行5次各自独立的微阵列分析。结果发现在本发明的转基因植物中，12S和2S的种子的储存蛋白质增加，并且响应ABA的基因(一种植物激素)或响应低温/干旱胁迫的基因的表达增加(见表2)。

表2.微阵列分析揭示了在过表达AtCYP78A7基因的转基因拟南芥中，编码种子储存蛋白质的基因、ABA-响应蛋白质的基因或干旱/寒冷胁迫相关的蛋白质的基因被上调了。

为了确定本发明的转基因植物中上述基因表达是否增加，从野生型(Ws-2)和转基因种植物(35S：AtCYP78A7的#9、#19和#38株系)中分别分离RNAs。进行RT-PCR后，发现在本发明的转基因植物中它们的表达都增加了(见图4)。

3)本发明的转基因植物对水分胁迫的抗性

基于从上述微阵列分析获得的结果来研究本发明的转基因植物对水分胁迫的抗性。对于野生型，发现植物在水分胁迫处理12天后开始枯萎，然后在第18天完全死亡。另一方面，对于本发明的转基因植物(35S：AtCYP78A7的#9、#19和#38株系)，发现植物在水分胁迫处理18天后开始枯萎，而一旦再次浇水则可以完全从水分胁迫中恢复。而野生型植物不能恢复(见图5)。

实施例4：过表达AtCYP78A7基因的转基因稻类植物的制备和用于检测所述植物对水分胁迫的抗性的测试

制备18个单独的过表达AtCYP78A7的转基因稻类植物的株系。在所有制备的转基因稻类植物株系中，确认筛选标记基因(hyg)的表达(见图6-A)。除#14株系以外，所有转基因稻类植物株系都确认有AtCYP78A7基因的表达(见图6-A)。从这样制备的转基因稻类植物中提取基因组DNA，用AtCYP78A7基因作为探针进行基因组杂交反应。结果确认了引入到植物中的AtCYP78A7基因成功地整合到稻类植物的基因组中(见图6-B)。对于一些这样制备的转基因稻类植物进行测量对水分胁迫的抗性的测试。结果发现野生型植物(Hwayoung)在水分胁迫处理后7天开始枯萎，而本发明的转基因植物不会枯萎(见图7左侧板块)。在水分胁迫处理10天后，再对植物浇水。野生型植物不能恢复，但是所有的本发明的转基因稻类植物都可以很好的恢复到它们的正常状态，除#5株系以外(见图7右侧板块)。

对于18个单独的过表达AtCYP78A7的转基因稻类植物，分别测量100个种子的重量。结果发现#5、#10和#18株系的种子重量比非转基因植物的种子重量重10-33％(见图8)。

序列表

<110>明知大学校产学协力团

<120>用于增加种子的大小或植物对水分胁迫的抗性的细胞色素P450基因

<130>PCT07005

<160>29

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>536

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>1

Met Glu Leu Met Asn Leu Ala Ser Lys Glu Thr Ser Tyr Trp Met Ile

  1               5                  10                  15

Ala Leu Pro Ala Gly Phe Gly Ser Gln Asn Leu His Asp Val Ser Thr

             20                  25                  30

Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Ala Val Val Phe Leu Ser Ile Val Thr Trp

         35                  40                  45

Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Val Ala Trp Lys Asn Gly Arg Asn Arg

     50                  55                  60

Leu Gly Arg Val Ala Ile Pro Gly Pro Arg Gly Ile Pro Val Phe Gly

 65                  70                  75                  80

Ser Leu Phe Thr Leu Ser Arg Gly Leu Ala His Arg Thr Leu Ala Ala

                 85                  90                  95

Met Ala Trp Ser Arg Ala Asn Thr Glu Ile Met Ala Phe Ser Leu Gly

            100                 105                 110

Ser Thr Pro Val Ile Val Ala Ser Glu Pro Asn Ile Ala Arg Glu Ile

        115                 120                 125

Leu Met Ser Pro His Phe Ala Asp Arg Pro Val Lys Gln Ser Ala Lys

    130                 135                 140

Ser Leu Met Phe Ser Arg Ala Ile Gly Phe Ala Pro Asn Gly Thr Tyr

145                 150                 155                 160

Trp Arg Met Leu Arg Arg Ile Ala Ser Thr His Leu Phe Ala Pro Arg

                165                 170                 175

Arg Ile Leu Ala His Glu Ala Gly Arg Gln Leu Asp Cys Ala Glu Met

            180                 185                 190

Val Lys Ala Val Ser Val Glu Gln Asn Gly Ala Gly Ser Val Val Leu

        195                 200                 205

Arg Lys His Leu Gln Leu Ala Ala Leu Asn Asn Ile Met Gly Ser Val

    210                 215                 220

Phe Gly Arg Arg Tyr Asp Pro Leu Ala Gln Lys Glu Asp Leu Asp Glu

225                 230                 235                 240

Leu Thr Ser Met Val Arg Glu Gly Phe Glu Leu Leu Gly Ala Phe Asn

                245                 250                 255

Trp Ser Asp Tyr Leu Pro Trp Leu Gly Tyr Phe Tyr Asp Ser Ile Arg

            260                 265                 270

Leu Asn Gln Arg Cys Ser Asp Leu Val Pro Arg Ile Arg Thr Leu Val

        275                 280                 285

Lys Lys Ile Ile Asp Glu His Arg Val Ser Asn Ser Glu Lys Lys Arg

    290                 295                 300

Asp Ile Gly Asp Phe Val Asp Val Leu Leu Ser Leu Asp Gly Asp Glu

305                 310                 315                 320

Lys Leu Gln Glu Asp Asp Met Ile Ala Val Leu Trp Glu Met Ile Phe

                325                 330                 335

Arg Gly Thr Asp Thr Thr Ala Leu Leu Thr Glu Trp Thr Met Ala Glu

            340                 345                 350

Leu Val Leu Asn Pro Asn Val Gln Thr Lys Leu Arg Asp Glu Ile Leu

        355                 360                 365

Thr Ala Val Gly Asp Gly Ala Asp Gly Asp Val Ala Asp Ala Asp Leu

    370                 375                 380

Ala Lys Leu Pro Tyr Leu Asn Ala Val Val Lys Glu Thr Leu Arg Leu

385                 390                 395                 400

His Pro Pro Gly Pro Leu Leu Ser Trp Ala Arg Leu Ser Thr Ser Asp

                405                 410                 415

Val Gln Leu Ser Asn Gly Met Val Ile Pro Lys Gly Thr Thr Ala Met

            420                 425                 430

Val Asn Met Trp Ala Ile Thr His Asp Gln Thr Val Trp Ser Asp Pro

        435                 440                 445

Leu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Phe Thr Gly Asn Ala Asp Met Asp Ile

    450                 455                 460

Arg Gly Gly Asp Leu Arg Leu Ala Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Val

465                 470                 475                 480

Cys Pro Gly Lys Asn Met Gly Leu Ala Thr Val Thr Arg Trp Val Ala

                485                 490                 495

Glu Leu Val Arg Arg Phe Glu Trp Gly Gln Asp Gln Thr Glu Pro Val

            500                 505                 510

Asp Leu Gly Glu Val Leu Lys Leu Ser Cys Glu Met Glu His Pro Leu

        515                 520                 525

Arg Ala Val Val Thr Glu Ile Phe

    530                 535

<210>2

<211>1611

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>2

atggagttga tgaatttggc ttcaaaagaa acaagctatt ggatgattgc actgcctgcc     60

ggttttggat cccaaaacct acatgatgtt tccaccctag gctatctatt ccttgccgtc    120

gtttttctct ctatagtcac gtgggctctc gccggaggcg gtggtgtcgc ttggaagaac    180

ggccgtaacc ggttgggtcg tgtcgcgatc cctggtcctc gtggcatacc agtattcggc    240

agtcttttca ctctcagccg aggcttggct catcggacgt tagcagccat ggcttggagc    300

cgagccaaca ctgagattat ggcttttagc cttggttcaa cgccggttat cgtggcttct    360

gaaccaaaca tagctcgtga gattctgatg tcgcctcact tcgcggaccg gccggttaag    420

cagtctgcta agagcctcat gttcagccga gccataggtt tcgccccaaa cgggacttac    480

tggcgcatgt taagaaggat cgcatcgact cacctatttg ctcctcggcg tatcttagca    540

cacgaagctg ggcgccagct agactgcgct gaaatggtga aagctgtgtc agtggagcaa    600

aacggcgctg gatcagtcgt tttaaggaaa cacttacaac tagccgcctt gaacaacatc    660

atgggaagtg tttttgggag aagatacgat cctctggctc agaaagagga tcttgatgag    720

cttacatcaa tggttaggga agggttcgag cttttgggtg cttttaattg gtctgattat    780

cttccatggc tcggttattt ctacgactca attcgtttaa accaacgttg ctcagatctc     840

gtccctcgaa ttagaaccct cgtcaagaaa atcatcgacg aacatcgagt tagtaactct     900

gagaagaaaa gagacattgg agattttgtt gatgtcttat tgtctttaga cggtgatgag     960

aaacttcaag aagatgacat gatcgccgtt ttatgggaga tgatttttcg agggacagat    1020

acaacggcgt tattaacgga gtggaccatg gccgagctag tactgaaccc taacgtgcaa    1080

accaagttac gagacgagat tttaactgct gtgggcgacg gcgccgacgg agacgtggca    1140

gatgctgacc tggcaaaact cccgtaccta aacgcagtgg tgaaggaaac tctaaggctg    1200

catcctcctg gaccactgct ttcatgggct cgtctttcca cgtcagacgt ccagctcagc    1260

aatggcatgg tgattccaaa gggaactaca gcgatggtca acatgtgggc tataacccac    1320

gaccagactg tatggtccga cccgctaaag tttgacccgg agagattcac tgggaatgct    1380

gacatggata ttcgtggtgg ggatctaagg cttgcaccgt ttggagccgg taggagagtg    1440

tgtccgggga agaacatggg gctagctact gtgactcggt gggtggctga gttggtacga    1500

cggttcgagt ggggtcagga tcagaccgag ccagttgatc ttggtgaggt cttgaagctt    1560

tcttgtgaga tggagcatcc gttacgtgcc gttgtaacgg aaatatttta a             1611

<210>3

<211>2416

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>3

gtcgacccgc cccattccct gccaaacctc ccttcttcac cattcacact tttttctttt     60

ctttgaccaa ttgaaaaatt atttatatac attaattaat agttaaaagt aaacaaaatg    120

agaagcacca atctattttg gttaattttc catttagatg taactttcat gatagatgtt    180

gagattcaaa cctattacct aatatgttaa gcatgaagaa tggatgattt ggtgcatccc    240

aacctcggcc tctaagattc cacaacggat tcctctaact ttcaccaatt tgttaggctt    300

ttttattcaa tattttcaca agcattatct tcaaagaaaa cggtaaacga cgagctagaa    360

atatgcaaca tacaaattgc atgagacgtt tagttaactg gttttctaat gtgatttgat    420

tgtctcttgt tcttattatt aaagattata tattctcgta aatgaaaatt gttttatgtg    480

aaacggcatt tgcttaatct aacgcctaag taaaaatcta gtgttctaca tcatgtgttc     540

gaattagatc tatgttcaaa atgtgcgatg tgtttttaca tattattatt gtatatacta     600

ctgactacag tttgtcgtag tatacgtctt atagaaattt tgattgagca ttgaggagtt     660

cttttgagta atttgtatgt tgctatttag attatgtatt tgcaaattaa attgttagat     720

ttgtacgtcg taaacgatat aaatatttta aatatgataa gtgataaata ggaaaccatt     780

tccattactt aacatcattg atacaataca aagatttgaa tctcacgata agaattggtt     840

gctttctcta ttaggatcac tataaaaact tgtgatcaac gagttttaat gaataatatc     900

agtatttttt gtaaaaaaaa tagcgataaa aatattatat taatcgttga ttaaatataa     960

tatattgtta cgatcggata aaaaatatta atttattaat gatcgatcga taaatctatt    1020

atttaataaa tagattatat aagacaaata aatagattat ataagacaaa aatggtcaaa    1080

cgatattaaa tataaataaa tacatacatc gtgtttttcg agttggatat atgatcgtta    1140

attaaatata ttgttacgat catataaaaa gatcatttct tagtaatagt tcgggatgga    1200

ttggtgttgt tcctctacgc ctaggacacc agaatatcga accatgaata tcaatcgata    1260

aatatattat ttaaataatc gcttatatac gacaaaaaaa atcaaaatga tattgaatta    1320

atatagataa atacatacac aaatctggat gcgatagcaa aaacctagaa cgtctatttt    1380

tttttttgca tttcctgaat ttttttttaa tcagccatat actcataagt tttacaaaaa    1440

tgtctccttt atctcatcca ctttaaaatt acttattcat caaattttaa cagtagaaga    1500

cttaaaacta cagtttctta gcaaaaaata aataatttac atagtcccca attatatact    1560

tcgaaaacta tatattacta aaagctcaaa tataatgttc aattatactc tcatggaaaa    1620

ttataattct gttctactac aaactcaaaa aatatgaaga taattaatca gggcaagtat    1680

ctcgctgcac gtcacaacta tctaaagcca tcgatatcta taaccgacta atattctttc    1740

ttctctaaag aacatattca ttggtttgtc ctttcgtatt ctctaagccg aaatatacgg    1800

actcattgaa ttcttttttc ggtttaacga acctcattga attctcacat cgatgcaaag    1860

taacatcaca acccaagaaa aaaacggtgc aaacataatt aaatatagct aattaagaaa    1920

aacaaaataa aaatgccgaa ttcattgtca taacgccctc tttcacacac atatctttca    1980

tttcatccaa caccaaacca attcatgcga cccacctcct ccctccacgt gaatctctcc    2040

caattttaac cttgccaatt ttcctatatt ttacatcaac attacttata tataaacggg    2100

ataaattata tagaatcatt tcaaaaccga cgtctttctt cccatgcatt gcgcatttaa    2160

ttaacgctgc caaaacatac atgtggatat atatatagtt tttttatata tagatgtacc    2220

tttaccttca acttctccat tgttcttctc caagtacttc tctcttcaac caaaaaaaaa    2280

gagtactttc cttctcatag gatttttttg ctttctcttg aaaaaccttt tgttattgtt    2340

attggttcgt acgttgttca ttatttgaca agaaacaaga ttacaaaaaa aaaaagtaca    2400

tcaacccaaa ataatg                                                    2416

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工

<400>4

ggggtaccca tcaacccaaa ataatggagt tgatg                                      35

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工

<400>5

gctctagaca ttctgcaatt catacctctc gacaa                                      35

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>6

ggtacgacgg ttcgagtggg gtcagga                                               27

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>7

cattactcca tttagatttt agacccacaa                                      30

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>8

ataaaattca aagtgtaagc aaaac                                           25

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>9

attaattaga aaagaagtcc aaggt                                           25

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>10

atcacgaaga ctaataaaac aaagt                                           25

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>11

aacaaattaa cacttaggaa aattg                                           25

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>12

aaacaaaaga ctacattgtt gaga                                           24

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>13

tacgtattta aaatgtgcta gtgag                                          25

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>14

aaaaggtata gcagaaaaga ttaaa                                          25

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>15

catcatatta ttacaccaca caaat                                          25

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>16

aagaagatta ggtatgtgaa tagga                                          25

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>17

aacatcttct gttgtttgat aagat                                          25

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>18

aaaagttagt ggagaggaga agtat                                           25

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>19

agatctatct agtagctgaa ccaca                                           25

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>20

attctgttga agaggctcca aaatc                                           25

<210>21

<211>27

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>21

aatacatcaa agacgtcaaa caaaaca                                         27

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>22

ttatatccaa aggcatctct tgagt                                           25

<210>23

<211>25

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>23

aaacgatcca tagaacacac aaact                                           25

<210>24

<211>27

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>24

gagccttaca acgctactct gtctgtc                                           27

<210>25

<211>27

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>25

acaccagaca tagtagcaga aatcaag                                           27

<210>26

<211>26

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>26

gatccggtcg gcatctactc tatttc                                            26

<210>27

<211>26

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>27

cttgacattg gggagtttag cgagag                                            26

<210>28

<211>24

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>28

tcatctaata accagttcga tttc                                              24

<210>29

<211>23

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>29

gactacaaca tccagaagga gtc                                               23