法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-09-16
授权
授权
2010-01-06
实质审查的生效
实质审查的生效
2009-11-11
公开
公开
政府支持的声明
本研究得到美国国立卫生研究院(NIH)(GM065364)的支持。使 用在授予号DMR-0213805下由国家科学基金(National Science Foundation)(NSF)支持的材料研究科学和工程中心(Materials Research Science and Engineering Centers)(MRSEC)共享的设 施。这项工作也得到来自NSF的博士前奖学金(A.W.M)、Damon Runyon 癌症研究基金奖学金(Cancer Research Foundation Fellowship) (DRG-1805-04)(S.T.P)、来自美国癌症协会(American Cancer Society)的博士后奖学金(S.W.T.)、来自国家科学和工程研究委员 会(National Science and Engineering Research Council)(NSERC) 的博士后奖学金(S.J.V.)、来自马萨诸塞州技术转让中心 (Massachusetts Technology Transfer Center)的技术研究奖 (Technology Investigation Award)(M.J.B.)、圣保罗州研究基 金机构(Sao Paulo State Research Funding Agency)-FAPESP(E.C.) 的支持。
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求美国临时专利申请号 60/914,252的利益，所述美国临时专利申请于2007年4月26日提交 且名称为“Patterned Paper as a Platform for Inexpensive，Low Volume，Portable Bioassays and Methods of Making Same”，其 完整内容通过引用并入本文，并且还根据35 U.S.C.§119(e)要 求美国临时专利申请号60/852,751的利益，所述美国临时专利申请于 2006年10月18日提交且名称为“Patterned Paperasa Platform for Inexpensive，Low Volume，Portable Bioassays and Methods of Making Same”，其完整内容通过引用并入本文。
发明背景
发明领域
总的来说，本公开内容涉及基于多孔介质的生物测定装置、及其 制备方法和使用方法。
相关领域的讨论
生物学液体的分析对于监控个体和群体的健康有用。然而，这些 测量在偏远区域中例如在发展中国家中发现的那些，在紧急情况下， 或在家庭健康护理背景中可能难以实现。常规实验室仪器提供生物学 样品的定量测量，但它们一般不适合于偏远场所，因为它们很大、昂 贵且一般要求受过训练的人员和相当体积的生物学样品。
其他类型的生物测定平台提供了常规仪器的替代方案，但它们在 某些情况下也具有局限性。例如，微流体装置在生物学和化学筛选中 可以是有用的。包含孔和/或通道的基于玻璃和聚合物的微流体装置已 得到开发。然而，常规微流体装置——即使当设计为简单的时——— 般要求泵和外部检测器以进行使用。
尽管“浸渍片”在概念上是简单的，但它们一般太昂贵而不能用 于低成本背景，且一般要求相对大量的样品以便能够进行精确测量， 例如，约5mL样品。此种大体积的样品在许多情况下，特别是从早产 儿和幼儿中无法容易地获得。
发明概述
在一个方面，生物测定包括能够通过毛细管作用转运液体的多孔 亲水介质；和包埋在多孔亲水介质中的流体不透性屏障，所述屏障限 定在多孔介质中的一个或多个检测区域中终止的通道。在一个或多个 实施方案中，对多孔亲水介质进行处理以提供存在于液体中的分析物 的可见指示。
在一个方面，测定装置包括多孔、亲水介质；包含聚合光致抗蚀 剂的流体不透性屏障，所述屏障基本上穿透多孔、亲水介质的厚度， 且限定在多孔、亲水介质内的测定区域的边界；和在测定区域中的测 定试剂。
一个或多个实施方案包括一个或多个下述特征。屏障进一步限定 在多孔、亲水介质内的通道区域的边界，所述通道区域与测定区域流 体性连接。屏障进一步限定在多孔、亲水介质内的样品沉积区域的边 界，所述通道提供了在多孔、亲水介质内的在样品沉积区域和测定区 域之间的流体性途径。屏障进一步限定多个测定区域的边界。屏障进 一步限定在多孔、亲水介质内的多个通道区域的边界，且进一步限定 样品沉积区域的边界，每个通道提供在多孔、亲水介质内的在样品沉 积区域和多个测定区域的相应测定区域之间的流体性途径。测定试剂 在至少某些测定区域中。屏障使多个测定区域的测定区域彼此在物理 上分开。测定试剂在测定区域中与多孔、亲水介质共价结合。测定试 剂在测定区域中与多孔、亲水介质非共价结合。选择测定试剂以提供 分析物的存在的可见指示。选择测定试剂，以与存在的葡萄糖、蛋白 质、脂肪、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1、抗体和细胞因 子中的至少一种反应。光致抗蚀剂包括负性光致抗蚀剂。多孔、亲水 介质包含乙酸硝化纤维素、乙酸纤维素、纤维纸、滤纸、面巾纸、书 写纸、纸巾、布和多孔聚合物膜之一。多孔、亲水介质是弹性的。屏 障具有至少一个约5cm-约100μm的尺度。屏障具有至少一个约300 μm-约100μm的尺度。屏障具有至少一个小于约300μm的尺度。 通道具有至少一个约750μm-约100μm的横向尺度。通道具有至少 一个约250μm-约100μm的横向尺度。通道具有至少一个小于约 250μm的横向尺度。成像装置能够获得测定区域的数字图像。处理器 与成像装置相连，且基于测定区域的数字图像，能够获得关于测定区 域中的分析物的信息。基于测定区域的数字图像中的强度，处理器能 够获得关于分析物的信息。层在多孔亲水介质上，所述层包括至少一 个小孔。所述小孔提供至测定区域的至少部分流体性途径。
在另一个方面，测定装置包括多孔、亲水介质；基本上穿透多孔、 亲水介质的厚度且具有约1mm-约100μm的宽度的流体不透性屏障， 所述屏障完全限定在多孔、亲水介质内的测定区域的边界；和在测定 区域中的测定试剂。
一个或多个实施方案包括一个或多个下述特征。选择测定试剂以 提供分析物的存在的可见指示。选择测定试剂，以与存在的葡萄糖、 蛋白质、脂肪、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1、抗体和细 胞因子中的至少一种反应。屏障包含光致抗蚀剂和可固化(curable) 聚合物之一。多孔、亲水介质包含乙酸硝化纤维素、乙酸纤维素、纤 维纸、滤纸、面巾纸、书写纸、纸巾、布和多孔聚合物膜之一。屏障 具有至少一个约300μm-约100μm的横向尺度。屏障具有至少一个 小于约300μm的横向尺度。多个流体不透性屏障基本上穿透多孔、 亲水介质的厚度，每个屏障具有约1mm-约100μm的宽度，每个屏 障各自完全限定在多孔、亲水介质内的相应测定区域的边界；和在每 个测定区域中的测定试剂。
在另一个方面，测定装置包括多孔、亲水介质；基本上穿透多孔、 亲水介质的厚度，且具有长度和按照屏障的长度改变小于约10％的宽 度的流体不透性屏障，所述屏障限定在多孔、亲水介质内的测定区域 的边界；和在测定区域中的测定试剂。
一个或多个实施方案包括一个或多个下述特征。屏障进一步限定 在多孔、亲水介质内的通道区域的边界，所述通道区域与测定区域流 体性连接。屏障进一步限定在多孔、亲水介质内的样品沉积区域的边 界，所述通道提供了在多孔、亲水介质内的在样品沉积区域和测定区 域之间的流体性途径。选择测定试剂以提供分析物的存在的可见指示。 选择测定试剂，以与存在的葡萄糖、蛋白质、脂肪、血管内皮生长因 子、胰岛素样生长因子1、抗体和细胞因子之一反应。屏障包含光致 抗蚀剂和可固化聚合物之一。多孔、亲水介质包含乙酸硝化纤维素、 乙酸纤维素、纤维纸、滤纸、面巾纸、书写纸、纸巾、布和多孔聚合 物膜之一。屏障宽度小于约300μm。屏障宽度按照屏障的长度改变 小于约5％。通道区域具有约750μm-约100μm的宽度。通道区域 具有长度和按照通道的长度改变小于约10％的宽度。通道区域具有长 度和按照通道的长度改变小于约5％的宽度。
在另一个方面，制备装置的方法包括用光致抗蚀剂使多孔、亲水 介质饱和；使饱和的介质暴露于预定的光模式；基于预定的光模式从 介质的区域中去除光致抗蚀剂，以限定形成区域的边界的残留光致抗 蚀剂的屏障，其中选择预定的光模式，从而使得屏障限定区域中的测 定区域；和在测定区域中提供测定试剂。
一个或多个实施方案包括一个或多个下述特征。屏障是基本上流 体不透性的。选择预定的光模式，从而使得屏障完全包围区域。选择 预定的光模式，从而使得屏障作为区域的第一个部分的边界，和其中 多孔、亲水介质的边缘作为区域的第二个部分的边界。提供试剂包括 使试剂与测定区域共价结合。提供试剂包括使试剂与测定区域非共价 结合。选择其中预定的光模式，从而使得测定区域具有基于在液体的 存在下试剂的转运特征的形状。选择测定试剂以提供分析物的存在的 可见指示。选择测定试剂，以与存在的葡萄糖、蛋白质、脂肪、血管 内皮生长因子、胰岛素样生长因子1、抗体和细胞因子之一反应。选 择预定的光模式，从而使得屏障限定区域中的通道区域。通道区域具 有至少一个约750μm-约100μm的横向尺度。选择预定的光模式， 从而使得屏障限定区域中的样品沉积区域。用光致抗蚀剂使多孔、亲 水介质饱和包括将溶于溶剂的光致抗蚀剂溶液施加于介质，且使溶剂 基本上蒸发。使饱和的介质暴露于预定的光模式包括用光照射区域， 和基本上不用光照射屏障。使饱和的介质暴露于预定的光模式包括用 光照射屏障，和基本上不用光照射区域。去除光致抗蚀剂包括基于预 定的光模式从介质的多个区域中去除光致抗蚀剂，以限定形成相应区 域的边界的多个残留光致抗蚀剂的屏障。用光致抗蚀剂使第二多孔、 亲水介质饱和；使饱和的第二介质暴露于预定的光模式；基于预定的 光模式从第二介质的区域中去除光致抗蚀剂，以限定形成区域的边界 的残留光致抗蚀剂的屏障，使第二介质的屏障与第一所述介质的屏障 基本上对齐；和使第一介质与第二介质结合。在第一介质的区域中应 用试剂，所述试剂经选择以与靶分析物反应。在第二介质的区域中提 供标记抗体和标记蛋白质之一，选择所述标记抗体和标记蛋白质之一 以提供试剂和靶分析物之间的反应的颜色指示。提供在多孔、亲水介 质上的层，所述层包括至少一个基于屏障的位置对齐的小孔。选择预 定的光模式，从而使得屏障具有至少一个约5cm-约100μm的尺度。 选择预定的光模式，从而使得屏障具有至少一个小于约250μm的尺 度。多孔、亲水介质包含乙酸硝化纤维素、乙酸纤维素、纤维纸、滤 纸、面巾纸、书写纸、纸巾、布和多孔聚合物膜之一。基于预定的光 模式从介质的多个区域中去除光致抗蚀剂，以限定形成相应的多个区 域的边界的多个残留光致抗蚀剂的屏障，其中选择预定的光模式，从 而使得多个屏障限定区域中相应的多个测定区域；和在至少某些测定 区域中提供测定试剂。
在另一个方面，制备装置的方法包括用可固化聚合物涂布预定图 案的印模；将经涂布的印模压到多孔、亲水介质上，所述介质具有厚 度和可固化聚合物依照预定图案基本上穿透介质通过其厚度；使可固 化聚合物固化以便形成包埋在介质中的流体不透性屏障，所述流体不 透性屏障限定介质中的测定区域；和在测定区域中提供试剂。
一个或多个实施方案包括一个或多个下述特征。可固化聚合物包 括聚(二甲基-硅氧烷)(PDMS)。选择预定图案，从而使得屏障完全 包围区域。
在另一个方面，执行测定以确定液体样品中分析物的存在的方法 包括使液体样品沉积在测定装置上，所述测定装置包括多孔、亲水介 质，包含聚合光致抗蚀剂的流体不透性屏障，所述屏障基本上穿透多 孔、亲水介质的厚度，且限定在多孔、亲水介质内的测定区域的边界， 和在测定区域中的测定试剂，选择所述测定试剂以提供对分析物的存 在的可见应答；获得测定区域的图像；和基于测定区域的图像测定液 体中分析物的存在。
一个或多个实施方案包括一个或多个下述特征。测定液体中分析 物的存在包括获得测定区域的至少部分图像的平均强度，和基于平均 强度测定液体中分析物的存在。获得测定区域的图像包括用相机电话、 数码相机和扫描仪之一使测定区域成像。基于测定区域的图像测定分 析物的存在包括将图像传送给远方实验室，且从远方实验室获得关于 液体中分析物的存在的信息。获得测定区域的图像包括用相机电话使 测定区域成像，和其中基于测定区域的图像测定分析物的存在包括经 由相机电话将图像传送给远方实验室。
附图简述
在附图中：
图1A-1E是根据某些实施方案的横向流动(lateral flow)生物 测定装置的图像。
图2显示了根据某些实施方案，暴露于包含各种浓度的分析物的 溶液的横向流动生物测定装置的图像。
图3A-3C描述了根据某些实施方案，在暴露于包含分析物的溶液 之前和之后获取的，被灰尘、植物花粉和石墨粉污染的横向流动生物 测定装置。
图4示意性举例说明了根据某些实施方案，用于在测量生物学液 体中葡萄糖和蛋白质的存在中使用的横向流动生物测定装置的平面 图。
图5举例说明了根据某些实施方案，使用横向流动生物测定装置 以定量测定生物学液体中分析物例如葡萄糖和蛋白质的存在的步骤。
图6举例说明了根据某些实施方案，使用横向流动生物测定装置 定量测定具有各种浓度的葡萄糖和蛋白质的生物学液体中葡萄糖和蛋 白质的存在的结果。
图7举例说明了根据某些实施方案，含和不含海藻糖的流动装置 在定量测定生物学液体中葡萄糖和蛋白质的存在中的长期稳定性。
图8A和8B是根据某些实施方案的穿过(flow-through)生物测 定装置的透视图。
图9A和9B分别是根据某些实施方案的示例性穿过生物测定装置 的前和后视图。
图10举例说明了根据某些实施方案，用于装配穿过生物测定装置 的示例性方法。
图11举例说明了根据某些实施方案，使用洁净室中的光刻术来在 多孔、亲水介质中提供疏水屏障的示例性操作。
图12举例说明了根据某些实施方案，使用实验室中的光刻术来在 多孔、亲水介质中提供疏水屏障的示例性操作。
图13举例说明了根据某些实施方案，用于通过使用微接触印刷术 来提供在多孔、亲水介质中的疏水屏障的示例性操作。
图14A-14B是根据某些实施方案，使用各种形成图案的方法获得 的疏水屏障的图像。
图15A-15C是根据某些实施方案，由通过使用各种形式图案的方 法所形成的在纸内的形成图案的疏水屏障确定界限的约3.6×3.6mm2的格栅的图像。
图16A-16B是根据某些实施方案，相对狭窄的屏障的宽度的图像， 所述屏障提供功能装置且使用各种形成图案的方法来形成。
图17A是根据某些实施方案，用于与相机电话一起使用的示例性 透镜的图像。
图17B-17C分别是根据某些实施方案，用和不用图17A的透镜获 取的生物测定装置的图像。
图18A举例说明了根据某些实施方案的三维生物测定装置的透视 图。
图18B显示了根据某些实施方案，在暴露于有色液体期间在不同 时间上的示例性三维生物测定装置的图像。
图19举例说明了根据某些实施方案的三维生物测定装置的透视 图。
图20举例说明了根据某些实施方案，在横向生物测定装置中的层 的平面图和透视图。
图21A-21F是根据某些实施方案，在暴露于有色液体期间在不同 时间上图20的横向生物测定装置的图像。
发明详述
概述
本发明的实施方案提供了基于形成图案的多孔介质的横向流动和 穿过生物测定装置、及其制备方法和使用方法。
在某些方面，多孔、亲水介质用疏水屏障形成图案，以提供一类 低成本、便携式和技术上简单的平台用于运行关于生物学液体的多路 生物测定。用于生物测定的有用的亲水介质的一个例子是纸，其是廉 价的、容易商购获得的、一次性的，通过毛细作用快速吸取液体，且 无需如某些常规平台那样谨慎处理。纸或其他多孔、亲水介质用疏水 屏障形成图案，所述疏水屏障提供生物学液体的空间控制，且由于屏 障限定的区域内的毛细管作用使得液体能够转运。疏水屏障可以是聚 合的，例如可固化聚合物或光致抗蚀剂，且提供贯穿限定区域内的多 孔、亲水介质的厚度的基本上不透性屏障。与在聚合物或玻璃中包括 空流体性通道或孔的常规微流体装置不同，由这些屏障界定的区域不 是空的，而是由多孔、亲水介质构成且包含多孔、亲水介质。
与常规装置进一步形成对比，生物测定装置的某些实施方案使用 光刻术，通过用光致抗蚀剂使多孔、亲水介质饱和，使饱和的介质暴 露于预定的光模式，且基于模式去除光致抗蚀剂，形成由光致抗蚀剂 构成的疏水屏障进行制备。可以选择光模式以限定测定区域、通道区 域、样品沉积区域等，其边界至少部分由疏水屏障限定。尽管光致抗 蚀剂通常与半导体一起使用，但令人惊奇的是，本发明人已发现用光 致抗蚀剂使多孔、亲水介质饱和且对该光致抗蚀剂执行光刻术允许制 造高品质部件，这使用常规测定生产技术无法获得。一般的常规测定 生产技术包括依照图案将液体施加于多孔介质，然后使液体硬化以形 成部件。然而，当应用液体时，它在介质内横向扩散，从而引起部件 中的精确度(definition)的丧失。光刻术不依赖于依照图案应用液 体，从而提供比常规可得的显著更高的部件分辨率。例如，使用这种 光刻技术可以制备比使用筛选-印刷技术可以制备的显著更小的部件， 例如具有约1mm-约100μm，例如约300μm-100μm或甚至更小 的厚度的屏障。此外，该技术可以形成不按照其长度显著改变的部件， 例如具有按照其长度改变小于约10％、小于约5％或甚至更小的宽度 的屏障。相反，由此种屏障限定的通道也将具有不按照其长度显著改 变的宽度，例如，按照其长度改变小于约10％、小于约5％或甚至更 小。生物测定装置的其他实施方案基于其他生产方法，例如软刻蚀术， 其提供使用制备测定装置的常规技术无法获得的有用的利益和提高的 部件分辨率，如下文所更详细地描述的。
亲水介质的界定的区域可以用于限定生物测定装置中的一个或多 个测定区域。生物测定装置的测定区域可以用这样的试剂进行处理， 其响应生物学液体中存在的分析物且可以充当分析物存在的指示剂。 因为测定的许多实施方案意欲于无需使用复杂和昂贵的设备而容易地 使用，所以在某些实施方案中，装置对分析物的应答是肉眼可见的。 例如，亲水介质可以在测定区域中进行处理，以提供分析物的存在的 显色指示剂。指示剂可以包括在分析物的存在下变得有色，在分析物 的存在下改变颜色，或在分析物的存在下发出荧光、磷光或发冷光的 分子。在其他实施方案中，放射性、磁性、光学和/或电测量可以用于 测定蛋白质、抗体或其他分析物的存在。
在某些实施方案中，为了检测特定蛋白质，亲水介质的测定区域 可以用诸如小分子的试剂进行衍生，其与蛋白质选择性结合或相互作 用。或者，例如为了检测特定抗体，亲水介质的测定区域可以用诸如 抗原的试剂进行衍生，其与所述抗体选择性结合或相互作用。例如， 试剂例如小分子和/或蛋白质可以与亲水介质共价连接，使用与用于使 分子固定在珠或载玻片上的那种相似的化学作用，或使用用于使分子 与碳水化合物连接的化学作用。在备选实施方案中，试剂可以通过从 溶液中应用其且允许溶剂蒸发来进行应用和/或固定。试剂可以通过其 他非共价相互作用经由物理吸附在多孔介质上来进行固定。一般而言， 广泛多样的试剂可以与生物测定装置一起使用以检测分析物，且可以 通过各种合适的方法进行应用。这些试剂可包括抗体、核酸、适体、 分子印迹聚合物、化学受体、蛋白质、肽、无机化合物和有机小分子。 这些试剂可以非共价地(通过非特异性相互作用)或共价地(作为酯、 酰胺、亚胺、醚，或通过碳-碳、碳-氮、碳-氧、或氧-氮键)与纸吸 附。
然而，某些分析物与某些试剂的相互作用可以不导致可见的颜色 改变，除非分析物先前已进行标记。装置可以另外进行处理以添加染 色剂或标记蛋白质、抗体、核酸或其他试剂，其在其与测定区域中的 试剂结合后与靶分析物结合，且产生可见的颜色改变。这可以例如通 过提供具有已包含染色剂或标记试剂的分隔区域的装置来完成，且包 括在所述染色剂或标记试剂与测定区域中的试剂结合后通过其染色剂 或标记试剂可以容易地被导向靶分析物的机制。或者，例如，装置可 以与分隔通道一起提供，在所述染色剂或标记试剂与测定区域中的试 剂结合后，所述分隔通道可以用于使染色剂或标记试剂从纸的不同区 域流动到靶分析物内。在一个实施方案中，这种流动用水滴或其他液 滴来起始。在另一个实施方案中，试剂和标记试剂在装置的同一位置 处例如在测定区域中应用。
生物测定装置可以是横向流动构造(configuration)、穿过构造、 这2种的组合或三维构造。在横向流动生物测定装置中，液体经由毛 细管作用横向流过装置，例如从其中可以将样品引入装置内的介质的 样品沉积区域到其中分析物的存在可以经由通过疏水屏障限定的通道 进行检测的介质的测定区域。因为疏水屏障限定液体的流动途径，所 以屏障图案的合适选择可以产生多路测定，其中液体从介质的样品沉 积区域经由通过屏障限定的多个通道流动到多个测定区域。屏障可以 另外形成图案，从而使得通道足够狭窄以允许相对小体积的液体(例 如小于10μL)流动至装置的所有期望的区域。然而，应注意屏障的 最小部件尺寸在某种程度上依赖于所选择的制造技术，如下文所更详 细地描述的。
穿过生物测定装置一般包括多层，其中至少一层是用疏水屏障形 成图案的多孔、亲水介质。在使用中，液体从一层垂直流向另一层， 并且疏水屏障限制液体的横向流动。多孔、亲水介质的一个或多个区 域可以进行处理以提供用于靶分析物的测定，例如提供分析物的存在 的视觉指示剂(或其他可检测的指示剂)。在某些实施方案中，装置 的一层用染色剂或标记试剂进行处理，所述染色剂或标记试剂例如在 分析物与另一层中的试剂相互作用后提供分析物的存在的显色指示 剂。应注意某些实施方案可以包括液体的横向流动和穿过。
在许多方面，单滴液体，例如来自针刺手指的血滴足以执行测定， 提供对分析物的存在的简单的是/否回答，或样品中存在的分析物的量 的半定量测量，例如通过进行测定强度与标准比色图表的视觉或数字 比较。然而，为了获得液体中的分析物的定量测量，一般使限定体积 的液体沉积在装置中。因此，在某些实施方案中，限定体积的液体(或 足够接近于限定体积的体积以提供适当精确的读数)可以通过使纸形 成图案以包括接受限定体积的液体的样品孔来获得。例如，在全血样 品的情况下，受试者的手指可以进行针刺，然后针对样品孔对手指施 压直至孔充满，从而提供限定体积的良好近似。
某些实施方案进一步包括在液体沉积后可以用于使生物测定装置 成像的设备，以便基于装置的比色应答的强度获得关于分析物的量的 信息。在某些实施方案中，设备能够建立与不在现场的人员的通讯联 系，例如经由手机通讯通道，所述人员基于通过设备获得的图像进行 分析。
在某些方面，此种生物测定可以使用简单的方法进行制造，其产 生在亲水介质中形成图案的疏水屏障。例如，在某些实施方案中，将 亲水介质在光致抗蚀剂中浸透，并且使用光刻术以使光致抗蚀剂形成 图案从而形成屏障。光刻术可以在洁净室中进行，或如下所述，也可 以在洁净室外，例如在一般的实验室背景中进行，而不显著影响所制 造的屏障的品质，并且具有明显减少的成本。在其他实施方案中，微 接触印刷用于限定屏障。此处，限定图案的“印模”用聚合物“加墨”， 并且将其施压至亲水介质上并通过亲水介质，以便聚合物浸透介质， 从而形成那种限定图案的屏障。还可以使用其他制造技术，其中某些 在下文进行描述。依赖于装置的预期应用和所使用的具体屏障制造技 术，屏障可以具有超过约200μm的宽度，且可以限定具有微米级别 的宽度的通道，例如约50μm，或直至数毫米或更大。
尽管某些实施方案包括层析纸作为多孔、亲水介质，但一般而言 可以使用通过毛细管作用吸取液体且与所选择的形成图案的方法相容 的任何基质，例如硝化纤维素和乙酸纤维素、纤维纸、滤纸、布和多 孔聚合物膜。例如，硝化纤维素和乙酸纤维素是用于在液体诊断中使 用的常用的和众所周知的膜，但与通常在光刻术中使用的溶剂不相容， 因此其他方法将更适合于使其形成图案，如下文所更详细地讨论的。 此外，亲水介质和疏水屏障区域可以使用与测试条件例如温度、pH和 /或离子强度相容的材料进行制备。
首先，将描述横向流动生物测定装置及其使用的某些实施方案。 随后，将描述穿过生物测定装置及其使用的某些实施方案。随后，将 描述用于在多孔、亲水介质中提供形成图案的疏水屏障的方法的某些 实施方案。
横向流动生物测定装置
图1A是根据本发明的某些实施方案，具有亲水介质和疏水屏障的 横向流动生物测定装置的阵列100的图像。每个装置110包括一个或 多个形成图案的疏水屏障130，例如通过光刻术形成图案的和固化的 光致抗蚀剂，和多孔介质120，例如层析纸。疏水屏障130在介质120 中限定可以用于执行生物测定的区域。在举例说明性实施方案中，屏 障130限定样品沉积区域140，在其中可以沉积生物学液体，并且其 还充当通道以通过毛细管作用吸取液体，和生物学液体流到其内的多 个测定区域150。如下文所更详细地描述的，测定区域150可以进行 处理以提供用于特定应用的测定，例如以指示糖在尿中的存在。图1A 举例说明了由单个7.5cm层析纸盘生产的10个单独的装置110，然 而，对于给定应用可以适当选择纸的大小以及装置的数目和类型。
图1B是在通过毛细管作用吸收约5μL Waterman红墨水后，图 1A的生物测定装置110之一的图像。样品沉积区域140通过毛细管作 用吸收样品，并且形成图案的疏水屏障130将样品导入3个测定区域 150内。如图像所显示，屏障130基本上限制样品在界限清楚的区域 中流动。如下文所更详细地描述的，因为装置的形成图案的区域可以 制造成相对小的尺寸，所以仅需要相对小体积的液体(例如，小于10 μL)以充分充满由屏障130限定的区域140、150；一般而言，各种 构造的装置可能需要约0.1μL-100μL液体以充满装置，依赖于装 置的大小和装置内的部件的大小。
在某些实施方案中，亲水介质例如纸的一个或多个区域通过添加 合适的试剂进行衍生以用于生物测定。图1C是生物测定装置160的实 施方案的图像，其中测定区域170和180已用不同试剂进行点样以用 于诊断用途，和第三个测定区域190是对照。在举例说明性实施方案 中，区域170经制备用于葡萄糖测定，所述葡萄糖测定由J.D.Peele， R.H.Gadsden，R.Crews，Clin.Chem.1977，23，2242-2246中描 述的那种进行改编，所述参考文献的完整内容通过引用并入本文。如 下文所更详细地描述的，测定通过用0.3μL 0.6M碘化钾，随后用 0.3μL 1∶5辣根过氧化物酶/葡萄糖氧化酶溶液(15单位的蛋白质 /mL溶液)对测定区域170点样来进行制备。当测定暴露于葡萄糖时， 葡萄糖在水和氧的存在下被葡萄糖氧化酶氧化，产生葡萄糖酸和过氧 化氢。过氧化氢随后被辣根过氧化物酶还原成水，伴随碘化物同时氧 化成碘。结果是与葡萄糖的存在相关的从澄清到褐色的可见颜色改变。
区域180经制备用于蛋白质测定，所述蛋白质测定由M.J.Pugia， J.A.Lott，J.A.Profitt，T.K.Cast，J.Clin.Lab.Anal.1999， 13，180-187中描述的那种进行改编，所述参考文献的完整内容通过 引用并入本文。如下文所更详细地描述的，测定通过用0.3μL预充 溶液(0.3μL)(92体积％水、8体积％乙醇、2.5g/L聚乙烯醇和 在pH 1.8下的250mM柠檬酸盐缓冲剂)，随后用0.3μL试剂溶液 (95体积％乙醇、5体积％水、3.3mM四溴酚蓝)对区域180点样来 进行制备。蛋白质测定基于四溴酚蓝(TBPB)电离化且与蛋白质结合 时的颜色改变。这种情况下的阳性结果由从黄色到蓝色的颜色改变指 示。
区域190可以用作对照孔，且可以用不含酶溶液的碘化物，或不 含碘化物的酶溶液进行点样。
在这个示例性实施方案中，试剂用毛细管进行点样，然而，移液 管或例如微阵列中所使用的针可以用于大量生产测定。喷墨印刷也可 以用于沉积试剂。在使用装置前允许点样的试剂在室温下风干至少3 分钟。
图1D是在暴露于不包含葡萄糖或蛋白质的5μL人工尿液后，图 1C的生物测定装置的图像。具体地，用微量移液管将5μL样品溶液 转移至培养皿，将装置的底部浸入溶液内，并且溶液通过毛细管作用 吸收到纸内。人工尿液根据由Brooks和Keevil(T.Brooks，C.W. Keevil，Lett.Appl.Microbiol.1997，24，203-206，其完整内容 通过引用并入本文)提供的配方(recipe)进行制备。人工尿液包含 1.1mM乳酸、2.0mM柠檬酸、25mM碳酸氢钠、170mM尿素、2.5mM 氯化钙、90mM氯化钠、2.0mM硫酸镁、10mM硫酸钠、7.0mM磷酸 二氢钾、7.0mM磷酸氢二钾、和25mM氯化铵，全都混合在Millipore 纯化的水中。溶液的pH通过添加1.0M盐酸调整至6.0。所有试剂得 自Sigma-Aldrich。
图1E是在暴露于另外包括550mM葡萄糖和75μM牛血清白蛋 白(BSA)的5μL上述人工尿液后，图1C的生物测定装置的图像。 对照区域190用碘化钾溶液但不用酶溶液进行点样。葡萄糖测定区域 170和蛋白质测定区域180都显示对溶液中分别的分析物的存在的可 见应答，而对照区域190不显示显著应答。包含酶溶液但不含碘化物 的相似对照给出基本上相同的结果(数据未显示)。
上述测试在不同的时间和温度条件下进行重复以便确定测定的稳 定性。发现对于这个具体实施方案，当包装在铝箔中于约0℃或于约 23℃贮存约15天时，蛋白质测定产生与贮存温度和时间无关的可比较 的结果。葡萄糖测定看起来略微对贮存条件更敏感，且当贮存于23℃ 时显示对于在点样试剂后约24小时进行的测定减少的信号；然而，当 葡萄糖测定于约0℃贮存约30天时，它产生与它起始时得到的结果可 比较的结果。
图2举例说明了在图1C中举例说明的示例性生物测定上进行的测 试的顺序。具体地，通过将每个装置的底部浸入5μL测试溶液中， 使生物测定暴露于包含在临床相关范围中的葡萄糖和蛋白质(对于葡 萄糖2.5-500mM和对于BSA 0.38-75μM)的人工尿样品。液体在约 1分钟内基本上充满由形成图案的疏水屏障限定的整个区域。在约 10-11分钟后，测定干燥且视觉指示剂基本上完全显色。所得到的视 觉指示剂的强度大约对应于测试样品中葡萄糖和蛋白质的量。一般而 言，导致可检测应答，例如导致可见的颜色改变的最低分析物浓度限 定测定灵敏度的下限。在本文进行的测试中，颜色改变在2.5mM葡萄 糖和0.38μM BSA时可见，表明测定至少是这个灵敏度(且可能更灵 敏)。相比之下，一般的商购可得的浸渍片检测低至5mM葡萄糖或低 至0.75μM蛋白质。因此，上文描述的举例说明性生物测定至少与这 些浸渍片测定一样敏感。此外，所述测定形式允许同时测量2种或更 多分析物，而浸渍片一般局限于单种分析物的测量。
一般而言，通过用各种浓度的分析物进行测量，可以确定测量的 标准曲线。因此，给定蛋白质或抗体浓度可以与可见的颜色改变或强 度相关，允许定量测量。然而，应注意测定蛋白质或抗体的存在的常 规放射性、光学和/或电测量并非与该平台不相容，且在某些情况下可 能是有用的。
在一般使用过程中，液体样品可能不在无菌条件下进行测量；例 如吹尘或其他颗粒杂质可能接触液体和/或装置。包含多孔、亲水介质 的生物测定的一个有用特征是介质还充当滤器，以去除可能对生物学 样品有害的至少某些杂质。图3A-3C是如图1C中所示的横向流动装置 的图像，所述装置已分别另外被灰尘、植物花粉和石墨粉污染。这些 污染物近似于在本领域样品的一般收集和分析过程中可能遇到的条 件。在污染物沉积后，使装置暴露于包含550mM葡萄糖和75μM BSA 的人工尿样品。如图3A-3C所举例说明的，这些颗粒基本上不上升至 通道，且不显著干扰测定。
一般而言，依赖于具体实施方案的设计，存在至少2种将液体样 品引入生物测定装置的方法。例如，某些实施方案包括受多孔、亲水 介质的边缘界定的样品沉积区域。样品可以通过将样品沉积区域的这 个边缘浸入液体内来引入此种装置。液体随后横向流动至一个或多个 测定区域。其他实施方案包括位于装置中心的一个或多个样品沉积区 域，且具有至少部分由屏障限定的边界，从而使得不是将装置的边缘 浸入液体内，而是可以将液滴施加于中心样品沉积区域。液体随后横 向流动至一个或多个测定区域。此种装置可以无需分开的、无菌样品 储存库而使用，这不仅减少患者在储存库内提供相对高体积液体样品 的负担，还减少处理和沉积液体的健康护理工作者的负担。
图20显示示例性横向流动生物测定装置2000的顶部和底部平面 图。该装置包括层压至或以其他方式与底层2010结合的顶层2020。 如在装置的顶视图中可见的，顶层2020包括基本上液体不透性材料， 例如干膜光致抗蚀剂，在其内提供可以用于样品收集的通道2020′。 在举例说明性实施方案中，通道2020′包括中心小孔且由其辐射几个 狭窄小孔。底层2010包括多孔、亲水介质例如纸，和形成图案的疏水 屏障，例如如本文所更详细地描述的形成图案的光致抗蚀剂，并且所 述形成图案的疏水屏障限定测试区2010′，所述测试区2010′包括由其 辐射几个通道且这些通道在分别的测定区域中终止的中心样品吸收区 域。
根据某些实施方案，装置2000可以如图20中所举例说明的来形 成。首先，为了形成底层2010，提供用疏水材料例如光致抗蚀剂2011 饱和的多孔、亲水介质，如下文所更详细地描述的。饱和的介质2011 随后通过掩膜2040暴露于UV或其他合适的光，所述掩膜2040具有根 据装置2000中疏水屏障的所需图案而选择的图案，并且随后如下文所 更详细地描述的，疏水材料显现以形成层2010。层2010包括包含限 定测试区2010′的形成图案的疏水屏障的区域2011′，和可以无需接触 测试区2010′用于操作装置的纸标签2011″。在测试区2010′的通道 末端处的环状测定区域可以如上下文所更详细地描述的进行处理以与 分析物反应。
接下来，为了形成上层2020，提供能够使2021例如干膜光致抗 蚀剂形成图案的疏水材料层。材料2021随后通过掩膜2050暴露于UV 或其他合适的光，所述掩膜2050具有根据样品收集通道2020′的所需 图案而选择的图案，并且随后例如如下文所更详细地描述的，疏水材 料显现以形成层2020。层2020包括包含样品收集通道2020′的区域 2021′，和包含可以无需接触样品收集通道2020′用于操作装置的塑料 背衬的区域2021″。应注意上和下层可以根据需要以任何所需顺序或 平行形成。
上层2020随后例如通过使它们层压在一起与下层2010结合，以 形成装置2000。上和下层进行对齐，以使得区域2021″覆盖区域 2011″，和区域2011′覆盖区域2021′。在举例说明性实施方案中，样 品收集通道2020′的中心小孔覆盖测试区2010′的中心样品吸收区域。 然而，从样品收集通道2020′的中心小孔辐射的狭窄小孔不覆盖由测 试区2010′的中心样品吸收区域辐射的通道或测定区域。相反，通道 2020′的狭窄小孔由测试区2010′的通道和测定区域横向偏移，从而使 得液体基本上不从通道2020′的狭窄小孔之一直接流动到测试区 2010′的通道和测定区域之一内。相反，通道2020′的狭窄小孔引起液 体朝向样品收集通道2020′的中心小孔流动，从其液体流动到测试区 2010′的中心样品吸收区域内，且从该处向下流动到测试区2010的多 个通道和测定区域内。
在一个例子中，下层2010通过下述来形成：用光致抗蚀剂饱和 Whatman滤纸1；使纸于约95℃烘烤约10分钟；对纸连同掩膜(在2 片玻璃之间)一起施压；使纸通过掩膜暴露于UV光；使纸于约95℃ 烘烤约10分钟；使纸在丙二醇甲醚乙酸酯(PGMEA)中浸泡约30分钟 以洗掉未经照射的光致抗蚀剂；和用2-丙醇洗涤纸。纸随后于约25℃ 进行干燥，然后在约500托下进行等离子体氧化约10秒，以改善通道 和测试区的亲水性。
在相同例子中，下层2020通过首先获得干膜光致抗蚀剂来形成， 其作为在2侧上由透明的塑料片保护的浅蓝色塑料卷出现(来自Dupont)。光致抗蚀剂通过下述形成图案：使其经由掩膜(印刷 在透明物上)暴露于UV光；从一侧去除塑料片；且用约0.85重量％ Na2CO3的水溶液洗掉未经照射的光致抗蚀剂。形成图案的光致抗蚀剂 随后用3M Spray Mount TM粘合剂喷射约1秒，手工地将其与下层2010 对齐，并且使2层于约100℃层压在一起。使用喷枪以将溶于乙醇的 约7重量％的聚乙烯亚胺(MW＝20,000)溶液施加于装置的顶部，直 至装置看起来略微潮湿。涂层随后通过用氮流在装置上吹气进行干燥。 聚乙烯亚胺的涂层增加干膜光致抗蚀剂中的轮辐的亲水性。
图21A-21F是在暴露于有色水的过程中的不同时间点，使用上文 描述的实例操作制造的生物测定装置的图像。图21A是在暴露于水之 前装置的顶侧的图像。图21B是紧在使约5μL水沉积在上层2020 的样品收集通道2020′中的狭窄小孔之一上之后获得的装置的顶侧的 图像。图21C是在稍后时间点装置的顶侧的图像，且显示有色水沿着 它沉积在其上的狭窄小孔移到样品收集通道2020′的中心小孔内，且 进入下层2010的测试区2010′的中心样品吸收区域内。
图21D-21F是在有色水达到测试区2010′的中心样品吸收区域后 的不同时间点获取的装置的底侧的顺次图像。图21D显示在其从测试 区2010′的中心样品吸收区域流动到由中心区域辐射的通道内后的有 色水。图21E显示在其已从这些通道部分流动到测定区域内后的有色 水。图21F显示在其已基本上完全充满测试区2010′的中心样品吸收 区域、通道和测定区域后的有色水。在这个实施方案中，约5μL水 足以完全充满测试区2010′。
因为多孔介质可以用于过滤颗粒，所以它们还可以用于执行关于 全血样品的诊断。红细胞的存在一般使常规诊断复杂化，例如需要离 心或凝结。在本文描述的装置的某些实施方案中，多孔介质可以经选 择以便过滤掉红细胞，且允许血液的液体组分自由流动到通道内；可 替代地，纸可以另外进行处理，以增强与红细胞的结合且防止红细胞 阻断通道。一般而言，纸的多孔性将决定可以通过纸转运的颗粒的大 小。例如，蛋白质和小分子一般容易地通过纸移动，而孔径级别的颗 粒可以被滤出。
尽管比色测试在提供分析物的存在或不存在的视觉指示剂中一般 是有用的，但横向流动装置也可以用作平台用于定量测量生物学液体 例如尿中的分析物水平。使用廉价和便携的生物测定同时定量多种分 析物的能力可以在家庭健康护理背景中、在紧急情况下、和在较不工 业化的国家中、以及在实验室和医院背景中潜在地用于鉴定和监控疾 病。
在某些实施方案中，为了获得定量数据，生物测定装置在暴露于 液体后和比色结果显现后进行成像，例如使用台式扫描仪、便携式扫 描仪(例如名片扫描仪)、数码相机或相机电话进行成像。扫描仪对 于记录生物测定的结果有用，因为它们是相对廉价的，它们具有高分 辨率，扫描的图像一般是清晰的，并且图像的强度一般不受照明条件 的影响。数码相机是便携和日益能承受的、重量轻和功能强，尽管记 录的数字图像的强度可能受某些照明条件的影响，且聚焦相机重现性 的能力在某些情况下可能依赖于操作者。
相机电话一般具有与数码相机相似的特征，并且还允许记录的图 像可以通过现有通讯设施(例如手机通道)电子传递至不在现场的实 验室，其中数据可以由专家进行分析。专家随后可以将分析结果(例 如实时)返回给施用测试的人员。
某些型号的相机电话可以自动调焦，且不需要另外的透镜以便充 分聚焦于物体例如生物测定，而某些相机电话包括不能聚焦于与相机 太接近的物体的相机。某些实施方案包括置于相机前面的透镜，其可 以使得相机能够获取与相机相对接近的物体的充分聚焦的图像。图 17A是由聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)制备的示例性透镜1710的图像， 所述透镜1710可以与相机电话上的透镜可逆地密封。透镜1710使用 PDMS碱(PDMS base)和固化剂(184硅酮弹性体试剂盒) 的10∶1混合物进行制造，并且通过将其置于真空下30分钟从混合物 中去除气泡。将约5μL PDMS置于培养皿1720的底部上，且于60℃ 倒置固化2小时，以制备凹PDMS透镜。用镊子从培养皿1720中取出 PDMS透镜1710，且将基置于相机电话的透镜上。通过调整相机电话与 装置之间的距离使相机电话聚焦于装置。一般而言，透镜的焦距可以 通过改变PDMS透镜的曲率半径进行调整，例如通过使PDMS在比培养 皿更亲水或更不亲水的表面上固化。更亲水的表面将产生具有更大的 曲率半径和更大的焦距的透镜。更不亲水的表面将产生具有更小的曲 率半径的透镜。具有更小的曲率半径的透镜也可以通过使PDMS右侧朝 上(而不是倒置)固化来获得。具有合适焦距的任何会聚透镜(例如 平凸透镜、双凸透镜、菲涅耳(Fresnel)透镜)都可以置于相机电话 的前面以聚焦图像。
图17B是通过将透镜1710置于相机电话(自动模式的Samsung Trace相机电话，1.3兆像素)的透镜上，且使相机电话保持在示例性 生物测定装置上约4cm而获得的图像1730。图17C是用与图17B中 相同的相机电话和离装置相同的距离获取的相同生物测定装置的图像 1740。由于PDMS透镜，图像1730比图像1740显著更清晰。
在某些实施方案中，测定的结果转变成数字形式后，在每个测试 区中显现的颜色的强度使用例如或另一种图像分 析程序进行测量。颜色的强度随后与校正曲线进行比较，以计算分析 物的浓度。
图4示意性举例说明了示例性生物测定装置400，其包括通过毛 细管作用将样品吸取到多孔、亲水介质(例如纸)内的中心通道410， 和将样品导入4个分离的测定区域420、421、430、431的4个侧面通 道，所述测定区域各自包含测定试剂。该设计包括相对狭窄的通道(约 0.75mm宽)以减少每个测定所需的样品体积。一般地，通道越大， 运行测定所需的样品体积就越大。测定区域420、421用上文描述的蛋 白质测定进行处理，和测定区域430、431用上文描述的葡萄糖测定进 行处理。
这个设计的几个特征使得其适合于例如在家庭健康护理或偏远背 景中使用。约3mm长的中心通道410从生物学样品中过滤颗粒，类似 于上文描述的装置，且中心通道410的钟形较低部分促进样品的吸收。 整个示例性装置可以安装在1.6×1.6cm纸片上，使得装置不仅是小 和便携的，还是重量轻的(～35mg)。在测定区域420、421、430、 431上的空区域可以用于标记和处理装置。
在这个示例性例子中，还存在对所使用的具体葡萄糖和蛋白质测 定特异的几个设计特征。液体引起用于葡萄糖测定的试剂随着溶剂前 沿移动，而液体不引起用于蛋白质测定的试剂移动。图4的设计包括 2种类型的测试区，以适应这种差异行为并增强定量测定的能力。对 于葡萄糖测定，在测定区域430、431中提供菱形样形状，以使试剂在 测定区域的末端处浓缩。对于蛋白质测定，在测定区域420、421中提 供矩形样形状，以提供限定区域的相对一致的数据分析。一般而言，4 种不同的生物测定可以用这种示例性设计来进行，但在此处在每个装 置上一式两份地提供2种测定。此外，在图4的实施方案中，通道和 测试区的大小被设定和设计得足够大以通过肉眼可见，但同时足够小 以使运行测定所需的液体体积限制于样品的易处理的体积(例如约5 μL)，例如泪或尿滴。
一般而言，通道和/或测定区域的形状和大小可以根据装置与之一 起使用的液体和/或分析物和/或检测方法的类型进行选择。例如，如 果装置对分析物的应答将通过使装置成像且用计算机软件分析图像进 行测量，那么通道和测定区域不需要是人类肉眼可见的，只要成像系 统可以获得关于对分析物的应答的足够量的信息以执行分析。或者， 如上文例子中，如果试剂与施加于装置的液体一起移动，那么测定区 域可以进行调整，以捕获和/或浓缩试剂。或者，如上文例子中，如果 试剂在测定区域内相对静止，那么测定区域可以进行调整，以提供图 像分析软件可以容易地分析的区域。
图5举例说明了用于定量尿中的葡萄糖和蛋白质水平的示例性操 作500。首先，使生物测定装置暴露于液体510，例如浸入具有已知浓 度的葡萄糖和蛋白质(牛血清白蛋白，BSA)的约5.0μL人工尿样品 溶液内。在一个例子中，溶液和浸渍操作与上文描述的相同。
暴露的生物测定装置随后进行成像520。在一个例子中，测定开 始后30分钟，装置使用下述进行拍照：用闪光灯以手动模式的Nikon D50数码SLR相机(6.1兆像素)；不用闪光灯以自动模式的Sony Ericsson W660i相机电话(2.0兆像素具有自动对焦)；或具有PDMS 透镜以自动模式的Samsung Trace相机电话(1.3兆像素)。该装置 还可以使用Epson Perfection 1640SU扫描仪以缺省设置(彩色照片， 600dpi)；和Docketport 465 sheetfed便携式扫描仪以缺省装置 (彩色，600dpi)进行扫描。这些例子是非限制性的，并且可以使用 其他成像装置。
图像随后例如使用任选转变成8-比特灰度 530或转变成彩色格式例如CMYK 530′。随后，选择图像中的测定区域 540。在一个例子中，用鼠标使用矩形选取框工具选择用于蛋白质测定 的测定区域和使用多角形套索工具选择用于葡萄糖测定的测定区域。 对于蛋白质测定，用2.5×1.5mm宽的矩形选择整个测定区域。对于 葡萄糖测定，选择在图案的尖端处的三角形。
接下来，在每个测定区域内的像素强度的算术平均值用于定量比 色应答550。将这些平均强度扣除具有点样的试剂但未暴露于样品的 装置的平均强度。应注意某些或所有分析步骤可以进行自动化。例如， 在计算机上运行的软件可以用于自动选择随后进行分析的图像区域。 或者，例如，整个图像分析可以进行自动化，即计算机程序可以自动 选择图像区域，测量平均像素强度，且使用衍生自浓度曲线的等式将 像素强度转变成浓度。
图6举例说明根据本发明的某些实施方案，对人工尿中不同浓度 的葡萄糖和蛋白质获得的信号。测量0-20mM的葡萄糖浓度。蛋白质 测定使用0-60μM浓度的BSA来运行，并且显示于图底部处的图表中。 该图表包含使用台式扫描仪(方形)、便携式扫描仪(空心方形)、 数码相机(圆圈)和具有自动聚焦的相机电话(空心圆圈)获得的数 据；插图更详细地显示数据的线性区域。每个数据点是12次测定的平 均值；误差条表示这些测量的相对标准差。使数据的线性区域与线拟 合；每条线的斜率(m)、截距(b)和R2值如下：葡萄糖(台式扫描 仪)(m＝16.6，b＝-1.54，R2＝0.991)、葡萄糖(便携式扫描仪) (m＝18.0，b＝2.95，R2＝0.986)，葡萄糖(数码相机)(m＝8.96， b＝-2.12，R2＝0.983)，葡萄糖(相机电话)(m＝6.17，b＝0.186， R2＝0.986)，蛋白质(台式扫描仪)(m＝1.16，b＝12.8，R2＝0.982)， 蛋白质(便携式扫描仪)(m＝1.07，b＝14.0，R2＝0.954)，蛋白 质(数码相机)(m＝0.771，b＝14.5，R2＝0.980)，蛋白质(相 机电话)(m＝0.379，b＝17.0，R2＝0.950)。
如图6所举例说明的，得自示例性葡萄糖和蛋白质测定的信号与 分析物的浓度近似线性相关。这个图中显示的数据点和误差条分别是 来自每个分析物浓度的至少12次测量的平均值和标准差值。每个数据 集的线性最小二乘法拟合给出0.95-0.99的确定系数(R2)。应答在 0-5mM葡萄糖和5-60μM BSA之间是近似线性的，但在更高的分析 物浓度下变平而偏离线性。通过使用扫描仪或相机测量的葡萄糖的浓 度范围不跨越临床上在尿中检测出的整个葡萄糖浓度范围(1-56mM)。 然而，在尿中即使超过0.8mM的葡萄糖水平也指示疾病，因此它可以 用于检测低水平的葡萄糖。葡萄糖测定的线性范围(0-5mM)可以允 许定量测量尿中低浓度的葡萄糖。蛋白质检测的线性范围也适合于临 床使用。所述测定看起来足够敏感以区分肾小球疾病([蛋白质]＞35 μM)、肾小管疾病(10μM＜[蛋白质]＜20μM)和微蛋白尿 (microalbuminia)(0.3μM＜[蛋白质]＜2μM)。应注意通过 改变试剂的浓度或通过缩短图案的中心通道以限制测试孔和装置底部 之间的距离，可能可以定量检测其他浓度的葡萄糖和蛋白质。
图6还举例说明了使用特定照明条件，信号的强度对于数码相机 和相机电话一致地小于台式扫描仪和便携式扫描仪，但确定系数之间 的相似性以及葡萄糖和蛋白质数据的斜率之间的一致关系表明，对于 获得定量数据高品质数码相机几乎与扫描仪一样有效。例如，将来自 扫描仪和相机的校正曲线进行比较，以定量人工尿的测试样品中BSA 和葡萄糖的水平。对包含4.5mM葡萄糖和45μM BSA的样品测定12 次，产生4.3±0.4mM葡萄糖和46±5μM BSA(使用扫描仪校 正曲线)和4.5±0.8mM葡萄糖和48±6mM BSA(使用相机校正 曲线)的结果。因此2种技术都产生统计上相当的结果。
在示例性操作中，因为来自数码相机和相机电话的数据在某种程 度上依赖于照明条件，所以每个数据集通过运行已知浓度的人工尿样 品进行校正。将这种已知的样品的信号强度与由图6中显示的曲线预 期的值进行比较，从而获得用于调整实验数据以拟合校正曲线的应答 因子。
一般而言，图像分析方案例如上文的示例性方案可以用于分析各 种生物测定装置，且不限于所述实施方案。以可以数字化成像的方式 响应分析物的存在的任何装置可以使用上述操作的改编版进行分析。 例如，还可以分析横向生物测定装置、穿过生物测定装置和三维生物 测定装置的其他设计。
如上所述，生物测定装置的性能不受颗粒污染物的存在显著影响。 表1显示概括被灰尘、锯末屑或植物花粉污染的示例性人工尿样品 (4.5mM葡萄糖和50μM BSA)的定量分析的结果。每种污染物使用 数码相机和扫描仪测量6次；数字信号使用图6中所示的校正线转变 成浓度。在每种情况下，污染物对于葡萄糖的浓度具有很少的影响(误 差≤6％)，并且仅植物花粉影响蛋白质的浓度(误差≤13％)。这 起因于溶解于样品中且引起增加的应答的来自花的某些蛋白质。
表1.使用葡萄糖(4.5mM)和BSA(45μM)的污染溶液的测定的定量结果。装置使用台式扫描仪进行扫描，并且使用用于台式扫描仪的校正曲线计算浓度
a在被花粉污染的0μM BSA样品中独立测量到约34±10μM 蛋白质
如上所述，一般需要超过分析的样品体积的至少某些对照，以便 进行定量测量。然而，在某些环境中，例如偏远场所，可能无法获得 能够分配5μl样品的微量移液管。因为在生物测定装置上的通道和 测试区的组合表面积在许多实施方案中是恒定的，所以分析物可以通 过将装置浸入未知体积的样品内，且通过样品刚已充满测试区就取出 装置来定量获得。表2显示使用这样的方法的3个不同浓度的葡萄糖 和蛋白质的测量结果，其中将约20μL人工尿转移至培养皿，并且将 装置的底部浸入样品内，并且样品刚已充满4个测试区就从样品中取 出装置。使装置平放在纸巾上，且在30分钟后，如上所述对装置成像。 使用这种方法的测量中的误差略微大于使用固定体积的样品的那些， 但分析物的水平仍可以进行定量检测。
表2.包含葡萄糖(2.5、3.5和4.5mM)和蛋白质(25、35和45μM)的样品的定量检测。值是12次测量的平均值和标准差。
a来自具有自动聚焦的相机电话的校正曲线用于定量这些结果。
形成图案的纸和扫描仪或数码相机检测器的组合提供了用于在家 庭健康护理背景中或通过第一急救者定量检测疾病的几个优点。已发 现当检测尿中的葡萄糖和蛋白质时，这个实施方案给出精确和定量的 结果(误差≤15％)。这些结果还证实这种廉价、简单和便携的基于 纸的技术在测试系统中足够定量，可以用于医学相关背景。
在某些示例性装置中，在将试剂点样到装置上后观察到葡萄糖测 定的结果随着时间过去变得较不敏感(当装置贮存于室温下时)。在 偏远场所中有用的分析装置将希望包括保持稳定至少数日且优选数周 的试剂。为了增强用于葡萄糖测定的试剂的稳定性，可以添加海藻糖 ——已知其在其他应用中以蛋白质的活性形式稳定蛋白质的能力的二 糖。图7举例说明在其中将海藻糖点样在纸上(在添加酶之前)的某 些示例性实施方案中，经过2周的时间未观察到酶促活性的丧失(即 使当装置贮存于室温下时)，而在不用海藻糖制备的某些示例性实施 方案中，葡萄糖测定随着时间过去线性减少。特别地，在海藻糖的存 在下，当装置用试剂点样且贮存于室温下时，葡萄糖测定的信号强度 (当检测人工尿中的4.5mM葡萄糖时)接近恒定，持续约30天。图 表上的值是6次测量的平均值，并且误差条表示来自这些平均值的标 准差。蛋白质测定可以在室温下贮存超过2个月，而无信号的丧失(数 据未显示)。应理解，给功能装置提供海藻糖不是必需的，并且许多 其他处理也可以用于增强测定的稳定性。
尽管上述实施方案的多孔介质包括经衍生用于检测葡萄糖和蛋白 质的不同区域，但一般而言所述介质可以适当地衍生同样用于测量许 多其他分析物，并且可以在对于其简单、廉价的测试的可用性是有用 的各种应用中使用。
例如在某些实施方案中，生物测定装置用于执行婴儿例如早产儿 的尿分析。用常规技术从婴儿特别是早产儿获得足够量的尿是困难的。 常规技术是将棉球置于婴儿的尿布中的合适位置处，3小时后打开尿 布，取出棉球，且将尽可能多的尿(一般仅滴的部分)挤到成人尺寸 的尿分析浸渍片上。这种方法导致各种问题，包括样品一般至少已部 分蒸发，这影响分析物的浓度，以及溶液的比重(和因此的流动性)。 此外，分析物可能已氧化，这可以影响蛋白质、葡萄糖、pH和/或其 他测量的结果。
相比之下，本发明的实施方案提供了可以容易地用于捕获和分析 来自婴儿例如早产儿的尿样品的装置。在一个实施方案中，将经制备 用于所需测定的横向流动生物测定装置置于尿布中的合适位置处，且 所述装置包括导向尿布的外表面的纸通道。当婴儿排尿时，尿穿过装 置和纸通道，且展示可以由护士、技术员或医生阅读的外部比色指示 剂。因为其低成本，此种装置可以容易地包括在尿布中。此外，阅读 装置不需要触摸婴儿，因为颜色/测定在尿布的外表面上出现。这个方 面对于早产儿可以是特别有用的，因为触摸可以引起例如与其呼吸、 温度和/或应激水平有关的问题。此外，结果在排尿后可立刻获得；这 个结果无需等待直至预定的尿布更换(一般每3小时)时执行测试， 且减少可以伴随常规测定发生的潜在的样品降解。在某些实施方案中， 视觉指示剂被特别制成发亮的，以便指示尿已进行分析，从而使得结 果可以快速阅读。
各种测定可以并入基于尿布的装置内。例如，可以包括上文描述 的葡萄糖和/或蛋白质测试。在某些实施方案中，可以监控在婴儿例如 早产儿的尿中的血管内皮生长因子(VEGF)水平。VEGF水平是视网膜 疾病发展的指示剂。诊断早产儿中的视网膜疾病的常规方法是每周或 每2周由婴儿-视网膜眼科医生检查15分钟，这是昂贵的且对于婴儿 是破坏性的。检测尿中的VEGF和其他生长因子(例如，IGF-1或胰岛 素样生长因子1)可以用于诊断早产儿视网膜病、糖尿病、癌症和移 植，如S.K.Smith，Hum.Reprod.Update 1998，4，509-519中所 公开的，其完整内容通过引用并入本文。VEGF和其他生长因子的检测 可以以与怀孕测试条检测尿中的β-HCG相同的方法用形成图案的纸 技术来完成。
在其他实施方案中，装置可以用于执行动物例如实验动物或求助 于兽医的宠物的尿分析。常规地，对动物进行挤压和/或瘙痒直至它们 排尿；收集尿且随后将其沉积在成人尿分析浸渍片上。相比之下，横 向流动生物测定可以作为相对小的纸“碎片”来制备，且散布在动物 在其上可以排尿的笼的地板上。此种比色测试可以用于测量其中糖尿 病和肾疾病的早期诊断是有用的实验动物中的蛋白质和葡萄糖。在兽 医学背景中，在肥胖猫和犬中测定糖尿病是可能难以常规完成的有用 的测试。
在其他实施方案中，横向流动生物测定可以用于分析脑脊髓液 (CSF)，例如以测定患者是否具有脑膜炎。一般地，脑膜炎的诊断包 括CSF的培养，细胞计数以测定在CSF中有多少白细胞，以及CSF的 蛋白质和葡萄糖水平的测量。这3种因素在确定病毒对细菌/寄生虫/ 真菌性脑膜炎的病因学中可以是有用的。CSF一般无法以大量(数mL) 获得，特别是在儿童中。此外，对培养CSF的需要给予优先，留下少 许样品或未留下样品用于化学测定(葡萄糖、蛋白质)。尽管常规化 学分析器可以对数μL的样品执行葡萄糖/蛋白质测量，但此种测试是 昂贵的且在不发达国家一般不可用。相比之下，横向流动装置可以廉 价且快速地提供来自CSF的蛋白质和葡萄糖的半定量读数。例如，用 于资源贪乏的热带背景的应用可以通过筛选CSF中的蛋白质和葡萄糖 水平来允许区分脑型疟疾与病毒性脑膜炎。这些病症需要完全不同的 治疗，并且合适的区分可以使患者免于不必要的药物及其并非无关紧 要的副作用。
在某些实施方案中，装置可以用于母乳分析，例如以测定母乳中 的蛋白质、脂肪和葡萄糖水平，这可以帮助母乳喂养的母亲调整其喂 养/泵出以捕获足够的卡路里。这个问题对于其中营养对追赶生长至关 重要的早产婴儿特别重要。
在其他实施方案中，装置可以在组织工程应用中使用，例如在用 于替代治疗用途的肝、胰腺、胰岛细胞和其他外分泌/内分泌器官的小 “组织”的产生中使用。监控这些小数目细胞的输出，例如测量来自 肝细胞的小型培养物的白蛋白输出可能是困难的。催化化学例如 ELISA可以并入装置内，以便进行相对小的样品的测量。ELISA类型的 测定可以是横向流动或穿过装置的形式，其中例如酶标记的抗体可以 沉积在装置上的区域内，然后当它通过装置通过毛细管作用吸取时由 生物学液体形成溶剂化物。标记抗体可以与样品中的抗原结合，并且 这种复合物进一步结合与基底连接(共价)或附着(非共价)的抗体。 与抗体连接的酶的底物可以通过装置中分开的通道，或在生物学液体 已经过装置后通过试剂的手动添加来提供。
在另外其他的实施方案中，装置可以在眼科中，例如在分析玻璃 体液(眼的内容物)或泪膜中的组分中使用。此种分析在诊断各种病 状(例如感染、肿瘤、创伤、对全身性炎症如类风湿性关节炎的应答) 中可以是有用的。眼液体可以进行快速分析，例如以测定抗体和/或细 胞因子的水平。
在其他实施方案中，装置可以用于测量支气管肺泡 (broncheoalveolar)灌洗液中的组分，以诊断例如来自胃内容物的 胃食管反流的抽吸。
一般而言，装置适合于检测植物、动物和人中的代谢、应激和疾 病的生物化学标记。装置还可以用于检测水和土壤中的污染和其他分 析物，并且适合于检测其他液体如化妆品、油、燃料等中的分析物。
穿过生物测定装置
尽管某些实施方案一般通过液体样品在由疏水屏障限定的通道中 在多孔介质中的横向流动来操作，但在某些实施方案中，样品穿过多 层亲水介质，即以“穿过”构造的形式。在穿过装置中，当液体从一 层横贯(transversely)流动到另一层内时，疏水屏障横向包含液体。 不同层的多孔介质可以根据给定应用适当地进行处理或不进行处理。
图8A是根据本发明的某些实施方案，穿过装置800的透视图的示 意性举例说明。该装置包括上和下保护涂层810、850，任选的滤器820， 和多孔介质830、840。上和下保护涂层810、850使装置的其他层彼 此保持邻近，为装置提供另外的强度和稳定性，减少来自装置的蒸发， 且保护其他层不受外部污染。上保护涂层810包括通过其液体样品可 以沉积到下层上的小孔815。上和下保护层可以是例如聚合物涂层。 有用的保护涂层的一个例子是商购可得的胶粘带，其是廉价的且将容 易地结合其接触的层的表面。层压也是有用的。
当使样品过滤可能是必须的时，例如当预期存在灰尘或其他污染 物时，或当装置对全血样品使用且希望去除红细胞时，可以任选包括 滤器820例如玻璃纤维滤器或其他商购可得的滤器。多孔介质830例 如纤维纸包括一个或多个形成图案的疏水屏障，其限定其中试剂可以 进行点样或以其他方式应用的区域835。多孔介质840例如纤维纸同 样包括一个或多个疏水屏障，其限定其中其他试剂可以进行点样或以 其他方式应用的区域845。在某些实施方案中，区域835中的试剂与 样品中的分析物反应以产生中间产物试剂。这些中间产物试剂与过量 液体一起进入区域845内，在其中它们与先前已吸附到区域845内的 第二组试剂反应。在某些实施方案中，这个二次反应产生有色产物。 分层结构抑制区域835和845中的试剂之间的接触直至分析物存在时。
图8B是根据本发明的某些实施方案，穿过装置800′的透视图的 示意性举例说明。该装置类似于图8A中所示的装置，且包括上和下保 护涂层810′、850′，任选的滤器820′，和多孔介质830′、840′，其 可以与上文描述的那些基本上相同。装置800′进一步包括吸收介质 860′，其充当泵以使液体通过装置的层820′、830′和840′。在某些实 施方案中，区域835′中的试剂是抗原，其可以用于检测生物学样品中 的抗体。在其他实施方案中，试剂是用于检测抗原的抗体；在进一步 的实施方案中，它们是核酸、适体、分子印迹的聚合物、或经配制结 合抗原的其他化学受体，例如核酸、蛋白质、小有机分子或无机离子。 区域845′中的试剂可以共价(例如使用先前描述的化学作用)或非共 价地(例如通过非特异性吸附)与层840′附着。
使用装置800′进行的示例性测定包括向滤器820′添加生物学液 体；液体分布到滤器内，并且过量液体经过滤器且分布到层830′的区 域内。过量液体溶解沉积到层830′上的试剂例如标记的二抗，且将它 们运送至层840′。液体中的分析物例如抗体结合与区域845′连接的受 体，并且来自区域835′的标记试剂与分析物结合。过量液体和试剂被 运送到层860′内，其是亲水的且充当用于收集过量液体和试剂的区 域。任选地，水、缓冲液或其他洗涤液体的滴可以加入滤器820′中， 以将过量试剂通过装置洗涤到层860′内；这个洗涤步骤可以去除非特 异性结合的标记和减少本底信号。这种装置适合于例如免疫测定，其 中一种测定可以是但不限于ELISA测定。示例性ELISA测定将包括在 区域835′中酶标记的例如用辣根过氧化物酶标记的二抗。在测定完成 后向区域845′添加试剂例如碘化物可以导致测定的信号的扩增，例如 通过辣根过氧化物酶催化碘化物至碘的转化，产生褐色。
应注意并非所有层都必须包括在所有实施方案中。例如，在某些 实施方案中，仅需要单层多孔介质例如图8A中的介质830，以对目的 样品执行生物测定。其他实施方案可以包括比图8A和8B中举例说明 的那些更多的层，或与图8A和8B中举例说明的那些不同的层。此外， 在给定单元(例如在单片多孔介质上)中可以提供多个装置，所述给 定单元可以容易地允许多个诊断测试平行或顺次进行。如下文所更详 细地描述的，每个装置其自身可以是多路的，从而允许同时进行许多 不同种类的测量。
图9A和9B分别举例说明了根据某些实施方案，示例性垂直流动 装置900的前和后视图。如图9A中可见，该装置包括保护上层910 例如胶粘带、滤器920和多孔介质930例如滤纸。保护上层910包括 类似于图8A中所示的那种的小孔，其提供其中液体样品可以沉积到滤 器920例如玻璃纤维滤器上的区域。保护上层910还任选地包括“标 签”，其延伸超过多孔介质930的边缘，且允许容易地操作装置。多 孔介质930包括限定通过其样品可以在施加于滤器920后流动的区域 (在这个图像中看不见)的疏水屏障。
图9B显示了装置900的后视图。该装置包括保护下层950和用于 样品分析的区域935，其由多孔介质930中的疏水屏障限定。在举例 说明性实施方案中，存在各自进行处理以提供不同测定的4个区域 935；然而，一般而言其他形状和数目的区域和其他构造也是可能的。 与上文描述的横向流动装置形成对比，此处测定区域通过疏水屏障彼 此分开。然而，某些实施方案包括彼此流体性连通的测定区域。此种 实施方案可以作为组合横向和穿过装置操作。
图10举例说明了用于装配图9A-9B的横向流动装置的示例性操 作。首先，制备生物测定层和滤器1010。在一个例子中，生物测定层 是具有形成图案的屏障和点样在由屏障限定的区域中的测定的多孔介 质，例如如上所述，并且滤器是使用打孔机制备的9-mm直径的玻璃纤 维滤纸片(Whatman GF/C)。使滤器在生物测定层上对齐1020。提供 保护层例如粘带1030。在一个例子中，在距离胶带的一个末端～7mm 处在透明胶粘带(例如Scotch胶带)(7×1.9cm)上打出7-mm直 径的孔。随后使用粘带使滤器与生物测定层粘着1040。随后使粘带折 叠数次1050，以使滤器与生物测定层紧固，并且使粘带中的孔置于玻 璃纤维滤器上且使过量长度的胶带包裹在生物测定层周围以使装置密 封。
在一个例子中，所制造的装置是相对重量轻(约50mg)和小型 的(约36×18×0.3mm)，但足够大以通过手操作。装置设计为通 过用不同测定处理4个区域935来执行产生肝功能的指示剂的4个测 定。
所制造的装置的第一个区域935使用由美国专利号5,279,944中 报道的操作改良的方法进行处理，以检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)， 所述专利的完整内容通过引用并入本文。测定依赖于在L-丙氨酸和α -酮戊二酸的存在下丙酮酸的形成(由ALT催化)。丙酮酸随后与丙酮 酸氧化酶反应以产生过氧化氢。过氧化氢在4-氨基安替比林 (aminoantipyridine)和二甲氨基苯甲酸(dimethylaminobenozoic acid)钠的存在下与辣根过氧化物酶反应，以产生4-N(1-亚胺基-3- 羧基-5-N，N二甲氨基-1，2-cycloexandion)安替比林钠盐；当ALT存 在时，测定变成红/紫色。
在一个示例性实施方案中，通过以所列出的顺序将下述溶液点样 到测定孔内，随后在每种溶液之间干燥10分钟，制备在纸上的ALT 测定：1)0.3μL溶于Millipore水的0.3M海藻糖溶液；2)0.3μ L溶于200mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.35)的包含L-丙氨酸(1M)、 α-酮戊二酸(30mM)、KH2PO4(2mM)、MgCl2·6H2O(20mM)和焦磷 酸硫胺素(TPP)(2mM)的溶液；3)0.3μL溶于200mM Tris-HCl 缓冲液(pH 7.35)的包含4-氨基安替比林(2mM)和二甲氨基苯甲 酸钠(10mM)的溶液；和4)0.3μL溶于200mM Tris-HCl缓冲液 (pH 7.35)的包含丙酮酸氧化酶(6U/ml)和辣根过氧化物酶(6U/ml) 的溶液。通过将0.5μL溶于包含150mM NaCl的50mM磷酸钠缓冲 液(pH 8.0)的ALT溶液点样到测试区域内来制备关于ALT的校正曲 线。
所制造的装置的第二个区域935使用由J.Clin.Lab.Anal. 1999，13，180和Angew.Chem.Int.Ed.2007，46，1318中报道的 那种改良的操作进行处理，以检测血浆中的蛋白质水平。具体地，将 0.3μL 250-mM柠檬酸缓冲溶液(pH 1.8)点样到测试区域内，随后 干燥10分钟，然后添加0.3μL溶于乙醇的4.5-mM四溴酚蓝(TBPB) 溶液；再次使纸干燥10分钟。通过将0.5μL溶于包含150mM NaCl 的50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)的BSA溶液(浓度0.1-2mM)点样 到测试区域内来制备校正曲线。
所制造的装置的第三个区域935使用由下述参考文献中描述的那 种改良的测定进行处理，以检测血浆中的碱性磷酸酶(ALP)水平： ″Rapid and Sensitive Colorimetric Method for Visualizing Biotin-Labeled DNA Probes Hybridized to DNA or RNA Immobilized on Nitrocellulose：Bio-Blots，″Leary，J.J.；Brigati，D.J.； Ward，D.C，PNAS，第80卷，No.13，1983，第4045-4049页，所 述参考文献的完整内容通过引用并入本文。具体地，将0.3μL 500mM Tris缓冲液(pH 9.5)点样到纸测试区域内，允许区域干燥10分钟， 然后点样0.3μL溶于70％二甲基甲酰胺的2.5％硝基蓝四唑，随后干 燥10分钟和点样0.3μL溶于100％DMF的5％5-溴-4-氯-3-吲哚基 磷酸盐。允许测试区域干燥30分钟。通过将0.5μL溶于500mM Tris 缓冲液(pH 9.5)的碱性磷酸酶溶液点样到测试区域内来制备校正曲 线。
所制造的装置的第四个区域935使用US 5,834,226中报道的那种 改良的操作进行处理，以检测血浆中的天冬氨酸氨基转移酶(AST)水 平，所述专利的完整内容通过引用并入本文。具体地，在测试基底的 后面覆盖在胶带中以使蒸发降到最低后，将2.0μL溶于Millipore 水的5％w/v海藻糖溶液点样到测试区域内。干燥10分钟后，将溶于 包含0.0237M NaCl和4.5mM EDTA二钠盐的200mM TRIS缓冲液(pH 8.0)的，包含1.0M L-半胱亚磺酸和0.1M 2-酮戊二酸单钠的2.0μ L溶液点样到测试区域内。干燥另外10分钟后，将2.0μL染料溶液 (包含溶于25.0mL去离子水的0.25g聚乙烯醇、7.5mg甲基绿、 7.5mg若丹明B、2.8mg ZnCl2)和0.06％Triton X-100点样到测试 区域内。通过将2.0μL溶于包含150mM NaCl的50mM磷酸钠缓冲液 (pH 8.0)的天冬氨酸氨基转移酶溶液(浓度0.05U/mL-2.50U/mL) 点样到测试区域内来制备校正曲线。
在某些实施方案中，使装置暴露于通过使用刺血针刺破手指而获 得的血滴，其中通过使装置把握在刺破的手指和拇指之间(从而使得 血滴与滤器对齐)将血液加入装置中。使装置无压力把握约60秒，然 后轻轻挤压约10秒。约70秒后，装置不再需要把握；然而，测定的 结果直至30分钟后才进行分析。通过从形成图案的纸中剥离保护罩 (即胶带)(这个过程也去除玻璃纤维滤器)来观察测定的结果。测 定的结果可以通过与比色图表比较进行定性显现，或它们可以通过使 结果数字化且进行分析来进行定量，例如如上文所更详细地描述的。
因为任何所需图案都可以在多孔介质中进行限定，所以可以设想 除生物测定外的广泛范围的应用。例如，多孔介质例如纸可以图案化 成通道，并且随后通过应用电场在这些通道中对样品进行电泳。尽管 电泳中纸的使用是众所周知且理解的，但样品的路径长度和因此样品 中带电颗粒之间分开的程度常规地受限于所使用的纸的长度。此处， 因为纸可以任意地进行图案化，所以通道可以制造为相对于纸的长度 增加通道的路径长度的“锯齿形”或其他图案。此外，图案化允许通 道比常规基于纸的电泳中的通道明显更狭窄，因此可以使用小得多的 样品尺寸。
在某些实施方案中，形成图案的多孔、亲水介质(例如纸)层和 绝缘材料(例如双面胶带)层以交替顺序叠加，以产生三维微流体装 置。三维微流体装置可以在形成图案的纸层内通过毛细管作用横向吸 取液体，或在2层形成图案的纸之间通过毛细管作用垂直吸取液体。 绝缘材料层确保形成图案的纸的不同层中的液体不会彼此混合。无论 何时需要液体在2层形成图案的纸之间垂直流动时，可以在绝缘材料 层中提供小孔。三维微流体装置可以使得2个不同通道能够彼此交叉 而不出现直接的物理接触；这是在单层横向流动装置中不可能的特征。 三维装置对于将样品以任何所需模式分布到大量孔内也是有用的。三 维装置在其中将处理或分析大量样品的应用中是有用的，因为样品可 以以垂直方向流动，并且装置的每层都可以用于样品处理或分析。因 为纸和胶带的层很薄(每层～100-200μm)，所以可以叠加数层纸和 胶带，而不显著改变装置的大小。
图18A示意性举例说明了一个实施方案的三维微流体装置1800 的透视图，其包括2层形成图案的纸1810和1830，和具有小孔的一 层绝缘材料1820，例如双面胶带。这3层1810、1820、1830彼此对 齐且结合。图18B显示通过毛细管作用吸取2种不同颜色的水性染料 (在灰度图像中，其中之一看起来比另一种更明亮)的图18A的装置。 装置允许通过其染料彼此交叉流动而不在2种液体之间发生任何混合 的分开通道。
图19示意性举例说明了另一个实施方案的三维微流体装置1900 的透视图，其是设计为将2种样品以特定模式分布到16个测试区内的 样品分布装置。装置1900包括4层形成图案的纸1910和3层绝缘材 料1920。装置的顶层1911包括用于2种样品的2个入口，和装置的 底层1914包括16个测试区。装置的内层包括使样品在水平面中分布 的多个通道。图19示意性举例说明了在将液体施加于装置的顶层1911 上的2个入口，且允许染料通过装置运行到底层1914上的16个测试 区内后，2种不同颜色的水性染料(在灰度图像中，其中之一看起来 比另一种更明亮)的流动。利用通道在装置的内层中的合适安排，可 以在测试区中获得任何样品模式。
在多孔、亲水介质中提供形成图案的疏水屏障的方法
在某些实施方案中，如下文所更详细地描述的，疏水屏障可以使 用形成图案的方法在多孔、亲水介质中提供，所述形成图案的方法需 要相对少的设备，可以在几乎任何实验室中进行，且足够通用以制备 许多类型的图案和每个图案的多个拷贝。因为相对容易制造和廉价组 分的现成可用性，生物测定装置可以用比常规装置例如浸渍片显著更 低的成本来形成，并且因此尤其可以用于在其中资源有限且装置的成 本和便携性有用的偏远场所中检测疾病。
如上所述，为了在多孔、亲水介质例如但不限于纸中制造微流体 通道，形成图案的疏水聚合物一般基本上延伸通过纸的整个厚度，以 便将液体限制在所需区域内。这种约束限制了可以在实践中用于使纸 形成图案的方法。例如，使用标准墨的印刷方法可能不适合于在纸中 制备通道，因为目前可用的墨设计为与纸的表面附着，而不吸收到纸 内。然而，可以设想可以设计某些墨以便基本上通过纸的厚度吸收。
多孔介质例如纸的组成也可能限制可以在实践中使用的形成图案 的方法。例如，纸一般包括在纸片的x和y轴上定向且在z方向上在 彼此之上叠加的缠绕纤维。这种排列的结果是与z方向比较，x、y平 面中液体增加的扩散，这导致形成图案的部件的模糊。可以进行单体、 聚合物和溶剂的合适选择，以克服纸的这些性质，且使得经过纸的整 个厚度的不同部件的图案化成为可能。
用于使纸形成图案的某些有用的方法基于光刻术，并且可以在洁 净室或实验室中实现。洁净室光刻术对于制备在纸中高度限定的图案 运转良好，但相对昂贵和缓慢，这可能使得它的商业活力略微受限制。 其他方法例如实验室光刻术和软刻蚀术(也称为微接触印刷)消除了 对洁净室的需求，并且对于就制造商而言的设备和专门技术仅具有适 度需求，且仍产生高品质装置。实验室光刻术对于制备具有良好分辨 的通道和小部件尺寸的图案有用。软刻蚀术一般比基于光刻术的方法 更便宜，并且对于相对快速地制备相同图案的多个拷贝有用。
对于某些应用，纸微流体装置中的部件尺寸相对较大(例如，具 有约1-2mm宽的通道)，因此较低分辨率但较快速压印的技术将是足 够的。对于其他应用，将使用微米尺寸的部件，并且因此廉价但更高 分辨率的方法将是有用的。对于大多数应用，装置将具有尺寸小于1.5 mm的部件。然而，应认识到可以使用本文描述的系统和方法形成广泛 多样的通道形状和尺寸。在2种应用中，都希望形成图案的方法是廉 价的，具有高生产量，并且不要求高级技术技能使用者来制造。
下文的讨论描述了根据本发明的某些实施方案，用于使纸形成图 案的3种方法(洁净室刻蚀术、台面式刻蚀术和压印)，且比较了使 用每种方法生产的图案的品质与制备其的成本。这些比较针对在纸微 流体装置中可能有用的几个部件进行，所述部件例如曲线、直角、T- 结点和直通道。这些部件的宽度对于亲水通道和疏水屏障也都是可变 的。比较这些部件的分辨率和一致性，以及图案控制水在纸中的扩散 的能力。各个例子意欲于举例说明可以使用某些方法产生的某些类型 的部件，且不应解释为限制本发明。
在某些实施方案中，疏水图案使用洁净室光刻术来产生。图11 示意性举例说明了用光致抗蚀剂通过光刻术使层析纸形成图案以在纸 内产生疏水屏障的示例性方法中的步骤。
在图11中举例说明的实施方案中，首先提供多孔、亲水介质例如 层析纸(例如直径约7.5cm和厚度约100μm)1110。选择具有足以 经得住刻蚀术步骤的厚度和强度，且还与后续预期用途相容的纸。
接下来，将纸浸入光致抗蚀剂中且进行前烘1120。在一个例子中， 将纸浸入约2mL SU-8 2010光致抗蚀剂中，持续足以使光致抗蚀剂浸 透纸的一段时间，例如30秒-1分钟。在某些实施方案中，光致抗蚀 剂基本上渗透或浸透纸，从而使得当稍后去除限定部分的光致抗蚀剂 时，保留在纸上和纸中的部分形成对于横向液体流基本上不透的屏障。 也可以使用与光刻术相容的其他光活性材料，例如光聚合物，只要材 料可以去除以限制图案，而不损伤纸。随后使光致抗蚀剂浸透的纸任 选例如在2000rpm下旋转30秒，以去除过量的光致抗蚀剂。过量的 光致抗蚀剂可以以其他方式例如通过刮擦或施压来去除。接下来，将 纸例如于95℃烘烤5分钟或风干，以去除SU-8配方中的环戊酮。
接下来，使光致抗蚀剂浸透的纸在光掩膜下对齐，且在所选择的 波长下暴露于UV光，以引起光致抗蚀剂适当地反应1130。在一个例 子中，使用掩膜对准器(OL-2Mask Aligner，AB-M，Inc)使得自CAD/Art Services，Inc.的光掩膜对齐，并且使纸通过掩膜暴露于～405nm UV 光(50mW/cm2)约10秒。在另一个例子中，使用喷墨打印机将光掩 膜直接印刷到透明物上。
接下来，使经照射的纸例如于95℃烘烤5分钟1140，以使光致抗 蚀剂交联或以其他方式适当地处理光致抗蚀剂。
接下来，光致抗蚀剂得到显现，且所得到的组件任选地进行等离 子体氧化1150。在一个例子中，未聚合的光致抗蚀剂通过下述去除： 将经照射和后烘的纸浸入丙二醇甲醚乙酸酯(PGMEA)内(5分钟)， 且用2-丙醇(3×10mL)洗涤图案。显现过程使光致抗蚀剂形成的 疏水屏障留在纸(或其他多孔介质)中。在某些情况下，在光刻术过 程后，纸具有比其在处理前更高的疏水性，这可能是由于残留的与纸 结合的抗蚀剂。如果对于在纸中达到用于预期应用的满意的亲水性水 平是适当的，那么整个纸表面可以任选地暴露于氧等离子体或进行其 他合适的处理以调整亲水性。在一个例子中，使形成图案的纸在600 托下暴露于氧等离子体10秒(SPI Plasma-Prep II，Structure Probe， Inc)。在其中去除光致抗蚀剂后纸的亲水性足以用于预期用途的实施 方案中，这个步骤无需进行。在某些实施方案中，选择光致抗蚀剂及 其处理，以减少或消除纸的亲水性的改变。
所得到的形成图案的纸随后可以与圆片切开，以形成单独的生物 测定装置1160，并且可通过点样试剂和干燥进行衍生或以其他方式进 行修饰以在诊断测定中使用1170，如下文所更详细地描述的。
光致抗蚀剂通过其进行暴露的掩膜针对完成的生物测定装置的所 需应用适当地形成图案。在某些实施方案中，使掩膜形成图案以限定 具有例如约1mm宽度的疏水通道，和/或根据需要限定测定区域，例 如1-10个测定区域或更多。在其中装置将用于微阵列应用中的实施方 案中，装置可以包括超过50个、超过100个、或甚至数百个测定区域。 在包括测定区域和通道的实施方案中，测定区域可以与通道共同扩张， 或可以由其分支。适当地，形成图案的区域可以具有不同的形状以给 使用者提供关于测定类型的信息。一般而言，因为占有通道的纸或其 他多孔、亲水介质能够通过毛细管作用通过通道转运液体，所以通道 无需具有本身能够诱导毛细管作用的特定尺寸或形状。然而，通道越 小，将需要越少的样品以便进行满意的测量。
使用本文描述的光刻术方法，已达到100μm的通道宽度。尽管 最小的部件的大小在理论上受光刻术分辨率的限制，但某些实验参数 限制实际上可以用这种方法形成的部件的大小。例如，因为纸是不透 明和相对厚的，所以它一般要求相对长的暴露时间以通过纸完全暴露 光致抗蚀剂，这略微减少了刻蚀术分辨率。然而，小于100μm的部 件大小应当可以容易地达到，并且小得多的部件(例如，100nm)在 理论上是可能的。
使用“台面式”或“实验室”光刻术在多孔、亲水介质中提供疏 水屏障的操作利用许多与上文描述的洁净室光刻术相同的原理，但一 般对于执行更廉价且更简单。
图12举例说明了根据某些实施方案，在多孔、亲水介质中提供疏 水屏障的示例性操作。首先，提供多孔、亲水介质1210。尽管选择具 有足以经得住刻蚀术步骤的厚度和强度，且还与后续预期用途相容的 纸，但为了减少成本，在一个例子中，将10cm×10cm纸巾片用作 亲水介质。
接下来，将纸浸入光致抗蚀剂中且进行干燥1220。在一个例子中， 使用玻璃试管的侧面将1mL SC光致抗蚀剂遍布在纸巾上，以获得通 过纸巾厚度的大致均匀的抗蚀剂涂层。例如通过用纸巾吸收来去除过 量抗蚀剂，并且随后使光致抗蚀剂浸透的纸于25℃风干10分钟。光 致抗蚀剂的选择一般与就图11而言描述的相同。SC光致抗蚀剂一般 比许多其他种类的商购可得的光致抗蚀剂更廉价，且因此在成本敏感 性应用中可以是有用的。自制光致抗蚀剂也是合适的。
接下来，使光致抗蚀剂浸透的纸在光掩膜下对齐，且在所选择的 波长下暴露于UV光，以引起光致抗蚀剂适当地反应1230。在一个示 例性过程中，用于台面式刻蚀术的掩膜通过使用台式喷墨打印机(HP PhotoSmart C3100)将其印刷到透明片上来产生。在这个例子中，通 过光掩膜使纸暴露于来自保持在纸上方12cm的，长波UV灯、B 100 AP、 UVP、～20mW/cm2的UV光约3.5分钟，所述光掩膜通过夹紧2片玻璃 之间的掩膜和纸保持在纸顶部上合适的位置。另一个廉价的UV光来源 是UV EPROM(可擦除可编程只读存储器)芯片擦除灯。
接下来，光致抗蚀剂得到显现1240。在一个例子中，未聚合的光 致抗蚀剂通过将纸浸入二甲苯(3分钟)和二氯甲烷(3×3分钟)中 来去除。显现过程使光致抗蚀剂形成的疏水屏障留在纸(或其他多孔 介质)中。如在图12的实施方案中，纸可以任选地用氧等离子体进行 处理以调整其亲水性，例如，通过使纸在600托下暴露于氧等离子体 10秒(SPI Plasma-Prep II，Structure Probe，Inc)。
所得到的形成图案的纸随后可以如上文所更详细地描述的进行切 割和衍生。
在其他实施方案中，使用软刻蚀术/微接触印刷/压印在多孔、亲 水介质中提供疏水屏障。图13举例说明了使用软刻蚀术提供疏水屏障 的示例性方法。筛选，提供印模1310。在一个例子中，印模由塑料 (Costar 384-孔微量平板，Corning)制成，并且在另一个例子中， 通过Rubber Stamps Net定制橡皮印模，对于3×3英寸印模成本为 约$25，并且所述印模限制于宽度约0.35mm的部件。预期其他最低限 度的部件大小也是可能的，并且受所使用的制造技术和材料的限制。
接下来，例如通过将疏水聚合物涂到印模上使印模“加墨”1320。 在一个例子中，使用白色刚毛扁平画笔#4将聚(二甲基硅氧烷)(PDMS) (sylgard 184，10∶1弹性体碱(elastomer base)：固化剂，在室 温下固化3小时)以薄层遍布在图案的部件上。
接下来，将聚合物-加墨的印模施压到多孔、亲水介质上1330。 在一个例子中，使经PDMS涂布的印模与Whatman No.1滤纸的10×10 cm纸片接触，通过人工轻轻施压约20秒，然后去除印模。
随后对聚合物进行处理，例如进行固化1340。继续上述例子，纸 中的PDMS在使用前在室温下固化8小时。
使用上文对于洁净室刻蚀术、实验室/台面式刻蚀术和软刻蚀术描 述的示例性操作形成的图案化的部件的尺度通过下述进行定量：使用 与立体显微镜(Leica MZ12)连接的Nikon数码相机DXM1200使图案 成像，在Microsoft Powerpoint中放大图像，印刷图像，和使用直尺 测量部件。图14A和14B分别是使用洁净室刻蚀术和实验室刻蚀术形 成的部件的图像。表3概括了对图像进行的测量：表3中报道的值对 放大进行校正，且表示实际尺度；它们还是在遍及整个图案分布的位 置处测量10次的相同图案的3次重复的平均值。
表3.使纸形成图案的2种示例性方法的转移的保真度。在所有情况下，亲水通道和疏水壁设计为1mm。
用上文就图11而言描述的洁净室刻蚀术使疏水屏障形成图案的 示例性操作产生相对界限清楚的部件，在某些实施方案中，可以制备 对于亲水通道宽度小至约150μm(实验：158±13μm)和对于疏 水壁宽度约300μm(实验：297±27μm)的部件，如图16A中所 示。一般而言，可以制备甚至小于约150μm的疏水壁，然而，较薄 的壁在限制水扩散到亲水通道外方面不如较厚的壁有效。
尽管洁净室光刻术产生高品质部件，但就生产量、费用和制备图 案所需的步骤数目而言，它略微不如台面式刻蚀术和台面式压印有效。 例如，在一个示例性过程中，洁净室刻蚀术使用约0.5g SU-8 2010 光致抗蚀剂，以在7.5cm滤纸片上制备3.6×3.6mm2的5×5cm 格栅(在图15A中显示)；这个量的光致抗蚀剂单独花费～$0.26。用 于产生图15A中所示格栅的示例性制造过程在装置完成和准备使用前 需要9个步骤。
洁净室中的光刻术也具有实践局限性，因为设备一般设计用于特 定最大尺寸的基底。例如，在示例性过程中使用的设备不能用于使直 径大于7.5cm的圆形纸片形成图案，因为掩膜对准器不能容纳更大的 基底。较大的掩膜对准器将允许较大的基底形成图案。
当部件尺寸为毫米时，对于将部件从掩膜转移至纸片，台面式刻 蚀术具有与洁净室刻蚀术相当的保真度。例如，如表3中所示，具有 1mm亲水通道和疏水壁的掩膜给出纸中的下述图案，其对于通道宽 0.99±0.03mm和对于壁宽1.02±0.03mm。
然而，台面式刻蚀术在提供遍及图案具有相等大小的部件方面可 能略微不如洁净室刻蚀术一致。例如，在某些实施方案中，台面式刻 蚀术的线宽比洁净室刻蚀术变异高50％。台面式刻蚀术在产生具有相 对狭窄的线宽的图案方面也可能不如洁净室刻蚀术有效。例如，使用 上文描述的示例性过程，使用台面式刻蚀术制备的不渗漏的最狭窄部 件宽度约100μm(实验值106±23μm)(对于亲水通道)，和 宽度约150μm(实验值245±31μm)(对于疏水壁)，如图16B 中所示。
然而，台面式刻蚀术比洁净室刻蚀术显著更廉价和更高生产量。 在使用台面式刻蚀术的一个示例性过程中，0.5g SC光致抗蚀剂用于 制备3.6×3.6mm2的10.7×7.2cm格栅(图15B)，这花费～$0.05 (比洁净室刻蚀术少$0.21)。
相同抗蚀剂也可以用于洁净室方法中，因此台面式方法的一个有 用特征不在于抗蚀剂的成本，而在于设备的成本和该方法的生产量。 例如，在某些示例性过程中，在台面上制备相同的5×5cm格栅需要 6个步骤(比洁净室过程少3个)，并且可以比在洁净室中制备格栅 所需的时间快～10分钟完成。
在某些实施方案中，压印方法是比洁净室或台面式光刻术更容易 和更便宜的使纸形成图案的方法，但产生略微更低品质的图案。除了 转移过程外，印模自身的品质可以影响所得到的图案的品质。尽管上 文描述的示例性过程使用商业购买的印模，但印模也可以在实验室中 进行制备，例如使用聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)通过使母版(由光 刻术制备)反复模压，使用本领域已知的技术来制备。
在某些实施方案中，压印方法比光刻法显著更廉价。在一个示例 性过程中，使用仅0.1g PDMS(这花费～$0.01，并且分别比通过示 例性台面式或洁净室刻蚀法制备相同图案使用的聚合物便宜$0.25和 $0.04)在约120秒中可以制备3.6×3.6mm2的10.7×7.2cm格栅 (图15C)。
压印方法的实施方案还允许广泛多样的材料。该技术已证实用于 产生图案，例如使用PDMS、石蜡(熔点58-60℃)、和Norland光学 粘合剂(NOA)——可以用UV光固化的基于乌拉坦(urethane)的粘 合剂(Norland Products，Inc.)。
表4包括根据各种示例性实施方案，比较关于用疏水屏障使多孔、 亲水介质形成图案的估计成本的信息。相对高分辨率的方法(洁净室 光刻术和台面式光刻术)的成本可以通过下述得到减少：例如使用相 对廉价的负性光致抗蚀剂(例如SC光致抗蚀剂，Arch Chemicals， Inc.)，使用喷墨打印机印刷掩膜(例如，而不是从印刷服务购买它 们)，和/或使用标准100W汞灯(例如，Blak-ray长波UV灯B100AP， 约$514)照射光致抗蚀剂。为了产生具有相对低分辨率(宽)部件的 单个图案的多个拷贝，可以使用可以以几乎任何所需设计购自供应商 的印模(橡皮或塑料的)(橡皮印模花费～$25)。在某些实施方案中， 聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)用作疏水聚合物。各种多孔介质也进行 比较，例如，Kimberly-Clark硬卷纸巾和Whatman No.1滤纸，尽管 用其他纸也可能获得相似结果。Kimberly-Clark纸巾是通过毛细管作 用良好地吸取液体的可获得的相对廉价的纸来源。
表4.用疏水屏障使多孔介质形成图案的3种示例性方法需要的设备和产生的费用的比较
a所有方法使用Kimberly-Clark硬卷纸巾或Whatman No.1滤纸。
b它需要另外10分钟以进行第二次重复。
c它需要另外约8分钟以进行第二次重复。
d这个时间估计不包括图案干燥所需的时间。
d这个成本估计仅是关于聚合物(光致抗蚀剂或PDMS)的成本； 它不包括纸、溶剂或使用的电的成本。
其他方法也可以用于在多孔、亲水介质中形成疏水屏障。例如， 液体可以依照图案施加于介质。液体自身可以是疏水的，或可以在干 燥或进一步处理后能够变成疏水固体。例如，液体可以是亲水且因此 使纸湿润但在干燥后形成疏水固体的商购可得的防水溶液，或液体可 以是聚合后形成疏水固体的单体。
液体可以依照图案以许多不同的方式进行施加。例如，液体可以 进行喷射，例如用喷枪喷，或通过模板以其他方式进行沉积。或者， 例如，液体可以使用众所周知的“丝网印刷(silk screening)”技 术进行沉积。可选择地，通过刻蚀术形成图案的纸片可以用作另一个 纸片的“印模”。例如，形成图案的纸片可以例如如上所述通过刻蚀 术形成图案，以产生疏水和亲水区域。形成图案的纸随后可以用液体 浸湿，从而使得仅指定的纸部分，一般是亲水部分，被溶液润湿。随 后使形成图案和浸湿的纸与液体浸入其内的另一个(未形成图案的) 纸片接触，从而转移图案。喷墨印刷是可以用于依照图案将液体沉积 在纸上的另一种方法。可选择地，绘图仪可以用于在纸上“描绘”图 案。上述实施方案的共同特征是需要将足够的液体沉积在纸上以基本 上穿透它，从而产生经过形成图案的区域的横向液体流的屏障。
当依照图案将液体施加于纸时，可能限制分辨率大小的一个因素 是当液体通过纸的厚度浸湿时，它还可以横向流动，因此模糊了预期 部件的边缘。这个问题可以通过对纸的底面施加真空而略微得到改善， 对纸的底面施加真空可以加速液体通过纸厚度的转运，从而限制液体 可以横向扩散的时间。
蜡是光致抗蚀剂的一种廉价、容易获得的替代物，其可以潜在地 用于在层析纸内形成疏水通道。例如，来自蜡纸的蜡可以依照图案转 移至层析纸。在某些实施方案中，这通过使待形成图案的纸夹在2片 蜡纸之间，且使用加热仪器将所需图案“书写”在蜡纸上来完成。这 个过程将少量蜡从2片蜡纸转移到纸的2侧上。纸随后可以在加热板 上进行加热以使蜡通过纸的厚度融化，产生疏水屏障。或者，例如浸 入蜡中的线可以依照图案通过层析纸进行缝线，并且蜡随后被融化从 而使得它局部浸透纸。
应当理解本发明的范围不限于上述实施方案，并且本发明包括对 已描述的那些的修改和改进。其他实施方案在下述权利要求的范围内。
机译： 基于图案化多孔介质的横向流动和流通式生物测定装置，制造方法和使用方法
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