强化生物除磷功能菌筛选用培养基及筛选强化生物除磷功能菌的方法

摘要

强化生物除磷功能菌筛选用培养基及筛选强化生物除磷功能菌的方法，它涉及一种除磷功能菌筛选用培养基及筛选除磷功能菌的方法。本发明解决了现有的筛选强化生物除磷功能菌的方法针对性差，得到强化生物除磷功能菌的菌株数量少及所用的培养基不适合强化生物除磷功能菌生长的问题。筛选用培养基为厌氧培养基、好氧培养基、固体分离培养基和液体分离培养基；方法：一、配制培养基；二、取污泥；三、厌氧培养基；四、好氧培养基；六、厌氧培养基；七、循环操作四至六2～4次、八、等梯度稀释；九、固体分离培养基；十、液体分离培养基；十一、重复八至十3～8次；十二、检测。本发明方法针对性强，筛选得到的功能菌数量多，培养基适合功能菌的生长。

说明书

技术领域

本发明涉及一种除磷功能菌筛选用培养基及筛选除磷功能菌的方法。

背景技术

目前筛选强化生物除磷功能菌的方法是将从强化生物除磷系统中取出的污泥置于含有牛肉膏蛋白胨培养基的摇瓶中发酵培养，再将发酵培养后的菌液稀释，然后涂布于固体传统培养基进行筛选得到强化生物除磷功能菌，但该方法还存在以下问题：1、该法针对性差，所以在培养过程中非强化生物除磷功能菌大量繁殖，杂菌滋生，导致强化生物除磷功能菌的比例下降，所分离得到强化生物除磷功能菌的菌株数量少，仅占分离得到的全部菌株数的15％左右；2、该法所采用的营养肉汤培养基中营养成分不合理，使得培养过程中强化生物除磷功能菌的生长受到限制。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的筛选强化生物除磷功能菌的方法针对性差，得到强化生物除磷功能菌的菌株数量少及所用的培养基不适合强化生物除磷功能菌生长的问题。而提供了一种强化生物除磷功能菌筛选用培养基及筛选强化生物除磷功能菌的方法。

本发明强化生物除磷功能菌筛选用培养基为强化生物除磷功能菌所依次进行筛选用的四种培养基，按照用于筛选的顺序四种培养基分别为厌氧培养基、好氧培养基、固体分离培养基和液体分离培养基；强化生物除磷功能菌筛选用的培养基为厌氧培养基、好氧培养基、固体分离培养基和液体分离培养基；其中每升厌氧培养基是由0.1～0.3g的NaAC、130～150mg的(NH₄)₂SO₄、13～15mg的CaCl₂·2H₂O、170～190mg的MgSO₄·7H₂O、0.2～0.4mL的微量元素液、0.8～1.2mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，厌氧培养基的pH值为7～7.2；每升好氧培养基是由130～150mg的KH₂PO₄、230～260mg的K₂HPO₄、120～160mg的(NH₄)₂SO₄、12～16mg的CaCl₂·2H₂O、160～200mg的MgSO₄·7H₂O、0.1～0.6mL的微量元素液、0.5～1.5mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，好氧培养基的pH值为7～7.2；每升固体分离培养基由0.1～0.3g的NaAC、32～40mg的KH₂PO₄、62～68mg的K₂HPO₄、1.2～1.4g的(NH₄)₂SO₄、120～160mg的CaCl₂·2H₂O、1.6～2g的MgSO₄·7H₂O、1～6mL的微量元素液、5～15mL的维生素液、14～16g的琼脂和余量的蒸馏水组成，固体分离培养基的pH值为7～7.2；每升液体分离培养基是由0.1～0.3g的NaAC、32～40mg的KH₂PO₄、62～68mg的K₂HPO₄、1.2～1.4g的(NH₄)₂SO₄、120～160mg的CaCl₂·2H₂O、1.6～2g的MgSO₄·7H₂O、1～6mL的微量元素液、5～15mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，液体分离培养基的pH值为7～7.2。

本发明筛选强化生物除磷功能菌的方法按照以下步骤进行：一、配制上面所述的厌氧培养基、好氧培养基、固体分离培养基和液体分离培养基；二、收集污泥沉淀：取强化生物除磷反应器中好氧结束的污泥60ml进行离心，弃上清，留沉淀，将沉淀置于100mL的血清瓶中；三、将60ml步骤一配制的厌氧培养基倒于步骤二的血清瓶中与血清瓶中的污泥沉淀混合均匀，向血清瓶中充入氮气5分钟，然后在室温条件下静止培养23～25h；四、好养培养基培养：将步骤三培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有75ml的步骤一配制的好氧培养基的150mL三角瓶中，在室温条件下摇床培养23～26h；五、厌养培养基培养：将步骤四培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有60ml步骤一配制的厌氧培养基的100mL血清瓶中，向血清瓶中充入氮气5分钟，在室温条件下静止培养23～26h；六、循环操作步骤四至五2～4次，对活性污泥进行驯化，得到厌氧培养基培养后的菌液；七、将步骤六培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有75ml的步骤一配制的好氧培养基的150mL三角瓶中，在室温条件下摇床培养23～26h；八、取1mL步骤七摇床培养后的菌液进行等梯度稀释；九、用平板涂布法将稀释的菌液接种到步骤一配制的固体分离培养基中，在室温条件下培养20～24h；十、挑取步骤九中固体分离培养基上的单菌落接种到步骤一配制的液体分离培养基中，在室温条件下培养20～24h；十一、重复操作步骤八至十3～8次获得纯菌株；十二、对步骤九得到的纯菌株进行除磷性能检测和镜检，确定筛选得到的纯菌株为强化生物除磷功能菌。

在厌氧培养基的培养过程中，强化生物除磷功能菌分解体内的聚磷颗粒或糖原释放能量吸收NaAC形成聚-beta-羟基-链烷酸酯(PHAs)；在好氧培养基培养过程中，强化生物除磷功能菌分解在体内的的PHAs作为能量来源吸收磷酸盐或合成糖原；本发明的培养基中的营养成分合理，与现有的筛选用的牛肉膏蛋白胨培养基相比，本发明方法所用的培养基适合强化生物除磷的生长。

本发明的筛选方法中在厌氧培养基中静止放置22～26h，可以将专性好氧菌筛掉，保留强化生物除磷功能菌，然后再放入好氧培养基中培养，其中一些没有在厌氧阶段聚集PHA的菌株就不会生长，而强化生物除磷功能菌继续生长；且在厌氧培养基中和好氧培养基中均培养1天左右的时间，这种极限状态不适合非强化生物除磷功能菌的生长，减少了杂菌数量；本发明又经过等梯度稀释、固体分离培养基培养和液体分离培养基培养，进一步减少了杂菌的数量，本发明筛选方法针对性强，杂菌数量少，所分离得到的强化生物除磷功能菌数量多，占分离得到的全部菌株数的70％以上。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式强化生物除磷功能菌筛选用培养基为强化生物除磷功能菌所依次进行筛选用的四种培养基，按照用于筛选的顺序四种培养基分别为厌氧培养基、好氧培养基、固体分离培养基和液体分离培养基；其中每升厌氧培养基是由0.1～0.3g的NaAC、130～150mg的(NH₄)₂SO₄、13～15mg的CaCl₂·2H₂O、170～190mg的MgSO₄·7H₂O、0.2～0.4mL的微量元素液、0.8～1.2mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，厌氧培养基的pH值为7～7.2；每升好氧培养基是由130～150mg的KH₂PO₄、230～260mg的K₂HPO₄、120～160mg的(NH₄)₂SO₄、12～16mg的CaCl₂·2H₂O、160～200mg的MgSO₄·7H₂O、0.1～0.6mL的微量元素液、0.5～1.5mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，好氧培养基的pH值为7～7.2；每升固体分离培养基由0.1～0.3g的NaAC、32～40mg的KH₂PO₄、62～68mg的K₂HPO₄、1.2～1.4g的(NH₄)₂SO₄、120～160mg的CaCl₂·2H₂O、1.6～2g的MgSO₄·7H₂O、1～6mL的微量元素液、5～15mL的维生素液、14～16g的琼脂和余量的蒸馏水组成，固体分离培养基的pH值为7～7.2；每升液体分离培养基是由0.1～0.3g的NaAC、32～40mg的KH₂PO₄、62～68mg的K₂HPO₄、1.2～1.4g的(NH₄)₂SO₄、120～160mg的CaCl₂·2H₂O、1.6～2g的MgSO₄·7H₂O、1～6mL的微量元素液、5～15mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，液体分离培养基的pH值为7～7.2。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是厌氧培养基、好氧培养基、固体分离培养基和液体分离培养基中的微量元素液中FeCl₃-6H₂O的浓度为1.5g/L、H₃BO₃的浓度为0.15g/L，CuSO₄·5H₂O的浓度为0.03g/L、KI的浓度为0.18g/L、MnCl₂·4H₂O的浓度为0.12g/L、Na₂MO₄·2H₂O的浓度为0.06g/L、ZnSO₄·7H₂O的浓度为0.12g/L和CoCl₂·6H₂O的浓度为0.15g/L。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是厌氧培养基、好氧培养基、固体分离培养基和液体分离培养基中的维生素液由浓度为50mg/L的维生素B₁、浓度为50mg/L的维生素B₂、浓度为100mg/L维生素B₆、浓度为1g/L的维生素B₁₂、浓度为20mg/L的叶酸、浓度为50mg/L的烟酸，浓度为50mg/L的泛酸钙、浓度为50mg/L的对氨基苯甲酸和浓度为20mg/L的生物素组成。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式筛选强化生物除磷功能菌的方法按照以下步骤进行：一、配制如具体实施一所述的厌氧培养基、好氧培养基、固体分离培养基和液体分离培养基；二、收集污泥沉淀：取强化生物除磷反应器中好氧结束的污泥60ml进行离心，弃上清，留沉淀，将沉淀置于100mL的血清瓶中；三、将60ml步骤一配制的厌氧培养基倒于步骤二的血清瓶中与血清瓶中的污泥沉淀混合均匀，向血清瓶中充入氮气5分钟，然后在室温条件下静止培养23～25h；四、好养培养基培养：将步骤三培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有75ml的步骤一配制的好氧培养基的150mL三角瓶中，在室温条件下摇床培养23～26h；五、厌养培养基培养：将步骤四培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有60ml步骤一配制的厌氧培养基的100mL血清瓶中，向血清瓶中充入氮气5分钟，在室温条件下静止培养23～26h；六、循环操作步骤四至五2～4次，对活性污泥进行驯化，得到厌氧培养基培养后的菌液；七、将步骤六培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有75ml的步骤一配制的好氧培养基的150mL三角瓶中，在室温条件下摇床培养23～26h；八、取1mL步骤七摇床培养后的菌液进行等梯度稀释；九、用平板涂布法将稀释的菌液接种到步骤一配制的固体分离培养基中，在室温条件下培养20～24h；十、挑取步骤九中固体分离培养基上的单菌落接种到步骤一配制的液体分离培养基中，在室温条件下培养20～24h；十一、重复操作步骤八至十3～8次获得纯菌株；十二、对步骤九得到的纯菌株进行除磷性能检测和镜检，确定筛选得到的纯菌株为强化生物除磷功能菌。

本实施方式步骤一中每升厌氧培养基是由0.1～0.3g的NaAC、130～150mg的(NH₄)₂SO₄、13～15mg的CaCl₂·2H₂O、170～190mg的MgSO₄·7H₂O、0.2～0.4mL的微量元素液、0.8～1.2mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，厌氧培养基的pH值为7～7.2；每升好氧培养基是由130～150mg的KH₂PO₄、230～260mg的K₂HPO₄、120～160mg的(NH₄)₂SO₄、12～16mg的CaCl₂·2H₂O、160～200mg的MgSO₄·7H₂O、0.1～0.6mL的微量元素液、0.5～1.5mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，好氧培养基的pH值为7～7.2；每升固体分离培养基由0.1～0.3g的NaAC、32～40mg的KH₂PO₄、62～68mg的K₂HPO₄、1.2～1.4g的(NH₄)₂SO₄、120～160mg的CaCl₂·2H₂O、1.6～2g的MgSO₄·7H₂O、1～6mL的微量元素液、5～15mL的维生素液、14～16g的琼脂和余量的蒸馏水组成，固体分离培养基的pH值为7～7.2；每升液体分离培养基是由0.1～0.3g的NaAC、32～40mg的KH₂PO₄、62～68mg的K₂HPO₄、1.2～1.4g的(NH₄)₂SO₄、120～160mg的CaCl₂·2H₂O、1.6～2g的MgSO₄·7H₂O、1～6mL的微量元素液、5～15mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，液体分离培养基的pH值为7～7.2。

本实施方式厌氧培养基、好氧培养基、固体分离培养基和液体分离培养基中的微量元素液中FeCl₃-6H₂O的浓度为1.5g/L、H₃BO₃的浓度为0.15g/L，CuSO₄·5H₂O的浓度为0.03g/L、KI的浓度为0.18g/L、MnCl₂·4H₂O的浓度为0.12g/L、Na₂MO₄·2H₂O的浓度为0.06g/L、ZnSO₄·7H₂O的浓度为0.12g/L和CoCl₂·6H₂O的浓度为0.15g/L。

本实施方式厌氧培养基、好氧培养基、固体分离培养基和液体分离培养基中的维生素液由浓度为50mg/L的维生素B₁、浓度为50mg/L的维生素B₂、浓度为100mg/L维生素B₆、浓度为1g/L的维生素B₁₂、浓度为20mg/L的叶酸、浓度为50mg/L的烟酸，浓度为50mg/L的泛酸钙、浓度为50mg/L的对氨基苯甲酸和浓度为20mg/L的生物素组成。

本实施方式步骤四中将离心后的沉淀放入含有步骤一配制的好氧培养基的瓶中，然后用透气滤膜封口。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是步骤二中的污泥在转速为4000～5000转/分的条件下，离心15～20分钟。其它步骤及参数与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四或五不同的是步骤四、步骤五和步骤七中离心转速均为4000～5000转/分，离心时间均为15～20分钟。其它步骤及参数与具体实施方式四相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是步骤九中等梯度稀释的稀释梯度倍数为10¹～10⁹倍。其它步骤及参数与具体实施方式六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式四、五或七不同的是步骤十二中纯菌株的性能检测方法按照以下步骤进行：A、配制具体实施方式四中步骤一所述的厌氧培养基和液体分离培养基；B、取1mL具体实施方式四分离得到的纯菌株的菌液置于40mL步骤A配制的液体分离培养基中，在16～20℃摇床中培养1～1.5天，再将培养得到的菌液倒入50mL的离心管中，在4000～5000转/分的条件下离心15～20分钟，弃上清留沉淀；C、再向离心管中50mL加入30ml步骤A配制的厌氧检测培养基混匀，向50mL离心管中充入氮气5分钟，密封置于16～20℃的摇床中培养1.5～2.5h；D、将离心管置于4000～5000转/分的条件下离心15～20分钟，弃上清留沉淀；E、再向步骤D 50mL的离心管中加入30ml步骤A配制的好氧检测培养基混匀，在室温条件下曝气1.5～2.5小时；F、将离心管置于4000～5000转/分的条件下离心15～20分钟，弃上清留沉淀；G、循环操作步骤C至F10～15次进行菌种的驯化；H、向含有驯化后菌株的50mL离心管内加入步骤A配制的厌氧检测培养基30ml混合均匀，向50mL的离心管中充入氮气5分钟，密封置于16～20℃的摇床中培养1.5～2.5小时；I、将离心管置于4000～5000转/分的条件下离心15～20分钟，弃上清留沉淀；J、向步骤H50mL的离心管中加入好氧检测培养基，培养1.5～2.5小时，用钼酸铵分光光度法测定培养得到的菌液中的磷浓度为b、好氧检测培养基中的磷浓度为a，纯菌株的除磷率为1-b/a，即确定了生物除磷功能菌的除磷性能；其中其中好氧检测培养基与离心管的体积比为0.5∶1；步骤E和步骤I中每升好氧检测培养基是由35～40mg的KH₂PO₄、62～68mg的K₂HPO₄、120～160mg的(NH₄)₂SO₄、12～16mg的CaCl₂·2H₂O、160～200mg的MgSO₄·7H₂O、0.1～0.6mL的微量元素液、0.5～1.5mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，好氧检测培养基的pH值为7～7.2。其它步骤及参数与具体实施方式四、五或七相同。

本实施方式步骤一中每升厌氧培养基是由0.1～0.3g的NaAC、130～150mg的(NH₄)₂SO₄、13～15mg的CaCl₂·2H₂O、170～190mg的MgSO₄·7H₂O、0.2～0.4mL的微量元素液、0.8～1.2mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，厌氧培养基的pH值为7～7.2；每升液体分离培养基是由0.1～0.3g的NaAC、32～40mg的KH₂PO₄、62～68mg的K₂HPO₄、1.2～1.4g的(NH₄)₂SO₄、120～160mg的CaCl₂·2H₂O、1.6～2g的MgSO₄·7H₂O、1～6mL的微量元素液、5～15mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，液体分离培养基的pH值为7～7.2。

其中厌氧培养基和液体分离培养基中的微量元素液中FeCl₃-6H₂O的浓度为1.5g/L、H₃BO₃的浓度为0.15g/L，CuSO₄·5H₂O的浓度为0.03g/L、KI的浓度为0.18g/L、MnCl₂·4H₂O的浓度为0.12g/L、Na₂MO₄·2H₂O的浓度为0.06g/L、ZnSO₄·7H₂O的浓度为0.12g/L和CoCl₂·6H₂O的浓度为0.15g/L；厌氧培养基和液体分离培养基中的维生素液由浓度为50mg/L的维生素B₁、浓度为50mg/L的维生素B₂、浓度为100mg/L维生素B₆、浓度为1g/L的维生素B₁₂、浓度为20mg/L的叶酸、浓度为50mg/L的烟酸，浓度为50mg/L的泛酸钙、浓度为50mg/L的对氨基苯甲酸和浓度为20mg/L的生物素组成。

本实施方式步骤J中向50mL离心管中加入30ml好氧检测极端两相培养基，在室温条件下曝气1.5～2小时，分别在培养到20分钟、40分钟、60分钟、90分钟和120分钟时取样0.6ml，置于1.5ml离心管中，4000～5000转/分离心5分钟之后，分别取0.5ml上清液于另一个1.5ml离心管中，用钼酸铵分光光度法测定菌液中的磷浓度，记录检测得到的最高磷浓度为b。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八不同的是步骤十二中对纯菌株进行镜检，通过镜检观察确定具体实施方式四分离得到纯菌株的形态是四聚体形态，即确定出纯菌株为强化生物除磷功能菌中的聚糖菌。其他步骤及参数与具体实施方式八相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式四不同的是筛选强化生物除磷功能菌的方法按照以下步骤进行：一、配制如具体实施方式一所述的厌氧培养基、好氧培养基、固体分离培养基和液体分离培养基；二、收集污泥沉淀：取强化生物除磷反应器中好氧结束的污泥60ml进行离心，弃上清，留沉淀，将沉淀置于100mL的血清瓶中；三、厌氧培养基培养：将60ml步骤一配制的厌氧培养基倒于步骤二中的血清瓶中与血清瓶中的污泥沉淀混合均匀，向血清瓶中充入氮气5分钟，然后在室温条件下静止培养23～25h；四、好养培养基培养：将步骤三培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有75ml的步骤一配制的好氧培养基的150mL三角瓶中，在室温条件下摇床培养23～26h；五、厌养培养基培养：将步骤四培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有60ml步骤一配制的厌氧培养基的100mL三角瓶中，在室温条件下静止培养23～26h；六、好养培养基培养：将步骤五培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有75ml的步骤一配制的好氧培养基的150mL三角瓶中，在室温条件下摇床培养23～26h；七、厌养培养基培养：将步骤六培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有60ml步骤一配制的厌氧培养基的100mL血清瓶中，向血清瓶中充入氮气5分钟，在室温条件下静止培养23～26h；八、好养培养基培养：将步骤七培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有75ml的步骤一配制的好氧培养基的150mL三角瓶中，在室温条件下摇床培养23～26h；九、将步骤八培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有60ml步骤一配制的厌氧培养基的100mL三角瓶中，在室温条件下静止培养23～26h；十、将步骤九培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有75ml的步骤一配制的好氧培养基的150mL三角瓶中，在室温条件下摇床培养23～26h；十一、取1mL步骤七摇床培养后的菌液进行等梯度稀释；十二、用平板涂布法将稀释的菌液接种到步骤一配制的固体分离培养基中，在室温条件下培养20～24h；十三、挑取步骤九中固体分离培养基上的单菌落接种到步骤一配制的液体分离培养基中，在室温条件下培养20～24h得到纯菌株；十四、再取1mL步骤七摇床培养后的菌液进行等梯度稀释；十五、用平板涂布法将稀释的菌液接种到步骤一配制的固体分离培养基中，在室温条件下培养20～24h；十六、挑取步骤九中固体分离培养基上的单菌落接种到步骤一配制的液体分离培养基中，在室温条件下培养20～24h得到纯菌株；十七、再取1mL步骤七摇床培养后的菌液进行等梯度稀释；十八、用平板涂布法将稀释的菌液接种到步骤一配制的固体分离培养基中，在室温条件下培养20～24h；十九、挑取步骤九中固体分离培养基上的单菌落接种到步骤一配制的液体分离培养基中，在室温条件下培养20～24h得到纯菌株；二十、再取1mL步骤七摇床培养后的菌液进行等梯度稀释；二十一、用平板涂布法将稀释的菌液接种到步骤一配制的固体分离培养基中，在室温条件下培养20～24h；二十二、挑取步骤九中固体分离培养基上的单菌落接种到步骤一配制的液体分离培养基中，在室温条件下培养20～24h得到纯菌株；二十三、对步骤十六、十九和二十二得到的纯菌株进行除磷性能检测和镜检，确定筛选得到的纯菌株为强化生物除磷功能菌。其他步骤及参数与具体实施方式四相同。

具体实施方式十一：本实施方式筛选强化生物除磷功能菌的方法按照以下步骤进行：一、配制如具体实施方式一所述的厌氧培养基、好氧培养基、固体分离培养基和液体分离培养基；二、收集污泥沉淀：取强化生物除磷反应器中好氧结束的污泥60ml进行离心，弃上清，留沉淀，将沉淀置于100mL的血清瓶中；三、厌氧培养基培养：将60ml步骤一配制的厌氧培养基倒于步骤二的血清瓶中，与血清瓶中的污泥沉淀混合均匀，向血清瓶中充入氮气5分钟，然后在室温条件下静止培养25h；四、好养培养基培养：将步骤三培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有75ml的步骤一配制的好氧培养基的150mL三角瓶中，在室温条件下摇床培养26h；五、厌养培养基培养：将步骤四培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有60ml步骤一配制的厌氧培养基的100mL血清瓶中，向血清瓶中充入氮气5分钟，在室温条件下静止培养23～26h；六、循环操作步骤四至五3次，对活性污泥进行驯化，得到厌氧培养基培养后的菌液；七、将步骤六培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有75ml的步骤一配制的好氧培养基的150mL三角瓶中，在室温条件下摇床培养25h；八、取1mL步骤七摇床培养后的菌液进行等梯度稀释；九、用平板涂布法将稀释的菌液接种到步骤一配制的固体分离培养基中，在室温条件下培养23h；十、挑取步骤九中固体分离培养基上的单菌落接种到步骤一配制的液体分离培养基中，在室温条件下培养22h；十一、重复操作步骤八至十5次获得纯菌株；十二、对步骤九得到的纯菌株进行除磷性能检测和镜检，确定筛选得到的纯菌株为强化生物除磷功能菌。

本实施方式步骤一中每升厌氧培养基是由0.2g的NaAC、140mg的(NH₄)₂SO₄、14mg的CaCl₂·2H₂O、180mg的MgSO₄·7H₂O、0.3mL的微量元素液、1mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，厌氧培养基的pH值为7.2；每升好氧培养基是由140mg的KH₂PO₄、250mg的K₂HPO₄、150mg的(NH₄)₂SO₄、14mg的CaCl₂·2H₂O、180mg的MgSO₄·7H₂O、0.4mL的微量元素液、1mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，好氧培养基的pH值为7.2；每升固体分离培养基由0.2g的NaAC、35mg的KH₂PO₄、64mg的K₂HPO₄、1.3g的(NH₄)₂SO₄、140mg的CaCl₂·2H₂O、1.8g的MgSO₄·7H₂O、3mL的微量元素液、10mL的维生素液、15g的琼脂和余量的蒸馏水组成，固体分离培养基的pH值为7.2；每升液体分离培养基是由0.2g的NaAC、35mg的KH₂PO₄、65mg的K₂HPO₄、1.3g的(NH₄)₂SO₄、150mg的CaCl₂·2H₂O、1.8g的MgSO₄·7H₂O、3mL的微量元素液、10mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，液体分离培养基的pH值为7.2。

本实施方式厌氧培养基、好氧培养基、固体分离培养基和液体分离培养基中的微量元素液中FeCl₃-6H₂O的浓度为1.5g/L、H₃BO₃的浓度为0.15g/L，CuSO₄·5H₂O的浓度为0.03g/L、KI的浓度为0.18g/L、MnCl₂·4H₂O的浓度为0.12g/L、Na₂MO₄·2H₂O的浓度为0.06g/L、ZnSO₄·7H₂O的浓度为0.12g/L和CoCl₂·6H₂O的浓度为0.15g/L。

本实施方式厌氧培养基、好氧培养基、固体分离培养基和液体分离培养基中的维生素液由浓度为50mg/L的维生素B₁、浓度为50mg/L的维生素B₂、浓度为100mg/L维生素B₆、浓度为1g/L的维生素B₁₂、浓度为20mg/L的叶酸、浓度为50mg/L的烟酸，浓度为50mg/L的泛酸钙、浓度为50mg/L的对氨基苯甲酸和浓度为20mg/L的生物素组成。

本实施方式步骤十二中纯菌株的性能检测方法按照以下步骤进行：A、配制具体实施方式四中步骤一所述的厌氧培养基和液体分离培养基；B、取1mL具体实施方式四分离得到的纯菌株的菌液置于40mL步骤A配制的液体分离培养基中，在16～20℃摇床中培养1～1.5天，再将培养得到的菌液倒入50mL的离心管中，在4000～5000转/分的条件下离心15～20分钟，弃上清留沉淀；C、再向离心管中50mL加入30ml步骤A配制的厌氧检测培养基混匀，向50mL离心管中充入氮气5分钟，密封置于16～20℃的摇床中培养1.5～2.5h；D、将离心管置于4000～5000转/分的条件下离心15～20分钟，弃上清留沉淀；E、再向步骤D 50mL的离心管中加入30ml步骤A配制的好氧检测培养基混匀，在室温条件下曝气1.5～2.5小时；F、将离心管置于4000～5000转/分的条件下离心15～20分钟，弃上清留沉淀；G、循环操作步骤C至F10～15次进行菌种的驯化；H、向含有驯化后菌株的50mL离心管内加入步骤A配制的厌氧检测培养基30ml混合均匀，向50mL的离心管中充入氮气5分钟，密封置于16～20℃的摇床中培养1.5～2.5小时；I、将离心管置于4000～5000转/分的条件下离心15～20分钟，弃上清留沉淀；J、向步骤H50mL的离心管中加入好氧检测培养基，培养1.5～2.5小时，用钼酸铵分光光度法测定培养得到的菌液中的磷浓度为b、好氧检测培养基中的磷浓度为a，纯菌株的除磷率为1-b/a，即确定了生物除磷功能菌的除磷性能；其中其中好氧检测培养基与离心管的体积比为0.5∶1；步骤E和步骤I中每升好氧检测培养基是由35～40mg的KH₂PO₄、62～68mg的K₂HPO₄、120～160mg的(NH₄)₂SO₄、12～16mg的CaCl₂·2H₂O、160～200mg的MgSO₄·7H₂O、0.1～0.6mL的微量元素液、0.5～1.5mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，好氧检测培养基的pH值为7～7.2。

本实施方式步骤十二中对纯菌株进行镜检，通过镜检观察确定本实施方式分离得到纯菌株的形态是四聚体形态，即确定出纯菌株为强化生物除磷功能菌中的聚糖菌。

本实施方式的筛选过程均在超净工作台中进行，并观察步骤三中的厌氧培养基中乙酸的变化，步骤四中的好氧培养基中磷酸盐的变化；其中在厌氧培养阶段乙酸吸收量保持在25mg左右，在好氧培养阶段磷酸盐吸收量都保持在2.0mg左右，本实施方式步骤三、四的培养过程中淘汰了将污泥中的非功能菌，而污泥中强化生物除磷功能菌继续生长；本实施方式的杂菌数量少，本实施方式所用的培养基适合强化生物除磷功能菌的生长。

本实施方式共分离得到了33株菌，将这33株菌分别进行测序，测序结果显示，有8株菌为戴尔福特菌属(Delftia sp)的菌株，有6株菌为病菌/绿脓杆菌属(Pseudomonas sp)_的菌株，有15株菌为不动杆菌属(Acinetobacter sp)的菌株，有1株菌为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp)的菌株，有1株菌为副球菌属(Paracoccus sp)的菌株，有1株菌为气单胞菌属(Aeromonas sp)的菌株，有1株菌为短芽孢杆菌属(Brevibacillus sp)的菌株；本实施方式分离得到了的菌株中有14株菌具有明显的除磷能力为聚磷菌，占总筛菌数的42.4％；通过镜检观察确定分离得到纯菌株中具有四聚体形态的菌株有11株菌，即有11株菌为聚糖菌，占总筛菌数的33.3％，关于聚糖菌在Oehmen A与《Water Research》上发表的一篇名为《强化生物除磷的发展：微观和宏观》的文章中也有记载。本实施方式分离得到的强化生物除磷功能菌占分离得到的全部菌株的75.7％，强化生物除磷功能菌的数量多；而采用现有的牛肉膏蛋白胨培养基筛选强化生物除磷功能菌方法由于针对性差，所用的牛肉膏蛋白胨培养基培养基不适合强化生物除磷功能菌，杂菌多，该法分离得到的化生物除磷功能菌的数量极少，仅为15％左右。

将本实施方式获得的33株菌进行性能检测，检测结果如表1所示，其中除磷率低于20％的为非除磷功能菌。

表1

    种属    菌株    除磷率(％)    Acinetobacter sp.    J1-1    31.5    Acinetobacter sp.    J1-2    40.5    Acinetobacter sp.    J2    20    Delftia sp.    J3-1    32.5    Acinetobacter sp.    J3-2    27.5    Acinetobacter sp.    J3-3    31.5    Delftia sp.    J3-4    7.5    Delftia sp.    J3-5    16    Acinetobacter sp.    J4    9.5    Aeromonas sp.    J5    15    Pseudomonas sp.    J6-1    12.5    Acinetobacter sp.    J6-2    9    Acinetobacter sp.    J6-3    64    Delftia sp.    J7-1    12.5

    Brevibacillus sp.    J7-2    82    Delftia sp.    J7-3    35    Acinetobacter sp.    J7-4    40.5    Acinetobacter sp.    H1    37    Acinetobacter sp.    H2-1    33.5    Acinetobacter sp.    H2-2    22.5    Acinetobacter sp.    H3-1    97.2    Pseudomonas sp.    H3-2    70    Delftia sp.    H3-3    50.5    Acinetobacter sp.    H4-1    89    Pseudomonas sp.    H4-2    96    Stenotrophomonas sp.    H5-1    97.4    Pseudomonas sp.    H5-2    91.6    Pseudomonas sp.    H5-3    97    Paracoccus sp.    H6    81.5    Acinetobacter sp.    H7    100    Delftia sp.    C1-1    100    Pseudomonas sp.    C1-2    98.6    Delftia sp.    C4    67

从表1中可以看出，本实施方式筛选得到的强化生物除磷功能菌的除磷率可达到100％，除磷效果好。