水产品中3种食源性病毒检测试剂盒及检测方法

摘要

水产品中3种食源性病毒检测试剂盒及检测方法。所述的试剂盒中包括浓度为5U/μL的反转录－Tag DNA聚合酶、浓度为5U/μL的反转录酶及RT－PCR反应液；其中的RT－PCR反应液中含有10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mMMgCl

说明书

技术领域

本发明涉及用于水产品中三种食源性病毒检测的试剂盒，尤其涉及利用多重PCR及变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测水产品中多种病毒的试剂盒。还涉及检测的方法。

背景技术

甲型肝炎病毒(HAV)、轮状病毒、诺沃克病毒是水产品中常见食源性病毒。它们极易污染环境、食物、水源、海产品(如毛蚶等)、食具、生产加工用器具等和健康人的手。进而造成易感者感染患病或是引发区域性流行疾病的爆发。由于食品生产的全球化发展，新的食品生产工艺的应用，人们饮食习惯的改变等各种因素在一定程度上使食源性病毒病的发病率愈来愈烈。据权威资料报道，病毒引起的食源性疾病是影响食品安全的主要因素之一。近年来，在世界范围内食品安全方面的恶性、突发性事件屡屡发生。据世界卫生组织(WHO)统计报告表明，食源性疾病的实际发病率要比报告的病例数多300～500倍，全世界的患病者以达数亿，并且每年的统计数值都居高不下，消耗了大量的人力物力。然而，与常规的病毒检测不同，食品中的所含致病性病毒一般都多种且少量，并且这些病毒往往难于富集和体外培养，这决定食源性病毒的检测一直是微生物检测中的难点和空白点。现有的检测技术如微生物培养和生化鉴定、免疫学技术、PCR技术等均存在一些问题：常规的生化鉴定方法操作复杂，耗时长，往往一次检测实验只能鉴定一种或少数几种细菌；免疫学技术虽灵敏性高，但易污染，经常出现假阳性现象；PCR技术一般要与凝胶电泳技术联用，也仅可达到对病毒进行检测，不具备高通量的特点。目前，对于水产品中食源性病毒疾病，仍没有完整的病原检测及鉴定手段，尤其是适用于快速、多菌种同时检测的检测技术，因此急待发展。

本发明即旨在利用mPCR和DHPCL技术，建立可快速、灵敏、高通亮检测水产品中3种常见的食源性病毒的快速检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于灵敏快速检测水产品中3种常见的食源性病毒，即甲型肝炎病毒、轮状病毒和诺沃克病毒的mPCR-DHPLC检测试剂盒。

本发明所述的水产品中3种食源性病毒检测试剂盒包括浓度为5U/μL的反转录-Tag DNA聚合酶、浓度为5U/μL的反转录酶及RT-PCR反应液；其中的RT-PCR反应液中含有10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各10mM、RNA酶抑制剂40U/μL及3种食源性病毒的上、下游引物对各20μM；

所述的引物序列如下：

试剂盒保存条件：-20℃保存。

本发明还提供利用上述试剂盒检测水产品中上述3种食源性病毒的方法，包括如下步骤：

①取2μl待测样品RNA溶液，加入22μl试剂盒中的PCR反应液、1.0μL反转录-Tag DNA聚合酶和1.0μL反转录酶，灭菌超纯水24μL，总体积50μL；5000r/min离心10s，然后按照下述条件进行多重RT-PCR扩增：

逆转录：RT反应42℃30min，RTase失活94℃2min；

循环扩增：94℃变性60s，48℃退火2min，72℃延伸3min，35个循环；

终止延伸：72℃10min；

②将RT-PCR产物进行DHPLC分析，DHPLC分析条件如下：

色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相(体积百分比)：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B，

                    0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B，

                    3.0min，42.9％缓冲溶液A，57.1％缓冲溶液B，

                5.5min，39.4％缓冲溶液A，60.6％缓冲溶液B，

                8.0min，37.3％缓冲溶液A，62.7％缓冲溶液B，

                10.5min，36.0％缓冲溶液A，64.0％缓冲溶液B，

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物10μL。

利用本发明的试剂盒及检测方法可同时检测水产品中甲型肝炎病毒、轮状病毒和诺沃克病毒3种病毒。检测灵敏度高，可以检测到1×10^-7ng病毒核酸，即相当于能够检测出30个病毒粒子，其灵敏度优于目前所报道的水产品中病毒检测方法。使用本试剂盒可以实现一类食品中多项目食源性病毒高通量检测，解决同时快速检测多种食源性病毒的问题。

附图说明

本发明附图5幅，其中：

图1是实施例2的特异性试验结果谱图；

图2是实施例3的灵敏度试验结果谱图；

图3是实施例4的精密度试验结果谱图；

图4是实施例5模拟污染样品检测试验中用于甲肝病毒和诺沃克病毒人工污染样品检测的试验结果谱图；

图5是实施例5模拟污染样品检测试验中用于轮状病毒和诺沃克病毒人工污染样品检测的试验结果谱图；

上述附图中，横坐标均为保留时间(单位：分钟min)，纵坐标表示吸收峰信号强度(单位：毫伏mV)。

具体实施方式

下面为本发明的具体实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。

若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器及其商品来源为：RNA/DNA小量纯化试剂盒(Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit)、RT-PCR反应液、AMV-Optimized Tag聚合酶、AMV RTase XL等试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；三乙胺乙酰盐(TEAA，色谱纯)购自Transgenomic公司；乙腈(色谱纯)购自Fisher公司；普通PCR仪PE24000(PerkinElmer公司，美国)；变性高效液相色谱仪NAV-99-4500(Transgenomic公司，美国)；高速离心机centrifuge 5804(Eppendorf公司，德国)。

本部分试验所涉及的病毒株来源分别为：HAV病毒为大连市中心医院在2006～2007年期间从已确诊的甲型肝炎病人标本中分离出来，标本接种猴胚肾传代细胞(FRHK4)传代培养，增殖1～3d后，将细胞消化分散制成抗原片，再用间接免疫荧光法检查细胞内抗原，检测甲型肝炎病毒感染滴度。

轮状病毒为大连医科大学在2006～2007年期间从已确诊的轮状病毒感染的病人标本中分离出来，标本接种恒河猴胚肾细胞MA104株传代培养，增殖1～3d后，将细胞消化分散制成抗原片，再用间接免疫荧光法检查细胞内抗原，检测轮状病毒感染滴度；

将DHPLC分析的甲型肝炎病毒、诺沃克病毒和轮状病毒的特异性基因片段，进行片段回收，DNA纯化，克隆，构建含有甲型肝炎病毒、诺沃克病毒和轮状病毒靶序列的克隆质粒pMD18-T。

诺沃克病毒、脊髓灰质炎病毒(I，II，III型，疫苗株)、柯萨奇病毒(1-6型，疫苗株)、伪狂犬病病毒和乙型肝炎病毒RNA或DNA由大连市临床检验中心馈赠。

本部分所使用的贝类鱼虾蟹等水产品标本从2007～2008年期间，从大连、丹东等沿海及各区各大超市和农贸市场采集。采集后2h内放入-20℃冰箱。冷藏送至测试地点。

实施例1、水产品中3种食源性病毒检测试剂盒的及检测方法的建立

(1)试剂盒的建立

本实施例确定用于检测的引物如下表所示：

在此基础上，设计用于PCR扩增的水产品中3种食源性病毒检测试剂盒：

该试剂盒包括浓度为5U/μL的反转录-Tag DNA聚合酶、浓度为5U/μL的反转录酶及RT-PCR反应液；其中的RT-PCR反应液中含有10mM Tris·HCl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各10mM、RNA酶抑制剂40U/μL及上述3种食源性病毒的上、下游引物对各20μM；

该试剂盒保存条件：-20℃保存。

使用该试剂盒检测水产品样品中3种食源性病毒的mPCR-DHPLC方法包括如下步骤：

①待检样品的制备：采用试剂盒提取法制备待测样品RNA基因组：

a.甲肝病毒的富集方法：聚乙二醇6000沉降法

取水产品的腮和消化系统，以pH9.5的0.05mol/L甘氨酸-NaCl制成悬液，-20℃冻融后，以10000r/min，4℃离心0.5h后在上清液中加入8％聚乙二醇6000，0.4mol/L NaCl反复振摇4℃，再10000r/min 4℃离心半小时，弃上清将沉淀溶于PBS中制成悬液即得被测样品。

b.诺沃克病毒的富集

取5g贝类的中肠腺组织加入35mL甘氨酸缓冲液(pH9.5)。匀浆器高速匀浆3min，将匀浆液装入50mL离心管，37℃温育30min或室温下振荡30min，4℃，10000g离心30min。

移取上清至50mL新管，加入等体积的PEG 8000溶液，颠倒5次混匀。冰上放置至少1h，4℃，10000g离心5min，弃去上清，保留沉淀。

c.轮状病毒的富集

取10g贝类消化道组织中加入70ml甘氨酸缓冲液(样品重量与缓冲液体积之比为1∶7)搅拌器中充分破碎混匀2min。取出30ml，37℃孵育30min。15000g，4℃离心20min。收集上请液，加入等体积的PEG8000溶液，于冰上过夜沉降病毒(PEG终浓度为8％)，10000g，4℃，离心5min。

以上三种病毒富集物采用Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit，提取病毒的RNA。直接作为RT-PCR模板或-20℃保存备用。

②PCR扩增：

取2μl待测样品RNA溶液，加入22μl试剂盒中的PCR反应液、1.0μL反转录-Tag DNA聚合酶和1.0μL反转录酶，灭菌超纯水24μL，总体积50μL；5000r/min离心10s，然后按照下述条件进行多重RT-PCR扩增：

逆转录：RT反应42℃30min，RTase失活94℃2min；

循环扩增：94℃变性60s，48℃退火2min，72℃延伸3min，35个循环；

终止延伸：72℃10min；

③DHPLC分析，DHPLC分析条件如下：

色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相(体积百分比)：0.0min，55.0％缓冲溶液A，45.0％缓冲溶液B，

                    0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B，

                    3.0min，42.9％缓冲溶液A，57.1％缓冲溶液B，

                    5.5min，39.4％缓冲溶液A，60.6％缓冲溶液B，

                    8.0min，37.3％缓冲溶液A，62.7％缓冲溶液B，

                    10.5min，36.0％缓冲溶液A，64.0％缓冲溶液B，

其中，缓冲溶液A为50ml TEAA和250μl乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；缓冲溶液B为50ml TEAA和250ml乙腈混合，加灭菌超纯水定容至1000ml所得溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物10μL。

实施例2、特异性试验

用多种食品病毒标准物质，模拟日常检验的操作步骤，按照实施例1所建立的方法提取核酸，进行mPCR-DHPLC检测。

分别提取甲型肝炎病毒、诺沃克病毒和轮状病毒的RNA，应用脊髓灰质炎病毒(I，II，III型，疫苗株)DNA和柯萨奇病毒(1-6型，疫苗株)DNA、伪狂犬病病毒DNA和乙型肝炎病毒DNA，同时以灭菌水为空白对照。用三个病毒的特异性引物，按照实施例1所建立的方法对提取模板进行扩增，进行mPCR-DHPLC特异性试验。检测结果如附图1所示。

特异性试验结果表明，实施例所建立的检测试剂盒及检测方法可特异地检测三种目标病毒，只有甲型肝炎病毒、诺沃克病毒和轮状病毒检测出特异样品峰，其它对照病毒的检测结果都为阴性，没有假阳性和假阴性结果。

本部分所涉及的病毒株来源分别为：HAV病毒为大连市中心医院在2006～2007年期间从已确诊的甲型肝炎病人标本中分离出来，标本接种猴胚肾传代细胞(FRHK4)传代培养，增殖1～3d后，将细胞消化分散制成抗原片，再用间接免疫荧光法检查细胞内抗原，检测甲型肝炎病毒感染滴度。

轮状病毒为大连医科大学在2006～2007年期间从已确诊的轮状病毒感染的病人标本中分离出来，标本接种恒河猴胚肾细胞MA104株传代培养，增殖1～3d后，将细胞消化分散制成抗原片，再用间接免疫荧光法检查细胞内抗原，检测轮状病毒感染滴度；

将DHPLC分析的甲型肝炎病毒、诺沃克病毒和轮状病毒的特异性基因片段，进行片段回收，DNA纯化，克隆，构建含有甲型肝炎病毒、诺沃克病毒和轮状病毒靶序列的克隆质粒pMD18-T。

诺沃克病毒、脊髓灰质炎病毒(I，II，III型，疫苗株)、柯萨奇病毒(1-6型，疫苗株)、伪狂犬病病毒和乙型肝炎病毒RNA或DNA由大连市临床检验中心馈赠。

实施例3、多重PCR-DHPLC灵敏度试验

用已知病毒量的食品病毒标准物质，采用实施例1所建立试剂盒及检测方法制作模板并mPCR-DHPLC检测，确定检测的灵敏度。表1为3种病毒在不同接种量时，提取的基因组核酸片段，分光光度计测OD值，计算所得核酸含量。

为验证本检测方法的检出限，用分光光度计分别测定阳性质粒pMD18-T(分别含甲型肝炎病毒、诺沃克病毒、轮状病毒靶序列)的浓度，然后分别稀释成1×10^-1ng、1×10^-2ng、1×10^-3ng、1×10^-4ng、1×10^-5ng、1×10^-6ng，1×10^-7ng，1×10^-8ng，按照实施例1的方法提取质粒DNA，进行mPCR-DHPLC检测。下表(表1)为梯度稀释的病毒浓度：

表1

检测结果如附图2所示，样品吸收峰从高到低依次为：1×10^-4ng阳性质粒、1×10^-5ng阳性质粒、1×10^-6ng阳性质粒、1×10^-7ng阳性质粒表明该多重PCR-DHPLC检测方法的最小检测限度为1×10-7ng阳性质粒。即本实施例所建立的多重PCR-DHPLC方法，可检测出1×10^-7ng病毒DNA，相当于能够检测出30个病毒粒子。其灵敏度优于目前所报道的水产品中病毒检测方法。

实施例4、多重PCR-DHPLC的精密度试验

在实施例3中不同批次提取的病毒RNA之间，取1×10^-5ng的病毒RNA作为模板进行PCR-DHPLC检测，确定检测精密度。精密度试验结果如附图3所示。由附图3可见，对于不同批次的1×10^-5ng检测浓度的病毒RNA，经PCR-DHPLC检测，10次重复均能呈现很好的稳定性和重现性。

实施例5、模拟污染样品检测试验

将已知浓度的各种病毒添加到水产品中，或用阳性质粒模拟污染鱼类组织，按照实施例1建立的方法提取基因组核酸，进行mPCR-DHPLC检测。

1、已定量的甲肝病毒和诺沃克病毒阳性质粒与碾磨好的水产品消化系统悬液作对倍混和，充分混匀，冻融3次后，6000r/min 4℃离心30min，取上清。按照实施例1所建立的检测方法提取微生物的核酸，mPCR-DHPLC检测。检测结果如附图4所示。

2、已定量的轮状病毒和诺沃克病毒病毒阳性质粒，与碾磨好的水产品消化系统(牙鲆血、鳃、肝、脾、胃和肠悬液)作对倍混和，充分混匀，反复冻融3次后，6000r/min 4℃离心30min，取上清。按照实施例1所建立的检测方法提取微生物的核酸，mPCR-DHPLC检测。检测结果如附图5所示。

从检测结果可以看出，本发明的试剂盒和方法应用模拟污染样品检测时效果非常理想。

实施例6、本方法在实际检测中的应用

自2007年12月至2008年6月的7个月期间，将实施例1所建立的试剂盒及检测方法应用于实际样品的检验，共检测5大类1341种样品。检测样品无扩增吸收峰出现，可判定样品结果为阴性，直接报告未检出相对应的致病菌；检测样品出现典型的PCR产物吸收峰，且吸收峰值大于3mV时，可判定该样品结果为可疑阳性；检测样品出现典型的PCR产物吸收峰，但吸收峰值小于3mV时，建议样本重做。重做结果峰吸收值仍小于3mV则为阴性，否则为可疑阳性。

同时采用国家标准GB/T 22287-2008(贝类中甲型肝炎病毒检测方法，普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法)、检验检疫行业标准SN/T 1635-2005(贝类中诺沃克病毒检测方法，普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法)进行验证比较。结果表明，采用实施例1所建立的试剂盒及检测方法筛选检出的3份阳性样本，其中2份样品检出甲肝病毒，1份样品检出诺沃克病毒。结果与国标方法检测结果一致(GB/T 22287-2008和SN/T 1635-2005)。具体检测结果如下表(表2)所示：

表2

SEQUENCE LISTING

<110>陈，颖

<120>水产品中3种食源性病毒检测试剂盒及检测方法

<130>N/A

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ggaaatgtct caggtacttt ctttg     25

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gttttgctcc tctttatcat gctatg    26

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ataccactat gatgcagatt a         21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tcatcatcac catagaaaga g         21

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

atcaacatgc ttctaatgga agc        23

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

agttgatgcg tcccacctta atatgac    27